DE10051983A1 - Inhibierung der pathogenen Wirkung oxidierter Proteine - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel und ihre Verwendung zur Inhibierung der pathogenen Wirkung oxidierter Proteine über deren Reaktion mit CD36.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel und ihre Verwendung zur Inhibierung der pathogenen Wirkung oxidierter Proteine über deren Reaktion mit CD36.

Die oxidative Modifikation von Proteinen wird als kritischer Schritt für die Pathogenese von verschiedenen Erkrankungen, die von Atherosklerose (Arteriosklerose), über neurodegenerative Erkrankungen bis hin zum Alterungsprozeß selbst reichen, angesehen (Holvoet 1999; Witztum and Steinberg 1991; Smith MA et al. 1996; Stadtmann ER 1992; Stadtmann und Levine 2000; Berlett und Stadtmann 1997). Hohe LDL-Konzentrationen im Blut gelten als Hauptrisikofaktor für die Entwicklung von arteriosklerotischen (atherosklerotischen) Gefäßerkrankungen (Brown MS. Goldstein IL 1986).

Jedoch besteht heute überwältigende Evidenz zu glauben, dass nicht LDL selber, sondern seine oxidierte Form der entscheidende Trigger für die krankheitserregenden Veränderungen, die zur Arteriosklerose führen, ist (Steinberg D 1997; Chisolm und Steinberg 2000). Das US Patent No 5,756,067 beschreibt, daß die Messung von Cholesterin, Triglyzeriden und Lipoproteinen als Risikomarker für eine sich entwickelnde Atherosklerose noch nicht ausreichend ist, da etwa dis Hälfte aller Herzerkrankungen aufgrund von Atherosklerose in Patienten vorkommt, welche normale Plasma Triglyzerid- und normale Cholesterinwerte haben und weil der angiographische Nachweis von Atherosklerose auch in Patient mit normalen Lipidwerten geführt werden kann. Weitere noch nicht publizierte Vorgänge müssen also an der Entstehung der Arteriosklerose ursächlich beteiligt sein.

Die Oxidation der Lipide im LDL, entweder in vitro z. B. durch Kupferinduzierte Oxidation, oder in vivo, führt zur Bildung von reaktiven Aldehyden. (WO 98/59248). Die Aufnahme von oxLDL durch Makrophagen führt zur Bildung von sogenannten Schaumzellen, ein Vorgang, welcher als initiierender Schritt bei der Entwicklung der Arteriosklerose angesehen wird (WO 98/59248).

Als für diesen Prozeß verantwortlich wird die Oxidation des Lipidanteils im LDL angesehen. Daher wird oxLDL für Untersuchungen zur Entstehung der Arteriosklerose von fast allen Wissenschaftlern durch CuSO₄-Zusatz oder mit Malondialdehyd, ein Endprodukt der Lipidperoxidation, durchgeführt (Holvoet et al 1999). Die Konzentration an oxLDL im Plasma von Patienten mit koronarer, primärer Herzkrankheit oder Transplantationsassoziierter koronarer Herzkrankheit korreliert stark mit dem Fortschreiten der Erkrankung, während in gesunden Kontrollpersonen keine erhöhten oxLDL-Spiegel gemessen werden können (Holvoet et al 1998a). Auch chronische Nierenerkrankungen und Transplantatabstoßungen sind mit hohen oxLDL-Spiegeln assoziiert (Holvoet et al 1998b, 2000; Holvoet und Collen 1997 und 1998).

Auch die Oxidation des Proteinanteils im LDL kann physiologische/pathophysiologische Veränderungen hervorrufen. So führte delipidiertes HOCI-oxLDL zur Induktion des oxidativen Burst in Makrophagen (Nguyen-Khoa et al 1999) und HOCI-oxLDL rief Thrombozytenaggregation hervor (Volf et al 2000).

Reaktive Oxidantien werden vom Körper durch Phagocyten freigesetzt und spielen eine bedeutende Rolle bei der Abwehr gegen Krankheitserreger, bei der Tumorüberwachung und bei allen Entzündungsprozessen (Babior 1978a und b). Neben "professionellen" Phagocyten, wie Granulozyten und Monozyten, können auch andere Zellen, wie z. B. Endothelzellen oder glatte Muskelzellen, reaktive Oxidantien produzieren und abgeben.

Zu diesen oxidierenden Substanzen gehören O₂, Superoxid, Hydrogenperoxid, Peroxynitrite, OH-Radikale, hypochlorige Säure HOCI, Cl₂-Gas und Chloramine. Weiche Prozesse im Detail an der Entstehung dieser oxidativen Substanzen beteiligt sind, ist noch unklar. Ceruloplasmin, 15-Lipoxygenase, Myeloperoxidase (MPO) und Nitric oxid-Synthase (NO-S) wurden in arteriosklerotischen Läsionen im Tier und Mensch gefunden und könnten zur Oxidierung von LDL beitragen (Carr et al 2000). Ein möglicher Oxidierungsweg involviert die MPO. MPO, ein Häm-Protein Enzym, kann halogenieren und peroxidieren (Carr et al). Das am besten beschriebene Produkt der Myeloperoxidase ist hypochlorige Säure HOCl^-, Cl^- + H₂O₂ + H⁺ → HOCI + H₂O. Hypochlorite modifizierte Proteine, insbesondere HOCI-oxLDL, werden in arteriosklerotischen Läsionen gefunden (Hazell et al 1996).

HOCI-Modifikation von Proteinen spielt auch eine Rolle bei anderen Erkrankungen, wie z. B.
entzündliche Gelenkerkrankungen,
Gerinnungsstörungen (Glaser et al 1992),
Gewebszerstörung durch Granulozyten bei Entzündungsreaktionen allgemein (Schraufstatter et al 1990),
Ischämie, Reperfusionsschaden (Samanta et al 1989),
Glomerulonephritis,
Immunregulation (NK-cell-Apoptose) (Hansson et al 1996 und 1999).

CD36, auch Glykoprotein IIIb (GPIIIb) oder Glykoprotein IV (GP IV) genannt, ist ein Hauptglykoprotein der Plättchen, Endothelzellen, Monozyten, Erythroblasten, Epithelzellen und einiger Tumorzellinien, wie Melanomzellen und Osteosarkomzellen (Asch et al 1987, Knowles et al, 1984, Kieffer et al 1989). Es gehört zur Familie der Klasse B "scavenger" Rezeptoren. Mitglieder der Familie sind das integrale lysosomale Membranprotein LIMP-II (lysosomal integral membrane protein II, Vega et al 1991) das CLA-1 (Cd36 and LIMP-II analogous, Calvo und Vega 1993), das FAT-Protein der Adipozytenmembran (Abumrad et al 1993 und 1999), PAS IV aus Brustepithelzellen (Greenwalt et al 1990 und 1992) und das SR-B1 (Acton et al 1994).

Das FAT-Protein der Adipozyten ist an der Bindung und dem Transport langkettiger Fettsäuren beteiligt. Das PAS IV-Protein ist ein integrales Membranprotein laktierender Brustepithelzellen und wird im apikalen Plasmalemma konzentriert. Mit der Sekretion von Triglyceriden gelangt es in die Milch und wird in der MFGM (milk-fat globule membrane)-Fraktion gefunden. Die Sequenz PAS IV ist fast identisch mit CD36, es liegen aber Unterschiede in der Glykosilierung vor (Catimel et al 1991).

SR-B1 ist ein "scavenger receptor" für LDL (Acton et al 1994). CD36 besteht aus einer einzigen stark glykosilierten Polypeptidkette mit einem aparenten Molekulargewicht von 88000 im reduzierten und nicht reduzierten Zustand und einem isoelektrischen Bereich zwischen 4,4 und 6,3 (McGregor et al 1980, Clemetson 1987). Daß sich kein klar definierter isoelektrischer Punkt bestimmen lässt, liegt am variablen Gehalt an Sialinsäure (McGregor et al 1980 und 1981). Der Kohlenhydratanteil von 26% und eine starke Hydrophobie gibt dem CD36 eine hohe Resistenz gegenüber Abbau durch Proteasen, solange das Protein sich in der Membran befindet (Greenwalt et al 1992). CD36 hat N- und O-glykosidische Bindungen. Die aus plazentarer cDNA für CD36 abgeleitete Aminosäuresequenz (Oquendo et al 1989) zeigt mehrere hydrophobe Bereiche und vermutlich zwei transmembranäre Bereiche.

Einige Funktionen sind für CD36 postuliert worden.

So wurde es als Rezeptor für Kollagen beschrieben (Tandon et al 1989 und 1991). Gereinigtes CD36 bindet an Fibrillen von Kollagen Typ I, und Fab-Fragmente eines polyklonalen Antikörpers gegen CD36 hemmen die Kollagen-induzierte Aggregation.

Analysen von Plättchen, denen das CD36 fehlt, zeigen aber, dass CD36 für die Aktivierung von Plättchen mit Kollagen nicht unbedingt notwendig ist. Unsere gemeinsamen Untersuchungen mit Kollegen der Arbeitsgruppe von J. J. Sixma (Utrecht) zeigten keine Unterschiede in der Adhäsion von CD36-defizienten Plättchen und Kontrollplättchen bovine oder humane Kollagen Typ I oder III im statischen System und unter Einfluß von geringen, mittleren und hohen Scherraten in der Perfusionskammer bei Verwendung von Heparinblut und bei physiologischen Ca²⁺-Konzentrationen (Saelman et al 1994).

CD36-defiziente Plättchen aggregieren normal mit Horm-Kollagen, einem Gemisch aus equinem Typ I und III Kollagen, und mit gereinigtem bovinen und humanen Kollagen Typ I und III (Kehrel et al 1991 und 1993). Die Sekretion der (-Granula und dichten Granula induziert durch Typ I oder III Kollagen unterscheidet sich nicht bei CD36-defizienten Plättchen und Kontrollplättchen (Kehrel et al 1993). Daniel und Mitarbeiter zeigten, daß die Signalübertragung nach Aktivierung mit Kollagen Typ I in CD36-defizienten Plättchen und Kontrollplättchen gleich verläuft (Daniel et al 1994).

CD36 ist ein Rezeptor für Thrombospondin-1 (TSP-1) (Asch et al 1993, McGregor et al 1989). Gereinigtes CD36 bindet spezifisch an Thrombospondin. Diese Bindung ist Ca²⁺-abhängig und kann durch RGD-Peptide nicht gehemmt werden. Der monoklonale Antikörper OKM5, der gegen CD36 gerichtet ist, hemmt die Bindung von Thrombospondin an mit Thrombin aktivierte Plättchen. Leung und Mitarbeiter (1992) beschrieben, daß auf dem CD36 zwei Peptidbereiche die Bindung von Thrombospondin beeinflussen. Peptid 139-155 verstärkt die Plättchenaggregation im Plättchen-reichen Plasma, die durch ADP oder Kollagen induziert wurde. Peptid 93-110 hingegen hemmt die Kollagen-induzierte Aggregation teilweise und blockiert auch die Bindung von CD36 an immobilisiertes Thrombospondin. Dieses Peptid kann das Thrombospondin allein nicht binden, aber in Gegenwart des Peptids 139-155 (Leung et al 1992). Die Sequenz SVTCG des Thrombospondins bindet mit hoher Affinität an CD36 (Li et al 1993). Silverstein et al (1992) belegten durch Experimente mit "sense" und "antisense" transfizierten Melanomzellen die Bedeutung von CD36 für die Tlhrombospondinbindung. Die Bindungsstelle auf CD36 für Tlhrombospondin liegt zwischen Aminosäure 93-120 (Frieda et al 1995). CD36 wird auch als Bindungsvermittler zwischen Plättchen, Endothelzellen, Monozyten oder C32-Melanomzellen einerseits und mit dem Malariaparasiten Plasmodium falciparum befallenen Erythrozyten andererseits, beschrieben (Barnwell et al 1989). Die Bindung infizierter Erythrozyten an Kapillarendothelzellen, Sequestration genannt, ist von entscheidender Bedeutung für den oft tödlichen Ausgang der Malaria tropica, wenn die Sequestration im Gehirn stattfindet (zelebrale Malaria). Infizierte Erythrozyten binden an immobilisiertes, gereinigtes CD36 (Ockenhouse et al 1989a und b). COS-Zellen, in denen die cDNA für CD36 exprimiert wurde, erlangen die Fähigkeit, Malaria-infizierte Erythrozyten zu binden (Oquendo et al 1989). Mit Hilfe von anti-Idiotyp-Antikörpern gegen den monoklonalen anti CD36-Antikörper OKM5 wurde ein Bindungspartner auf infizierten Erythrozyten, das Sequestrin, gefunden. Durch den Kontakt mit infizierten Erythrozyten werden Plättchen und Monozyten aktiviert (Ockenhouse et al 1989). CD36-defiziente Plättchen zeigen in den Händen von Tandon et al (1991) keine Bindungsfähigkeit für infizierte Erythrozyten. Wir beobachteten dagegen, daß die Bindung nur in Gegenwart von EDTA gestört ist. In Gegenwart von Ca²⁺ und Mg²⁺ konnten wir klar Rosetting von Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten und CD36-defizienten Plättchen beobachten. Es sind neben CD36 noch andere Bindungsvermittler für Malaria-infizierte Erythrozyten beschrieben worden, darunter Thrombospondin, welches für diese Funktion zweiwertige Kationen benötigt (Berendt et al 1994, Roberts et al 1985). Thrombospondin könnte die von uns beobachtete Bindung von CD36­ -defizienten Plättchen an infizierte Erythrozyten vermitteln. Die Bindung von Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten an CD36 wird durch die CD36 Peptide 145-171 und 156-184 inhibiert (Baruch et al 1999). Auch eine Rolle des CD36 bei der Signalübertragung wird häufig diskutiert. Bei der Immunpräzipitation von CD36 aus ruhenden Plättchen werden die Tyrosinkinasen der src-Genfamilie pp60^fyn, pp62yes und pp54/58^lyn mitpräzipitiert, was für eine enge Assoziation mit dem CD36 spricht (Huang et al 1991). Die Bedeutung dieser Entdeckung ist noch unklar. Einige Antikörper gegen CD36 aktivieren Plättchen und Monozyten (Aiken et al 1990; Alessio et al 1991; Schuepp et al 1991). Der IgM-Antikörper NLO7 aktiviert Plättchen mit Hilfe des Komplementsystems (Alessio et al 1993). Als weitere Funktion von CD36 wird eine Rolle bei der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura (TTP) beschrieben (Siddiqui et al 1992). Ein Protein (p37), welches im Plasma von TTP-Patienten vorkommt, agglutiniert Plättchen, vermittelt über CD36. Die Bedeutung dieses Befundes ist noch unbekannt. Das Peptid VTCG aus dem Thrombospondin hemmt die Phosphatidylinositol (3.4) biphosphat-Synthese in mit Thrombin aktivierten Plättchen. CD36 ist einer der Thrombospondin-Rezeptoren, welche eine späte Aktivierung der PI-3-Kinase und der Phospholipase C vermitteln.

CD36 ist beteiligt am Transport von langkettigen Fettsäuren in Muskelgewebszellen.

Eine Überexpression von CD36 in Muskelzellen von transgenen Mäusen führte zu verstärkter zellulärer Aufnahme von Fettsäuren, verstärkte die Featsäureoxidation durch kontraktile Muskeln und reduzierte die Konzentration von Triglyceriden und freien Fettsäuren im Plasma. Die Mäuse hatten ein geringeres Körpergewicht, insbesondere geringeres Körperfett, als ihre Kontrollverwandten.

Fehlen von CD36 beim Menschen führt zum Verlust der Aufnahme von langkettigen Fettsäuren, die Hauptenergiequelle für den Herzmuskel, in die Herzmuskelzellen und konsequent zu erhöhtem Auftreten von angeborenen hypertrophen Kardiomyopathien (Nakata et al 1999b; Okamoto et al 1998; Watanabe et al 1998). Auch CD36 defiziente Mäuse zeigen einen defekten Transport von Fettsäuren in die Zellen und einen gestörten Lipoproteinstoffwechsel (Febbraio et al 1999 und 2000; Coburn et al 2000).

CD36 vermittelt die Arachidonsäure vermittelte Plättchenaggregation (Dutta-Roy et al 1996) und bindet an negativ geladene Phospholipide in Zellmembranen (Ryeom et al 1996). Insbesondere Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylinositol (PI) werden von CD36 spezifisch mit hoher Affinität gebunden (Rigotti et al 1995). Da apoptotische Zellen Phosphatidylserin an ihrer Oberfläche exponieren, kann über CD36 ein Kontakt zu phagozytotischen Zellen vermittelt werden (Fadok et al 1998). Phosphatidylserin bindet vermutlich an die CD36-Sequenz 162-183 (Yamaguchi et al 2000). CD36 bindet an Cholesteryl-hemisuccinat und kann über diese Reaktion leicht gereinigt werden (Kronenberg et al 1998).

Die Hauptfunktion von CD36 ist wohl seine Rolle als Rezeptor für oxidiertes LDL. Diese Rolle wurde von Endemann et al 1993 zuerst beschrieben. Transfektionsexperimente mit einem cDNA-Klon, der für CD36 codiert, in der humanen Makrophagen ähnlichen THP-Zelllinie führten zu einer neu erlangten Bindungsfähigkeit der Zelle für Cu²⁺-oxidiertes LDL. Der monoklonale CD36-spezifische Antikörper OKM5 hemmt die Bindung von Cu²⁺-oxLDL an Plättchen um 54%. Die Bündungsstelle für Cu²⁺-oxLDL liegt im Bereich der CD36 Sequenz 155-183 (Puente-Navazo et al 1996). Nicholson et al beschrieben, dass Cu²⁺-oxLDL vermutlich über seinen Lipidanteil an CD36 bindet (Nicholson et al 1995 and 2000). Makrophagen von Blutspendern, denen das CD36 auf den Monozyten fehlt, haben im Vergleich zu Kontrollen eine deutlich reduzierte (-40%) Aufnahme von oxLDL (Nozaki et al 1995).

Vitamin E (alpha-Tocopherol) hemmt die Aufnahme von Cu²⁺-oxLDL in glatte Muskelzellen der Aorta, indem es CD36 inhibiert (Ricciarelli et al 2000). Die Bindung von oxLDL an Maus CD36 wird teilweise durch oxidierte Phospholipide übernommen, die mit Lipid und Proteinanteil assoziiert sind (Boullier et al 2000). Kürzlich wurde festgestellt, daß CD36 nicht nur der Rezeptor für Cu²⁺-oxLDL ist, sondern auch für NO₂-LDL und daß CD36 für die NO₂-LDL mediierte Schaumzellbildung verantwortlich ist (Podrez et al 2000).

Diese Bindung wird durch Lipid-Oxidationsprodukte von 1-Palmitoyl-2-arachidonyl-sn-glycero-3-phosphocholine kompetitiv inhibiert. Die Autoren spekulieren daher, dass die Myeloperoxidase katalysierte Peroxidation von Lipiden dazu dient, Phospholipidhaltige Angriffsziele für die Phagozytose durch CD36-haltige Zellen zu markieren. Im Einklang mit seiner Rolle als Rezeptor für oxLDL wird CD36 auf mit Lipiden beladenen Makrophagen in arteriosklerotischen Plaques gefunden (Nakata et al 1999a) und glatte Muskelzellen können durch Expression von CD36 in vivo zu Schaumzellen werden (Ohya et al 2000).

Fehlen von CD36 scheint ein Schutz gegen Arteriosklerose zu sein. So entwickeln Mäuse, denen das ApoE-Protein fehlt, bei entsprechender Diät arteriosklerotische Plaques. Wird diesen Mäusen zusätzlich das CD36 Gen ausgeknockt, so entwickeln die Mäuse unter gleichen Bedingungen wie ihre CD36 haltigen Kontrollverwandten 76% weniger arteriosklerotische Läsionen im Aortenbaum unter fettreicher Diät und 45% weniger Plaques im Aortensinus bei normaler Diät.

Makrophagen von CD36 und ApoE doppel knock-out Mäusen internalisierten mehr als 60% weniger Kupfer-oxidiertes LDL und NO2-LDL (Febbraio et al 2000).

Eine Blockade der thrombotischen und arteriosklerotischen Funktionen von CD36 bei gleichzeitiger Nichtbeeinflussung der wichtigen CD36 vermittelten Aufnahme von langkettigen Fettsäuren in die Zelle wäre ein wichtiger Schritt vorwärts zur Bekämpfung von Gefäßerkrankungen.

Diese Aufgabe wurde durch die vorliegende Erfindung gelöst.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel, welches mindestens eine Substanz enthält, welche die Reaktion von oxidierten Proteinen mit CD36 hemmt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass Zellfunktionen, die oxLDL über CD36 auslöst, auch von anderen Substanzen ausgelöst werden können. Überraschenderweise handelt es sich bei diesen anderen Substanzen um oxidierte Proteine, die keinen Lipidanteil haben müssen. Im Körper werden Proteine bei der Infektabwehr, bzw. in arteriosklerotischen Plaques, oder bei akuten und chronischen Entzündungen, mit hoher Wahrscheinlichkeit oxidiert.

Im folgenden seien beispielhaft einige Reaktionen aufgeführt, die nicht nur von oxLDL, sondern auch von oxidierten Proteinen über CD36 ausgelöst werden:

• 1. Aktivierung von Thrombozyten → Thrombosen, Herzinfarkt, Schlaganfall
• 2. Schädigung von Endothelzellen → Ischämie, Entzündungsreaktionen, Ödembildung, Störung der Prostacyclin-Freisetzung
• 3. Aktivierung von Leukozyten, z. B.
  • a) Erhöhte Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen
  • b) Förderung der Transmigration von Leukozyten durch Endothel und Epithelien
  • c) "Homing" von Leukozyten in arteriosklerotische Plaques
  • d) "Priming" und Auslösen des oxidativen Burst in Phagozyten
  • e) Tissue Faktor Expression auf Monozyten, insbesondere Verstärkung der durch Lipopolysaccharid (LPS) ausgelösten Reaktion
  → Schäden durch Entzündungsreaktion, Thrombosen, etc.
• 4. Aktivierung von glatten Muskelzellen (SMC's)
  • a) Proliferation von SMC's
  • b) Intimaverdickung in arteriosklerotischen Plaques
  → Reocclusion nach Bypass, Stent, PTCA; Fortschreiten von Arteriosklerose
  • 1. Stimulation der Renin-Freisetzung aus juxta-glomerulären Zellen → Renin-abhängiger Bluthochdruck bei Nierenerkrankungen
  • 2. Bildung von Schaumzellen über Stimulation der Aufnahme von co-inkubiertem LDL durch Makropinozytose → Entwicklung/Verstärkung von Arteriosklerose
  • 3. Apoptose von Gefäßzellen im Zentrum von arteriosklerotischen Läsionen → Nekrose, Plaque-Ruptur
  • 4. Stimulierung der Expression von Matrix-Metalloproteinasen in Endothelzellen → Stimulation der Ruptur von arteriosklerotischen Plaques.

Desweiteren wurde im Rahmen dieser Erfindung festgestellt, dass die durch oxidierte Proteine hervorgerufenen pathologischen Zellfunktionen durch Substanzen, die die Interaktion zwischen CD36 und oxidierten Proteinen hemmen, inhibiert werden können.

Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders wünschenswert, Substanzen aufzufinden, welche möglichst spezifisch die Bindung zwischen CD36 und oxidierten Proteinen hemmen. Bevorzugt sind solche Substanzen monoklonale Antikörper oder Fragmente davon. Besonders bevorzugte monoklonale Antikörper sind anti CD36 Antikörper, welche an Epitope von CD36 binden, welche an der Bindung von oxidierten Proteinen beteiligt sind. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind derartige Antikörper Klon 37, Klon 13 und Klon 7, wie in den beigefügten Beispielen beschrieben. Die Herstellung solcher Antikörper kann nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Herstellungsverfahren durchgeführt werden.

Obwohl monoklonale Antikörper vorteilhaft als solche eingesetzt werden, ist es ebenfalls möglich, Fragmente dieser Anikörper und insbesondere das F(ab)₂, das F(ab) Fragment oder mindestens ein Teil der Antigenerkennungsregion im erfindungsgemäßen Arzneimitel einzusetzen.

Als weitere Möglichkeit, die Bindung von oxidierten Proteinen an CD36 zu hemmen, ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt, Proteine, Peptide oder Peptidmimetika als derartige Hemmsubstanzen einzusetzen. Dabei gibt es in erster Linie zwei Möglichkeiten, die Bindung zwischen CD36 und oxidiertem Protein zu hemmen, einmal dadurch, daß ein Protein, Peptid oder Peptidmimetikum an CD36 bindet und damit die Bindungsstelle für oxidierte Proteine blockiert, oder aber, daß umgekehrt ein Protein, Peptid oder Peptidmimetikum an das oxidierte Protein bindet und dadurch ebenfalls eine Bindung zwischen CD36 und oxidiertem Protein verhindert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man lösliches Thrombospondin-1 zur Hemmung der Bindung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verwendet man ein Peptid aus CD36 oder ein Peptidmimetikum oder -analogon davon, welches an ein oxidiertes Protein bindet. Solche Peptide, Peptidmimetika und -analoga können z. B. dadurch identifiziert werden, daß sie mit den erfindungsgemäßen monoklonalen anti CD36 Antikörpern, welche gemäß der nachstehenden Vorschrift hergestellt wurden, reagieren.

Peptide und Peptidmimetika, welche an CD36 binden, können leicht mit Hilfe des Phage Display Verfahrens identifiziert werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können neben den Substanzen, welche die Bindung zwischen oxidiertem Protein und CD36 hemmen, weiter pharmazeutisch akzeptierbare Hilfs- oder Trägersubstanzen vorhanden sein. Außerdem kann es von Vorteil sein, Substanzen zuzusetzen, welche im weiteren Sinne zur Behandlung oder Prophylaxe von arteriosklerotischen Erkrankungen eingesetzt werden können. Derartige Substanzen, sowie weitere Substanzen, die der pharmazeutischen Wirkung förderlich sein können, sind dem Fachmann bekannt und können von diesem leicht mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel kombiniert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittels bei Krankheiten, welche durch die oben bereits genannten Reaktionen verursacht werden, welche von oxidierten Proteinen über CD36 ausgelöst werden. Bevorzugt genannt seien hier die Prophylaxe von Thrombosen, insbesondere bei entzündlichen Erkrankungen, die Unterstützung einer antithrombotischen Therapie, die Verhinderung einer Transplantatabstoßung oder transplantationsbedingten Arteriosklerose, die Verhinderung eines Bluthochdrucks bei Nierenerkrankung, insbesondere eines Renin-bedingten Bluthochdrucks, die Verhinderung der Entwicklung und des Fortschreitens von arteriosklerotischen (atherosklerotischen) Erkrankungen, die Behandlung von chronischen Entzündungsreaktionen, die Verhinderung einer frühen Gefäß-Reocclusion oder Gefäßrestenose nach Bypass-Operation, Stent, PTCA oder ähnlichem.

Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele und die Figuren näher erläutert.

Die Figuren zeigen dabei:

Abb. 1 Oxidierte Proteine wirken prothrombotisch - Steigerung der Thrombozyten-Adhäsion/Inhibition dieser Reaktion

• 1. Oxidierte Proteine steigern die Plättchenadhäsion an Kollagen Typ I. Die Adhäsion der Thrombozyten wurde nach Santoro et al. 1994 durchgeführt.
  Eine 96-Well-Zellkulturplatte wurde mit Kollagen Typ I (25 µg/ml; 100 µl/well) über Nacht bei 4°C gecoatet und die Platten mit BSA geblockt. Humane Thrombozyten wurden durch Gelfiltration in MEPES-Tyrode-Puffer pH 7.4 mit Zusatz von 2 mM Mg²⁺, 1 mM Mn²⁺, 0.9% Glukose und 0.35% BSA von Plasmaproteinen gereinigt. 100 µl gelfiltrierte Plättchen (300000/µl) wurden mit und ohne oxidierten Proteinen für 1 Stunde bei RT in einer feuchten Kammer in den Wells inkubiert. Nicht adhärierte Thrombozyten wurden gründlich ausgewaschen. Die Anzahl der adhärierten Plättchen wurde durch Lyse der Plättchen mit Triton X-100 und Nachweis des lysosomalen Enzyms Hexosaminidase bestimmt. Zur Kalibrierung des Adhäsions-Assays wurde auf der Mikrotiterplatte eine Eichreihe bekannter ansteigender Plättchenanzahl gegeben und die Extinktion des umgesetzten Substrates P-Nitrophenyl-N-Acetyl-(-D-Glucosaminid im Verhältnis zur Plättchenzahl bestimmt. Oxidiertes Antithrombin III steigerte dosisabhängig die Thrombozytenadhäsion.
• 2. Thrombozyten wurden im oben beschriebenen Adhäsions-Assay eingesetzt und mit 50 µg/ml oxidiertem ATIII aktiviert. Zusatz von löslichem gereinigtem Thrombospondin inhibierte die durch oxidiertes ATIII gesteigerte Thrombozytenadhäsion dosisabhängig.
• 3. Die Inhibition der Thrombozytenadhäsion durch lösliches Thrombospondin-1 wird nicht über dessen Bindungsstelle an CD36 direkt (Peptid VTCG) vermittelt. VTCG zeigt keinen Einfluß auf die Steigerung der Thrombozytenadhäsion durch oxidierte Proteine (hier oxidiertes ATIII).
• 4. Die Inhibition der Thrombozytenadhäsion durch lösliches Thrombospondin-1 scheint über die Heparin-Bindungsstelle von Thrombospondin vermittelt zu sein. Ein Antikörper (Klon A 4.1), welcher gegen die Heparin-Bindungsstelle von Thrombospondin-1 gerichtet ist, steigert die Wirkung von oxidierten Proteinen vermutlich indem er mit endogenem TSP reagiert und dessen inhibitorische Wirkung abblockt. Ohne Zusatz von oxidierten Proteinen (hier oxidiertes ATIII) hat der anti-TSP-1 Antikörper A 4.1 keinen Einfluß auf die Thrombozytenadhäsion. Alle Experimente zum Einfluß von Antikörpern auf Thrombozytenfunktionen wurden in Gegenwart sättigender, komplett blockierender Konzentrationen von Fab-Fragmenten eines Antikörpers gegen den FcRIIA-Rezeptor (Klon IV.3) durchgeführt, um Fc-Rezeptoreffekte auszuschließen.
• 5. Thrombozyten wurden im oben beschriebenen Adhäsionsassay eingesetzt und mit oxidiertem ATIII aktiviert. Monoklonale Antikörper, die die Bindung von oxidierten Proteinen an CD36 hemmen wie a) die Klone 37, 13 und 7, hemmen die Wirkung von oxidiertem ATIII. Alle Experimente zum Einfluß von Antikörpern auf Thrombozytenfunktionen wurden in Gegenwart sättigender, komplett blockierender Konzentrationen von Fab-Fragmenten eines Antikörpers gegen den FcRIIA-Rezeptor (Klon IV.3) durchgeführt, um Fc-Rezeptoreffekte auszuschließen.
• 6. Dieser Effekt ist dosisabhängig.
• 7. Antikörper gegen CD36, die die Bindung von CD36 an oxidierte Proteine nicht inhibieren, wie der Klon FA6/152, rufen dagegen keine signifikante Hemmung hervor. Alle Experimente zum Einfluß von Antikörpern auf Thrombozytenfunktionen wurden in Gegenwart sättigender, komplett blockierender Konzentrationen von Fab-Fragmenten eines Antikörpers gegen den FcRIIA-Rezeptor (Klon IV.3) durchgeführt, um Fc-Rezeptoreffekte auszuschließen.

Abb. 2 Oxidierte Proteine wirken prothrombotisch - Steigerung der Fibrinogenanbindung an Thrombozyten/Inhibition dieser Reaktion

Gelfiltrierten Plättchen (50000/µl) in HEPES-Tyrode-BSA-Puffer wurde FITC konjugiertes Fibrinogen, 0.2 mM Zn²⁺ und 10 µg/ml Thrombospondin zugesetzt. Ein Teil der Proben wurde mit oxidierten Proteinen in aufsteigenden Konzentrationen versetzt. Nach Inkubation für 30 Minuten bei RT wurde die Fibrinogenanbindung im Durchflußzytometer bestimmt.

• 1. Oxidierte Proteine (hier als Beispiel oxidiertes Fibrinogen, oxidiertes Humanalbumin und oxidiertes Antithrombin III) verstärken die Fibrinogenanbindung an Thrombozyten.
• 2. Antikörper, die die Bindung von oxidierten Proteinen an CD36 hemmen, inhibieren dosisabhängig die durch oxidierte Proteine induzierte Fibrinogenanbindung an Thrombozyten oxidiertes Protein: oxidiertes ATIII;
  Antikörper: anti CD36 AK, Klon 37.
• 3. oxidiertes Protein: oxidiertes Fibrinogen
  Antikörper: anti CD36 AK, Klon 37.
• 4. oxidiertes Protein: oxidiertes Humanalbumin
  Antikörper: anti CD36 AK, Klon 37.
  Alle Experimente zum Einfluß von Antikörpern auf Thrombozytenfunktionen wurden in Gegenwart sättigender, komplett blockierender Konzentrationen von Fab-Fragmenten eines Antikörpers gegen den FcRIIA-Rezeptor (Klon IV.3) durchgeführt, um Fc-Rezeptoreffekte auszuschließen.

Abb. 3 Oxidierte Proteine wirken prothrombotisch - Induktion der Thrombozytenaggregation

Oxidierte Proteine induzieren die Thrombozytenaggregation. Die Thrombozytenaggregation wurde nach Born 1962 durchgeführt. Zu gelfiltrierten Plättchen (2000000/µl) in HEPES-Tyrode Puffer pH 7.4 mit 100 µg/ml Fibrinogen wurde in einer Aggregationsküvette TSP-1 (25 µg/ml) pipettiert. Lösliches TSP-1 löste alleine keine Aggregation aus. Gleichzeitige Gabe von oxidierten Proteinen (hier oxidiertes Fibrinogen oder oxidiertes Antithrombin III) führte zu einer starken Aggregatbildung.

Abb. 4 Oxidierte Proteine wirken prothrombotisch - Induktion der Mikropartikelbildung

Oxidierte Proteine vermitteln die Mikropartikelbildung von Thrombozyten. Gelfiltrierte Plättchen (50000/µl) wurden mit oxidierten Proteinen (hier oxidiertes ATIII und oxidiertes Fibrinogen) in steigenden Konzentrationen aktiviert. Nach 30 Minuten Inkubation wurden Plättchen und aus Plättchen entstandene Mikropartikel mit anti GPIX-PE markiert und die Zahl der entstandenen Mikropartikel im Verhältnis zu 5000 gezählten Plättchen im Durchflußzytometer gemessen.

Abb. 5 Oxidierte Proteine aktivieren Leukozyten - Ca²⁺-Signal

Oxidierte Proteine (hier gezeigt oxidiertes Antithrombin III) induzieren in Monozyten ein Ca²⁺-Signal. Die Ca²⁺-Messungen wurden nach Sozzani et al. 1993 durchgeführt. Elutriierte Monozyten (5 × 106/ml) wurden bei RT mit HEPES-Tyrode Puffer pH 7.4 gewaschen und anschließend 15 Minuten mit 1 µM Fura2/AM bei 37°C markiert, zweimal mit HEPES-Tyrode Puffer ohne Ca²⁺ gewaschen und dann in HEPES-Tyrode mit 1 mM Ca²⁺ aufgenommen. Ca²⁺-Signal, induziert durch oxidierte Proteine und als Positiv- oder Negativkontrollen wirksame Substanzen, wurden fluorimetrisch im Hitachi F-2000 bestimmt. Oxidiertes Antithrombin III (100 µg/ml) aktiviert Monozyten und ruft ein deutliches Ca²⁺-Signal hervor.

Abb. 6 Oxidierte Proteine aktivieren Leukozyten - oxidativer Burst

Oxidierte Proteine verstärken dosisabhängig die aktivierende Wirkung von fMLF auf den oxidativen Burst von PMNL und lösen ihn sogar als selbständige, unabhängige Agonisten auch aus. Die induktion des oxidativen Burst wurde im wesentlichen gemäß Anleitung des Herstellers mit dem Phagotest/Burst-Test der Firma Orpegen (Heidelberg) am Durchflußzytometer durchgeführt, jedoch zuerst die PMNL mit dem Substrat DHR123 inkubiert und anschließend die PMNL aktiviert. Oxidiertes Antithrombin III steigerte dabei die aktivierende Wirkung von fLMF und rief selbst eine ox. Burst-Reaktion hervor.

Abb. 7 Oxidierte Proteine aktivieren Leukozyten - Transmigration durch das Endothel/Inhibition dieser Reaktion

• 1. In "Transwell"-Zellkulturkammern (Costar, Bodenheim) wurde je ein mit einer mikroporösen Polycarbonat-Membran bespannter "Transwell"-Einsatz pro einer der 24 Vertiefungen plaziert. Die Polycarbonat-Membran mit einer Porengröße von 5 µm wurde mit Febronectin beschichtet und darauf humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) bis zur Konfluenz kultiviert. Durch Dichtegradientenzenfirifugation isolierte humane Monozyten (200 µl mit 2 × 10⁷ Zellen/ml in DMEM aus dem periphären Blut) wurden bei 37°C, 7­ % CO₂ mit dem HMEC-1 Monolayer inkubiert. Als Maß für die Transmigrationsrate wurde die Anzahl der Monozyten im unteren "Transwell"-Kompartiment unter dem "Transwell"-Einsatz bestimmt. Um den Einfluß von verschiedenen oxidierten Proteinen, von Thrombospondin oder von anti CD36 Antikörpern zu untersuchen, wurden die Testsubstanzen dem Medium in der oberen "Transwell"-Kammer zugesetzt oder die Endothelzellen für 10 Minuten mit den Testsubstanzen vorinkubiert und gewaschen. Nach 4-7 Stunden Transmigrationsdauer wurden die Einsätze vorsichtig entfernt, die Zellkulturplatte für 30 Minuten zur Ablösung der adhärierten Monozyten auf Eis gestellt und die Zahl der transmigrierten Monozyten ausgezählt. Oxidiertes Protein (hier oxidiertes ATIII) förderte die Transmigration von Monozyten durch ein HMEC-1 Monolayer, während das nicht oxidierte Ausgangsprotein diese Reaktion nicht zeigte (Transmigrationsdauer 4 h).
• 2. Durch Vorinkubation des Endothellayers für 10 Minuten mit TSP-1, bzw. Zusatz von TSP-1 zum Kulturmedium während des Transmigrationsversuchs konnte die Transmigration der Monozyten signifikant gehemmt werden (Transmigrationsdauer 7 h).

Abb. 8 Oxidierte Proteine induzieren Prozesse, welche die Arteriosklerose fördern

Oxidiertes Antithrombin III steigerte das "Homing" von Makrophagen in arteriosklerotische Plaques. Die Durchführung des Versuchs wurde in der Beschreibung des Beispiels im Detail beschrieben.

Abb. 9 Thrombospondin hemmt proarteriosklerotische Prozesse

Thrombospondin hemmt die Adhäsion von Makrophagen an arteriosklerotisch veränderte Endothelzellen. Die Versuchsdurchführung ist in der Beschreibung des Beispiels im Detail erläutert.

• 1. Thrombospondin-1 hemmt die transiente, durch Rollen von Makrophagen gekennzeichnete Adhäsion, an arteriosklerotisch verändertes Endothel.
• 2. Thrombospondin hemmt die permanente, stabile Adhäsion von Makrophagen an arteriosklerotisch verändertes Endothel.

Abb. 10 Thrombospondin hemmt Entzündungsprozesse in vivo

Lösliches Thrombospondin-1 inhibiert die Arthus-Reaktion im Ohr von Balb/c Mäusen

• 1. Linke Maus: zweimal zum Zeitpunkt 0 und 0 + 3 Stunden je 50 pg TSP-1 i. p. behandelte Maus - Arthus-Reaktion im linken Ohr Rechte Maus: zweimal zum Zeitpunkt 0 und 0 + 3 Stunden mit dem Kontrollpuffer i. p. behandelte Maus - Arthus-Reaktion im linken Ohr
• 2. In den Ohren eingelagertes BSA-FITC als Maß für die Arthus-Reaktion in mit TSP-1 und Kontrollpuffer behandelten Mäusen - Arthus-Reaktion im linken Ohr.
• 3. Ausschnittsvergrößerungen von Mausohren, welche gemäß der Beschreibung zur Abb. 10a) behandelt wurden.

Beispiele Beispiel Isolierung von humanem Thrombospondin-1

Die Isolierung von humanem Thrombospondin-1 aus Thrombozyten erfolgte wie in Kehrel et al 1991 beschrieben. Abweichend davon wurden die Plättchen aber mit Thrombin aktiviert und EDTA im Waschpuffer durch Na-Citrat (0.08 M) ersetzt. Zusätzlich wurde dem Aggregationspuffer und allen Puffern für die nachfolgenden Reinigungsschritte Ca²⁺ in einer Konzentration von 2 mM zugesetzt.

Beispiel 2 Hybridomkultur zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Die monoklonalen Antikörper gegen CD36 wurden weitgehend nach den Anleitungen von Peters und Baumgartner (1990) durchgeführt.

8-12 Wochen alte Balb/c Mausweibchen wurden mit gereinigtem CD36 (50 µg/Boost) immunisiert. Zur Immunisierung wurde das lange Innmunisierungsschema (4 Monate) nach Baumgartner et al 1990 benutzt. Etwa 14 Tage vor dem geplanten Fusionstermin wurde den Tieren Blut entnommen und der IgM und IgG-Titer gegen CD36 im Serum der Mäuse bestimmt. Unterschied sich der IgG-Titer noch bei einer Verdünnung von 1 : 100.000 deutlich von der Kontrolle, so wurden die Milzzellen mit Ag 8.652 Zellen fusioniert. Die Ag 8.653 Zellen wurden mit 0.13 M 8-Azaguanin im Kulturmedium selektioniert. Lymphozyten aus der Milz wurden präpariert und mit Ag 8.653 fusioniert. Fusionierte Zellen (1.10⁶ Milzzellen/ml) wurden direkt nach der Fusion für 24 Stunden in Selektionsmedium (Kulturmedium mit Zusatz von Hypoxanthin, 27.2 µg/ml) und Azaserin (50 µg/ml) in einer Zellkulturflasche (75 ml) inkubiert. Dabei haften die Makrophagen aus der Milz an die Kunststoffoberfläche und stören nicht mehr die eigentliche Kultur der Hybridome in einer 96-Well-Platte.

Die Klonierungsschritte wurden durch das Verdünnungsverfahren ("limited-dilution-cloning") mit einer Aussaatwahrscheinlichkeit von 0.5 Zellen pro Loch der 96-Well-Platte nach Würzner 1990 vorgenommen. Überstände von Hybridomen wurden im ELISA-Verfahren auf die Produktion von IgG, bzw. IgM getestet. IgG-positive Zellkulturüberstände wurden mit mehreren Verfahren auf ihre Spezifität gegen CD36 getestet: 19 Klone spezifisch für CD36 wurden erhalten, welche nicht mit CD36 defizienten Plättchen (Beschreibung: Kehrel et al 1993, Saelman et al 1994, Kehrel et al 1995) reagierten, aber eine deutliche Anbindung an Kontrollplättchen zeigten. Dieses wurde sowohl mittels Durchflußzytometrie, als auch mit dem Dot-Blot-Verfahren und Immunpräzipitation bewiesen. Alle Antikörper erkannten gereinigtes CD36. Drei dieser Klone (Klon37, 13 und 7) hemmten die Reaktion von oxidierten Proteinen mit humanen Zellen (s. u.).

Beispiel 3 Isolierung von CD36

Die Isolierung von CD36 erfolgte, wie von unserer Arbeitsgruppe beschrieben (Kronenberg et al 1998), über Phasentrennung der Membranproteine mit Triton X-114 und anschließender Affinitätschromatographie an Cholesteryl-Hemisuccinat-Agarose.

Beispiel 4 Beispiele für die Herstellung von oxidierten Proteinen

348 µg Protein (handelsübliches Fibrinogen, Humanalbumin, Rinderserumalbumin (BSA) oder Antithrombin) wurden mit 832 µg NaOCI (Natriumhypochlorit) in 1 ml Phosphat-gepufferte Saline mit EDTA-Zusatz (0.1 mM) für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Protein und Oxidanz wurden sofort nach Reaktionsende durch eine Gelfiltration bei 4°C über Sepharose G25-Coarse (PD-10 Säule, Amersham Pharmacia) getrennt).

Beispiel 5 Beispiele für die Wirkung der Erfindung

• 1. 1.) Oxidierte Proteine aktivieren Thrombozyten. Diese Aktivierung wird durch Substanzen, die die Interaktion von CD36 mit oxidierten Proteinen hemmen, inhibiert
  • a) Oxidierte Proteine (Fibrinogen, Antithrombin III, BSA, Humanalbumin) verstärken dosisabhängig die Adhäsion von Thrombozyten an Adhäsionsproteine, wie Thrombospondin, Vitronectin, Fibrinogen, Fibrin, Fibronectin und Kollagen (siehe Abb. 1a). Diese Adhäsionsverstärkung wird durch lösliches Thrombospondin-1 inhibiert (siehe Abb. 1b). Diese Adhäsionsverstärkung wird durch die monoklonalen anti CD36 Antikörper Klon 37, 13 und 7 inhibiert (siehe Abb. 1c).
  • b) Oxidierte Proteine (Fibrinogen, Antithrombin III, BSA, Humanalbumin) induzieren in Gegenwart von Thrombospondin-1 (10 µg/ml) dosisabhängig die Fibrinogenanbindung an Thrombozyten (siehe Abb. 2). Diese Aktivierung wird durch die monoklonalen Antikörper gegen CD 36, Klon 37,13 und 7, inhibiert (siehe Abb. 2b, c, d)
  • c) Oxidierte Proteine (Fibrinogen, Antithrombin III, BSA, Humanalbumin) lösen in Gegenwart von Thrombospondin-1 (10 µg/ml) die Plättchenaggregation aus (siehe Abb. 3).
  • d) Oxidierte Proteine (Fibrinogen, Antithrombin III, BSA, Humanalbumin) führen zur Mikropartikelbildung (siehe Abb. 4).
• 2. Oxidierte Proteine (z. B. Fibrinogen, Antithrombin III, BSA, Humanalbumin) aktivieren Monozyten. Diese Aktivierung wird durch Substanzen wie z. B. lösliches Thrombospondin oder monoklonale Antikörper gegen CD36, die die Interaktion zwischen CD36 und oxidierten Proteinen hemmen, dosisabhängig gehemmt.
  • a) Oxidierte Proteine (z. B. Fibrinogen, Antithrombin III, BSA, Humanalbumin) induzieren in Monozyten ein Ca²⁺-Signal (siehe Abb. 5).
  • b) Oxidierte Proteine (z. B. Fibrinogen, Antithrombin III, BSA, Humanalbumin) induzieren in PMNL den oxidativen Burst (siehe Abb. 6).
  • c) Oxidierte Proteine (z. B. Fibrinogen, Antithrombin III, BSA, Humanalbumin) induzieren eine erhöhte Transmigration von Monozyten, PMNL und Lymphozyten durch Endothelmonolayer (siehe Abb. 7a). Diese Reaktion wird durch Substanzen, die die Bindung von CD36 an oxidierte Proteine inhibieren, wie lösliches Thrombospondin inhibiert (siehe Abb. 7b).
• 3. Oxidierte Proteine (z. B. Fibrinogen, Antithrombin III, BSA, Humanalbumin) sind ursächlich an der Entstehung von Arteriosklerose beteiligt.
  • a) Oxidierte Proteine (z. B. Fibrinogen, Antithrombin III, BSA, Humanalbumin) induzieren ein "Homing" von Makrophagen in arteriosklerotische Plaques. In Apo-E knock-out Mäusen (Palinski et al 1994) wurde durch intraperitoneale Injektion von Thioglycolat die Wanderung von Makrophagen ins Peritoneum angeregt. Nach 4 Tagen wurde das Peritoneum gewaschen und aktivierte Peritonealmakrophagen gewonnen. In den Proben wurden die Erythrozyten lysiert. Makrophagen wurden in RPMI 1640-Medium aufgenommen und in Zellkulturplatten überführt, um ihnen die Adhäsion zu ermöglichen. Fluoreszenz markierte Mikrosphären (2 µm yellow-green fluorescent latex microspheres, Molecular Probes) wurden zur besseren Aufnahme durch die Phagozyten für 30 Minuten mit 50% Mausserum opsonisiert und dann zu den platierten Makrophagen gegeben. Die adhärenten Makrophagen phagozytierten die Mikrosphären. Nicht adhärierte Zellen und Mikrosphären wurden durch Waschen der Platte entfernt. Markierte Makrophagen wurden auf Eis von der Platte abgelöst und in "Hanks balanced salt solution" resuspendiert. 50 Wochen alten ApoE-defiziente Mäuse wurde je 3 mal je 50 µg oxidiertes Protein, bzw. Placebo (nur HBSS), hier oxidiertes Antithrombin III, intraperitoneal injiziert; 6 Stunden vor intravenöser Injektion von markierten Makrophagen, 2 Stunden nach Makrophageninjektion und 10 Stunden nach Makrophageninjektion. Es wurden 10 × 10⁶ Makrophagen in 0.2 bis 0.3 ml HBSS suspendiert und in die Schwanzvene gespritzt. 24 Stunden nach Makrophageninjektion wurden die Tiere getötet. Die Herzbasis und die aufsteigende Aorta wurde in OCT eingebettet, bei 80°C gelagert und 7 pm dicke Kryoschnitte angefertigt. Die fluoreszenzmarkierten Makrophagen von 140 Serienschnitten per Maus, aus einem Bereich 1 mm proximal der Aortenklappe, wurden gezählt. Im Vergleich zu den Placebo behandelten ApoE-/- Kontrollmäusen stieg die Wanderung von markierten Makrophagen in die arteriosklerotischen Plaques in mit oxidiertem Antithrombin III behandelten Mäusen von 100 (15% (n = 14) auf 156 (9.2% (n = 5) signifikant (p = 0.008)("alternate welch test") an. Da diese Einwanderung mit der Entstehung, dem Fortschreiten und der Rupturgefahr des arteriosklerotischen Plaques ursächlich verbunden ist, verdeutlicht dieses Ergebnis die Gefährlichkeit von oxidierten Proteinen in Hinblick auf die Arteriosklerose (Abb. 8).
  • b) Substanzen, die die Interaktion zwischen CD36 und oxidierten Proteinen hemmen, verhindern/reduzieren die pro-arteriosklerotische Wirkung von oxidierten Proteinen. Lösliches Thrombospondin hemmt die Adhäsion von Makrophagen an arteriosklerotisch veränderte Endothelzellen. Dies ist die Voraussetzung für das Einwandern von Makrophagen in arteriosklerotische Plaques. Murine immortalisierte Endothelzellen wurden mit β-VDL (50 µg Protein/ml) von ApoE-defizienten Mäusen für 6 Stunden stimuliert und dann mit 2 × 10⁵ peritonealen Makrophagen pro ml bei einer Scherraten von 400 s^-1 in einer Durchflusskammer superfundiert. β-VDL induzierte einen signifikanten relativen Anstieg der rollenden Leukozyten um 224 ±44% im Vergleich zur Kontrolle. Zusatz von 10 µg/ml lösliches Thrombospondin hemmte diesen Adhäsionszuwachs komplett und inhibierte zusätzlich teilweise die Grundadhäsion der Makrophagen an das Endothel (75 ±37% Adhäsion im Vergleich zur Kontrolle, n = 4-7; p < 0.01) (siehe Abb. 9a). Die durch das β-VDL deutlich induzierte permanente Adhäsion der Makrophagen nach einer 5-minütigen Waschperiode wurde durch Thrombospondin-1 ebenfalls reduziert (100 ± 21% Kontrolle vs 300 ±119% β-VDL vs 157 ±70% β-VDL + TSP-1; n = 4-7; p < 0.01) (Abb. 9b).
• 4. Lösliches Thrombospondin-1 inhibiert Entzündungsreaktionen in vivo. Im Ohr von Balb/c-Mäusen wurde durch lokale Injektion von anti-BSA zum Zeitpunkt 0 und gleichzeitiger Injektion von FITC gekoppeltem BSA ins Peritoneum eine Arthus-Reaktion ausgelöst. Kontrolltieren (Negativkontrollen) wurde nur FITC (ohne BSA) ins Peritoneum injiziert. Nach ca. 6 Stunden zeigte sich eine deutlich ausgeprägte Entzündungsreaktion mit Anschwellung des Ohrs (Oedem), FITC-Einlagerung, Einwanderung von PMNL und petechialen Einblutungen ins Gewebe bei den mit anti-BSA und BSA-FiTC behandelten Tieren. 18 Mäuse wurden zusätzlich zum Zeitpunkt 0 und nach 0 + 3 Stunden je 50 µg Thrombospondin-1 in Puffer (PBS) intraperitoneal injiziert. 16 Kontrollmäuse erhielten zum Zeitpunkt 0 + 3 Stunden nur PBS. Die Arthus-Reaktion wurde durch Thrombospondin fast vollständig verhindert. Mit Thrombospondin behandelte Mäuse zeigten signifikant geringere FITC-Einlagerungen, signifikant geringere Ohrdicken (weniger Oedeme) und fast keine Petechien im Vergleich zu PBS behandelten Kontrolltieren (siehe Abb. 10a-c).

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Claims (18)

1. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Substanz enthält, welche die Reaktion von oxidierten Proteinen über CD36 hemmt.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das die Substanz ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.

3. Arzneimittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment F(ab)2, F(ab) oder mindestens ein Teil der Antigenerkennungsregion ist.

4. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Protein, Peptid oder Peptidmimetikum ist.

5. Arzneimittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz an CD36 bindet und so die Interaktion mit oxidierten Proteinen hemmt.

6. Arzneimittel nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz lösliches Thrombospondin ist.

7. Arzneimittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Peptid aus CD36 oder ein Peptidmimetikum oder analogon ist und an oxidierte Proteine bindet und so die Interaktion mit CD36 hemmt.

8. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es weitere pharmazeutisch akzeptable Träger oder/und Hilfsstoffe enthält.

9. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es weitere Substanzen enthält, welche zur Behandlung arteriosklerotischer oder thrombotischer Krankheiten eingesetzt werden.

10. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1-9 zur Prophylaxe von Thrombosen, insbesondere bei entzündlichen Erkrankungen.

11. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1-9 zur Unterstützung einer antithrombotischen Therapie.

12. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1-9 zur Verhinderung einer Transplantatabstoßung und einer transplantationsbedingten Arteriosklerose.

13. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1-9 zur Verhinderung eines Bluthochdrucks bei Nierenerkrankungen, insbesondere eines Renin-bedingten Bluthochdrucks.

14. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1-9 zur Verhinderung der Entwicklung und des Fortschreitens von arteriosklerotischen Erkrankungen.

15. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1-9 zur Behandlung von chronischen Entzündungsreaktionen.

16. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1-9 zur Verhinderung einer frühen Gefäß-Reocclusion nach Bypass-Operationen, Stent, PTCA oder dergleichen.

17. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1-9 zur Verhinderung einer Gefäß-Restenose nach Bypass-Operationen, Stent, PTCA oder ähnlichem.

18. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1-9 oder einer Substanz, welche die Oxidierung von Proteinen hemmt, als Zusatz zu Thrombozytenkonzentraten oder Thrombozyten enthaltenden Blutprodukten zur Verbesserung der Thrombozytenqualität und -lagerungsfähigkeit.