DE60004015T2

DE60004015T2 - Inhibitoren für homöostase und immunfunktion

Info

Publication number: DE60004015T2
Application number: DE60004015T
Authority: DE
Inventors: O. Paul SHEPPARD; W. Gerald LASSER; D. Paul BISHOP
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-02-19
Filing date: 2000-02-17
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2020-02-18
Also published as: CN1341027A; WO2000048625A2; BR0008298A; CA2361273A1; NO20014012D0; JP2002537270A; HUP0105284A2; ES2202061T3; DE60004015D1; WO2000048625A3; HK1039892A1; IL144460A0; AU772103B2; NO20014012L; AU2883200A; DK1154785T3; CZ20012916A3; PL349924A1; KR20010102130A; EP1382345A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Verletzung der Blutgefäße setzt eine Anzahl an Ereignissen in Bewegung, um den Schaden zu reparieren und die Freisetzung von Blut aus dem Gefäß zu kontrollieren. Dieser Vorgang ist bekannt als Hämostase. Blutplättchen spielen eine frühe Rolle bei der Hämostase, indem ein Blutgerinnsel oder ein Pfropfen gebildet wird, um die Gefäßschädigung vorübergehend zu reparieren. Blutplättchen gehen normalerweise keine Wechselwirkung mit dem Endothelium ein, das die Gefäßwände auskleidet, aber Verletzung der Blutgefäße durch Unfall oder während chirurgischer Eingriffe kann die Endothelzellen stören. In Abhängigkeit von dem Ausmaß der Verletzung werden unterschiedliche subendotheliale Elemente, wie z. B. Kollagene, elastische Lamina oder glatte Muskelzellen mit begleitenden fibrillären Kollagenen dem fließenden Blut ausgesetzt.
Wenn das Subendothelium nach einer Gefäßverletzung freigelegt wird, gehen Blutplättchen, die sich in dem örtlichen Blutfluss bewegen, Wechselwirkungen mit freigesetzter Subendotheliummatrix ein, die Kollagen enthält, und werden abgebremst. Die weitere Wechselwirkung zwischen Rezeptoren auf der Oberfläche der Blutplättchen und der freigelegten Kollagenschicht führt zur Plättchenbindung und -aktivierung, was zum Anhalten des lokalen Blutflusses führt. Die gebundenen Blutplättchen werden aktiviert und bilden Aggregate mit Blutplättchen in dem vorbeifließenden Blutfluss durch die Bildung von Fibrinogenbrücken zwischen den Plättchen (Moroi und Jung, Frontiers in Bioscience 3: 719-28, 1998; Barnes et al., Atherosclerosis XI, Jacotot et al., Hrsg., Elsevier Science, S. 299–306, 1998 und Barnes et al., Curr. Opin. Hematol. 5: 314–20, 1998)
Die hämostatische Antwort ist abgestuft und abhängig von dem Ausmaß der Verletzung der Blutgefäße, der spezifischen Blutgefäßbestandteile, die freigelegt werden und den Blutflussbedingungen in dem verletzten Gebiet (Rand et al., Thrombosis und Haemostasis 78: 445–50, 1997). Durch Freilegen der Subendotheliummatrix (Typ VI-Kollagen und von-Willebrand-Faktor), wie z. B. während leichter Gefäßverletzung, werden ein geringes Maß der Haftung und Aggregation in Gebieten mit Bedingungen eines geringen Blutflusses gefördert. Verletzungen, die in einem größerem Ausmaß der Gefäßverletzung und dem Freisetzen zusätzlicher Gefäßbestandteile resultieren, wie z. B. der inneren elastischen Lamina und elastinassoziierter Mikrofibrillen, werden die Bildung von stärkeren Plättchenaggregaten stimulieren. Starke Gefäßverletzung, wodurch fibrilläre Kollagene freigesetzt werden, ruft eine thrombotische Plättchenantwort hervor, die das Opfer vor übermäßigem Blutverlust bewahrt (Rand et al., ebenda).
Hämostaseinhibitoren würden nützlich sein für die Steigerung des Blutflusses nach Gefäßverletzung und, um Kollagenoberflächen zu beruhigen.
Der Komplementfaktor C1q besteht aus sechs Kopien dreier verwandter Polypeptide (A-, B- und C-Ketten), wobei jedes Polypeptid ungefähr 225 Aminosäuren lang ist, mit einer Kollagendomäne in der Nähe des Aminoterminus und einem carboxyterminalen globulären Bereich. Sechs Tripelhelixbereiche werden durch die Kollagendomänen der sechs A-, sechs B- und sechs C-Ketten gebildet, wodurch ein Zentralbereich und sechs Stiele gebildet werden. Ein globulärer Kopfteil wird gebildet durch das Verknüpfen der globulären carboxyterminalen Domäne einer A-, einer B- und einer C-Kette. C1q ist deswegen aus sechs globulären Köpfen zusammengesetzt, die über sechs kollagenähnliche Stiele mit einem zentralen fibrillären Bereich gekoppelt sind. Sellar et al., Biochem. J. 274: 481–90, 1991. Auf diese Anordnung wird oftmals Bezug genommen als Blumenstrauß. Acrp30 hat eine ähnliche Bukettstruktur, die aus einem einzigen Polypeptidkettentyp gebildet wird.
Von C1q wurde herausgefunden, dass es Abwehrmechanismen ebenso stimuliert, wie es die Bildung toxischer Sauerstoffarten auslöst, die eine Gewebeschädigung bewirken können (Tenner, Behring Inst. Mitt. 93: 241–53, 1993). C1q-Bindestellen werden auf Blutplättchen gefunden. Zusätzlich spielen Komplement und C1q eine Rolle bei Entzündungen. Die Komplementaktivierung wird durch das Binden von C1q an Immunoglobulinen in Gang gebracht.
Inhibitoren von C1q und des Komplementweges würden nützlich sein bei antiinflammatorischen Anwendungen, der Inhibition der, Komplementaktivierung und der thrombotischen Wirkung.
Die vorliegende Erfindung stellt solche Polypeptide für diese und andere Zwecke, die offensichtlich sein sollten für Fachleute, aus den hierin offenbarten Lehren bereit.
In einem Aspekt der Erfindung wird eine Verwendung eines komplementverwandten Proteins aus Adipozyten, das die thrombogene und Komplementaktivität in dem Gefäßsystem reduziert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Förderung des Blutstroms im Gefäßsystem eines Säugers bereitgestellt. In einem Ausführungsbeispiel umfasst das komplementverwandte Protein aus Adipozyten ein Polypeptid, das eine Sequenz von Aminosäureresten umfasst, die wenigstens zu 75% identisch ist zu der Aminosäuresequenz der Reste 26–281 von SEQ ID NO: 2, worin diese Sequenz umfasst: Gly-Xaa-Xaa- oder Gly-Xaa-Pro-Repeats, die eine Kollagendomäne bilden, worin Xaa irgend eine Aminosäure ist, und einen carboxyterminalen globulären Anteil. In einem verwandten Ausführungsbeispiel umfasst das Polypeptid eine Sequenz von Aminosäureresten, die zu wenigstens 90% identisch ist mit der Aminosäuresequenz der Reste 22–281 von SEQ ID NO: 2. In einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst das Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die zu wenigstens 90% identisch ist mit der Aminosäuresequenz der Reste 26–281 von SEQ ID NO: 2. In noch einem anderen Ausführungsbeispiel beruhen alle Unterschiede zwischen diesem Polypeptid und SEQ ID NO: 2 auf konservativen Aminosäuresubstitutionen. In einem anderen Ausführungsbeispiel besteht die Kollagendomäne aus 13 Gly-Xaa-Xaa-Repeats und 1 Gly-Xaa-Pro-Repeat. In noch einem anderen Ausführungsbeispiel besteht die globuläre Domäne aus zehn β-Faltblättern. In einem verwandten Ausführungsbeispiel sind die β-Faltblätter verbunden mit Aminosäureresten, die den Resten 147–151, 170–172, 178–181, 191-203, 207–214, 219–225, 227–239, 244–250 und 269–274 der SEQ ID NO: 2 entsprechen. In noch einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst das Polypeptid die Reste 1–281 von SEQ ID NO: 2 oder Reste 1–281 von SEQ ID NO: 44.
Die Erfindung stellt auch das Polypeptid bereit, das mit einem zweiten Polypeptid komplexiert ist, um ein Oligomer zu bilden. In einem Ausführungsbeispiel sind die Polypeptide komplexiert durch intermolekulare Disulfidbindungen. In einem anderen Ausführungsbeispiel ist das Oligomer ein Trimer. In noch einem anderen Ausführungsbeispiel ist das Oligomer ein Hexamer. In noch einem anderen Ausführungsbeispiel ist das Multimer ein 18mer.
In einem anderen Auführungsbeispiel kann das Polypeptid verwendet werden, um die thrombogene und Komplementaktivität durch Inhibition des Komplementweges und durch Inhibition kollagenvermittelter Plättchenhaftung, -aktivierung oder -aggregation zu reduzieren. In einem anderen Ausführungsbeispiel ist das Polypeptid vor, während oder nach einer akuten Gefäßverletzung in diesem Säuger zu verabreichen. In noch einem anderen Ausführungsbeispiel beruht die Verletzung auf einer Gefäßrekonstruktion. In einem verwandten Ausführungsbeispiel umfasst die Gefäßrekonstruktion Angioplastik, Transplantation eines Koronararterien-Bypasses, Endarteriektomie, mikrovaskuläre Reparatur oder Anastomose eines Gefäßtransplantates. In einem anderen verwandten Ausführungsbeispiel beruht die Verletzung auf Trauma, Schlaganfall oder Aneurysma.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines komplementverwandten Proteins aus Adipozyten, wobei dieses Protein beschädigtes Kollagengewebe inert macht für Komplementaktivierung, thrombotische Aktivität oder Immunaktivierung, für die Herstellung eines Medikamentes zur Beruhigung geschädigter Kollagengewebe in einem Säuger bereitgestellt.
In einem Ausführungsbeispiel beruhen die geschädigten Kollagengewebe auf Verletzung im Zusammenhang mit Ischämie und Reperfusion. In einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst die Verletzung traumatische Verletzungsischämie, Intestinalstrangulation oder Verletzung im Zusammenhang mit der Prä- und Postetablierung des Blutflusses. In noch einem anderen Ausführungsbeispiel wird das Polypeptid einem Menschen verabreicht, der an kardiopulmonaler Bypassischämie und Rezidiv (recesitation), Myokardinfarkt oder posttraumatischem Vasospasmus leidet. In einem verwandten Ausführungsbeispiel umfasst der posttraumatische Vasospasmus Schlaganfall, perkutane transluminale Angioplastik, Endarteriektomie, Gefäßverletzung durch Unfall oder chirurgisch induzierte Gefäßverletzung.
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines komplementverwandten Proteins aus Adipozyten für die Herstellung eines Medikamentes zur Beruhigung der Oberfläche von prothetischem Biomaterial zur Verwendung im Zusammenhang mit einem Säuger bereit, wobei dieses Protein die Oberfläche eines prothetischen Biomaterials inert macht, für Komplementaktivierung, thrombotische Aktivität oder Immunaktivierung.
In einem Ausführungsbeispiel ist die Oberfläche dieses prothetischen Biomaterials mit Kollagen oder Kollagenfragmenten, Gelatine, Fibrin oder Fibronektin überzogen.
In noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines komplementverwandten Proteins aus Adipozyten, wobei dieses Protein das Fortschreiten der Wundheilung verstärkt, für die Herstellung eines Medikamentes zur Vermittlung der Wundheilung in einem Säuger bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 erläutert die Anordnung mehrerer Sequenzen eines zsig37-Polypeptids der vorliegenden Erfindung und von HUMUPST2_1 (Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 221(2): 286–9, 1996); C1QA_HUMAN (Seilar et al., Biochem. J. 274: 481–90, 1991, Reid, Biochem. J. 179: 367–71, 1979, und Reid et al., Biochem. J. 203: 559–69, 1982); HP25_TAMAS (Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1516–21, 1993 und Kondo & Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473–8, 1992); HP27_TAMAS (Takamatsu et al. und Kondo & Kondo oben zitiert); und CERL_RAT (Wada & Ohtani, Brain Res. Mol. Brain Res. 9: 71–7, 1991).
2 ist eine Matrix, die die Aminosäureidentität im Vergleich zu sechs Proteinen, die in der Anordnung der Sequenzen von 1 gezeigt sind, in Prozent zeigt.
3a zeigt die zsig37-FITC-Bindung an Typ VI-Kollagen.
3b zeigt die Verdrängung von unmarkiertem zsig37 mit FITC-markiertem zsig37, gebunden an Typ VI-Kollagen.
4 zeigt das Binden von Komplement-Clq-FITC an zsig37.
5 zeigt die Hemmung der menschlichen Komplementaktivität durch zsig37.
6 zeigt die Aggregation von Blutplättchen durch Kollagen in Anwesenheit von zsig37 in Prozent.
7 zeigt die Proliferation von SKS-Fibroblasten in Anwesenheit von zsig37.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bevor angefangen wird die Erfindung im Detail zu beschreiben, kann es für deren Verständnis hilfreich sein, die folgenden Begriffe zu definieren.
Der Begriff „Affinitätsmarkierung" wird hierin verwendet, um einen Peptidabschnitt zu bezeichnen, der an ein Polypeptid angehängt werden kann, um für die Aufreinigung oder den Nachweis des Polypeptids zu sorgen, oder um Stellen für das Anheften des Peptids an ein Substrat bereitzustellen. Grundsätzlich kann jedes Peptid oder Protein, für das ein Antikörper oder ein anders spezifisches Bindungsmittel erhältlich ist, als ein Affinitätsmarkierung verwendet werden. Affinitätsmarkierungen schließen ein: Polyhistidinsystem, Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), Glutathion-S-Transferase (Smith und Johnson, Gene 67: 31, 1988), Substanz P, F1ag^TM-Peptid (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204–10, 1988; erhältlich von Eastman Kodak Co., New Haven, Connecticut, USA), Streptavidinbindungspeptid oder ein anderes antigenes Epitop oder Bindungsdomäne. Siehe allgemein Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. DNS, die Affinitätsanhänge kodieren, sind erhältlich von gewerblichen Lieferanten (z. B. Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA).
Der Begriff „Komplemente eines Polynukleotidmoleküls" bezeichnet ein Polynukleotidmolekül mit einer komplementären Basensequenz und umgekehrten Orientierung im Vergleich zu einer Bezugssequenz. Zum Beispiel ist die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3'.
Der Begriff „degenerierte Nukleotidsequenz" bezeichnet eine Sequenz an Nukleotiden, die eine oder mehrere degenerierte Codons einschließt (im Vergleich zu einem Bezugspolynukleotidmolekül, das ein Polypeptid kodiert). Degenerierte Codons enthalten unterschiedliche Triplets an Nukleotiden, aber kodieren denselben Aminosäurerest (d. h. GAU- und GAC-Triplets kodieren jeweils Asp).
Der Begriff „isoliert", wenn er auf ein Polynukleotid angewendet wird, gibt an, dass das Polynukleotid aus seiner natürlichen genetischen Umgebung entfernt worden ist und folglich frei ist von anderen äußeren oder ungewollten kodierenden Sequenzen, und dass es in einer Form ist, die geeignet ist zur Verwendung in genetisch modifizierten Proteinherstellungssystemen. Solche isolierten Moleküle sind folglich jene, die von ihrer natürlichen Umgebung getrennt werden und schließen cDNS und genomische Klone ein. Isolierte DNS-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit denen sie gewöhnlich verbunden sind, können aber natürlich vorkommende 5'- und 3'-untranslatierte Regionen, wie z. B. Promotoren und Terminatoren, einschließen. Die Identifizierung verbundener Bereiche wird offensichtlich sein für Durchschnittsfachleute (wie z. B. Dynan und Tijan, Nature 316: 774–78, 1985).
Ein „isoliertes" Polypeptid oder Protein ist ein Polypeptid oder Protein, das in einem Zustand gefunden wird, der von seiner natürlichen Umgebung abweicht, wie z. B. entfernt von Blut und tierischem Gewebe. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, insbesondere von anderen Polypeptiden tierischen Ursprungs. Es ist bevorzugt, die Polypeptide in einer hochgereinigten Form bereitzustellen, d. h. zu mehr als 95% rein, noch bevorzugter reiner als 99%. Wenn er in diesem Zusammenhang verwendet wird, schließt der Begriff „isoliert" die Anwesenheit desselben Polypeptids in alternativen physikalischen Formen, wie z. B. als Dimere oder alternativ glykosylierte oder derivatisierte Formen, nicht aus.
Der Begriff „ortholog" bezeichnet ein Polypeptid oder Protein, das aus einer Art gewonnen wird, die der funktionelle Gegenspieler eines Polypeptids oder Proteins einer anderen Art ist. Sequenzunterschiede unter Ortholgen sind das Ergebnis der Artenbildung.
Der Begriff „Polynukleotid" bezeichnet ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer von Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen, die von dem 5'- zu dem 3'-Ende gelesen werden. Polynukleotide schließen RNS und DNS ein und können aus natürlichen Quellen isoliert werden, in vitro synthetisiert werden oder aus einer Kombination natürlicher und synthetischer Moleküle zubereitet werden. Die Größen von Polynukleotiden werden in Basenpaare (abgekürzt „bp"), Nukleotide („nt") oder Kilobasen („kb") ausgedrückt. Wo es der Zusammenhang erlaubt, können die letzten beiden Begriffe Polynukleotide beschreiben, die einzelsträngig oder doppelsträngig sind. Wenn der Begriff angewendet wird auf doppelsträngige Moleküle, wird er verwendet, um die Gesamtlänge zu bezeichnen und er wird als äquivalent zu dem Begriff „Basenpaare" verstanden werden. Es wird von Fachleuten bemerkt werden, dass die beiden Stränge eines doppelsträngigen Polynukleotids in der Länge leicht voneinander abweichen können, und dass deren Enden als ein Ergebnis enzymatischer Spaltung versetzt sein können; folglich mögen nicht alle Nukleotide in einem doppelsträngigen Polynukleotidmolekül gepaart sein. Solche ungepaarten Enden überschreiten im Allgemeinen nicht 20 nt in der Länge.
Ein „Polypeptid" ist ein Polymer von Aminosäureresten, die durch Peptidbindungen verbunden sind, ob natürlich oder synthetisch hergestellt. Auf Polypeptide mit weniger als ungefähr 10 Aminosäureresten wird gewöhnlich Bezug genommen als „Peptide".
„Sonden und/oder Primer", wie hierin verwendet, können RNS oder DNS sein. DNS kann sowohl cDNS als auch genomische DNS sein. Polynukleotidsonden und primer sind einzel- oder doppelsträngige DNS oder RNS und im Allgemeinen synthetische Oligonukleotide, aber sie können erzeugt werden aus klonierter cDNS oder genomischen Sequenzen oder deren Komplemente. Analytische Sonden werden im Allgemeinen wenigstens 20 Nukleotide lang sein, obwohl etwas kürzere Sonden (14–17 Nukleotide) verwendet werden können. PCR-Primer sind wenigstens 5 Nukleotide lang, vorzugsweise 15 oder mehr nt, noch bevorzugter 20–30 nt. Kurze Polynukleotide können verwendet werden, wenn ein kleiner Bereich des Gens für die Analyse zum. Ziel genommen wird. Für die Grobanalyse von Genen kann eine Polynukleotidsonde ein gesamtes Exon oder mehr umfassen. Sonden können markiert werden, um ein detektierbares Signal bereitzustellen, z. B. mit einem Enzym, Biotin, einem Radionuklid, Fluorophor, Chemilumineszenzerzeuger, mit paramagnetischen Teilchen und Ähnlichen, die im Handel erhältlich sind von vielen Quellen, wie z. B. Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA, und Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA, unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik wohlbekannt sind.
Molekulargewichte und Längen von Polymeren, die durch unpräzise analytische Verfahren (z. B. Gelelektrophorese) bestimmt sind, werden verstanden werden als ungefähre Werte. Wenn solch ein Wert ausgedrückt wird mit „ungefähr" X oder „annähernd" X, so wird verstanden werden, dass der festgestellte Wert von X genau ±10% ist.
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, dass ein neues komplementverwandtes Adipozytenproteinhomolog die kollagenvermittelte Plättchenaktivierung und den Komplementweg einschließlich C1q inhibiert. Dieses Protein wurde als zsig37 bezeichnet und ist vollständig beschrieben in der allgemein angeführten, veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 99/04000.
Die zsig37-Nukleotidsequenz, (SEQ ID NO: 1) kodiert ein Polypeptid (SEQ ID NO: 2) mit einer aminoterminalen Signalsequenz, einem benachbarten N-terminalen Bereich der Nichthomologie, einer gekürzten Kollagendomäne, bestehend aus Gly-Xaa-Xaa- oder Gly-Xaa-Pro-Repeats und einem carboxyterminalen globulären Anteil. Die neue Polynukleotidsequenz enthält auch einen langen 3' -untranslatierten Bereich. Die allgemeine, oben angeführte Polypeptidstruktur wird geteilt von Acrp30 und HUMUPST2_1, mit der Ausnahme, dass die kollagenähnliche Domäne jedes dieser Proteine länger ist als die von zsig37-Polypeptiden. Auch ist die HUMUPST2_1-DNS-Sequenz charakterisiert durch einen langen 3'-untranslatierten Bereich. Weiterhin teilen Acrp30 und alle in 1 angeordneten Sequenzen, mit Ausnahme von CERL_RAT, einen konservierten Cysteinrest an Position 187 des zsig37-Polypeptids, wie in 1 und SEQ ID NO: 2 zeigt. Auch schließen die zsig37-Polypeptide der vorliegenden Erfindung eine mutmaßliche N-gekoppelte Glykosylierungsstelle bei der Aminosäure 93 (Asn) von SEQ ID NO: 2 ein.
Die Analyse der Gewebeverteilung der mRNS, die zsig37 entspricht, zeigte, dass die Expression am höchsten war in Herz und Plazenta, mit vergleichsweise weniger starken Signalen in Niere, Eierstock, Nebenniere und Skelettmuskel, und mit geringeren Signalen in einer weiten Reihe anderer Gewebe, die in dem Northern-Blot vorhanden waren.
Eine homologe Beziehung mit dem komplementverwandten Protein aus Adipozyten Acrp30 (SEQ ID NO: 3) und dem von Adipozyten sezernierten Protein apM1 (HUMUPST2_1 in 1 und 2) wurde für zsig37 etabliert. Eine etwas weiter entfernte Homologie wurde auch identifiziert für den Komplementbestandteil C1 Q-A-Kette, zwei Faktoren, die im aktiven Zustand Winterschlaf haltender Sibirischer Waldmurmeltiere (HP25 TAMAS und HP27 TAMAS) beobachtet wurden, und in einem Rattenhirnprotein (CERL_RAT), wie in den 1 und 2 gezeigt.
Die Nukleotidsequenz von zsig37 wird beschrieben in SEQ ID NO: 1 und seine abgeleitete Aminosäuresequenz ist beschrieben in SEQ ID NO: 2. Eine degenerierte Nukleotidsequenz, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 kodiert, ist in SEQ ID NO: 23 bereitgestellt. Wie oben allgemein beschrieben schließt das zsig37-Polypeptid eine Signalsequenz, die sich von Aminosäure 1 (Met) zum Aminosäurerest 21 (Gly) erstreckt, ein. Eine alternative Signalsequenz erstreckt sich von der Aminosäure 1 (Met) bis zur Aminosäure 25 (Ser). Das reife Polypeptid reicht demzufolge von der Aminosäure 22 (Leu) oder 26 (Arg) bis zur Aminosäure 281 (Pro). In dem reifen Polypeptid wird ein N-terminaler Bereich unbekannter Homologie gefunden, der sich zwischen den Aminosäureresten 22 (Leu) und 98 (Lys) erstreckt. Zusätzlich wird eine gekürzte Kollagendomäne zwischen den Aminosäuren 99 (Gly) und 140 (Arg) gefunden. In der gekürzten Kollagendomäne werden ein vollständiges Gly-Xaa-Pro- und 13 unvollständige Gly-Xaa-Xaa-Repeats beobachtet. Im Gegensatz dazu enthält Acrp30 22 vollständige oder unvollständige Repeats. Das zsig37-Polypeptid schließt auch eine carboxyterminale globuläre Domäne ein, die sich von ungefähr den Aminosäuren 141 (Cys) bis 281 (Pro) erstreckt. Zsig37-Polypeptid, HUMUPST2_1 und Acrp30 scheinen homolog innerhalb der Kollagendomäne zu sein und in der globulären Domäne, aber nicht in dem N-terminalen Anteil des reifen Polypeptids.
Von der globulären Clq-Domäne von Acrp30 wurde festgestellt, dass sie eine 10 β-Stränge aufweisende "jelly-roll"-Topologie hat (Shapiro und Scherer, Curr. Biol. 8: 335–8, 1998), die eine signifikante strukturelle Homologie zu der TNF-Familie zeigt, und dass die zsig37-Sequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, alle 10 β-Stränge dieser Struktur enthält. (Aminosäurereste 147–151, 170–172, 178–181, 185–188, 191–203, 207–214, 219–225, 227–238, 244–250 und 269–274 von SEQ ID NO: 2). Diese Stränge wurden bezeichnet als „A", „A'", „B", „B'", „C", „D", „E", „F", „G" und „H".
Zsig37 hat zwei Rezeptorbindungsschleifen an den Aminosäureresten 152–180 und 213–226. Die Aminosäurereste 191 (Gly), 193 (Tyr), 238 (Leu) und 272 (Gly) scheinen in der Superfamilie, die CD40, TNFα, TNFβ, ACRP30 und zsig37 einschließt, konserviert zu sein.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt die Verwendung von zsig37-Polypeptidfragmenten als Inhibitoren der Hämostase und von Immunfunktionen ein. Bevorzugte Fragmente schließen die kollagenähnliche Domäne von zsig37-Polypeptiden, die sich von der Aminosäure 99 (Gly) bis zur Aminosäure 140 (Arg) der SEQ ID NO: 2 erstreckt, einen Teil des zsig37-Polypeptids, die die kollagenähnliche Domäne enthält, oder einen Teil der kollagenähnlichen Domäne, die fähig ist zur Dimerisierung oder Oligomerisierung, ein. Andere bevorzugte Fragmente schließen die globuläre Domäne des zsig37-Polypeptids, die sich von der Aminosäure 140 (Arg) oder 141 (Cys) bis zu 281 (Pro) von SEQ ID NO: 2 erstreckt, einen Teil des zsig37-Polypeptids, der die der globulären Domäne ähnliche Domäne oder einen aktiven Teil der zur globulären ähnlichen Domäne enthält, ein. Ein anderes zsig37-Polypeptidfragment der vorliegenden Erfindung schließt sowohl die kollagenähnliche Domäne als auch die globuläre Domäne ein, im Bereich vom Aminosäurerest 99 (Gly} bis 281 (Pro) von SEQ ID NO: 2. Diese Fragmente sind besonders nützlich bei der Hemmung der kollagenvermittelten Plättchenaktivierung und bei der Hemmung von Komplement und C1q.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung von zsig37-Fusionsproteinen bereit. Zum Beispiel schließen Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung ein: (1) ein Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: (a) Polypeptidmoleküle, die eine Sequenz der Aminosäurereste, wie gezeigt in Sequenz ID NO: 2 vom Aminosäurerest 1 (Met), 22 (Leu) oder 26 (Arg) bis zum Aminosäurerest 281 (Pro) aufweisen; (b) Polypeptidmoleküle, die sich von der Aminosäure 99 (Gly) bis zur Aminosäure 140 (Arg) der SEQ ID NO: 2 erstrecken, einen Teil des zsig37-Polypeptids, das die kollagenähnliche Domäne oder einen Teil der kollagenähnlichen Domäne enthält, der fähig ist zur Dimerisierung oder Oligomerisierung; (c) Polypeptidmoleküle, die sich von der Aminosäure 140 (Arg) oder 141 (Cys) bis 281 (Pro) von SEQ ID NO: 2 erstrecken, einen Teil des zsig37-Polypeptids, das die Domäne, die der globulären Domäne ähnlich ist, oder einen aktiven Teil der zur globulären Domäne Ähnlichen enthält; oder (d) Polypeptidmoleküle, die sich von der Aminosäure 99 (Gly) bis zu 281 (Pro) erstrecken, einem Teil des zsig37-Polypeptids, einschließlich der kollagenähnlichen Domäne und der globulären Domäne; und (2) ein anderes Polypeptid. Das andere Polypeptid kann eine alternative oder zusätzliche globuläre Domäne, eine alternative oder zusätzliche kollagenähnliche Domäne, ein Signalpeptid zur Erleichterung der Sekretion des Fusionsproteins, oder Ähnliches sein.
In den Verfahren der Erfindung sind auch zsig37-Agonisten und -Antagonisten nützlich. Verfahren zu Identifizierung von Antagonisten sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel können Antagonisten des zsig37-Polypeptids identifiziert werden durch Bereitstellen von Zellen, die reaktionsfähig sind auf ein zsig37-Polypeptid, Kultivieren eines ersten Teils der Zellen in Anwesenheit des zsig37-Polypeptids, Kultivieren eines zweiten Teils der Zellen in Anwesenheit des zsig37-Polypeptids und einer Testverbindung, und Nachweisen einer Abnahme der zellulären Antwort auf den zweiten Teil der Zellen im Vergleich zum ersten Teil der Zellen. Zusätzlich zu jenen hierin offenbarten Nachweisen können Proben auf die Inhibition der zsig37-Aktivität in einer Reihe an Ansätzen, die gestaltet sind, um die Rezeptorbindung oder die Stimulation/Inhibition zsig37-abhängiger zellulärer Antworten zu messen, untersucht werden. Zum Beispiel können zsig37-reaktionsfähige Zelllinien mit einem Reportergenkonstrukt transfiziert werden, das reaktionsfähig ist für einen zsig37-stimulierten Weg. Reportergenkonstrukte dieses Typs sind im Stand der Technik bekannt und werden allgemein ein zsig37-Antwortelement umfassen, das wirksam gekoppelt ist an ein Gen, das ein nachweisbares Protein, wie zum Beispiel Luziferase, kodiert. DNS-Antwortelemente können einschließen aber sind nicht beschränkt auf zyklische AMP-Antwortelemente (CRE), Hormon-Antwortelemente (HRE), Insulin-Antwortelemente (IRE) (Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5273–7, 1990) und Serum-Antwortelemente (SRE) (Shaw et al. Cell 56: 563–72, 1989). Zyklische AMP-Antwortelemente sind zusammenfassend berichtet in Roestler et al., J. Biol. Chem. 263 (19): 9063–6, 1988 und Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087–94, 1990. Hormon-Antwortelemente sind zusammenfassend berichtet in Beato, Cell 56: 335–44; 1989. Kandidatenverbindungen, -lösungen, -mischungen oder -extrake sind untersucht auf ihre Fähigkeit, die Aktivität von zsig37 auf Zielzellen zu inhibieren, wie nachgewiesen durch eine Abnahme in der zsig37-Stimulation der Reportergenexpression. Nachweise dieses Typs werden Verbindungen detektieren, die unmittelbar die zsig37-Bindung an Zelloberflächenrezeptoren hemmen, ebenso wie Verbindungen, die Vorgänge im zellulären Weg im Anschluss an die Rezeptor-Ligand-Bindung hemmen. Als Alternative können Verbindungen oder andere Proben auf die unmittelbare Hemmung der zsig37-Rezeptorbindung untersucht werden, unter Verwendung von zsig37, das mit eine detektierbaren Markierung (z. B. ¹²⁵I, Biotin, Meerrettich-Peroxidase, FITC und Ähnliche) markiert ist. In Nachweisen dieses Typs ist die Fähigkeit einer Testprobe, die Bindung von markiertem zsig37 an den Rezeptor zu inhibieren, kennzeichnend für die inhibitorische Aktivität, die bestätigt werden kann durch Sekundärnachweise. Die in den Bindungsassays verwendeten Rezeptoren können zelluläre Rezeptoren oder isolierte, immobilisierte Rezeptoren sein.
Ebenso sind in den Verfahren der Erfindung Antikörper nützlich, die spezifisch an zsig37-Polypeptidepitope, -peptide oder -polypeptide binden. Verfahren zur Zubereitung polyklonaler und monoklonaler Antikörper sind im Stand der Technik wohlbekannt (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989; und Hurrell, J. G. R., Hrsg., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, USA, 1982).
Wie es für einen Durchschnittsfachmann offensichtlich sind wird, können polyklonale Antikörper durch das Impfen einer Reihe warmblütiger Tiere, wie z. B. Pferde, Kühe, Ziegen, Schafe, Hunde, Hühner, Kaninchen, Mäuse, Hamster, Meerschweinchen und Ratten, ebenso wie transgener Tiere, wie z. B. transgenen Schafen, Kühen, Ziegen oder Schweinen, erzeugt werden. Antikörper können auch in Hefen und Pilzen in modifizierten Formen exprimiert werden, ebenso wie in Säuger- und Insektenezellen. Das zsig37-Polypeptid oder ein Fragment davon dient als ein Antigen (Immunogen), um ein Tier zu impfen oder um eine Immunantwort auszulösen. Geeignete Antigene würden das durch SEQ ID NO: 2, das durch die Aminosäurereste 22-281 der SEQ ID NO: 2 und das durch die Aminosäurereste 26–281 der SEQ ID NO: 2 kodierte zsig37-Polypeptid einschließen, oder ein zusammenhängendes 9–-281-Aminosäurerest-Fragment davon. Die Immunogenität eines zsig37-Polypeptids kann erhöht werden durch die Verwendung eines Hilfsstoffes, wie z. B. Alaun (Aluminiumhydroxid) oder Freund's vollständiges oder unvollständiges Adjuvans. Polypeptide, die nützlich sind für die Immunisierung, schließen auch Fusionspolypeptide, wie z. B. Fusionen von zsig37 oder einem Teil davon, mit einem Immunglobulinpolypeptid oder mit einem Affinitätsmarkierung, ein. Das Polypeptidimmunogen kann ein Molekül der vollen Länge oder ein Teil davon sein. Falls der Polypeptidteil „Hapten-ähnlich" ist, kann solch ein Teil vorteilhafterweise verbunden sein mit oder gekoppelt sein an einen makromolekularen Träger (wie z. B. Schlüssellochnapfschnecken-Hämozyanin (KLH), Rinderserumalbumin (BSA) oder Tetanustoxoid) für die Immunisierung.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff „Antikörper" polyklonale Antikörper, affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und antigenbindende Fragmente, wie z. B. F(ab')₂ und Fab-proteolytische Fragmente, ein. Genetisch modifizierte intakte Antikörper oder Fragmente, wie z. B. Chimärenantikörper, Fv-Fragmente, Einzelkettenantikörper und Ähnliche, ebenso wie synthetische antigenbindende Peptide und Polypeptide sind auch eingeschlossen. Nicht-menschliche Antikörper können menschlich gemacht werden, indem nur nicht-menschliche CDRs auf menschliches Gerüst und konstante Bereiche übertragen werden, oder indem die gesamten nicht-menschlichen variablen Domänen eingebaut werden (wobei diese wahlweise mit einer menschenähnlichen Oberfläche „umhüllt" werden durch Ersetzen ausgesetzter Reste, wodurch das Ergebnis ein „verkleideter" Antikörper ist). In einigen Fällen können humanisierte Antikörper nicht-menschliche Reste in den menschlichen Gerüstdomänen variabler Bereiche beibehalten, um die richtigen Bindungseigenschaften zu verstärken. Durch humanisierte Antikörper kann die biologische Halbwertszeit erhöht werden, und die Möglichkeit ungünstiger Immunreaktionen nach der Verabreichung an Menschen wird reduziert. Alternative Techniken zur Herstellung oder Auswahl von hierin nützlichen Antikörpern schließen das in vitro-Aussetzen von Lymphozyten an zsig37-Protein oder -Peptid ein und die Auswahl eines Antikörpers, der Bibliotheken in Phagen oder ähnlichen Vektoren widerspiegelt (z. B. durch die Verwendung von immobilisiertem oder markiertem zsig37-Protein oder -Peptid).
Antikörper sind als spezifisch bindend definiert, falls: 1) sie einen Schwellenwert an Bindungsaktivität ausüben, und/oder 2) sie nicht signifikant mit verwandten Polypeptidmolekülen kreuzreagieren. Erstens binden Antikörper hierin spezifisch, falls sie an zsig37-Polypeptid, -Peptid oder -Epitop mit einer Bindungsaffinität (K_a) von 10⁶ mol^–1 oder höher, vorzugsweise 10⁷ mol^–1 oder höher, noch bevorzugter 10⁸ mol^–1 oder höher und am meisten bevorzugt 10⁹ mol^–1 oder mehr binden. Die Bindungsaffinität eines Antikörpers kann leicht vom Durchschnittsfachmann bestimmt werden, z. B. durch die Scatchard-Analyse (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660–672, 1949).
Zweitens binden Antikörper spezifisch, falls sie nicht mit verwandten Polypeptiden signifikant kreuzreagieren. Antikörper reagieren nicht signifikant kreuz mit verwandten Polypeptidmolekülen, z. B. falls sie zsig37-Polypeptide detektieren, aber nicht bekannte verwandte Polypeptide unter Verwendung einer Standard-Western-Blot-Analyse (Ausubel et al., ebenda). Beispiele bekannter verwandter Polypeptide schließen andere Mitglieder einer Proteinfamilie ein, wie z. B. Acrp30 (SEQ ID NO: 3), die in der Anordnung von 1 gezeigten Polypeptide und Ähnliche ein. Sie können auch einschließen, falls dies gewünscht ist, orthologe und mutierte menschliche zsig37-Polypeptide. Ferner können Antikörper „gescreent werden gegen" bekannte verwandte Polypeptide, um eine Population zu isolieren, die spezifisch an die erfinderischen Polypeptide bindet. Zum Beispiel werden gegen meschliche zsig37-Polypeptide erzeugte Antikörper an verwandte Polypeptide adsorbiert, die an eine unlösliche Matrix angeheftet sind; Antikörper, die spezifisch sind für menschliche zsig37-Polypeptide werden durch die Matrix unter geeigneten Pufferbedingungen hindurchfließen. Ein solches Screening ermöglicht die Isolierung polyklonaler und monoklonaler Antikörper, die nicht kreuzreaktiv für eng verwandte Polypeptide sind (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (Hrsg.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Screening und Isolierung spezifischer Antikörper sind im Stand der Technik wohlbekannt (siehe Fundamental Immunology, Paul (Hrsg.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1–98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J. W. (Hrsg.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67–101, 1984). Typische Beispiele solcher Nachweise schließen ein: gleichzeitige Immunelektrophorese, Radioimmuntest, Radioimmunfällung, enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), Dot-Blot- oder Western-Blot-Assay, Inhibitionsoder Verdrängungsnachweis und Sandwichassay.
Die Wirkung von zsig37-Polypeptiden, -Fragmenten, -Fusionen, -Agonisten oder – Antagonisten auf die Hämostase, insbesondere auf die Plättchenanheftung und -aktivierung, die zu Plättchenaggregation führt, kann bestimmt werden durch hierin bereitgestellte Verfahren und Nachweise und durch jene im Stand der Technik bekannten. Kollagen ist ein starker Induktor der Plättchenaggregation. Dies birgt Risiken für Patienten, die sich von Gefäßverletzungen erholen. Inhibitoren der kollageninduzierten Plättchenaggregation würden für solche Zwecke nützlich sein. Von zsig37 wurde herausgefunden, dass es an Fibronektin und Typ I-, II-, III-, V- und VI-Kollagene bindet. Insbesondere bindet zsig37 an spezifische Domänen auf Kollagen VI in einer konzentrationsabhängigen Weise. Von zsig37 wurde auch herausgefunden, dass es die kollagenvermittelte Plättchenaktivierung inhibiert. Die zsig37-induzierte Inhibition war selektiv für die Kollagenaktivierng, wobei zsig37 keine Wirkung auf Blutplättchen hatte, die durch die bekannten Plättchenaktivatoren ADP oder Thrombin aktiviert worden waren. Diese Ergebnisse sind detaillierter unten im Abschnitt über die Beispiele beschrieben. Es wird erwartet, dass zsig37-Polypeptide, -Fragmente, -Fusionen, – Agonisten oder -Antagonisten zum Hemmen der Bindung von Blutplättchen an kollagenüberzogene Oberflächen und für die Reduktion der damit verbundenen kollageninduzierten Plättchenaggregtion nützlich sein werden.
C1q ist ein Bestandteil des Komplementweges und es wurde festgestellt, dass es Abwehrmechanismen stimuliert, ebenso wie es die Bildung von toxischen Sauerstoffarten, die eine Gewebeschädigung verursachen können, auslöst (Tenner, Behring Inst. Mitt. 91: 241–53, 1993). C1q-Bindungsstellen werden auf Blutplättchen gefunden. Von C1q, unabhängig von einem Immunbindungspartner, wurde festgestellt, dass es die Plättchenaggregation hemmt, aber nicht die Plättchenanheftung oder -form ändert. Der aminoterminale Bereich von C1q teilt eine Homologie mit Kollagen (Peerschke und Ghebrehiwet, J. Immunol. 145: 2984–88, 1990). Zsig37 bindet an Komplement C1q in einer konzentrationsabhängigen Weise. Von zsig37 wurde festgestellt, dass es wirksam ist bei der Inhibition des Komplementweges, einschließlich C1q, sowohl mit sensibilisierten als auch mit unsensibilisierten Schaf-Erythrozyten.
Die zsig37-Polypeptide, -Fragmente, -Fusionsproteine, -Antikörper, -Agonisten oder-Antagonisten der vorliegenden Erfindung können in Verfahren zur Förderung des Blutflusses in dem Gefäßsystem eines Säugers verwendet werden, indem die Anzahl der Blutplättchen, die anhaften und aktiviert werden und die Größe der Plättchenaggregate reduziert werden. Solche Verfahren würden die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an zsig37-Polypeptiden, -Fragmenten, -Fusionen, -Antikörpern, -Agonisten oder -Antagonisten an einen Säuger, der Bedarf hat für eine solche Behandlung, umfassen, wobei zsig37 die thrombogene und Komplementaktivität in dem Gefäßsystem des Säugers reduziert. Wie oben beschrieben, hemmen zsig37-Polypeptide die kollagenvermittelte Plättchenaktivierung und inaktivieren Fibronektin und Typ I-, II-, III-, V- und VI-Kollagene durch Bindung. Die zsig37-Verabreichung reduziert die thrombogene Aktivität an der Stelle der Gefäßverletzung durch Reduktion der Arten der Plättchenanheftung, -aktivierung und -aggregation. Zsig37 hemmt auch den Komplementweg und C1q, wie unten beschrieben, wodurch folglich die Komplementaktivität in dem Gefäßsystem reduziert wird. Zsig37-Polypeptide, -Fragmente, – Fusionen, -Antikörper, -Agonisten, oder -Antagonisten, die in solchen Verfahren verwendet werden, können dem Säuger vor, während oder nach einer akuten Gefäßverletzung verabreicht werden.
In einem bevorzugten Verfahren beruht die Gefäßverletzung auf der Gefäßrekonstruktion, einschließlich aber nicht beschränkt auf, Angioplastik, Endarteriektomie, Koronararterien-Bypass-Transplantation, mikrovaskulärer Reparatur oder Anastomose eines Gefäßtransplantates. Auch sind Gefäßverletzungen bedacht, die auf Trauma, Schlaganfall oder Aneurysma beruhen. In anderen bevorzugten Verfahren beruht die Gefäßverletzung auf Losreißen von Plaques, Abbau des Gefäßsystems, Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes und Atherosklerose. Das Losreißen von Plaques induziert in der Koronararterie einen Herzanfall und in der Hirnarterie einen Schlaganfall. Die Verwendung von zsig37-Polypeptiden, -Fragmenten, -Fusionsproteinen, -Antikörpern, -Agonisten oder – Antagonisten in solchen Verfahren würde auch nützlich sein für die Verbesserung von Gesamtsystemerkrankungen des Gefäßsystems, die verbunden sind mit dem Immunsystem, wie beispielsweise disseminierte intravaskuläre Gerinnung (DIC) und SIDs. Zusätzlich würde die komplementinhibierende Aktivität nützlich sein für die Behandlung von Nichtgefäßsystem-Immunerkrankungen wie z. B. Arteriolosklerose.
Es wurde ein Zusammenhang gefunden zwischen der Anwesenheit von C1q in örtlich begrenztem ischämischem Myokard und der Anhäufung von Leukozyten nach dem Koronarverschluss und der Reperfusion. Das Freisetzen zellulärer Bestandteile nach der Gewebeschädigung löst die Komplementaktivierung aus, was in toxischen Sauerstoffprodukten resultiert, die die primäre Ursache der Myokardschädigung sein können (Rossen et al., Circ. Res. 62: 572–84, 1998 und Tenner, ebenda). Es wurde herausgefunden, dass das Hemmen des Komplementweges ischämisches Myokard vor Reperfusionsverletzung schützt (Buerke et al., J. Pharm. Exp. Therp. 286: 429–38, 1998). Die Komplementinhibition und C1q-Bindungsaktivität von zsig37-Polypeptiden würden nützlich sein für solche Zwecke.
Die Kollagen- und C1q-Bindungsfähigkeiten von zsig37 würden nützlich sein, um beschädigte Kollagengewebe zu beruhigen, wodurch die Plättchenanheftung, -aktivierung oder -aggregation verhindert wird, und wodurch die Aktivierung von Entzündungsvorgängen, die zur Freisetzung von toxischen Sauerstoffprodukten führen, verhindert wird. Indem das ausgesetzte Gewebe für solche Vorgänge, wie Komplementaktivität, thrombotische Aktivität und Immunaktivierung, inert gemacht wird, würden zsig37-Polypeptide, -Fragmente, – Fusionen, -Antikörper, -Agonisten oder -Antagonisten nützlich sein bei der Reduktion der schädlichen Wirkungen von Ischämie und Reperfusion. Insbesondere würden solche Verletzungen einschließen Trauma-Verletzungsischämie, Intestinalstrangulation und Verletzung im Zusammenhang mit der Prä- und Postetablierung des Blutflusses. Zsig37 würde nützlich sein bei der Behandlung von kardiopulmonaler Bypass-Ischämie und – Rezidiv, Myokardinfarkt und posttraumatischem Vasospasmus, wie z. B. Schlaganfall oder perkutaner transluminaler Angioplastik, ebenso wie durch Unfall verursachtes oder chirurgisch induziertes Gefäßtrauma.
Zsig37-Polypeptide, -Fragmente, -Fusionen, -Antikörper, -Agonisten oder – Antagonisten würden auch nützlich sein, um prothetische Biomaterialien und chirurgische Ausrüstung zu beruhigen, um die Oberfläche der Materialien inert für die Komplementaktivierung, thrombotische Aktivität oder Immunaktivierung zu machen. Solche Materialien schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Kollagen oder mit Kollagenfragmenten überzogene Biomaterialien, mit Gelatine überzogene Biomaterialien, mit Fibrin überzogene Biomaterialien, mit Fibronektin überzogene Biomaterialien, mit Heparin überzogene Biomaterialien, Kollagen und mit Gel überzogene Stents, Arterientransplantate, synthetische Herzklappen, künstliche Organe oder jede Prothesenanwendung, die dem Blut ausgesetzt ist, die zsig37 zu mehr als 1 × 10⁸ binden wird. Das Überziehen solcher Materialien kann getan werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, siehe z. B. Rubens, US-Patent Nr. 5,272,074.
Komplement und C1q spielen eine Rolle bei der Entzündung. Die Komplementaktivierung wird durch das Binden von C1q an Immunglobuline gestartet (Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12: 933–41, 1993; Ward und Ghetie, Therap. Immunol. 2: 77–94, 1995). Inhibitoren von C1q und Komplement würden nützlich sein als antiinflammatorische Mittel. Eine solche Anwendung kann vorgenommen werden, um eine Infektion zu verhindern. Zusätzlich können solche Inhibitoren einem Individuum verabreicht werden, das an einer Entzündung leidet, die durch Komplementaktivierung und Binden von Immunkomplexen an C1q vermittelt wurde. Zsig37-Polypeptide, -Fragmente, -Fusionsproteine, -Antikörper, -Agonisten oder -Antagonisten würden bei Verfahren, die die Wundheilung vermitteln, nützlich sein, wodurch das Fortschreiten der Wundheilung verstärkt würde, indem die beeinträchtigte Wundheilung überwunden würde. Das Fortschreiten der Wundheilung würde einschließen, z. B. solche Elemente, wie eine Reduktion der Entzündung, Verstärkung der Fibroblasten, Zurückziehen der Wunde und Reduktion der Infektion.
Die Fähigkeit von Tumorzellen, an Kollagen zu binden, kann zu der Metastase von Tumoren beitragen. Inhibitoren der Kollagenbindung sind auch nützlich, um die adhäsiven Wechselwirkungen und das metastatische Ausbreiten von Tumoren zu vermitteln (Noeske-Jungbult et al., US-Patent Nr. 5,723,312).
Von zsig37 wurde festgestellt, dass es die Vasodilatation in durch Noradrenalin zusammengezogenen Aortenringen induziert, unter Verwendung der Verfahren von Dainty et al., J. Pharmacol. 100: 767, 1990 und Rhee et al., Neurotox. 16: 179, 1995, wie es unten detaillierter beschrieben werden wird.
Plättchenanheftung, -aktivierung und -aggregation kann abgeschätzt werden unter Verwendung von hierin beschriebenen Verfahren oder von im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z. B. dem Thrombozytenaggregationsansatz (Chiang et al., Thrombosis Res. 37: 605–12, 1985) und Thrombozytenadhäsionsassays (Peerschke und Ghebrehiwet, J. Immunol. 144: 221–25, 1990). Die Inhibition von C1q und dem Komplementweg kann bestimmt werden unter Verwendung von hierin offenbarten Verfahren oder von im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z. B. beschrieben in Suba und Csako, J. Immunol. 117: 304–9, 1976. Nachweise für die Plättchenanheftung an Kollagen und die Inhibition der kollageninduzierten Plättchenaggregation können gemessen werden unter Verwendung von Verfahren beschrieben in Keller et al., J. Biol. Chem. 268: 5450–6, 1993; Waxman und Connolly, J. Biol. Chem. 268: 5445–9, 1993; Noeske-Jungblut et al., J. Biol. Chem. 269: 5050–3 oder 1994 Deckmyn et al., Blood 85: 712–9, 1995.
Zahlreiche in vitro- und in vivo-Modelle sind erhältlich, um die Wirkungen von zsig37-Polypeptiden, -Fragmenten, -Fusionen, -Antikörpern, -Agonisten oder -Antagonisten auf Ischämie und Reperfusionsverletzung abzuschätzen. Siehe z. B. Shandelya et al., Circulation 88: 2812–26, 1993; Weisman et al., Science 249: 146–151, 1991; Buerke et al., Circulation 91: 393–402, 1995; Horstick et al., Circulation 95: 701–8, 1997 und Burke et al., J. Phar. Ex. Therp. 286: 429–38, 1998. Ein ex vivo-Hamsterthrombozytenaggregationsassay ist beschrieben durch Deckmyn et al., ebenda. Blutungszeiten in Hamstern und Pavianen können gemessen werden nach der Injektion von zsig37-Polypeptiden unter Verwendung des von Deckmyn et al., ebenda beschriebenen Modells. Die Thrombusbildung in Antwort auf die Verabreichung von Proteinen der vorliegenden Erfindung kann gemessen werden, unter Verwendung des Hamsterfemoralvenen-Thrombosemodells, das bereitgestellt ist durch Deckmyn et al., ebenda. Änderungen in der Plättchenanheftung unter Flussbedingungen nach der Verabreichung von zsig37, können gemessen werden unter Verwendung der in Harsfalvi et al., Blood 85: 705–11, 1995 beschriebenen Verfahren.
Die Komplementinhibition und Wundheilung durch zsig37-Polypeptide, -Fragmente, – Fusionsproteine, -Antikörper, -Agonisten oder -Antagonisten kann allein oder in Kombination mit anderen bekannten Inhibitoren der kollageninduzierten Plättchenaktivierung und -aggregation, wie z. B. Palldipin, Moubatin oder Calin, nachgewiesen werden.
Zsig37-Polypeptide, -Fragmente, -Fusionsproteine, -Antikörper, -Agonisten oder – Antagonisten können beurteilt werden unter Verwendung von hierin oder von im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z. B. dem Heilen von Hautschichten in Schweinen (Lynch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7696–700, 1987) und von Vollhautwunden in Mäusen mit genetisch erzeugter Diabetes (Greenhalgh et al., Am. J. Pathol. 136: 1235–46, 1990), zum Beispiel. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können allein oder in Kombination mit anderen bekannten Komplementinhibitoren, wie oben beschrieben, untersucht werden.
Weiterhin können die zsig37-Polypeptide, Fragmente, Fusionsagonisten, oder Antagonisten davon, therapeutisch nützlich sein für antimikrobielle Anwendungen. Zum Beispiel spielt der Komplementbestandteil C1q eine Rolle in der Wirtsverteidigung gegen infektiöse Mittel, wie z. B. Bakterien und Viren. Von C1q ist bekannt, dass es zahlreiche spezialisierte Funktionen ausübt. Zum Beispiel löst C1q die Komplementkaskade über eine Wechselwirkung mit dem gebundenen Antikörper oder C-reaktiven Protein (CRP) aus. Auch tritt C1q direkt in Wechselwirkung mit bestimmten Bakterien, RNS-Viren, Mykoplasma, Harnsäurekristallen, dem Lipid-A-Bestandteil bakteriellen Endotoxins und den Membranen gewisser intrazellulärer Organellen. Von der C1q-Bindung an den C1q-Rezeptor wird angenommen, dass sie die Phagozytose fördert. C1q scheint auch den Antikörperbildungsaspekt des Wirtsabwehrsystems zu steigern. Siehe z. B. Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12 11: 933–41, 1993. Folglich können lösliche C1q-ähnliche Moleküle nützlich sein als antimikrobielle Mittel, wodurch die Lyse oder Phagozytose infektiöser Mittel gefördert wird.
Es wurde festgestellt, dass die positiv geladenen, extrazellulären Tripelhelix-Kollagendomänen von C1q und Makrophagenfängerrezeptor eine Rolle spielen in der Ligandbindung und es wurde gezeigt, dass sie eine breite Bindungsspezifität für Polyanione haben (Acton et al., J. Biol. Chem. 268: 3530–37, 1993). Lysophospholipidwachstumsfaktor (Lysophosphatidsäure, LPA) und andere mitogenetische Anionen sind örtlich auf die Stelle geschädigter Gewebe begrenzt und unterstützen bei der Wundheilung. LPA übt viele biologische Wirkungen aus, einschließlich der Aktivierung von Blutplättchen und der Heraufregulierung des Matrixzusammenbaus. Es wird gedacht, dass LPA mit anderen Blutgerinnungsfaktoren zusammenwirkt und die Wundheilung vermittelt.
Von den Kollagendomänen von Proteinen, wie z. B. C1q und Makrophagenfängerrezeptor, ist bekannt, dass sie saure Phospholipide, wie z. B. LPA, binden. Ein 9mer-Bereich der Kollagendomäne von zsig37, die Aminosäurereste 127–135 von SEQ ID NO: 2, teilt eine Sequenzhomologie mit der Kollagendomäne, die auf C1q und Makrophagenfängerrezeptor gefunden wird. Die Wechselwirkung von zsig37-Polypeptiden, – Fragmenten, -Fusionen, -Agonisten oder -Antagonisten mit mitogenischen Anionen, wie z. B. LPA, kann bestimmt werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Tests, siehe z. B. Acton et al., ebenda. Die Inhibition entzündlicher Prozesse durch Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung würden auch nützlich sein bei der Verhinderung von Infektion an der Wundstelle.
Für die pharmazeutische Verwendung können die Proteine der vorliegenden Erfindung mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern für die parenterale, orale, nasale, rektale, topische, transdermale Verabreichung oder Ähnlichen, gemäß den gängigen Verfahren formuliert werden. Vorzugsweise wird die Verabreichung an oder in der Nähe der Stelle der Gefäßverletzung getätigt. Im Allgemeinen werden pharmazeutische Formulierungen ein zsig37-Protein in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel, wie z. B. Kochsalzlösung, gepufferter Salzlösung, 5% Dextrose in Wasser oder Ähnliches einschließen. Die Formulierungen können weiterhin einen oder mehrere Trägerstoffe, Konservierungsmittel, Lösungsvermittler, Puffermittel, Albumin, um den Proteinverlust auf den Oberflächen von Arzneimittelfläschchen zu verhindern, etc. einschließen. Verfahren der Formulierung sind im Stand der Technik wohlbekannt und sind z. B. offenbart in Remington: The Science und Practice of Pharmacy, Gennaro, Hrsg. Mack Publishing Co., Easton PA, 19. Auflage, 1995. Therapeutische Dosen werden im Allgemeinen bestimmt werden durch den Kliniker, gemäß angenommener Standards, wobei die Art und Schwere des zu behandelnden Zustandes, Patientenmerkmale, etc. mit einbezogen werden. Die Bestimmung der Dosis liegt innerhalb des Maßes des Durchschnittkönnens.
Wie hierin verwendet, ist eine „pharmazeutisch wirksame Menge" eines zsig37-Polypeptides, -Fragmentes, -Fusionsproteins, -Agonisten oder -Antagonisten eine Menge, die ausreichend ist, ein gewünschtes biologisches Ergebnis zu erzielen. Das Ergebnis kann die Erleichterung der Anzeichen, Symptome oder Ursachen einer Erkrankung sein, oder jede andere gewünschte Veränderung eines biologischen Systems. Zum Beispiel kann eine wirksame Menge eines zsig37-Polypeptids eine sein, die entweder eine subjektive Erleichterung von Symptomen oder eine objektiv identifizierbare Verbesserung, wie durch den Kliniker oder einen anderen qualifizierten Beobachter festgestellt, bereitstellt. Solch eine wirksame Menge eines zsig37-Polypeptids würde, beispielsweise für die Inhibition der kollagenaktivierten Plättchenaktivierung und des Komplementweges, einschließlich C1q, sorgen, wodurch der örtlich begrenzte Blutfluss in dem Gefäßsystem eines Patienten erhöht wird/oder die Reduktion schädlicher Wirkungen von Ischämie und Reperfusion gesteigert wird. Wirksame Mengen der zsig37-Polypeptide können weit variieren, in Abhängigkeit von der zu behandelnden Krankheit oder dem zu behandelnden Symptom. Die Menge des zu verabreichenden Polypeptids und seine Konzentration in den Formulierungen hängt ab von dem gewählten Vehikel, dem Applikationsweg, der Leistungsfähigkeit des bestimmten Polypeptids, dem klinischen Zustand des Patienten, den Nebenwirkungen und der Stabilität der Verbindung in der Formulierung. Folglich wird der Kliniker die geeignete Zubereitung anwenden, die die geeignete Konzentration in der Formulierung enthält, ebenso wie die Menge der verabreichten Formulierung, in Abhängigkeit von der klinischen Erfahrung mit dem in Frage kommenden Patienten oder mit ähnlichen Patienten. Solche Mengen werden zum Teil abhängen von dem bestimmten zu behandelnden Zustand, Alter, Gewicht und der allgemeinen Gesundheit des Patienten und von anderen Faktoren, die offensichtlich sind für Fachleute. Typischerweise wird eine Dosis im Bereich von 0,01 bis 100 mg/kg des Patienten sein. In Anwendungen wie z. B. Ballonkathetern wird der typische Dosisbereich 0,05–5 mg/kg des Patienten sein. Dosen spezifischer Verbindungen können bestimmt werden aus in vitrooder ex vivo-Untersuchungen, in Kombination mit Untersuchungen an Versuchstieren. Konzentrationen von Verbindungen, die in vitro oder ex vivo für wirksam befunden wurden, stellen eine Orientierung für Tieruntcrsuchungen bereit, wodürch Dosen berechnet werden, um ähnliche Konzentrationen an der Wirkungsstelle bereitzustellen.
Die Erfindung wird weiter erläutert durch die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele.
Beispiel 1
Ausdehnung der EST-Sequenz
Die neuen zsig37-Polypeptid-kodierenden Polynukleotide der vorliegenden Erfindung wurden anfänglich identifiziert durch Auswählen eines ESTs aus einer EST-Datenbank, wodurch eine darauf basierende Proteinsequenz vorhergesagt wurde, und durch Durchsuchen bekannter Sequenzdatenbanken für das sezernierte Protein, das zu dem basierend auf dem EST-vorhergesagten Protein am homologsten ist. ESTs, die möglicherweise Proteine mit biologisch interessanter Homologie zu bekannten sezernierten Proteinen kodieren, wurden für weitere Untersuchungen identifiziert. Eine einzelne EST-Sequenz wurde entdeckt und es wurde von ihr vorhergesagt, dass sie homolog sei zu einem adipozytenspezifischen Protein. Siehe z. B. Scherer et al., J. Biol. Chem. 270 45: 26746–9, 1995. Um die entsprechene cDNS zu identifizieren wurde ein Klon verwendet für das Sequenzieren, von dem angenommen wurde, dass er wahrscheinlich die gesamte kodierende Sequenz enthält. Unter Verwendung eines Invitrogen S. N. A. P.^TM-Mini-Prep-Kits (Invitrogen, Corp., San Diego, Kalifornien, USA) wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers eine 5 ml-Übernachtkultur in LB + 50 μg/ml Ampizillin zubereitet. Die Matrize wurde sequenziert auf einem ABIPRISM^TM Modell 377 DNS-Sequenziergerät (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct.) unter Verwendung des ABI PRISM^TM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaktion Kit (Perkin-Elmer Corp.), gemäß den Anleitungen des Herstellers. Die Oligonukleotide ZC695 (SEQ ID NO: 5) und ZC694 (SEQ ID NO: 6) der SP6- und T7-Promotoren auf dem Klon-enthaltenden Vektor wurden als Sequenzierprimer verwendet. Die Oligonukleotide ZC13210 (SEQ ID NO: 7), ZC13588 (SEQ ID NO: 8), ZC13532 (SEQ ID NO: 9), ZC13641 (SEQ ID NO: 10), ZC13586 (SEQ ID NO: 11), ZC13651 (SEQ ID NO: 12), ZC13622 (SEQ ID NO: 13), ZC13625 (SEQ ID NO: 14), ZC13650 (SEQ ID NO: 15), ZC13589 (SEQ ID NO: 16), ZC13624 (SEQ ID NO: 17), ZC13531 (SEQ ID NO: 18), ZC13587 (SEQ ID NO: 19), und ZC13623 (SEQ ID NO: 20) wurden verwendet, um die Sequenz des Klons zu vervollständigen. Sequenzierreaktionen wurden in einem Hybaid OmniGene Temperature Cycling-System (National Labnet Co., Woodbridge, NewYork, USA) durchgeführt. Die SEQUENCHER^TM 3.0 Sequenzanalysesoftware (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan, USA) wurde für die Datenanalyse verwendet. Die resultierende 2769 bp lange Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 offenbart. Der Vergleich der ursprünglich abgeleiteten EST-Sequenz, mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zeigt, dass eine Basenpaarmehrdeutigkeit (ein unbekannter „N"-Rest) vorhanden war und keine Basenpaarinsertionen, was in der Identifizierung von Leucin bei der Auflösung der Mehrdeutigkeit resultierte und dass keine Leserasterverschiebungen zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen vorhanden waren.
Beispiel 2
Gewebeverteilung
Norhtern-Blots wurden durchgeführt unter Verwendung von Human Multiple Tissue Blots von Clontech (Palo Alto, Kalifornien, USA). Eine 30-Basenpaar-umfassende DNS-Sonde (ZC12447; SEQ ID NO: 4) für das 5'-Ende der Nukelotidsequenz des in SEQ IDNO: 1 gezeigten reifen Proteins, wurde radioaktiv mit ³²P unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase und Vorwärts-Reaktionspuffer (GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) gemäß den Anleitungen des Herstellers markiert. Die Sonde wurde gereinigt unter Verwendung einer NUCTRAP Drucksäule (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornien, USA). EXPRESSHYB- (Clontech, Palo Alto, Kalifornien, USA) Lösung wurde verwendet für die Prähybridisierung und als eine Hybridisierungslösung für die Northern-Blots. Die Hybridisierung fand über Nacht bei 50°C statt und die Blots wurden dann in 2X SSC und 0.1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einem Waschvorgang in 1X SSC und 0,1% SDS bei 68°C (ungefähr 5° weniger als der Schmelzpunkt). Eine Transkriptgröße wurde bei ungefähr 2.8 kb beobachtet. Die Signalintensität war am höchsten für Herz und Plazenta, mit vergleichsweise weniger starken Signalen in Niere, Eierstock, Nebenniere und Skelettmuskel, und mit geringen Signalen in einer breiten Reihe von anderen, im Northern-Blot vorhandenen Geweben.
Unter Verwendung eines Darmgewebe-Northern-Blots wurde eine zusätzliche Northern-Blot-Analyse durchgeführt. Der Blot wurde zubereitet unter Verwendung von mRNS einer menschlichen kolorektalen Adenokarzinom-Zelllinie SW480 (Clontech, Palo Alto, Kalifornien, USA), menschlichen Dünndarmgewebes (Clontech), menschlichen Magengewebes (Clontech), einer menschlichen glatten Darmmuskelzelllinie (Hism; ATCC Nr. CRL–1692; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA), einer normalen menschlichen Kolonzelllinie (FHC; ATCC Nr. CRL–1831; American Type Culture Collection) und einer menschlichen normalen fetalen Dünndarmzelllinie (FHs74 Int.; ATCC Nr. CCL241; American Type Culture Collection).
Aus Hism, FHC und FHs74 Int. wurde Gesamt-RNS durch das Säure-Guanidium-Verfahren (Cheomczynski et al., Anal. Biochem. 162: 156–9, 1987) isoliert. PolyA⁺-RNS wurde gesammelt, indem Gesamt-RNS durch eine Säule, die PolyA+-RNS zurückhält, eluiert wurde (Aviv et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 69: 1408–12, 1972). Es wuden 2 μg PolyA+-RNS von jeder Probe in einem 1,5% Agarosegel in 2,2 M Formaldehyd und Phosphatpuffer abgetrennt. Die RNS wurde auf eine Nytran-Membran (Schleicher und Schuell, Keene, New Hampshire, USA) in 20X SSC über Nacht übertragen. Der Blot wurde in dem UV-Stratalinker 2400 (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) bei 0,12 Joule behandelt. Der Blot wurde dann bei 80°C für eine Stunde gebacken.
Gesamtlängen-cDNS (gezeigt in SEQ ID NO: 1) wurde durch PCR amplifiziert und mit ³²P dCTP radiomarkiert unter Verwendung eines Rediprime Pellet-Kits (Amersham, Arlington Heights, Illinois, USA), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Der Blot wurde in EXPRESSHYB (Clontech) bei 56°C über Nacht hybridisiert. Der Blot wurde bei Raumtemperatur in 2X SSC und 0,1% SDS, dann in 2X SSC und 0,1% SDS bei 65°C und schließlich bei 65°C in 0,1X SSC und 0,1% SDS gewaschen. Die Ergebnisse zeigten, dass zsig3 7 an alle Gewebe hybridisierte, mit Ausnahme der menschlichen glatten Darmmuskelzelllinie HISM.
Beispiel 3
Chromosomale Markierung des Zsig 37-Gens
Das zsig37-Gen wurde auf dem menschlichen Chromosom 17, Region 17g25.2 durch PCR unter Verwendung der NIGMS Mensch/Nager-Somazellhybrid-Kartiertafel Nr. 2 (National Institute of General Medical Sciences, Coriell Institute of Medical Research) kartiert. Die Tafel besteht aus DNS, die aus 24 Mensch/Nager-Körperzellhybriden, von denen jedes ein spezifisches menschliches Chromosom und die elterliche DNS behält, isoliert wurde. Für das Kartieren des zsig37-Gens wurden 20 μl-Reaktionen in einer 96-Well-Mikrotiterplatte (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) angesetzt und in einem „RoboCycler Gradient 96" Termocycler (Stratagene) verwendet. Jede der 27 PCR-Reaktionen enthielt 2 μl 10X KlenTaq-PCR-Reaktionspuffer (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, Kalifornien, USA), 1,6 μl dNTP-Mischung (2,5 mM von jedem, PERKIN-ELMER, Foster City, Kalifornien, USA), lμl Sinn-Primer (SEQ ID NO: 21), 1 μl Gegensinn-Primer (SEQ ID NO: 22), 2 μl RediLoad (Research Genetics, Inc.), 0,4 μl 50X Advantage K1enTaq-Polymerase-Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNS eines einzelnen Hybridklons oder der Kontrolle und ddH₂O für ein Gesamtvolumen von 20 μl. Die Reaktionen wurden mit einer gleichen Menge Mineralöl überschichtet und verschlossen. Die PCR-Cycler-Bedingungen waren wie folgt: ein anfänglicher Zyklus mit 5 Minuten Denaturierung bei 95°C, 35 Zyklen mit 1 Minute Denaturierung bei 95°C, 1 Minute Annealing bei 60°C und 1,5 Minuten Verlängerung bei 72°C, gefolgt von einer Endzyklus-Verlängerung von 7 Minuten bei 72°C. Die Reaktionen wurden durch Elektrophorese auf ein 3% NuSieve GTG-Agarosegel (FMC Bioproducts, Rockland, Maine, USA) getrennt.
Beispiel 4
Schaffung eines Säugerexpressionsvektors zsig37NEE/pZP9 und zsig37CEE/pZP9
Für das zsig37-Polypeptid wurden zwei Expressionsvektoren zubereitet, zSIG37NEE/pZP9 und zSIG37CEE/pZP9, worin die Konstrukte so angelegt wurden, dass sie ein zsig37-Polypeptid mit einer C- oder N-terminalen Glu-Glu-Markierung exprimieren.
Zsig37NEE/pZP9
Ein durch PCR erzeugtes 800 by zsig37-DNS-Fragment wurde unter Verwendung von ZC15040 (SEQ ID NO: 24) und SC15033 (SEQ ID NO: 25) als PCR-Primer und der in Beispiel 1 oben beschriebenen Matrize geschaffen. Die PCR-Reaktion wurde bei 94°C für 3 Minuten inkubiert und dann wurden 5 Zyklen laufen gelassen mit 94°C für 30 Sekunden, 30°C für 20 Sekunden und 72°C für 1 Minute, gefolgt 25 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden,64°C für 20 Sekunden und 72°C für 1 Minute. Es folgte eine 5-minütige Verlängerung bei 72°C. Das resultierende PCR-Produkt wurde dann auf einem 0,9%-TBE-Agarosegel mit 1X TBE-Puffer laufen gelassen. Eine Bande der vorhergesagten Größe wurde ausgeschnitten und die DNS wurde von dem Gel aufgereinigt mit einem Qiaex II^®-Harz (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die DNS wurde mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Xba I verdaut, gefolgt von Extraktion und Fällung.
Das ausgeschnittene, restriktionsverdaute zsig37-DNS-Fragment wurde in das Plasmid NEE/pZP9 subkloniert, das mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Xba I geschnitten worden war. Der zsig37NEE/pZP9-Expressionsvektor baut das TPA-Leitpeptid ein und hängt eine Glu-Glu-Markierung (SEQ ID NO: 26) an den N-Terminus der das zsig37-Polypeptid kodierenden Polynukleotidsequenz an. Das Plasmid NEE/pZP9 (hinterlegt bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, ATCC Nr. 98668) ist ein Säugerexpressionsvektor, der eine Expressionskassette mit dem Maus-Metallothionein-l-Promoter, einem TPA-Leitpeptid, gefolgt von der Sequenz, die die Glu-Glu-Markierung kodiert (SEQ ID NO: 26), multiple Restriktionsstellen für das Einfügen kodierender Sequenzen und eine Terminationssequenz des menschlichen Wachstumshormons enthält. Das Plasmid enthält auch einen E. coli-Replikationsstartpunkt, eine auswählbare Säuger-Markerexpressionseinheit mit einem SV40-Promoter, -Enhancer und -Replikationsstartpunkt, einem DHFR-Gen und der SV40-Terminationssequenz.
zsig376CEE/pZP9
Ein durch PCR erzeugtes, 866 by langes zsig37-DNS-Fragment wurde in Übereinstimmung mit dem oben ausgeführten Vorgehen geschaffen unter Verwendung von ZC15721 (SEQ ID NO: 27) und ZC15035 (SEQ ID NO: 28} als PCR-Primer. Das gereinigte PCR-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Bam HI verdaut, auf Gel gereinigt unter Verwendung eines Qiaex II-Harzes, wie oben beschrieben.
Die ausgeschnittene und restriktionsverdaute zsig37-DNS wurde in das Plasmid CEE/pZP9 subkloniert, das mit Eco RI und Bam HI geschnitten worden war. Der zsig37CEE/pZP9-Expressionsvektor verwendet das natürliche zsig37-Signalpeptid, und das Glu-Glu-Epitop (SEQ ID NO:26) ist an den C-Terminus als eine Aufreinigungshilfe angehängt. Das Plasmid CEE/pZP9 (hinterlegt bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, ATCC Nr. 98668) ist ein Säuger-Expressionsvektor, der eine Expressionskassette mit dem Maus-Metallothionein-l-Promoter, multiple Restriktionsstellen für das Einfügen kodierender Sequenzen, eine Sequenz, die die Glu-Glu-Markierung kodiert (SEQ ID NO:26), ein Stop-Codon und eine menschliche Wachstumshormon-Terminationssequenz enthält. Das Plasmid hat auch einen E. coli-Replikationsstartpunkt, eine auswählbare Säuger-Markerexpressionseinheit mit einem SV40-Promoter, -Enhancer und -Replikationsstartpunkt, ein DHFR-Gen und die SV40-Terminationssequenz.
Für die N- und C-markierten Konstrukte wurden ungefähr 30 ng der restriktionsverdauten Inserts und 50 ng der entsprechenden Vektoren bei Raumtemperatur für 4 Stunden ligiert. Ein Mikroliter jeder Ligationsreaktion wurde unabhängig in DH10Bkompetente Zellen (GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) elektroporiert, gemäß der Anweisung des Herstellers, und auf LB-Platten, die 50 mg/ml Ampicillin enthielten, ausplattiert und über Nacht inkubiert.
Die Kolonien wurden durch PCR gescreent, wie oben beschrieben. Für die zsig37NEE/pZP9- und zsig37CEE/pZA9-Screens waren die Primer ZC13006 (SEQ ID NO: 29) und ZC13007 (SEQ ID NO: 20). Die PCR-Reaktion wurde bei 94°C für 2,5 Stunden inkubiert und dann wurden 25 Zyklen mit 94°C für 10 Sekunden, 58°C für 20 Sekunden und 72°C für 1 Minute laufen gelassen. Eine 5-minütige Verlängerung bei 72°C folgte. Die Insert-Sequenz der positiven Klone, 1013 by für zsig37NEE und ein 950 bp-Fragment für zsig37CEE, wurden durch eine Sequenzanalyse überprüft. Eine Plasmidzubereitung im großen Maßstab wurde unter Verwendung eines QIAGEN^® Maxi-Prep-Kit (Qiagen} gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Beispiel 5
Transfektion und Expression der zsig37NEE- und -CEE-Polypeptide
BHK 570-Zellen (ATCC Nr. CRL–10314) wurden in 10 cm Gewebekulturschalen ausplattiert und man ließ sie wachsen bis zu ungefähr 50–70% Konfluenz über Nacht bei 37°C, 5% CO₂, in DMEM/FBS-Medien (DMEM, GibcoBRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, USA), 5% fetales Rinderserum (Hyclone, Logan, Utah, USA), 2 μM L-Glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas, USA), 1 μM Natriumpyruvat (Gibco BRL)). Die Zellen wurden dann mit dem Plasmid zsig37NEE/pZP9 (N-terminale Glu-Glu-Markierung) oder zsig37CEE/pZP9 (C-terminale Glu-Glu-Markierung) transfiziert unter Verwendung von Lipofectamin^TM (Gibco BRL), in serumfreier (SF) Medienformulierung (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, USA), 2 mM L-Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat, 10 μg/ml Transferrin, 5 μg/ml Insulin, 10 μg/ml Fetuin und 2 ng/ml Selen). Sechzehn Mikrogramm zsig37NEE/pZP9 und 16 μg zsig37CEE/pZP9 wurden gesondert in 15 ml-Röhrchen auf ein Gesamtendvolumen von 640 μl SF-Medium verdünnt. In gesonderten Röhrchen wurden 35 μl LipofectaminTM (Gibco BRL) mit 605 μl SF-Medium vermischt. Die Lipofectamin^TM-Mischung wurde zu der DNS-Mischung hinzugefügt und man ließ sie ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fünf Milliliter SF-Medium wurden zu der DNS:Lipofectamin^TM-Mischung hinzugefügt. Die Zellen wurden einmal mit 5 ml SF-Medium gespült, abgesaugt und die DNS:Lipofectamin^TM-Mischung wurde hinzugefügt. Die Zellen wurden bei 37°C für 5 Stunden inkubiert, dann wurden 6,4 ml von DMEM / 10% FBS, 1% PSN-Medium zu der Platte hinzugefügt. Die Platte wurde bei 37°C über Nacht inkubiert und die DNS:Lipofectamin^TM-Mischung wurde durch frisches FBS/DMEM-Medium am nächsten Tag ersetzt. Am Tage „ 2" nach der Transfektion wurden die Zellen in dem Selektionsmedium (ESTEP #1 mit 1 μM MTX) aufgeteilt in 150 mm Platten, in Verhältnissen von 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200. Am Tage „5" nach der Transfektion wurden die Platten erneut mit frischem Selektionsmedium gefüttert.
Screenig-Kolonien
Ungefähr 10–12 Tage nach der Transfektion wurde eine 150 mm Kulturschale Methotrexat-resistenter Kolonien von jeder Transfektion ausgewählt, das Medium wurde abgesaugt, die Platten wurden gewaschen mit 10 ml serumfreiem ESTEP-2-Medium (668,7 g/50 l DMEM (Gibco), 5,5 g/501 Brenztraubensäure, Natriumsalz 96% (Mallinckrodt), 185,0 g/50 lNaHCO₃ (Mallinkrodt), 5,0 mg/ml, 25 ml/50 l Insulin, 10,0 mg/ml und 25 ml/50 l Transferrin). Das Waschmedium wurde abgesaugt und durch 5 ml serumfreies ESTEP 2 ersetzt. Ein steriles Teflongitter (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, Kalifornien, USA), vorimprägniert mit serumfreinem ESTEP 2, wurde dann über den Zellen plaziert. Ein in serumfreiem ESTEP 2 vorimprägniertes, steriles Nitrocellulose-Filter wurde dann über das Gitter gelegt. Orientierungsmarkierungen auf der Nitrocellulose wurden auf die Kulturschalen übertragen. Die Platten wurden dann für 5–6 Stunden in einem 37°C, 5% CO₂ Inkubationsgerät inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Filter entfernt und das Medium abgesaugt und durch DMEM/5% FBS, 1X PSN (Gibco BRL)-Medium ersetzt. Das Filter wurde dann in einen verschließbaren Beutel, der 50 ml Puffer (25 mM Tris, 25 mM Glyzin, 5 mM β-Mercaptoethanol) enthält, gegeben und in einem 65°C Wasserbad für 10 Minuten inkubiert. Die Filter wurden in 10% nicht fettem, trockenem Milch/Western-A-Puffer (Western A: 5OmM Tris pH 7,4, 5mM EDTA, 0,05% NP–40, 150mM NaCl und 0,25% Gelatine) für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem rotierendem Schüttler geblockt. Das Filter wurde dann mit einem Anti-Glu-Glu-Antikörper-HRP-Konjugat inkubiert in einer 1 : 1000-Verdünnung in 2,5% nicht fettem, trockenen Milch/Western-A-Puffer (Western A: 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% NP–40, 150 mM NaCl und 0,25% Gelatine) über Nacht bei 4°C auf einem rotierenden Schüttler. Das Filter wurde dann dreimal bei Raumtemperatur in PBS plus 0,1% Tween 20 gewaschen, 5–15 Minuten pro Waschgang. Das Filter wurde mit ECL-Reagens (Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA) entwickelt, gemäß den Anweisungen des Herstellers und einem Film (Hyperfilm ECL, Amersham) für ungefähr 5 Minuten ausgesetzt.
Der Film wurde mit der die Kolonien enthaltenden Platte ausgerichtet. Geeignete Kolonien wurden unter Verwendung des Film als Führung ausgewählt. Sterile, 3 mm Koloniescheiben (PGC Scientific Corp., Frederick, Maryland, USA) wurden in Trypsin eingeweicht und auf die Kolonien gelegt. Zwölf Kolonien für jedes Konstrukt wurden in 200 μl Selektionsmedium in einer 96 Well-Platte übertragen. Eine Reihe an sieben Zweifach-Verdünnungen wurden für jede Kolonie durchgeführt. Man ließ die Zellen für eine Woche bei 37°C wachsen, nach der Zeit wurden die Vertiefungen, die die geringste Zellverdünnung erhalten hatten, die nun in der optimalen Dichte vorlagen, ausgewählt, trypsiniert und auf eine 12 Well-Platte, die Selektionsmedium enthält, übertragen. Die 150 mm Kulturschale wurde auch trypsiniert und die verbleibenden Zellen wurden vereinigt und der Western-Analyse und der Mycoplasma-Untersuchung unterzogen. Der Pool wurde für die Lagerung eingefroren.
Die Klone wurden direkt von der 12 Well-Platte auf zwei T-75-Flaschen erweitert. Eine Flasche wurde beibehalten, um das Zellwachstum fortzusetzen, die zweite Flasche wurde in serumfreiem ESTEP 2 wachsen gelassen, die für Western-Blot-Analyse geerntet wurde. Klone von jedem der Expressionskonstrukte basierend auf der Western-Blot-Analyse, wurden ausgewählt, vereinigt und für die Kultur im großen Maßstab überführt.
Beispiel 7
Säuger-Expression von zsig37CEE im großen Maßstab
Eine T-162-Flasche, die konfluente, zsig37CEE-exprimierende Zellen enthält und eine, die zsig37NEE, gewonnen von dem oben beschriebenen Expressionsvorgang, enthält, wurden jeweils auf vier T-162-Flaschen erweitert. Eine der vier resultierenden Flaschen wurde verwendet, um vier Kryobehälter einzufrieren, und die anderen drei Flaschen wurden verwendet, um eine Nunc-Zellfabrik zu erzeugen.
Die Zellen der drei T-162-Flaschen von zsig37CEE und zsig37NEE wurden verwendet, um unabhängig zwei Nunc-Zellfabriken (10 Schichten, im Handel erhältlich von VWR) auszusäen. Kurz, die Zellen der oben beschriebenen T-162-Flaschen wurden unter Verwendung von Trypsin abgelöst, vereinigt und zu 1,5 Litern ESTEPI-Medium (668,7 g/50 l DMEM (Gibco), 5,5 g/50 l Brenztraubensäure, Natriumsalz 96% (Mallinckrodt), 185,0 g/50 l NaHCO₃ (Mallinkrodt), 5,0 mg/ml und 25 ml/50 l Insulin (JRH Biosciences), 10,0 mg/ml und 25 ml 50 l Transferrin (JRH Biosciences), 2,5 l/50 lfetales Rinderserum (charakterisiert) (Hyclone), 1 μM MTX, mit einem pH, der auf 7,05 +/- 0,05 angepasst war), vorgewärmt auf 37°C, hinzugefügt. Das Medium, das die Zellen enthielt, wurde dann in die Nunc-Zellfabriken über einen Trichter eingefüllt. Die Zellfabriken wurden in ein 37°C / 5,0% CO₂-Inkubationsgerät gestellt.
Bei einer Konfluenz von 80–100 % wurde ein Sicht-Kontaminationstest (Farbänderung von Phenolrot) mit den Inhalten der Nunc-Zellfabriken durchgeführt. Da keine Kontamination beobachtet wurde, wurde der Überstand der konfluenten Fabriken in einen kleinen Erntebehälter gefüllt, eine Probe entnommen und verworfen. Die anhaftenden Zellen wurden dann einmal mit 400 ml PBS gewaschen. Um die Zellen von den Fabriken abzulösen, wurden 100 ml Trypsin zu jeder hinzugefügt und entfernt, und die Zellen wurden dann für 5–10 Minuten in dem Rest-Trypsin inkubiert. Die Zellen wurden nach zwei 200 ml-Waschvorgängen mit ESTEPI-Medium gesammelt. Zu jedem der zehn ESTEPI-Medium enthaltenden Flaschen (1,5 Liter jeweils, bei 37°C) wurden 40 ml der gesammelten Zellen hinzugefügt. Eine 1,5-Liter-Flasche wurde dann verwendet, um eine Nunc-Fabrik zu beüllen. Jede Zellfabrik wurde in ein 37°C/5,0% CO₂-Inkubationsgerät gestellt.
Bei einer Konfluenz von 80–90% wurde ein Sicht-Kontaminationstest (Farbänderung von Phenolrot) an den Nunc-Zellfabriken durchgeführt. Da keine Kontamination beobachtet wurde, wurde der Überstand der konfluenten Fabriken in einen kleinen Erntebehälter gefüllt, eine Probe entnommen und verworfen. Die Zellen wurden dann einmal mit 400 ml PBS gewaschen. 1,5 Liter ESTEP2-Medium (668,7 g/50 l DMEM (Gibco), 5,5 g/50 l Brenztraubensäure, Natriumsalz 96% (Mallinkrodt), 185,0 g/50 l NaHCO₃ (Mallinkrodt), 5,0 mg/ml, 25 ml/50 l Insulin, 10,0 mg/ml und 25 ml/50 l Transferrin) wurden zu jeder Nunc-Zellfabrik hinzugefügt. Die Zellfabriken wurden bei 37°C/5,0% CO₂ inkubiert.
Nach ungefähr 48 Stunden wurde ein Sicht-Kontaminationstest (Farbänderung von Phenolrot) an den Nunc-Zellfabriken durchgeführt. Der Überstand jeder Fabrik wurde in kleine Erntebehälter eingefüllt. Frisches serumfreies Medium (1,5 Liter) wurde in jede Nunc-Zellfabrik gefüllt und die Fabriken wurden bei 37°C/5,0% CO₂ inkubiert. Ein Milliliter der Ernte des Überstandes für jedes Konstrukt wurde auf einen Mikroskop-Objektträger übertragen und der mikroskopischen Analyse auf Kontamination unterzogen. Die Inhalte der kleinen Erntebehälter für jedes Konstrukt wurden vereinigt und sofort gefiltert. Eine zweite Ernte wurde dann nach 48 Stunden durchgeführt, im Wesentlichen wie oben beschrieben, und die Zellfabriken wurden anschließend verworfen. Ein aseptisch zusammengebauter Filterkolonnenapparat wurde für die aseptische Filtration des geernteten Überstandes verwendet (konditioniertes Medium). Der Zusammenbau war wie folgt: Die Verrohrung wurde mit einem Draht an ein Opti-Cap-Filter (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA) und ein Gelman-Supercap-50-Filter (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan, USA) gebunden. Das Supercap-50-Filter wurde auch an einen sterilen, bedeckten Behälter, der in einem Abzug aufgestellt war, befestigt; die Rohrleitung, die sich stromaufwärts des Millipore Opti-Cap-Filters befand, wurde in eine Rollkolbenpumpe eingeführt; und das freie Ende der Verrohrung wurde in dem großen Erntebehälter angeordnet. Die Rollkolbenpumpe wurde zwischen 200 und 300 rpm laufen gelassen, bis das gesamte konditionierte Medium durch das 0,22 μm Endfilter in einen sterilen Sammelbehälter hindurchgeführt worden war. Das Filtrat wurde in eine, in einem 4°C kalten Raum hängende Reinigung gegeben. Das Medium wurde 10X konzentriert mit einem Millipore-Konzentrationsgerät mit einem Rückhaltevermögen von 5 kDA (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA) konzentriert, gemäß der Anweisung des Herstellers und der Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Anti-FLAG-Markierungsantikörpers (Kodak) unterzogen.

Zsig37CEE:

5 T-162 Flaschen =	0,12 mg/l, 38 kDa;
1 Fabrik, FBS =	0,12 mg/l, 38 kDa;
10 Fabriken, FBS =	0,12 mg/l, 38 kDa;
10 Fabriken (#1), SF =	1,2 mg/l, 38 kDa; und
10 Fabriken (#2), SF =	3,56 mg/l, 38 kDa

Zsig37NEE:

5 T-162 Flaschen=	0,137 mg/l, 35 kDa;
1 Fabrik, FBS =	0,137 mg/l, 35 kDa;
10 Fabriken, FBS =	0,137 mg/l, 35 kDa;
10 Fabriken (#1), SF =	0,137 mg/l, 35 kDa; und
10 Fabriken (#2), SF =	4,11 mg/l, 35 kDa

Beispiel 7
Aufreinigung von zsig37 NEE und zsig37 CEE
Falls nicht andersweitig festgestellt, wurden alle Arbeiten bei 4°C durchgeführt. Das folgende Vorgehen wurde verwendet für die Aufreinigung von zsig37, das N-terminale oder C-terminale Glu-Glu (EE)-Markierungen enthält. Ein Gesamtvolumen von 25 Litern konditioniertes Medium von Babyhamster-Nieren (BHK)-Zellen wurde nacheinander steril filtriert durch ein 4 inch, 0,2 mM Millipore (Bedford, Massachusetts, USA)-OptiCap-Kapselfilter und ein 0,2 mM Gelman (Ann Arbor, Michigan, USA)-Supercap-50-Filter. Das Material wurde dann auf ungefähr 1,3 Liter konzentriert unter Verwendung eines Millipore ProFlux-A30 Tangentialfluss-Konzentrationsgerätes, ausgestattet mit einer Amicon (Bedford, Massachusetts, USA) -S10Y3-Membran mit einem Rückhaltevermögen von 3000 kDa. Das konzentrierte Material wurde wiederum steril filtriert mit dem Gelman-Filter, wie oben beschrieben. Eine Mischung von Protease-Inhibitoren wurde zu dem konzentrierten, konditionierten Medium hinzugefügt zu einer Endkonzentration von 2,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, Missouri, USA), 0,001 mM Leupeptin, (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Indiana, USA) 0,001 mM Pepstatin (Boehringer-Mannhein) und 0,4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim). Eine 25,0 ml Probe einer Anti-EE-Sepharose, zubereitet wie oben beschrieben, wurde zu der Probe hinzugefügt für die Batch-Adsorption und die Mischung wurde sanft auf einem Wheaton (Millville, New Jersey, USA)-Rollkulturgerät für 18,0 h bei 4°C bewegt.
Die Mischung wurde dann in eine 5,0 × 20,0 cm Econo-Säule (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, Kalifornien, USA) gefüllt und das Gel wurde mit 30 Säulenvolumen Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Die nicht zurückgehaltene Durchflussfraktion wurde verworfen. Wenn die Extinktion des Hindurchgeflossenen bei 280 nm erst einmal geringer war als 0,05, wurde der Durchfluss der Säule auf Null reduziert und das Anti-EE-Sepharosegel wurde chargenweise mit 2,0 Säulenvolumen PBS, das 0,4 mg/ml von EE-Peptid (AnaSpec, San Jose, Kalifornien, USA) enthält, gewaschen. Das verwendete Peptid hat die Sequenz Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp, SEQ ID NO: 31). Nach 1,0 h bei 4°C wurde der Fluss wieder aufgenommen und das eluierte Protein wurde gesammelt. Auf diese Fraktion wurde Bezug genommen als die Peptidelution. Das Anti-EE-Sepharosegel wurde dann mit 2,0 Säulenvolumen 0,1 M Glycin, pH 2,5 gewaschen, und die Glycin-Waschflüssigkeit wurde getrennt gesammelt. Der pH der Glycin-eluierten Fraktion wurde auf 7,0 durch die Zugabe eines kleinen Volumens 10X PBS angepasst und bei 4°C für die zukünftige Analyse, falls notwendig, gelagert.
Die Peptidelution wurde auf 5,0 ml aufkonzentriert, unter Verwendung eines Membrankonzentrationsapparates mit einem Molekulargewicht-Rückhaltevermögen von 15000 (Millipore, Bedford, Massachusetts, USA), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die konzentrierte Peptidelution wurde von freiem Peptid durch Chromatographie auf einer 1,5 × 50 cm Sephadex G-50 (Pharmacia, Piscataway, New York)-Säule, equilibriert in PBS, bei einer Flussrate von 1,0 ml/min unter Verwendung einer BioCad Sprint HPLC (PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachusetts, USA) getrennt. Es wurden 2-ml-Fraktionen gesammelt und die Extinktion bei 280 nm wurde aufgenommen. Der erste Peak an Material, der bei 280 nm absorbiert und in der Nähe des Leervolumens der Säule eluiert, wurde gesammelt. Diese Fraktion war reines zsig37 NEE oder zsig37 CEE. Das reine Material wurde aufkonzentriert, wie oben beschrieben, analysiert durch SDS-PAGE und Western-Blotting mit Anti-EE-Antikörper, und Proben wurden genommen für die Aminosäure- Analyse und N-terminales Sequenzieren. Der Rest der Probe wurde in Aliquote aufgeteilt, und bei –80°C gemäß unseren Standardverfahren gelagert.
Elektrophorese von zsig37 NEE auf SDS-PAGE-Gelen in Abwesenheit von Reduktionsmitteln, zeigte eine Coomassie Blau-gefärbte Hauptbande mit einem anscheinenden Molekulargewicht von 39000 und zahlreiche Nebenbestandteile mit Molekulargewichten zwischen 60000 und 116000. Alle Banden zeigten eine Kreuz-Reaktivität mit Anti-EE-Antikörpern auf Western-Blots. In Anwesenheit von einer Reduktionsmittel war die einzige wahrgenommene Bande ein 39000 kDa-Protein und seine Coomassie Blau-Färbungsintensität war erhöht. Diese Bande zeigte auch Kreuz-Reaktivität mit dem Anti-EE-Antikörper in Western-Blots.
Für zsig37 CEE zeigte die Elektrophorese auf SDS-PAGE-Gelen in Abwesenheit von Reduktionsmitteln eine Coomassie Blau-gefärbte Hauptbande mit einem anscheinenden Molekulargewicht von 39000 und zahlreiche Nebenbestandteile mit Molekulargewichten zwischen 60000 und 116000. Auf Western-Blots zeigten nur die Banden mit anscheinenden Molekulargewichten von 150000, 116000 und 60000 eine Kreuz-Reaktivität mit dem Anti-EE-Antikörper. In Anwesenheit von Reduktionsmitteln wurde nur die Coomassie Blaugefärbte Bande bei 39000 kDa wahrgenommen und dieses Material zeigte eine Kreuz-Reaktivität mit dem Anti-EE-Antikörper in Western-Blots. Unter diesen Bedingungen wurde eine kleine Menge an Kreuz-reaktiven Material auch bei 150000 kDa gesehen.
Zubereitung von Anti-EE-Sepharose
Ein 100 ml Grundvolumen von Protein G-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA) wurde dreimal mit 100 ml PBS, das 0,02% Natriumazid enthielt, gewaschen, unter Verwendung einer 500 ml Nalgene 0,45 Mikron-Filtereinheit. Das Gel wurde mit 6,0 Volumen 200 mM Triethanolamin, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, Missouri, USA) gewaschen. Und ein gleiches Volumen einer EE-Antikörper-Lösung, die 900 mg Antikörper enthielt, wurde hinzugefügt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4°C wurde ungebundener Antikörper entfernt durch Waschen des Harzes mit 5 Volumen 200 mM TEA, wie oben beschrieben. Das Harz wurde in 2 Volumen TEA resuspendiert, in einen geeigneten Behälter überführt und Dimethylpimilimidat-2HCl (Pierce, Rockford, Illinois, USA), gelöst in TEA, wurde bis zu einer Endkonzentration von 36 mg/ml Gel hinzugefügt. Das Gel wurde bei Raumtemperatur für 45 Minuten geschüttelt und die Flüssigkeit wurde entfernt unter Verwendung der Filtereinheit, wie oben beschrieben. Nicht-spezifische Stellen auf dem Gel wurden dann durch Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 Volumen 20 mM Ethanolamin in 200 mM TEA geblockt. Das Gel wurde mit Volumen PBS, die 0,02% Natiumazid enthielt, gewaschen und in dieser Lösung bei 4°C gelagert.
Beispiel 8
Adhäsions- und Proliferationsassays
Die Fähigkeit von zsig37, Adhäsion und Ausbreiten von TF-1-Zellen zu stimulieren, wurde wie folgt untersucht. Eine Reihe an Verdünnungen wurde zubereitet aus C-terminalem Glu-Glu-markiertem zsig37, von 10 bis 0,0625 μg/ml, in entweder PBS oder ELISA-Überzugspuffer (0,1 M NaCO₃) und jede wurde in eine 96 Well-Platte (Costar, Pleasanton, Kalifornien, USA) in einer Konzentration von 100 μl/Well gegeben. Die Platten wurden bei 37°C, 5% CO₂ für 2 Stunden inkubiert. Die Platten wurden dann 3× gewaschen mit RPMI/10% FBS (RPMI 1640, 2 mM L-Glutamin, 110 μg/ml Natriumpyruvat, PSN und 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum) und es wurde ihnen ermöglicht, für 15 Minuten zu blocken.
TF-1-Zellen (abgeleitet von akut myeloischen Leukämiezellen) wurden in RPMI/10% FBS resuspendiert und in einer Konzentration von 10000 Zellen/Well in die zsig37CEEüberzogenen 96 Well-Platten in einem Endvolumen von 120 μl/Well ausplattiert. Die Platte wurde bei 37°C unter 5% CO₂ für 2 Stunden inkubiert. Die Platten wurden dann 3X mit PBS gewaschen und 200 μl/Well Wachstumsmedium (RPMI/10% FBS, 5 ng/ml GM-CSF) wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden mikroskopisch untersucht vor und nach dem Waschvorgang.
Eine Farbstoffeinbauuntersuchung wurde auch verwendet, um quantitativ die Anzahl anhaftender Zellen zu messen, basierend auf einer colorimetrischen Änderung und einem Anstieg im Fluoreszenzsignal. Alamar Blue^TM (AccuMed, Chicago, Illinois, USA) wurde zu den 96 Well-Platten hinzugefügt und die Zellen wurden bei 37°C unter 5% CO₂ über Nacht inkubiert. Die Platten wurden dann abgesucht unter Verwendung eines Fluorometers mit einer Exzitationswellenlänge von 544 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm. Es gab mehr anhaftende Zellen auf den zsig37CEE-PBS-überzogenen Platten als auf den zsig37CEE-0,1 M NaCO₃-überzogenen Platten. Zugabe von löslichem zsig37 hemmte die Adhäsion von Zellen an das gebundene zsig37 nicht.
Eine zweite Untersuchung wurde gemacht unter Verwendung von TF-1, DA-1 (einer IL-3-abhängigen Zelllinie, erhalten aus dem Lymphknoten einer Maus mit einem B-Zelllymphom durch Auswuchs in IL-3-Medium (bereitgestellt von Dr. Kenneth Kaushansky, University of Washington, Seattle, Washington, USA)), pre-B (p53-/-Mausknochenmarkzellen, IL-7-abhängig, B220+, Thy 1 niedrig, Sca-1+), und A7BaF-3-Zeltlinien, wie oben beschrieben, in einer Konzentration von 5000 Zellen/Well. BHK-Zellen wurden auch ausplattiert in einer Konzentration von 500 Zellen/Well. Zsig37 erhöhte das Wachstum von A7-BaF-3-Zellen und hemmte leicht das Wachstum von DA-1-Zellen.
Beispiel 9
Maus-Ortholog-Sequenz
Die neuen, menschlichen, zsig37-Polypeptid kodierenden Polynukleotide der vorliegenden Erfindung wurden verwendet, um eine Maus-EST-Datenbank nach homologen Maus-Sequenzen abzusuchen. Eine einzelne EST-Sequenz wurde entdeckt und vorhergesagt für die menschliche zsig37-Sequenz. Um die entsprechende cDNS zu identifizieren, wurde ein Klon, von dem angenommen wurde, dass er wahrscheinlich die gesamte kodierende Sequenz enthält, für das Sequenzieren verwendet. Unter Verwendung eines Invitrogen S. N. A. P.^TM-Miniprep-Kits (Invitrogen Corp.), wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers eine 5 ml über-Nacht-Kultur in LB + 50 μg/ml Ampicillin zubereitet. Die Matrize wurde sequenziert auf einem ABIPRISM^TM Modell 377 DNS-Sequenziergerät (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut, USA) unter Verwendung des ABIPRISM^TM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Corp.), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Oligonukleotide ZC694 (SEQ ID NO: 6), ZC6768 (SEQ ID NO: 32), ZC18297 (SEQ ID NO: 33), ZC18298 (SEQ ID NO: 34), ZC18402 (SEQ ID NO: 35), ZC18403 (SEQ ID NO: 36), ZC18456 (SEQ ID NO: 37), ZC18457 (SEQ ID NO: 38), ZC 18560 (SEQ ID NO: 39), ZC 18561 (SEQ ID NO: 40), ZC 18687 (SEQ ID NO: 41) und ZC18688 (SEQ ID NO: 42), wurden verwendet, um die Sequenz des Klons zu vervollständigen. Sequenzierreaktionen wurden durchgeführt in einem Hybaid OmniGene Temperature Cycling-System (National Labnet Co., Woodbridge, New York, USA). SEQENCHER^TM 3.1 Sequenzanalysesoftware (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan, USA) wurde verwendet für die Datenanalyse. Die resultierende 2559 bp-Sequenz ist in SEQ ID NO: 43 offenbart und die abgeleitete Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 44. Die vergleichende Anordnung mit der menschlichen zsig37-Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) zeigte eine 77%ige Identität auf der Nukleotidebene. Die mutmaßliche Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 44) hatte eine 77%ige Identität mit der menschlichen Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 2).
Beispiel 10
Zellbasierte Untersuchungen
Zsig37-Polypeptide wurden in einem in vitro-Hochdurchsatzansatz untersucht, um Substanzen zu identifizieren, die selektiv zelluläre Antworten in unsterblich gemachten Osteoblasten-Zelllinien aktivieren. Eine reife Osteoblasten-Zelllinie, abgeleitet von p53-/(defizienten) Mäusen, CCC4, die mit einem Plasmid transfiziert wurde, das ein induzierbares Serum-Antwort-Element (SRE) enthielt, das die Expression von Luziferase lenkt, wurde in der Untersuchung verwendet. Diese Zellen exprimieren auch endogene PTH-, PDGF- und bFGF-Rezeptoren. Die Stimulation des SRE und folglich die Expression von Luziferase in den CCC4-Zellen zeigt an, dass die chemische Einheit wahrscheinlich Mitogenesis in Osteoblasten stimuliert.
CCC4-Linien wurden trypsiniert und auf 5 × 10⁴ Zellen/ml in Plattiermedium (alpha-MEM, 1% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum, 1 mM Na-Pyruvat und 2 mM L-Glutamat) angepasst und (200 μl/Wett) in Dynatech Microlite undurchsichtigen, weißen Mikrotiterplatten (Dynatech, Chantilly, Virginia, USA) ausplattiert und über Nacht bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Das Wachstumsmedium wurde dann abgesaugt und durch 50 μl/Welt Assaymedium (F-12 HAM, 0,5% Rinderserumalbumin, 20 mM HEPES, 1 mM Na-Pyruvat und 2 mM L-Glutamat) ersetzt. Reihenverdünnungen von zsig37 wurden in Assay-Medium angesetzt (0,29–1000 ng/ml Assay-Konzentration) und zu den Vertiefungen hinzugefügt. Zsig37-Proben wurden dreifach untersucht. Serum (Negativ)- und bFGF (Positiv)-Kontrollen wurden auch verwendet. Endkonzentration von bFGF war 3 ng/ml. Die Kontrollen wurden 4-fach untersucht. Die Platten wurden für 4 Stunden bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Das Assay-Medium wurde dann abgesaugt und die Platten wurden einmal mit PBS gespült. Zu jeder Vertiefung wurden dann 25 μl Lyse-Puffer (Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) hinzugefügt. Die Platten wurden inkubiert für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Es wurden 50 Mikroliter/Welt Luziferase-Substrat (Luciferase-Assay Reagent, E1501, Promega Corp.) hinzugefügt und die Luziferaseaktivität wurde detektiert unter Verwendung eines Labsystems LUMINOSKAN^® mit einer Geschwindigkeit von 2 Sekunden/Well; gefolgt von einer Verzögerung von 1 Sekunde. Die durchschnittlichen basalen (nicht induzierten) Signale wurden von allen Ablesungen abgezogen, die in Tabelle 5 als ein Prozentsatz der durch 3 ng/ml bFGF maximal erzeugten Induktion ausgedrückt sind.
Zsig37 stimuliert die Expression von Luziferase in diesem Ansatz, wodurch angezeigt wird, das die Osteoblasten stimulieren. Zsig37 stimuliert in einer Konzentration von 1000 ng/ml maximal zu 73 bis 75%.
Ein mimetischer Wachstumsfaktor-Gegenansatz wurde durchgeführt, um festzustellen, ob zsig37 als ein Wachstumsfaktor-Mimetikum wirkt, insbesondere für die Tyrosinkinaserezeptorliganden PDGF, bFGF und EGF (Insulin-R negativ). Eine klonale Zelllinie, abgeleitet aus Swiss 3T3-Mäusen, Swiss 3T3, die mit einem Plasmid transfiziert ist, das ein induzierbares Serum-Antwort-Element (SRE) enthält, das die Expression von Luziferase lenkt, wurde in dem Ansatz verwendet. Diese Zellen exprimieren auch endogene PMA-, EGF- und bFGF-Rezeptoren. Die Stimulation des SRE und folglich die Expression von Luziferase in den Swiss 3T3-Zellen zeigt an, dass die chemische Einheit wahrscheinlich die PDGF-, bFGF- und EGF-Wachstumsfaktor nachahmt.
Swiss 3T3-Zellen wurden trypsiniert und auf eine Konzentration von 5 ×10⁴ Zellen/ml in Ausplattiermedium angepasst, ausplattiert und inkubiert, wie oben beschrieben. Das Wachstumsmedium wurde dann abgesaugt und durch Assaymedium (F-12 HAM, 0,5 Rinderserumalbumin, 20 mM HEPES) in einer Konzentration von 50 μl/Well ersetzt. Reihenverdünnungen von zsig37 wurden in Assaymedium durchgeführt (0,29–1000 ng/ml Assayendkonzentration) und zu den Vertiefungen hinzugefügt. Zsig37-Proben wurden 3-fach untersucht. Eine Serum (Negativ)- und bFGF (Positiv)-Kontrolle, um die Zellproliferation zu fördern, wurden auch verwendet. Die Endkonzentration von bFGF war 3 ng/ml. Kontrollen wurden 4-fach untersucht. Die Platten wurden für 5 Stunden bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Das Assaymedium wurde dann abgesaugt und die Platten wurden einmal mit PBS gespült. Zu jeder Vertiefung wurden dann 25 μl Lysepuffer (Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) hinzugefügt. Die Platten wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Vierzig Mikroliter/Welt Luziferasesubstrat (Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp.) wurden hinzugefügt und die Luziferaseaktivität wurde detektiert unter Verwendung des Labsystems LUMINOSKAN^© mit einer Geschwindigkeit 2 Sekunden/Well; gefolgt von einer Verzögerung von 1 Sekunde. Die durchschnittlichen basalen (nicht induzierten) Signale wurden von allen Ablesungen abgezogen, die als ein Prozentsatz der durch 3 ng/ml bFGF maximal erzeugten Induktion ausgedrückt sind. Eine 5-stündige Behandlung dieser Zelllinie mit bFGF, DDGF, EGF oder PMA führt zu einer 25–50-fachen Induktion der SRE-Luziferase-Expression.
Zsig37 scheint nicht die Expression von Luziferase in dieser Untersuchung zu stimulieren. Zsig37 stimuliert in einer Konzentration von 1000 ng/ml maximal zu 0,2 bis 0,1%.
Beispiel 10
In vivo-Applikation von zsig37 im Wege der adenoviralen Zufuhr
Vierundzwanzig männliche und vierundzwanzig weibliche C57B16/J-Mäuse, ungefähr 12 Wochen alt (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA) wurden gewogen, die Körpertemperatur wurde gemessen und die Futteraufnahme wurde täglich für vier Tage vor der Injektion (Tage –4 bis –1) überwacht. Am Tage 0 wurden die Mäuse in drei Gruppen aufgeteilt und erhielten 0,1 ml Virus (AdV-leer 1,8 × 1011 Viruspartikel/0,1 ml oder AdVzsig37-CEE 5 × 1011 Viruspartikel/0,1 ml) durch intravenöse Schwanzveneninjektion, oder gar keine Injektion. Die Injektion sollte in der Infektion der Leber des Wirtes resultieren und die Expression des viral zugeführten Gens sollte innerhalb von 24 Stunden beginnen und für 1 bis 4 Wochen andauern. Drei Mausgruppen wurden untersucht. Gruppe 1, unbehandelt, n = 8, jeweils männlich und weiblich. Gruppe 2, AdV-leer (leeres Virus), n = 8, jeweils männlich und weiblich. Gruppe 3, AdV-zsig37CEE, n = 8, jeweils männlich und weiblich.
Die Körpertemperaturen, Gewichte und das Gewicht des aufgenommenen Futters der Tiere wurden während der 3-wöchigen Studie überwacht. Es wurde kein Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt.
Am Tag 21 wurden die weiblichen Mäuse der Euthanasie unterzogen und durch zervikale Dislokation geschlachtet, und am Tag 22 wurden dies die männlichen. Die Tiere wurden ausgeblutet und Gewebe geerntet für die Nekropsie.
Zum Zeitpunkt der Schlachtung wurde der Serumchemie-Standardplan durchgeführt. Leber-, Nieren- und Stoffwechselparameter lagen alle innerhalb von normalen Bereichen. Es gab jedoch einen Unterschied zwischen der zsig37-behandelten Gruppe und der mit leeren Viren behandelten Gruppe. Die zsig37-Tiere hatten einen höheren lipämischen Durchschnittsindex als die leeren Viruskontrollen. Der Unterschied war nicht signifikant, es wurde jedoch eine weitere Untersuchung angeordnet. Der Gesamtgehalt an freien Fettsäuren wurde in dem verbleibenden Serum jedes Tieres untersucht. Ein statistisch signifikanter Unterschied in den Serumspiegeln freier Fettsäuren wurde zwischen männlichen Mäusen (p = 0,0379), die das leere Virus erhielten, und jenen, die zsig37-kodierende Viren enthielten, gesehen; die zsig37-Mäuse hatten höhere Spiegel. Ein Unterschied, obwohl nicht statistisch signifikant, wurde auch in weiblichen Mäusen (p = 0,3357) gesehen. Leber, Milz, Niere, Thymus, Herz und Gehim wurden nach der Entnahme gewogen. Kein Unterschied wurde gefunden zwischen den Behandlungsgruppen. Die histopathologische Analyse dieser Gewebe und des Knochenmarks offenbarte keine Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen.
Um die obigen Ergebnisse zu bestätigen, wurde eine zweite Prüfung durchgeführt, wie oben mit den folgenden Abwandlungen. Drei Gruppen, a) unbehandelt und gefastet, b) AdVleer und gefastet, c) AdV-zsig37-CEE und gefastet, enthaltend 20 C57B16/J-Mäuse, jeweils 10 männliche und weibliche, wurden untersucht. Man ließ die Mäuse über Nacht fasten und 100 μl Serum wurden gesammelt, um einen Grundwert für die folgenden Parameter zu etablieren: Nüchternglucose, TP, alkalische Phosphatase, Cholesterin, Triglyceride, freie Fettsäuren und Insulin. Dreimal die Woche wurden Körpergewichte festgestellt. Am Tag 0 wurden den Mäusen in die laterale Schwanzvene 0,1 ml der geeigneten Viruslösung injiziert. Am Tag 17 wurde Blut gesammelt nach einem Fasten über Nacht. Nach 3 Wochen wurden die Mäuse geschlachtet und das gesamte Blut wurde gesammelt. Ein Teil des Bluts wurde mit EDTA vermischt, um CBCs anzuschauen und der Rest wird erneut untersucht und überprüft werden, wie oben beschrieben. Die Organe wurden gesammelt und der Rumpf für die Histopathologie aufbewahrt.
Beispiel 11
Vasodilatation von Aortenringen
Die Wirkung von zsig37 auf die Vasodilatation von Aortenringen wurde gemessen, gemäß dem Vorgehen von (Dainty et al., J. Pharmacol. 100: 767, 1990 und Rhee et al., Neurotox. 16: 179, 1995). Kurz, 4 mm lange Aortenringe wurden von 4 Monate alten Sprague Dawley-Ratten genommen und in modifizierte Krebs-Lösung (118,5 mM NaCl, 4,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO₄·7H₂O, 1,2 mM KH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂·2H₂O, 24,8 mM NaHCo₃ und 10 mM Glucose) gegeben. Die Ringe wurden dann an isometrische Kraftwandler (Radnoti Inc., Monrovia, Kalifornien, USA) angehängt und die Daten wurden mit einer Ponemah Physiologieplattform (Gould Instrument Systems, Inc., Valley View, Ohio, USA) aufgenommen und in eine oxygenierte (95% O₂, 5% CO₂), modifizierte 10 ml Gewebebad-Krebs-Lösung gegeben. Die Gewebe wurden angepasst auf ein Gramm Ruhespannung und es wurde ihnen ermöglicht, sich für eine Stunde vor der Untersuchung zu stabilisieren. Die Ringe wurden untersucht durch 5 μl Zugaben von 1 × 10^–7 M Noradrenalin (Sigma Co., St. Louis, Missouri, USA) zu einer Endkonzentration von ungefähr 1 × 10^–9 M, und von Carbachol, einem muskarinischen Acetylcholinagonisten (Sigma Co.) in einer Endkonzentration von 2 × 10^–7 M, um die Unversehrtheit der Ringe zu untersuchen. Nach jeder Untersuchung wurden die Ringe dreimal mit frischem Puffer gewaschen, 5 Minuten zwischen den Waschgängen, und es wurde ihnen ermöglicht, für eine Stunde zu ruhen. Um die Vasodilatation zu untersuchen, wurden die Ringe auf zwei Gramm kontrahiert, und es wurde ihnen ermöglicht, sich für 15 Minuten zu stabilisieren. Zsig37 wurde dann zu 1, 2 oder 3 der 4 Bäder hinzugefügt, ohne zu spülen, und die Spannung auf die Ringe wurde aufgenommen und mit den Kontrollringen verglichen. Die Ringe wurden dann im Hinblick auf die Kontraktion mit Noradrenalin untersucht, wie oben beschrieben. Die Ringe wurden in Konzentrationen von 323, 162 und 81 ng/ml zsig37 untersucht, aber eine Dosisantwort konnte nicht festgestellt werden. Um die statistische Signifikanz der Daten zu beurteilen, wurde ein Zufallstest durchgeführt, mit all den zsig37-und Kontroll-Ringen unter Verwendung von Dilatation als eine Bestimmungsgröße. Zehn der zwölf mit zsig37 untersuchten Ringe vasodialatierten, ebenso wie zwei der sieben Kontrollen. Der P-Wert ist 0,045 im Fisher's Exakt-Test. Es wurde geschlossen, dass zsig37 Vasodilatation in Noradrenalin-kontrahierten Aortenringen induziert.
Beispiel 12
Binden von zsig37 an Matrixproteine
Ein ELISA (Enzyme-gekoppelte Immunadsorptionsbestimmung) wurde verwendet, um das Binden von zsig37 an zahlreiche Matrixproteine und Komplement C1q zu messen. Die verwendeten Matrixproteine waren Rinderkollagen Typ I (Becton Dickinson, Lincoln Park, New Jersey, USA), Laminin, Vitronektin, Fibronektin, menschliches Kollagen Typen II, III, IV, V, VI (Chemicon International, Temecula, Kalifornien, USA). BSA V (Sigma Co.) wurde verwendet als eine Negativkontrolle. Die Proteine wurden erst unmittelbar vor der Verwendung in 2 × PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung, Sigma Co.) auf 100 μg/ml verdünnt und angepasst auf einen pH von 7,2 mit 0,1 N NaOH. Jede Proteinprobe wurde 4-fach in einer 96 Well-Platte ausplattiert (100 μl/Well). Der Platte wurde ermöglicht, über Nacht zu trocknen in einem Laminarströmungsabzug, und sie wurde dreimal mit 400 μl 5 mg/ml BSA in 1 × PBS gewaschen und trocken geblottet. Zsig37 wurde FITC-markiert, gemäß der Anweisung des Herstellers (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Zu jeder Vertiefung wurden 100 μl 1,8 μg/ml zsig37-FITC in 5% BSA, PBS hinzugefügt. Die Platten wurden für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, dann dreimal mit 5% BSA, PBS gewaschen. Zu jeder Vertiefung wurden dann 100 μl 1 : 400 Maus-Anti-FITCBiotin (Sigma Co.) hinzugefügt. Die Platte wurde für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal mit 5% BSA, PBS gewaschen. Die Platte wurde dann mit 100 μl 1 : 1000 Streptavidin/HRP (Amersham, Piscataway, New Jersey, USA) für 1 Stunde inkubiert und dreimal mit 5% BSA, PBS gewaschen. Die Platte wurde dann entwickelt unter Verwendung von Supersignal^® Ultra (Pierce, Rockford, Illinois, USA) gemäß der Anleitung des Herstellers. Nach dem Reagierenlassen für 1 Minute wurde die überschüssige Flüssigkeit von der Platte durch Umdrehen der Platte entfernt und die Platte wurde trocken geklopft. Die Platte wurde einem Röntgenstrahlfilm (Kodak, Rochester, New York) ausgesetzt.
Die Ergebnisse dieser Prüfung zeigten an, dass nur Fibronektin und die Kollagene I, II, III, V und VI signifikant an zsig37-FITC binden. Ein solches Binden wurde nicht beobachtet mit Laminin, Vitronektin, Kollagen IV oder der BSA-Kontrolle.
Beispiel 13
Spezifität der Zsig37-Bindung an Kollagen-Typ VI
Die ELISA-Bestimmung für die Bindung, wie beschrieben im Beispiel 12 wurde modifiziert, um das Binden quantitativ abzuschätzen. Zsig37-FITC, in einem Konzentrationsbereich von 0,41 μg/ml, wurde an 10 μg Kollagen Typ VI (Chemicon International), wie oben beschrieben, gebunden. Die Lumineszenz des Supersignal -Reagens wurde auf einem Wallac 1420 Plattenlesegerät (Wallac, Gaithersburg, Maryland, USA) gelesen und die Intensität wurde verwendet als ein quantitatives Maß der zsig37-FITC-Bindung an die ELISA-Platte.
Das Binden von zsig37 an Kollagen-Typ VI passt zu einer typischen hyperbolischen Bindungskurve (3a). Das gebundene zsig37-FITC, ausplattiert in einer Konzentration von 0,4 μg/ml, kann von dem Kollagen verdrängt werden durch die Zugabe von unmarkiertem Zsig37 in einem Konzentrationsbereich von 0,8 bis 8 μg/ml (3b). Diese Daten würden anzeigen, dass das Binden spezifisch ist für Domänen auf Kollagen Typ VI und dass es konzentrationsabhängig ist.
Beispiel 14
Zsig37-Bindung an Komplement C1q
Von Zsig37-FITC in einer Konzentration von 0,2 μg/ml, wurde gezeigt, dass es an Komplement C1q (Sigma Co.) in einer Konzentration von 0,1 bis 10 μg/ml, durch das im Beispiel 13 oben beschriebene Verfahren, bindet (4). Die Menge der Bindung ist konzentrationsabhängig und sättigbar.
Beispiel 15
Komplementinhibition durch Zsig37
Komplementbestimmungen wurden durchgeführt in 96 Well-Platten mit rundem Boden. Gelatine-Veronal-Puffer, enthaltend Magnesium und Calcium (141 mM NaCl, 1,8 mM Natriumbarbitol, 3,1 mM Barbitursäure, 0,1% Rindergelatine, 0,5 mM MgCl₂ und 0,15 mM CaCl₂), wurde verwendet für alle Serum-und Inhibitorverdünnungen, ebenso wie für Erythrozytensuspensionen. Fünfzig Mikroliter standardisierten menschlichen Komplementserums (Sigma Co.), verdünnt in einem Verhältnis von 1/37,5 (für eine Endverdünnung von 1/150) wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Der Inhibitor wurde 3-fach hinzugefügt, 50 μl/Well. Serum und Inhibitor wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis wurde gestartet durch die Zugabe von 100 μl 2 × 10⁸/ml unsensibilisierte Schaf-Erythrozyten (Colorado Serum Co., Denver, Colorado, USA), sensibilisierte Schaf-Erythrozyten, sensibilisiert unter Verwendung des Protokolls des Herstellers von Hämolysin (BioWhittaker Inc., Walkersville, Maryland, USA), und Kaninchen-Erythrozyten, die 16 mM EGTA und 4 mM Mg⁺⁺ enthielten. Eine Reihenverdünnung menschlichen Serums in Verhältnissen von 1/50 bis 1/400 wurde auch als eine Aktivitätskontrolle ausplattiert. Erythrozyten, lysiert mit destilliertem Wasser und verdünnt auf 100, 75, 50, 25 und 12,5 Prozent Lyse, wurden verwendet, um die prozentuale Komplementlyse zu quantifizieren. Die Platte wurde verschlossen und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert, wobei alle 15 Minuten gemischt wurde. Die Reaktion wurde gestoppt durch die Zugabe von 220 mM EDTA, 20 μl/Well, und die Platten wurden zentrifugiert bei 1500 × G für 10 Minuten. Einhundert Mikroliter Überstand wurden von jeder Vertiefung entfernt und in eine 96 Well-Platte mit flachem Boden für die Analyse überführt. Die Platte wurde ausgelesen bei 415 nm und die prozentuale Lyse wurde berechnet.
Zsig37 war wirksam beim Hemmen des klassischen Weges, sowohl mit sensibilisierten als auch mit unsensibilisierten Schaf-Erythrozyten (5). Es gab keine offensichtliche Hemmung des untersuchten alternativen Weges mit Kaninchen-Erythrozyten und EGTA. Der Mechanismus der Inhibition ist unbestimmt, aber da C1q zsig37 bindet, ist C1q das wahrscheinlichste Ziel.
Beispiel 16
Inhibition der Plättchenkollagenaktivierung durch zsig37
Blut wurde von gesunden Freiwilligen in Röhrchen, die Natriumcitrat enthielten, entnommen, aufbewahrt bei Raumtemperatur und innerhalb von vier Stunden nach der Entnahme verwendet. Gesamtblut wurde analysiert auf die Plättchenaktivierung unter Verwendung eines Chrono-Log 560A Whole Blood Lumi-Aggregometer (Chrono-Log Corp., Haverton, PA), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für jeden Testpunkt wurden 500 μl Blut zu einem Reagenzglas, das einen Rührstab und 500 μl isotonische Salzlösung, die zsig37 in Konzentrationen von 0 bis 20 μg/ml enthielt, hinzugefügt. Die Mischung wurde für vier Minuten inkubiert, gefolgt von der Plättchenaktivierung, gestartet durch die Zugabe von 5 μl 1 mg/ml vernetztem Kollagen (Chrono-Log Corp.) zu der Blut/zsig37-Mischung. Inhibition der Aktivierung durch ADP (Endkonzentration 10 μM) und Thrombin (Endkonzentration 1 U/ml) wurde auf einem ähnlichen Wege untersucht.
Die Inhibition der kollagenvermittelten Plättchenaktivierung durch zsig37 zeigt eine dosisabhängige Beziehung im Bereich zwischen 5 und 20 μg/ml (6a). Die Inhibition ist selektiv für die Kollagenaktivierung und hat keine Wirkung auf die durch ADP oder Thrombin stimulierte Aktivierung (6b). Die Kollagenaktivierung wurde nicht gehemmt durch ein anderes zu dem Komplement C1q verwandten Protein, zsig39 (ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung 09/140,804).
Beispiel 17
Stimulation des SKS-Fibroblastenwachstums durch Zsig37
Menschliches Fibronektin (25 μg/ml, GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) wurde in 96 Well-Platten (Costar, Pleasanton, Kalifornien, USA) in einer Konzentration von 100 μl/Well ausplattiert, und trocknen gelassen in einem Laminarströmungsabzug über Nacht. Menschliche SKS-Fibroblasten in DMEM (Gibco), enthaltend 10% fetales Rinderserum – niedrig Endotoxin (Hyclone, Logan, Utah, USA), wurden in einer Konzentration von 5000 Zellen/Well in den Fibronektin-überzogenen Platten ausplattiert und bei 37°C, 5% CO₂ für 2 bis 3 Tage inkubiert. Die Zahl der Zellen pro Platte wurde angepasst, um Nicht-Konfluenz zu erreichen. Die Zellen wurden dann zweimal gewaschen mit serumfreiem DMEM hi Glucose (Gibco) und Serum-ausgehungert durch Wachsen in serumfreiem DMEM hi Glucose für 24 Stunden. Zsig37 wurde dreifach zu den Vertiefungen hinzugefügt, in Konzentrationen von 312,2 ng/ml bis 10000 ng/ml in 100 μl DMEM. Die Zellen wurden dann für 48 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Die Zell-Proliferation wurde untersucht durch Hinzufügen von 15 μl MTT-Farbstofflösung (CellTiter96^TM-Kit, Promega) zu jeder Vertiefung. Die Platte wurde 4 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert und die Reaktion wurde gestoppt mit Solubilisierungs/Stop-Lösung (CellTiter96^TM-Kit, Promega), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Platte wurde für 1 Stunde inkubiert, um Formazan-Kristalle löslich zu machen, und die Extinktion wurde gemessen bei 570 nm mit einem Bezug bei 650 nm unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesegerätes.
Die Ergebnisse (7) zeigen einen dosisabhängigen Anstieg in der SKS-Fibroblastenanzahl über den Bereich der untersuchten zsig37-Konzentrationen. Diese Konzentrationen lagen innerhalb des Bereiches der Werte, die für die mitogenischen Wirkungen der Fibrinogen b-Kette (Gray, et al., Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 12, 684, 1995 und Gray, et al., J. Biol. Chem. 270, 26602, 1995) und für die Fibroblast-Zelladhäsion an ausplattiertem C1q (Bordin, und Ghebrehiwet, J. Immun. 145: 2520, 1990) beobachtet worden waren, von denen von beiden angenommen wird, dass sie mit Calreticulin der Zelloberfläche in Wechselwirkung treten.
Beispiel 18
Zsig37-Anti-Sera-Produktion
Polyklonales Kaninchen-Antiserum wurde zubereitet durch Immunisieren zweier weiblicher New Zealand White-Kaninchen mit zsig37-CEE, aufgereinigt aus BHK-Zellen. Das Protein wurde an das Trägerprotein Schlüssellochnapfschnecken-Hämozyanin (KLH) mit Glutaraldehyd konjugiert. Den Kaninchen wurde jeweils eine anfängliche intraperitoneale (ip) Injektion von 200 μg Peptid in vollständigem Freund's Adjuvans gegeben, gefolgt von ip Booster-Injektionen von 100 μg Peptid in unvollständigem Freund's Adjuvans alle drei Wochen. Sieben bis zehn Tage nach der Applikation der zweiten Booster-Injektion wurde Blut von den Tieren abgenommen und das Serum wurde gesammelt. Die Tiere wurden dann alle drei Wochen geboostert und Blut abgenommen.
Beispiel 19
Nachweis von der Proteinbindung von FITC-markiertem Zsig37 in Geweben
Die Proteinbindung von FITC-markiertem zsig37 in Geweben wurde wie folgt nachgewiesen: In Paraffin eingebettete und geschnittene menschliche Gewebe oder Mausembryonen auf Objektträgern wurden erhalten entweder von Handelsquellen (d. h. DAKO Corporation, Carpinteria, Kalifornien, USA; BioGenex, San Ramon, Kalifornien, USA; Novagen, Madison, Wisconsin, USA; und Biomeda, Foster City, Kalifornien, USA) oder vom Hause. Die menschlichen Gewebeschnitte schlossen ein: Nebenniere, Gehirn, Herz, Dünndarm, Dickdarm, Niere, Leber, Lunge, Eierstock, Pankreas, Prostata, Milz, Magen, Hoden, Schilddrüse und Uterus. Die Mausembryoschnitte waren von dem 16-Tage-Stadium.
Die Gewebeschnitte wurden entwachst unter Verwendung der Standardbedingungen von 3 × 5 Minuten in Xylen, 4 Minuten in 100% Ethanol (EtOH), 3 Minuten in 100% ETOH und 2 Minuten in 95% EtOH. Die Gewebeschnitte wurden dann einem 20-minütigem Antigenwiedergewinnungsverfahren bei 94°C gemäß den Anweisungen des Herstellers (DAKO Corporation) unterzogen, gefolgt von einer 20-minütigen 0,01% Pepsin/0,2 N HCl-Verdauung. Die Gewebeschnitte wurden zweimal in dH₂O und 1-mal in PBS/005% Tween 20 (Sigma, St. Louis, Missouri, USA)-Puffer gespült und dann für 45 Minuten mit 1 × PBS / 5% BSA/5% nicht fetter, trockener Milch (Carnation, Los Angeles, Kalifornien, USA) geblockt. Auf dieses folgte ein Avidin/Biotin-Block-Schritt, durchgeführt gemäß den Anweisungen des Herstellers (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, Kalifornien, USA). Die Gewebeschnitte wurden dreimal in 1 × PBS/0,05% Tween 20-Puffer gewaschen und dann mit der geeigneten Konzentration an FITC-markiertem Zsig37-Protein in PBS/5% BSA für 45–60 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Gewebeschnitte in 1 × PBS / 0,05 % Tween 20, wurden sie mit einer 1 : 400-Verdünnung eines Anti-FITC (mo) MAb-Biotin-Konjugates (Sigma) für 30–60 Minuten inkubiert, dreimal in PBS/0,05% Tween 20 gewaschen, und dann für 30–60 Minuten mit einer 1 : 500-Verdünnung von Streptavidin-FITC (NEN Life Science Products, Boston, Massachusetts, USA) inkubiert, gefolgt von zwei Waschvorgängen in 1 × PBS/0,05% Tween 20-Puffer und einem Waschvorgang in 1 × PBS ohne Tween 20. Die Gewebeschnitte wurden dann eingerahmt mit Antiverblassungs-Medium, enthaltend 0,5 μg/ml Propidiumiodid als Kontrastfarbe.
Signifikantes Binden wurde an Gefäßwänden und feinen, faserigen, bindegewebsartigen Geweben, wie z. B. kollagenartiger Matrix, in der Mehrheit der untersuchten menschlichen Gewebe- und Embryonenschnitte beobachtet.
Beispiel 20
Zsig37 in dem Kaninchen-Karotis-Verletzungsmodell
Zsig37 wurde angewandt in einem modifizierten Kaninchen-Karotis-Verletzungsmodell (Folts et al., Circulation 79: 116–24, 1989 und Golino et al., Thrombosis und Haemostasis 67: 302–5, 1992), um das Ausmaß des Schutzes, der angeboten wird, beim Verhindern des Gefäßverschlusses nach einer Quetschverletzung, zu bestimmen.
Vierunddreißig männliche, weiße New Zealand White-Kaninchen, ungefähr 3–6 Monate alt (R&R Rabbitry, Stanwood, Washington, USA) befanden sich in zwei Gruppen. Fünfzehn Kaninchen erhielten Dosen von zsig37 im Bereich von 2–13,5 μg/kg und 19 Kontroll-Kaninchen wurden mit PBS oder mit äquivalenten Mengen an PBS oder zsig39, einem anderen komplementverwandten Protein aus Adipozyten (WO99/10492), injiziert. Die Kaninchen wurden mit Ketamin (50 mg/kg, IM) anästhesiert und in einer Halothan-Inhalationsanästhesie für die Dauer der Untersuchung gehalten. Das Haar wurde von den Ohren und vom Hals abgeschert und ein Gefäßkatheter wurde in der Ohrrandvene für IV-Unterstützung platziert. Ein Mittellinieneinschnitt wurde im Hals gemacht und die Karotis wurde zugänglich gemacht. Ungefähr 5 cm der gemeinsamen Karotis, benachbart zu der Innen/Außen-Abzweigung, wurde freigelegt mit Hilfe von stumpfer Ablösung von dem umgebenden Gewebe und jegliche sichtbaren Seitenverzweigungen wurden kauterisiert. Eine Durchfluss-Sonde (Transonic Systems, Inc., Ithaca, New York, USA) wurde distal zu der voraussichtlichen Verletzungsstelle angeordnet und ein Basislinien-Blutfluss wurde etabliert. Ein 2,5 bis 3,0 cm-Abschnitt des Gefäßes wurde dann isoliert von dem Blutkreislauf unter Verwendung von atraumatischen Gefäßklemmen. Nach dem Entfernen des Blutes aus dem Gefäßsegment wurden 0,4 ml zsig37 in 0,9% Natiumchlorid oder 0,04 ml 0,9% Natriumchlorid als eine Kontrolle in den leeren Gefäßabschnitt, unter Verwendung einer 30 G-Nadel injiziert. Das Gefäß wurde ungestört belassen für eine 5-minütige Behandlung vor der Verletzung. Eine 1,0 cm-Quetschverletzung wurde dann dem Zentrum des Gefäßabschnittes zugefügt unter Verwendung einer geschützen Arterienklemme und für 10 Minuten ungestört belassen. Die Gefäßklemmen wurden dann entfernt und der Blutfluss wurde wiederhergestellt. Der Blutfluss wurde fortwährend für 60 Minuten überwacht, wonach die Kaninchen der Euthanasie unterzogen wurden und das Gefäß ausgeschnitten wurde für die histologische Analyse.
Es wurde keine Dosisabhängigkeit bei diesen Konzentrationen gesehen. Eine Metaanalyse aller zsig37-Dosen resultierte in einem signifikanten Anstieg in der offenen Zeit, im Vergleich zu Kontrollen in einem ungepaarten t-Test (P = 0,019).
Die prozentuale mittlere Offenzeit für die kombinierten Gruppen der negativen Kontrolltiere, wie abgeleitet von den Blutfluss-Aufzeichnungen, war 13,5% mit einer Standardabweichung von ±1,7%. Die prozentuale mittlere offene Zeit für die kombinierten zsig37-behandelten Gruppen an Tieren, wie abgeleitet von den Blutfluss-Aufzeichnungen, war 37,2% mit einer Standardabweichung von ±10,3%.
In einer zweiten Experimentenserie wurde Fluorescein-markiertes zsig37 in dem Modell der verletzten Karotis verwendet. Männliche New Zealand White-Kaninchen wurden anästhesiert, wie oben. Über einen Einschnitt im Hals wurde die Karotis freigelegt und ungefähr 5 cm des Gefäßes wurden von dem umgebenden Bindegewebe isoliert. Blut wurde aus dem isolierten Segment abgezogen und atraumatische Gefäßklemmen wurden angelegt. Ungefähr 0,05 ml Fluorescein-markiertes zsig37 (Konzentration 100 μg/ml) wurden in das isolierte Segment injiziert, um das Gefäß vollständig zu füllen, unter Verwendung einer 30 G-Nadel. Nach einer Aussetzungsdauer von 5 Minuten wurde das Gefäß verletzt und das Aussetzen dauerte für weitere 110 Minuten an, ehe die Klammern entfernt wurden und der Blutfluss wiederhergestellt wurde. Die Tiere wurden, wie oben beschrieben, der Euthanasie unterzogen nach 1, 10 und 60 Minuten nach dem Wiederherstellen des Blutflusses und die Gefäße wurden gesammelt und in Formalin fixiert für die histologische Beurteilung.
Markiertes zsig37 band bevorzugt an Rezeptoren in der Mitte der verletzten Gefäße. Markiertes zsig37 band nicht an Bereiche des Gefäßes, die nicht verletzt waren. Die Blutflusszeit vor dem Sammeln des Gefäßes scheint nicht die Menge an zsig37 zu beeinflussen, die an das Gewebe gebunden bleibt, d. h. es gab keinen Unterschied in der Menge des markierten zsig37, gebunden an die Gewebe in der ersten Minute, im Vergleich zu dem Sammelzeitpunkt nach 60 Minuten. Dies kann anzeigen, dass zsig37 fest an die verletzten Gefäße bindet und nicht durch den wiederhergestellten Blutfluss abgewaschen wird.
Die Wirkung von zsig37 auf Blutströmungsdynamiken nach der Gefäßverletzung in einem Kaninchen-Darmbeinarterien-Quetschverletzungs/Stenose-Modell wurde auch bewertet. Junge, erwachsene, männliche New Zealand White-Kaninchen wurden anästhesiert, wie oben beschrieben. Über einen Abdominal-Einschnitt wurde die Aorta-Darmbein-Abzweigung freigelegt und jedes Darmbein wurde von umgebenden Geweben befreit und die Hauptzweige wurden abgebunden. Jedes Darmbein wurde mit einer Ultraschall-Fluss-Sonde versehen, um den Blutfluss durch das Gefäß zu überwachen. Basierend auf Blutflussdaten wurde ein Darmbein ausgewählt, um für die Verletzung verwendet zu werden, und das andere wurde katheterisiert zur Zufuhr der Testprobe. Kaninchen wurden in Dosisgruppen von 6 Tieren/Gruppe aufgeteilt. Die zsig37-enthaltenden Testprobendosen, stiegen in halblogarithmischen Zuwächsen von 3–1000 μg/kg über die ausgewählte Infusionsdauer an. Die Testprobeninfusion wurde gestartet, gefolgt von der Schaffung einer kritischen Stenose, die den Blutfluss durch das Gefäß um ungefähr 50% reduzierte. Nach Schaffung der Stenose und einer Zeitspanne der Blutflussstabilisierung wurde das Gefäß verletzt durch Quetschen des Gefäßes zwischen den Klauen eines glatten Nadelhalters. Die Infusion wurde nach der Verletzung fortgesetzt für eine festgesetzte Zeitdauer, 10–20 Minuten. Der Blutfluss durch das verletzte Gefäß wurde überwacht für 60 Minuten nach der Verletzung. Die Tiere wurden der Euthanasie unterzogen, nach Abschluß der Studiendauer. Der untere Abschnitt der Abdominalaorta und jedes Darmbein wurde gesammelt und in Formalin fixiert für die histologische Beurteilung.
Blutflussparameter, bestimmt aus den Flussaufzeichnungen, schlossen den mittleren Fluss nach der Stenose, den mittleren Fluss nach der Verletzung und die Zeit, in der das Gefäß offen war, ein. Diese Daten legen nahe, dass eine Tendenz für zsig37 vorhanden ist, die gesteigerte Öffnungszeit zu fördern, mit einer erhöhten Dosis bis zu 300 μg/kg über eine 60-minütige Zeitdauer.
Beispiel 21
Relaxation Serotonin-induzierter Kontraktionen des Ratten-Aortenrings
Männliche Sprague-Dawley-Ratten, ungefähr 3 Monate alt, wurden leicht mit CO₂ anästhesiert und dann enthauptet. Die Brustaorta wurde dann schnell entfernt und in einen modifizierten Krebs-Henseleit-Puffer (NaCl, 118,2 mM; KCl, 4,6 mM; CaCl₂, 2,5 mM; MgSO₄, 1,2 mM; NaHCO₃, 24,8 mM; KH₂PO₄, 1,2 mM und Glucose, 10,0 mM) gegeben. Von jeder Ratte wurden vier 2–3 mm lange Aortenringabschnitte geschnitten, nachdem das rauhe Ende der Aorta verworfen worden war. In einigen Experimenten wurde das Endothelium freigelegt, vor dem Schneiden der Ringabschnitte, indem das Lumen der Aorta entlang einer 21 Gauge-Nadel gerieben wurde. Freilegen des Endotheliums wurde durch Zugabe des Acetylcholinanalogs, Carbachol, verwirklicht, vor der Bestimmung der konzentrationsabhängigen zsig27-Antworten. In Abwesenheit des Endotheliums vasorelaxiert Carbachol verengte Gefäßringabschnitte nicht.
Die Ringe wurden fixiert und mit Kraft-Verdrängungsumwandlern in oxygenierten (95% O₂, 5% CO₂) ummantelten Glasorganbädern, gehalten bei 30°C in modifiziertem Krebs-Henseleit-Puffer, pH 7,4 verbunden. Die Ruhespannung wurde auf 1 gm gesetzt und kontinuierlich erneut angepasst auf 1 gm über eine 1-ständige Inkubationsdauer. Frischer, oxygenierter modifizierter Krebs-Henseleit-Puffer wurde hinzugefügt zu den Bädern, alle 15 Minuten während der Ruhe-Inkubationsdauer. Nach dem Ende der 1-ständigen Inkubation wurden die Ringabschnitte durch die Zugabe von 10 μM Serotonin kontrahiert. Nachdem die maximale Kontraktion erreicht worden war, wurden ungefähr 15–20 Minuten nach der Zugabe des Serotonins, kumulative Konzentrations-Antwort-Kurven für zsig37 erstellt. Zsig37 wurde zu 5 ml Bädern in Volumen von 5 bis 150 μl hinzugefügt, für Endkonzentrationen im Bereich von 1 ng/ml bis zu 40 μg/ml. Die Lebensfähigkeit der Ringabschnitte wurde überprüft am Ende der Konzentrationsantwort durch die Zugabe von Forskolin (2,5 μM oder 25 μM) oder Nitroglycerin (22 μM).
Die Zugabe von zsig37 induzierte eine konzentrationsabhängige Vasorelaxation Serotonin-kontrahierter Ratten-Aortenabschnitte mit und ohne intaktes Endothelium. Relaxation in Antwort auf zsig37 wurde zuerst beobachtet bei Konzentrationen über 100 ng/ml. Relaxation wurde beobachtet ungefähr 30–60 Sekunden nach den Zugaben jeder zsig37-Konzentration zu dem Bad und die Relaxationsantworten erreichten ein Plateau innerhalb von 3–5 Minuten nach der Zugabe von zsig37. Die Eigenart der Relaxationsantwort auf zsig37 zeigt an, dass die Vasorelaxation ein Rezeptor-Zweiter-Bote-vermitteltes Ereignis ist. Zusätzlich zeigt die Fähigkeit von zsig37, Endothelium-entblöste Aortenabschnitte zu vasorelaxieren, dass zsig37 direkt auf die glatten Muskelzellen wirkt, um die vasorelaxierende Antwort auszulösen.
Beispiel 22
Identifizierung der Zellen, die den zsig37-Rezeptor exprimieren unter Verwenden von in situ-Hybridisierung
Spezifische menschliche Gewebe wurden isoliert und für die zsig37-Expression durch in situ-Hybridisierung gescreent. Die verschiedenen zubereiteten, geschnittenen und der in situ-Hybridisierung ausgesetzten menschlichen Gewebe schlossen Aorta, Herz, Lymphknoten, Plazenta, Prostata, Speicheldrüse, Haut und Hoden ein. Die Gewebe wurden in 10% gepuffertem Formalin (Surgipath, Richmond, Illinois, USA) fixiert und in Paraplast X-tra (Oxford Scientific, St. Louis, Missouri, USA) eingebettet und in 5 μm mit einem Reichart-Jung 2050–Mikrotom (Leica Instruments GmbH, Nussloch, Deutschland) geschnitten. Die Gewebe wurden auf 4–8 Mikron geschnitten. Die Gewebe wurden zubereitet unter Verwendung eines Standardprotokolls („Development of nono-isotopic in situ Hybridization", Laboratory of Experimental Pathology, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Park Triangle, North Carolina, USA). Kurz, von den Gewebeschnitten wurde Paraffin entfernt mit HistoClear (National Diagnostics, Atlanta, Georgia, USA) und dann mit Ethanol entwässert. Als nächstes wurden die Schnitte jeweils verdaut mit Proteinase K (50 μg/ml) (Boehringer Mannheim, Indinanapolis, Indiana, USA) bei 37°C für 2 bis 20 Minuten. Auf diesen Schritt folgte die Acetylierung und Rehydrierung der Gewebe.
Drei durch PCR hergestellte in situ-Sonden wurden für die menschliche zsig37-Sequenz entworfen. Zwei Sätze an Oligonukleotidprimern wurden entwickelt, um Sonden herzustellen für getrennte Bereiche der zsig37-cDNS: (1) die Oligonukleotide ZC23,689 (SEQ ID NO: 45) und ZC23,694 (SEQ ID NO: 46) wurden verwendet, um eine 414 bp-Sonde für zsig37 zu erzeugen; (2) ZC23,703 (SEQ ID NO: 47) und ZC23,697 (SEQ ID NO: 48) wurden verwendet, um eine 896 bp-Sonde für zsig37 zu erzeugen; (3) ZC24,441 (SEQ ID NO: 49) und ZC24,442 (SEQ ID NO: 50) wurden verwendet, um eine 290 bp-Sonde für zsig37 zu erzeugen. Die Gegensinn-Oligos jedes Satzes enthielten auch die Arbeitssequenz für den RNS-Polymerasepromoter von T7, um die leichte Transkription der Gegensinn-RNS-Sonden dieser Produkte zu ermöglichen. Die PCR-Produkte wurden gereinigt durch Qiagen-Drehsäulen (Qiagen, Inc., Chatsworth, Kalifornien, USA) gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. Die Sonden wurden anschließend mit Digoxigenin (Boehringer) oder Biotin (Boehringer) markiert, unter Verwendung eines in vitro- Transkriptionssystems (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA), gemäß den Anweisungen des Herstellers.
In situ-Hybridisierung wurde durchgeführt mit einer Digoxigenin- oder Biotinmarkierten zsig37-Sonde, wie oben beschrieben. Die Sonde wurde zu den Objektträgern hinzugefügt in einer Konzentration von 1 bis 5 pmol/ml für 12–16 Stunden bei 50–60°C. Die Objektträger wurden anschließend gewaschen in 2 × SSC und 0,1 × SSC bei 50–55°C. Die Objektträger wurden anschließend gewaschen in 2 × SSC und 0,1 × SSC bei 50–55°C. Die Signale wurden amplifiziert unter Verwendung der Tyramid-Signal-Amplifikation (TSA in situ-indirekter Kit, NEN, Boston, Massachusetts, USA) und sichtbar gemacht mit einem Vektor Red-Substratkit (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien, USA), gemäß den Anweisungen der Hersteller. Die Objektträger wurden dann gegengefärbt mit Hematoxylin (Vector Laboratories).
Positive Signale wurden in der menschlichen Aorta, Herz, Prostata, Speicheldrüsen und Hoden gesehen. Die positiv gefärbten Zellen schienen Endothelzellen von Gefäßen mit kleinem Durchmesser in der Adventitia, die die Aorta umgibt, mesotheliale Zellen, die über dem Epikard liegen, Azinuszellen der Speicheldrüse und verstreute mononukleäre Zellen, Trophoblasten der Plazenta, epitheliale Zellen der Prostata und Schichtepithel der Samenkanälchen der Hoden zu sein.
Beispiel 23
SEC-MALLS-Analyse von Zsig37
Zsig37 enthält eine N-terminale kollagenähnliche Domäne, ebenso wie einen Cterminalen globulären Bereich, der Homologie zu der Tumornekrosefaktor-Familie hat, und ähnlich anderen solchen Proteinen wird von zsig37 erwartet, dass es Multimere bildet. Aufgereinigtes zsig37, analysiert unter Verwendung eines ESI-Ionenfallen-Massenspektrometers (Finnigan Matt, San Jose, Kalifornien, USA), zeigte die Anwesenheit von Spezies an, die sich Trimeren und 9meren annähern, was im Vergleich zu anderen homologen Proteinen ein unerwartetes Ergebnis war. Das Peptidkartieren von zsig37 unter Verwendung von LC-MS/MS auf einem ESI-Ionenfallen-Massenspektrometer (Finnigan Matt) offenbarte, dass zahlreiche Cystein-Reste modifiziert waren mit einer S-Cysteinylgruppe. Es kann sein, dass die Modifikation von Schlüssel-Cysteinresten in dem zsig37-Protein während der Fermentation mit freiem Cystein im Medium die richtige Oligomerverknüpfung dieses Moleküls verhindert.
Um mehr zu verstehen, wurde ein Vergleich von reduziertem und nicht-reduziertem zsig37 gemacht, unter Verwendung einer Biosep S-300 Größenausschlusssäule mit einem Durchfluss von 1,0 ml/Minute (7,8 × 3000 mm; Phenomenex, Torrance, Kalifornien, USA) auf einem HP 1050 HPLC-Gerät (Hewlett Packard, Heidelberg, Deutschland). Das HP 1050 war an Lichtstreu- und Brechnungsindexdektoren, miniDAWN und Optilab DSP (Waytt Technology, Santa Barbara, Kalifornien, USA), für on-line SEC-MALLS angeschlossen.
Ein Milligramm rekombinantes zsig37 (1,0 mg/ml) wurde zu TCEP in einem Verhältnis von 10 : 1 mol/mol TCEP zu zsig37 hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 70 Minuten gehalten. Sechzig Mikroliter des reduzierten zsig37 wurden für die SEC-MALLS-Analyse injiziert und der Rest reduziertes zsig37 wurde in 0,5–3,0 ml Slide-A-Lyzer-Kassetten, 10K MWCO (Pierce, Rockford, Illinois, USA) unter Rühren gegen PBS, pH 7,4 dialysiert mit drei Pufferänderungen wie folgt: 1 Liter PBS bei Raumtemperatur für 4 Stunden, 1 Liter PBS bei 4°C über Nacht und 1 Liter PBS bei Raumtemperatur für 4 Stunden.
Nach der Dialyse wurde der Oxidation ermöglicht fortzuschreiten bei 4°C. Die Oxidation wurde überwacht durch SEC-MALLS-Analyse von Aliquoten, die an drei Zeitpunkten, T = 0 Stunden, T = 24 Stunden und T = 96 Stunden genommen worden waren. Molekulargewichtswerte wurden bestimmt unter Verwendung des LS-RI Zwei-Detektor-Verfahrens.
Analyse des reduzierten, dialysierten rekombinaten zsig37 scheint anfänglich die Bildung von Hexameren und 18meren, wie nachgewiesen durch SEC-MALLS, anzuzeigen, was stärker in Übereinstimmung ist mit den in Homologen beobachteten Oligomerzuständen. Diese Formen waren auch wirksam in in vitro-Untersuchungen.
Beispiel 24
Zsig37-Bindung an Monozyten
CD 14-positive Monozyten wurden aus einem gefrorenen peripheren Blut-Aphareseprodukt isoliert unter Verwendung eines positiven Selektionsverfahrens mit Miltenyi-Perlen (Miltenyi Biotec, Auburn, Kalifornien, USA). Gereinigte Zellen waren zu mehr als 80% CD14-positiv im Wege der FACS-Färbung. Die Zellen wurden resuspendiert auf 1 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI + 10% fetales Rinderserum (FBS) und in 100 mm Gewebekulturschalen ausplattiert, 5 ml/Platte. Rekombinantes menschliches γ-Interferon wurde hinzugefügt in einer Konzentration von 100 ng/ml und die Zellen wurden inkubiert bei 5% CO₂, 37°C für 48 Stunden.
Die Zellen wurden von den Platten entfernt durch nichtenzymatische Verfahren, unter Verwendung von sowohl EDTA als auch Abschaben, konzentriert durch Zentrifugation, resuspendiert in FACS-Färbepuffer und in Aliquote aufgeteilt zu 500000 Zellen/Röhrchen für das Färben. Nicht-aktivierte Zellen wurden gewonnen durch Durchführen einer anderen CD 14-Selektion mit demselben Aphereseprodukt nach 48 Stunden in γ-Interferon. Die Zellen wurden inkubiert in variierenden Konzentrationen von biotinylierten zsig37, gefolgt von Strepavidin PE. Jegliches Blocken mit „kaltem" zsig37 wurde durchgeführt auf Eis für 30 Minuten. Ungebundenes Protein wurde entfernt durch einmaliges Waschen in FACS-Puffer. Die Bindung wurde quantifiziert unter Verwendung eines FACS-Caliburinstrumentes (Becton Dickinson, Lincoln Park, New Jersey, USA) und als ein Signal über einem sekundären Antikörper als einziger Kontrolle ausgedrückt. Monozytenaktivierung wurde durch einen Anstieg um ungefähr 1 log in ICAM-1-Expression in γ-Interferon-behandelten Zellen nachgewiesen.
Zsig37-Bindung wurde detektiert, sowohl in aktivierten als auch in nicht aktivierten Monozyten mit einem Anstieg in der zsig37-Bindung, die in γ-Interferon-behandelten Zellen beobachtet wurde. Eine Bindung wurde nachgewiesen knapp bis zu 1,5 μg/ml, der niedrigsten untersuchten Konzentration. In einer Konzentration von 15 μg/ml, war das Binden ungefähr 4-fach erhöht in aktivierten Zellen. Eine leichte Reduktion (ungefähr 10%) in der Bindung wurde in aktivierten Zellen nur gesehen, wenn diese mit einem 70-fachen Überschuss an „kaltem" zsig37 vorbehandelt worden waren. Die Anstiege der zsig37-Bindung in aktivierten Monozyten legt die Heraufregulierung des Bindens von zsig37 an Monozyten-Proteine/Rezeptoren durch entzündliche Cytokine nahe. Dies könnte möglicherweise in der zsig37-Verwicklung in der Monozytenphagozytose, dem Abtöten von Mikrobien und zellulärer Zytotoxizität resultieren. Nach 2 Tagen in Kultur waren Makrophagen in der Kultur vorhanden und zsig37 kann vorzugsweise an diese Unterklasse von Zellen binden. Es sind keine guten Makrophagen-Marker erhältlich, um festzustellen, ob dies geschieht. Zsig37 band auch an eine Maus-Monozyten/Makrophagen-Linie, RAW 264.7 (ATCC Nr. CRL-2278), was eine Makrophagen-Spezifität anzeigt.
Von dem vorangegangenen wird geschätzt werden, dass obwohl spezifische Ausführungsbeispiele der Erfindung hierin beschrieben worden waren, für Zwecke der Erläuterung zahlreiche Modifikationen können gemacht werden, ohne von dem Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Demgemäß wird die Erfindung nicht beschränkt mit der Ausnahme als durch die anhängenden Ansprüche.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Komplement verwandten Proteins aus Adipocyten, das die thrombogenische und Komplementaktivität im Gefäßsystem verringert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Förderung des Blutstroms im Gefäßsystems eines Säugers.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Polypeptid die thrombogenische und Komplementaktivität durch Inhibition des Komplementweges und Inhibition der Collagen vermittelten Plättenhaftung, -aktivierung oder -aggregation verringert.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, worin die Zubereitung für die Verabreichung vor, während oder nach einer akuten Gefäßverletzung in dem Säuger bestimmt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 3, worin die Verletzung auf einer Gefäßrekonstruktion beruht.
Verwendung gemäß Anspruch 4, worin die Gefäßrekonstruktion die Angioplastie, die Transplantation eines Koronararterienbypasses, die Endarteriektomie, mikrovaskulare Reparaturen oder die Anastomose eines Gefäßtransplantats umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 3, worin die Verletzung auf Verletzung, Infarkt oder Aneurisma beruht.
Verwendung eines Komplement verwandten Proteins aus Adipocyten, worin das Protein verletztes kollagenöses Gewebe inert gegenüber der Komplementaktivierung, der thrombotischen Aktivität oder der Immunaktivierung macht, bei der Herstellung eines Medikaments zur Beruhigung beschädigter kollagenöser Gewebe in einem Säuger.
Verwendung gemäß Anspruch 7, worin das beschädigte kollagenöse Gewebe auf mit Verletzungen verbundenen Ischemien und Reperfusionen beruhen.
Verwendung gemäß Anspruch 8, worin die Verletzung eine traumatische Verletzungsischemie, die intestinales Strangulation oder eine Verletzung umfasst, verbunden mit der Pre- und Post-Etablierung eines Blutstroms.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 8–9, worin das Polypeptid an einen Säuger verabreicht werden soll, der an einer kardiopulmonären Bypass-Ischemie und Rezidiv (recesitation), einem Myokardinfarkt oder posttraumatischen Vasospasmen leidet.
Verwendung gemäß Anspruch 10, worin die posttraumatischen Vasospasmen den Herzinfarkt, die perkutane transluminale Angioplastie, die Endateriektomie, die Gefäßverletzung durch Unfall oder die chirurgisch induzierte Gefäßverletzung umfassen.
Verwendung eines Komplement verwandten Proteins aus Adipocyten, bei der das Protein die Oberfläche eines prostetischen Biomaterials inert gegenüber der Komplementaktivierung, der thrombotischen Aktivität oder der Immunaktivierung macht, bei der Herstellung eines Medikaments zur Beruhigung der Oberfläche eines prostetischen Biomaterials für die Verwendung in Verbindung mit einem Säuger.
Verwendung eines Komplement verwandten Proteins aus Adipocyten, bei der das Protein die Progression der Wundheilung fördert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Vermittlung der Wundheilung in einem Säuger.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das Komplement verwandte Protein aus Adipocyten ein Polypeptid umfasst, umfassend eine Sequenz von Aminosäureresten, die zu mindestens 75% der Aminosäuresequenz identisch zu den Resten 26– 281 der SEQ ID Nr. 2 ist, worin die Sequenz umfasst: Gly-Xaa-Xaa- oder Gly-Xaa-Pro-Repeats, welche eine Kollagendomäne bilden, worin Xaa jede Aminosäure darstellt, und einen carboxyterminalen-globulären Anteil
Verwendung gemäß Anspruch 14, worin das Polypeptid eine Sequenz von Aminosäureresten umfasst, die zu mindestens 90% der Aminosäuresequenz identisch zu den Resten 22 – 281 der SEQ ID. Nr. 2 ist.
Verwendung gemäß Anspruch 14, worin das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 90% der Aminosäuresequenz identisch zu den Resten 26 – 281 der SEQ ID Nr. 2 ist.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 14 bis 16, worin jegliche Unterschiede zwischen dem Polypeptid und der SEQ ID Nr. 2 auf konservativen Aminosäuresubstitutionen beruhen.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 14–17; worin die Kollagendomäne aus 13 Gly-Xaa-Xaa-Repeats und einem Gly-Xaa-Pro-Repeat besteht.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 14–18, worin die globuläre Domäne aus zehn beta-Faltblättern besteht.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 14–19, worin die Beta-Faltblätter mit Aminosäureresten assoziiert sind, entsprechend den Resten 147–151, 170–172, 178–181, 191-203, 207–214, 219–225, 227–239, 244–250 und 269–274 der SEQ ID Nr. 2.
Verwendung gemäß Anspruch 14, worin das Polypeptid die Reste 1–281 der SEQ ID Nr. 2 oder die Reste 1–281 der SEQ ID Nr. 44 umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 14, worin das Polypeptid mit einem zweiten Polypeptid komplexiert ist, um ein Oligomer zu bilden.
Verwendung gemäß Anspruch 22, worin die Polypeptide durch intermolekulare Disulfidbindungen komplexiert sind.
Verwendung gemäß Anspruch 22 und 23, worin das Oligomer ein Trimer ist.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 22 und 23, worin das Oligomer ein Hexamer ist.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 22 und 23, worin das Oligomer ein 18mer ist.
Verwendung eines Komplement verwandten Proteins aus Adipocyten bei der Herstellung eines Medikaments gemäß Anspruch 12 für die Beruhigung der Oberfläche eines prostetischen Biomaterials, worin die Oberfläche des prostetischen Biomaterials mit Kollagen oder Kollagenfragmenten, Gelatine, Fibrin oder Fibronectin beschichtet ist.