DE60118362T2

DE60118362T2 - VERFAHREN ZUR BEHANDLUNG VON HÄMOSTATISCHEN STÖRUNGEN DURCH LöSLICHES P-SELECTIN

Info

Publication number: DE60118362T2
Application number: DE60118362T
Authority: DE
Inventors: D. Denisa Wellesley WAGNER; Patrick Jamaica Plain ANDRE; Daqing W. Brookline HARTWELL; Ingrid Jamaica Plain HRACHOVINOVA
Original assignee: Center for Blood Research Inc Boston; Immune Disease Institute Inc
Current assignee: Center for Blood Research Inc Boston; Immune Disease Institute Inc
Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2001-05-17
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2021-05-18
Also published as: EP1289552A2; CA2408883A1; WO2001089564A2; ATE321570T1; US20080193949A1; US20050202007A1; AU2001261735B2; DE60118362D1; EP1289552B1; US7387777B2; US20020031508A1; WO2001089564A3; JP2003534291A; AU6173501A; US20040265311A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Fähigkeit von Zellen, aneinander zu haften, spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung, der normalen Physiologie und den Krankheitsverläufen. Diese Fähigkeit wird durch Adhäsionsmoleküle, im allgemeinen Glycoproteine, die an der Zelloberfläche exprimiert werden, wiedergegeben. Mehrere wichtige Klassen von Adhäsionsmolekülen schließen die Integrine, die Selektine, und Mitglieder der Immunoglobulin-(Ig)-Superfamilie ein. Selektine spielen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung von Leukozytenadhäsion an aktiviertem Endothelium und Blutplättchen.
Die Blutgerinnung zusammen mit Entzündung und Gewebereparatur sind Wirtsabwehrmechanismen, die parallel funktionieren, um die Integrität des Gefäßsystems nach einer Gewebeverletzung zu erhalten. Bei der Reaktion auf die Gewebeverletzung sind die Blutplättchen, die Endothelzellen und Leukozyten für die Bildung eines Blutgerinsels, die Ablagerung der Leukozyten im verletzten Gewebe, die Auslösung der Entzündung und die Wundheilung ganz wesentlich.
P-Selektin, auch bekannt als CD62, granuläres Membranprotein-140 (GMP-140) und von Blutplättchen-aktivierung abhängiges, granuläres, externes Membranprotein (PADGEM), ist ein integrales Membranglycoprotein, das an vaskulären, Endothelzellen und Blutplättchen exprimiert und an der Erkennung verschiedener zirkulierender Zellen beteiligt ist. Das P-Selektin-Molekül besitzt eine N-terminale Lektindomäne, einen Bereich mit Homologie zum epidermalen Wachstumsfaktor, einen Bereich mit Homologie zu komplementären Regulationsproteinen, eine Transmembrandomäne und ein kurzes zytoplasmisches Ende. Der P-Selektin-Ligand weist die Le^x-Kohlenhydratstruktur auf und enthält Sialsäure und das PSGL-1-Protein (US-Patent Nr. 5.843.707).
P-Selektin wird konstitutiv in sekretorischen Granulen (fx alpha-Granulen und Weibel-Palade-Körpern) gespeichert und als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen an die Oberfläche der Blutplättchen und Endothelzellen verlagert, darunter die Zellaktivierung, wo es Wechselwirkungen zwischen Blutplättchen-Leukozyten und Endothelium-Leukozyten vermittelt. Die Zelloberflächenexpression von P-Selektin ist fest reguliert, wobei P-Selektin bei Blutplättchenaktivierung schnell von der Zelloberfläche abgestoßen wird und als lösliches Fragment im Plasma erscheint (Berger, G. et al. Blood (1998) 92: 4446–4452). Das lösliche P-Selektin kann auch aus einer alternativ gespleißten Isoform des P-Selektins, bei dem die Transmembrandomäne fehlt, resultieren (Ishiwata, N. et al. J Biol Chem (1994) 269: 23708). Das Plasma von gesunden Menschen und Mäusen enthält geringfügige Mengen an löslichem P-Selektin, wie dies mit ELISA nachgewiesen wurde, und eine Erhöhung der P-Selektin-Konzentration im Plasma kann auf eine in-vivo-Aktivierung von und/oder einen Schaden an Blutplättchen und Endothelzellen hinweisen.
Außer seiner Rolle bei der Leukozytenrollung und Extravasation bei der Entzündung vermittelt P-Selektin auch noch die Blutplättchen-Leukozyten-Adhäsion innerhalb der Thrombi und erhöht die Gewebefaktorexpression auf Monozyten, wodurch die Fibrinablagerung durch Leukozyten und Thromobogenese gefördert wird (Palabrica, T. et al. Nature (1992) 359: 848–851; Celi, A. et al. Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 8767–8771).
M. Subramaniam et al., Blood, vol. 87, 1238–1242 (1996) berichtet über die Anwendung von Desmopressin bei Patienten mit niedrigen Werten des Willebrand-Faktors oder Faktor VIII, wodurch die P-Selektin-Expression hervorgerufen wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines löslichen P-Selektin-Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hämophilie oder der von-Willebrandschen Krankheit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Foto einer Ansicht von einer Untersuchung der thrombotischen Ablagerungen bei Wildtyp-Mäusen, Mäusen mit P-Selektin-Defizit (PKO), und ΔCT-Mäusen, die sich nach einer 2-minütigen nichtantikoagulierten Blutperfusion gebildet hatten (Blutstrom, von links nach rechts). Der weiße Pfeil zeigt den blutplättchenreichen Thrombus an, wohingegen der schwarze Pfeil auf das Fibrinende hinweist, das sich distal zum Blutplättchenthrombus gebildet hat.
2 zeigt die Fibrinbildung in einer Perfusionskammer von nichtantikoaguliertem Blut von Wildtyp-Mäusen (WT), Mäusen mit P-Selektin-Defizit (P-sel –/–), sowie ΔCT-Mäusen.
3 zeigt die makroskopische und mikroskopische Abstufung von hämorrhagischen Läsionen, die sich bei einer lokalen Shwartzman-Reaktion in Wildtyp-Mäusen (WT) gebildet haben, welche entweder unbehandelt, mit Human-IgG1 perfundiert oder mit löslichem P-Selektin-Ig (s-P-sel) perfundiert waren, sowie ΔCT-Mäusen.
4 zeigt die Fibrinablagerung bei einer örtlichen Shwartzman-Reaktion in Wildtyp-Mäusen (WT), die entweder mit Human-IgG1 oder löslichem P-Selektin-Ig (P-sel) perfundiert worden waren.
5A und B zeigen die Plasmagerinnungszeit von Wildtyp-Mäusen (WT), Mäusen mit P-Selektin-Defizit (P-sel –/–) sowie ΔCT-Mäusen, die entweder unbehandelt oder mit rekombinantem PSGL-1 oder rekombinantem löslichen P-Selektin perfundiert worden waren.
6 zeigt die Niveaus der Mikropartikel bei der Zirkulation von Wildtyp-Mäusen (WT), die entweder unbehandelt, mit Human-IgG1 perfundiert oder mit löslichem P-Selektin-Ig (s-P-sel) perfundiert worden waren, sowie ΔCT-Mäusen.
7 zeigt die Anzahl der Mikropartikel, die den Gewebefaktor bei Wildtyp-(WT)- und ΔCT-Mäusen exprimieren.
8 zeigt die erhöhte Erzeugung von prokoagulanten Mikropartikeln bei der Zirkulation von Mäusen mit mangelhaftem von-Willebrand-Faktor (vWF –/–), die mit löslichem P-Selektin-Ig (sP-sel-Ig) perfundiert worden waren.
9 zeigt die Prothrombin-Gerinnungszeit bei Wildtyp-Mäusen (WT) und bei Mäusen mit mangelhaftem von-Willebrand-Faktor (vWF –/–), die entweder unbehandelt, mit Human-IgG1 perfundiert oder löslichem P-Selektin-Ig (sPselIg) perfundiert worden waren.
10 zeigt die Blutungszeit bei Hemophilia A-Mäusen, die entweder mit Human-IgG1 oder löslichem P-Selektin-Ig (P-sel-Ig) behandelt worden waren.
11A zeigt die Verringerung der Anzahl von Mikropartikeln nach Behandlung von ΔCT-Mäusen mit löslichem PSGL-Ig im Vergleich zum Kontrollversuch mit Human-Ig (* = p < 0,05). 11B zeigt die Zunahme der Gerinnungszeit nach Behandlung von ΔCT-Mäusen mit löslichem PSGL-Ig im Vergleich zum Kontrollversuch mit Human-Ig (* = p < 0,05).
12A zeigt die Erzeugung von prokoagulanten Mikropartikeln in menschlichem Blut nach Inkubation entweder mit Human-IgG oder löslichem P-Selektin-Ig (P-sel-Ig). Nach 6 Stunden Inkubation mit löslichem P-Selektin-Ig, erhöhte sich die Anzahl der Mikropartikel erheblich um 30% (* = p < 0,04). 12B zeigt die Erzeugung von gewebefaktorpositiven Mikropartikeln in menschlichem Blut nach Inkubation entweder mit Human-IgG oder löslichem P-Selektin-Ig (P-sel-Ig). Die Anzahl der gewebefaktorpositiven Ereignisse hatte sich nach 6 Stunden durch Inkubation mit P-Selektin Ig erheblich um 30% erhöht (* = p < 0,05).
13A zeigt die Gerinnungszeit des ganzen menschlichen Blutes nach Inkubation mit Human-IgG oder löslichem P-Selektin-Ig (P-sel-Ig). Die Gerinnungszeit des gesamten Blutes mit löslichem P-Selektin-Ig verkürzte sich nach 2 Stunden um etwa 20% (* = p < 0,02) und nach 8 Stunden Inkubation um 60% (** = p < 0,004). 13B zeigt die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma nach Inkubation mit Human-IgG oder löslichem P-Selektin-Ig (P-sel-Ig). Die Plasmagerinnungszeit des mit löslichem P-Selektin behandelten Blutes verkürzte sich nach 6 Stunden Inkubation um 25% und nach 8 Stunden um 40% (** = p < 0,004).
14A zeigt die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) bei Mäusen mit Faktor VIII –/– (Mäuse mit Hämophilie A), die mit Kontroll-Ig oder löslichem P-Selektin-Ig behandelt worden waren. 14B zeigt die Plasmagerinnungszeit bei Mäusen mit Faktor VIII –/– (Mäuse mit Hämophilie A), die mit Kontroll-Ig oder löslichem P-Selektin-Ig behandelt worden waren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass lösliches P-Selektin bei einem Säugetier, zum Beispiel einer Maus oder einem Menschen, einen prokoagulanten Zustand hervorruft (z.B. durch Erhöhung der Anzahl der Mikropartikeln, die den Gewebefaktor im Blut enthalten, Reduzierung der Blutungszeit und/oder Reduzierung der Gerinnungszeit).
Wie hierin austauschbar verwendet, bezieht sich der Begriff „P-Selektin-Aktivität", „biologische Aktivität von P-Selektin" oder „funktionelle Aktivität von P-Selektin" auf eine Aktivität, die von einem löslichen P-Selektin-Polypeptid auf eine auf P-Selektin ansprechende Zelle (z.B. eine hämatopoetische Zelle oder Lymphozyten) oder Gewebe oder auf einen P-Selektin-Liganden oder -Rezeptor, wie in vitro und in vivo nach Standardtechniken bestimmt, ausgeübt wird. In einer beispielhaften Ausführungsform ist die P-Selektin-Aktivität die Fähigkeit, Hämostase zu modulieren. In einer Ausführungsform ist die P-Selektin-Aktivität eine prokoagulante Aktivität. In einer anderen Ausführungsform besteht die P-Selektin-Aktivität darin, die Anzahl der Mikropartikel, die Gewebefaktor enthalten, zu erhöhen. In einer weiteren Ausführungsform besteht die P-Selektin-Aktivität in der Fähigkeit, einen P-Selektin-Liganden zu binden, z.B. PSGL-1.
Wie hierin austauschbar verwendet, beziehen sich die Begriffe „Hämostase", „hämostatische Aktivität", oder „hämostatisches Potenzial" auf die Kontrolle der Blutung, darunter der physiologischen Eigenschaften der Vasokonstriktion und Koagulation. Die Blutkoagulation unterstützt die Aufrechterhaltung der Integrität der Blutzirkulation in Säugetieren nach einer Verletzung, Entzündung, Erkrankung, kongenitalem Defekt, Funktionsstörung oder anderen Störung. Nach Auslösung der Gerinnung schreitet die Blutkoagulation über eine sequentielle Aktivierung bestimmter Plasmaproenzyme in ihren Enzymformen voran (siehe beispielsweise Coleman, R. W. et al. (Herausg.) Hemostasis and Thrombosis (Hämostase und Thrombose), zweite Auflage, (1987)). Diese Plasmaglycoproteine einschließlich Faktor XII, Faktor XI, Faktor IX, Faktor X, Faktor VII, und Prothrombin sind Zymogene von Serinproteasen. Die meisten dieser Blutgerinnungsenzyme sind im physiologischen Maßstab nur wirksam, wenn sie in Komplexen an Membranoberflächen mit Proteinkofaktoren, wie z.B. Faktor VIII und Faktor V, eingebaut sind. Andere Blutfaktoren modulieren und lokalisieren die Bildung von Blutgerinnseln oder lösen Blutgerinnsel auf. Das aktivierte Protein C ist ein spezifisches Enzym, das prokoagulente Komponenten inaktiviert. An vielen der Komponentenreaktionen sind Calciumionen beteiligt. Die Blutkoagulation folgt dabei entweder dem intrinsischen Stoffwechselweg, wo alle Proteinkomponenten im Blut vorhanden sind, oder aber dem extrinsischen Stoffwechselweg, wo der Proteingewebefaktor der Zellmembran eine entscheidende Rolle spielt. Die Bildung von Blutgerinnseln tritt auf, wenn Fibrinogen durch Thrombin aufgespalten wird und Fibrin entsteht. Blutgerinnsel sind aus aktivierten Blutplättchen und Fibrin zusammengesetzt.
Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff „prokoagulanter Zustand" physiologische Bedingungen, die der Blutgerinnung, Hämostase und/oder Thrombose dienlich sind und/oder diese fördern. Das hämostatische Potenzial, z.B. das Potenzial zur Blutkoagulation unter den entsprechenden physiologischen Bedingungen, oder die hämostatische Aktivität können mit den allgemein bewährten Labortests eingeschätzt werden, darunter durch Ermittlung der Prothrombinzeit (PT), der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT), der Blutungszeit und der Thrombinzeit. Wie hierin austauschbar verwendet, schließen die Begriffe „Modulieren oder Modulation von Hämostase" und „Regulieren oder Regulierung der Hämostase" die Induktion (z.B. Stimulation, Erhöhung) der Hämostase sowie die Inhibition (z.B. Reduktion, Verringering) der Hämostase ein.
Wie hierin verwendet, beinhaltet ein „lösliches P-Selektin-Polypeptid" ein P-Selektin-Polypeptid, das Aminosäuresequenzen umfasst, welche der extrazellulären Domäne eines P-Selektin-Proteins oder eines Fragments davon entsprechen. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen von P-Selektin-Proteinen sind anderswo bereits beschrieben worden (siehe hierzu z.B. Sanders, W. E. et al. (1992) Blood 80: 795–800; und GenBank-Zugangsnummern NM_003005 und M25322 (Mensch); GenBank-Zugangsnummern NM_013114 und L23088 (Ratte); GenBank-Zugangsnummern NM_011347 und M87861 (Maus); und GenBank-Zugangsnummer L12041 (Rind)). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das lösliche P-Selektin-Polypeptid ein lösliches P-Selektin-Fusionsprotein. In einer Ausführungsform stellt das P-Selektin-Fusionsprotein ein P-Selektin-Ig-Fusionsprotein dar, das eine Signalsequenz, eine Lektindomäne, eine EGF-ähnliche Wiederholung und mindestens zwei mit der Fc-Region eines Immunoglobulins, z.B. dem Human-IgG1, operativ verbundene, komplementbindende Domänen eines P-Selektin-Proteins umfasst (Gelenk C1 und C2).
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Hypokoagulation" auf eine verringerte Fähigkeit oder eine Unfähigkeit zur Bildung von Blutgerinnseln. Solche Störungen schließen hämorrhagische Störungen, z.B. Hämophilie (beispielsweise Hämophilie A oder B) und Störungen ein, die aus einem Mangel an Gerinnungsfaktoren oder Plättchenliganden resultieren, z.B. einem Defizit am von Willebrand-Faktor, das zum von Willebrand's Syndrom führt. Die Induktion eines prokoagulanten Zustands würde die spontane Blutung verhindern oder stoppen und wäre auch vorteilhaft vor einem chirurgischer Eingriff bei einem Patienten oder bei Wundheilung.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff „hämostatische Störung" eine Störung oder eine Bedingung, die sich durch eine anomale oder unerwünschte hämostatische Aktivität charakterisieren lässt. Eine hämostatische Störung kann aus einer übermäßigen koagulanten Aktivität resultieren, z.B. einer thrombotischen Störung, oder aber aus einer unzureichenden koagulanten Störung, z.B. einer hämorrhagischen Störung.
Lösliches P-Selektin-Polypeptid
Die genomische Organisation und Kodierungssequenz für Human-P-Selektin ist bestimmt worden, wobei die cDNA kloniert und sequenziert wurde (siehe beispielsweise GenBank-Zugangsnummern NM_003005 und M25322). Außerdem sind die Sequenzen, welche das P-Selektin der Ratte (GenBank-Zugangsnummern NM_013114 und L23088), Maus (GenBank-Zugangsnummern NM_011347 und M87861) und des Rindes (GenBank-Zugangsnummer L12041) kodieren, offenbart worden. Des Weiteren wird ein Vergleich der Aminosäuresequenzen und der strukturellen Domänen von P-Selektin von Mensch und Maus bei Sanders, WE et al. (1992) Blood 80: 795–800 offenbart.
Lösliche P-Selektin-Polypeptide, die für die hier beschriebenen Verwendungen geeignet sind, besitzen vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die mit der Aminosäuresequenz eines nativen löslichen P-Selektin-Proteins hinreichend identisch ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „hinreichend identisch" auf eine Aminosäuresequenz, die eine ausreichende oder Mindestanzahl von identischen oder gleichwertigen (z.B. eines Aminosäurerestes, der eine ähnliche Seitenkette hat) Aminosäureresten, die die Aminosäuresequenz des nativen löslichen P-Selektins enthält, so dass sich das Polypeptid gemeinsame strukturelle Domänen oder Motive und/oder eine gemeinsame funktionelle Aktivität mit dem nativen löslichen P-Selektin-Protein teilt. Zum Beispiel werden Aminosäuresequenzen, die sich gemeinsame strukturelle Domänen teilen, bei den Aminosäuresequenzen der Domänen mindestens eine Identität von 70%–80%, und mehr bevorzugt 90–95% und zumindest eine, und mehr bevorzugt zwei oder mehr strukturelle Domänen oder Motive enthalten, hierin als hinreichend identisch definiert. Beispielsweise kann ein lösliches P-Selektin-Polypeptid mindestens eine oder mehrere der folgenden Domänen umfassen: ein Signalpeptid, eine Lektindomäne, eine EGF-ähnliche Wiederholung, eine komplementäre Bindungsdomäne und eine zytoplasmische Domäne. Des weiteren werden Aminosäuresequenzen, die sich zumindest eine Identität von 70–80% oder 90–95% und eine gemeinsame funktionelle Aktivität teilen (z.B. eine lösliche P-Selektin-Aktivität, wie sie hierin beschrieben wurde), hierin als hinreichend identisch definiert. Ein lösliches P-Selektin-Polypeptid kann sich in der Aminosäuresequenz von den hierin offenbarten P-Selektin-Polypeptiden auf Grund der natürlichen Allelenvariation oder Mutagenese unterscheiden. Dementsprechend können isolierte lösliche P-Selektin-Polypeptide mit einer P-Selektin-Aktivität für die hier beschriebenen Zwecke verwendet werden.
Um die prozentuale Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuresequenzen zu ermitteln, werden die Sequenzen zwecks optimalem Vergleich ausgerichtet (z.B. können in eine oder beide einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz für eine optimale Ausrichtung (Alignment) Lücken (gaps) eingeführt werden, wobei nichtidentische Sequenzen für Vergleichszwecke außer Acht gelassen werden können). In einer bevorzugten Aus führungsform beträgt die Länge einer für Vergleichszwecke ausgerichteten Bezugssequenz mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 40%, mehr bevorzugt mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, und noch mehr bevorzugt mindestens 70%, 80% oder 90% der Länge der Bezugssequenz. Die Aminosäurereste oder Nukleotide bei entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz vom gleichen Aminosäurerest oder Nukleotid eingenommen wird, wie die entsprechende Position in der zweiten Sequenz, dann sind die Moleküle in dieser Position identisch (wie hierin verwendet, ist der Begriff Aminosäure- oder Nukleinsäure'identität' gleichbedeutend mit Aminosäure- oder Nukleinsäure'homologie'). Die prozentuale Identität zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von identischen Positionen, die sich die Sequenzen teilen, und zwar unter Berücksichtigung der Anzahl von Lücken, und der Länge der jeweiligen Lücke, welche für eine optimale Ausrichtung der zwei Sequenzen eingeführt werden muss.
Der Vergleich von Sequenzen und die Feststellung der prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen kann mit Hilfe eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Algorithmus von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444–453 (1970)), der in das GAP-Programm im GCG-Softwarepaket einbezogen wurde (verfügbar unter http://www.gcg.com), entweder mit einer Blossom 62-Matrix oder einer PAM250-Matrix, sowie einem Lückengewicht von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und einem Längengewicht von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bestimmt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Programms im GCG-Softwarepaket (verfügbar unter http://www.gcg.com) mit einer NWSgapdna.CMP-Matrix und einem Lückengewicht von 40, 50, 60, 70 oder 80 und einem Längengewicht von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bestimmt. In einer anderen Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen unter Verwendung des Algorithmus von E. Meyers und W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11–17 (1988), der in das ALIGN-Programm (Version 2.0) einbezogen wurde, mit einer Gewichtsresttabelle PAM120, 12 Strafpunkten für die Lückenlänge (gap length penalty) und 4 Strafpunkten für die Lücke (gap penalty) bestimmt.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff „biologisch aktiver Teil" eines löslichen P-Selektin-Polypeptids ein Fragment eines löslichen P-Selektin-Polypeptids ein, das eine P-Selektin-Polypeptidaktivität behält. Typischerweise umfasst der biologisch aktive Teil eines löslichen P-Selektin-Polypeptids zumindest eine Domäne oder ein Motiv mit zumindest einer Aktivität des löslichen P-Selektin-Polypeptids. Biologisch aktive Teile eines löslichen P-Selektin-Polypeptids enthalten Polypeptide, die lösliche Aminosäuresequenzen umfassen, die mit der Aminosäuresequenz eines löslichen P-Selektin-Proteins, das weniger Aminosäuren enthält als das lösliche P-Selektin-Polypeptide mit voller Länge, hinreichend identisch sind oder sich aus dieser ableiten und weisen zumindest eine Aktivität eines löslichen P-Selektin-Polypeptids auf. Ein biologisch aktiver Teil eines löslichen P-Selektin-Polypeptids umfasst ein Polypeptid, das durch rekombinante Techniken hergestellt werden kann.
In einer Ausführungsform können lösliche P-Selektin-Polypeptide aus Zellen oder Gewebequellen nach einem entsprechenden Reinigungsschema unter Anwendung der üblichen Proteinreinigungstechniken isoliert werden. Zum Beispiel kann ein lösliches P-Selektin-Polypeptid aus dem Kulturmedium von Zellen, beispielsweise aktivierten Endothelzellen, isoliert werden, welche dahingehend induziert worden waren, dass sie das P-Selektin von der Zelloberfläche abstoßen. In einer anderen Ausführungsform werden lösliche P-Selektin-Polypeptide durch rekombinante DNA-Techniken produziert. Zum Beispiel kann ein lösliches P-Selektin-Polypeptid aus einer Wirtszelle isoliert werden, die mit einer Polynukleotidsequenz transfiziert wurde, welche eine lösliche Isoform des P-Selektins (z.B. eine Isoform des P-Selektins, dem eine Transmembrandomäne fehlt) oder ein lösliches P-Selektin-Fusionsprotein kodiert. Als Alternative zur rekombinanten Expression kann ein lösliches P-Selektin-Polypeptid chemisch unter Verwendung der üblichen Peptidsyntheseverfahren synthetisiert werden.
Ein „isoliertes" oder „gereinigtes" lösliches P-Selektin-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon ist im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder anderen verunreinigenden Proteinen aus der Zelle oder der Gewebequelle, aus der das lösliche P-Selektin-Polypeptid abgeleitet wird, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder, wenn es chemisch synthetisiert wurde, von anderen Chemikalien. Die Formulierung „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" schließt Präparate von löslichem P-Selektin-Polypeptid ein, bei denen das Protein aus zellulären Bestandteilen der Zellen separiert wird, aus denen es isoliert oder rekombinant produziert wird. In einer Ausführungsform schließt die Formulierung „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" Präparate von löslichem P-Selektin- Protein ein, das weniger als etwa 30% (der Trockenmasse) Nicht-P-Selektin-Protein besitzt (hierin auch als „verunreinigendes Protein" bezeichnet), mehr bevorzugt weniger als etwa 20% Nicht-P-Selektin-Protein, noch mehr bevorzugt weniger als etwa 10% Nicht-P-Selektin-Protein und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% Nicht-P-Selektin-Protein enthält. Wenn das lösliche P-Selektin-Polypeptid oder der biologisch aktive Teil davon rekombinant produziert wird, ist dieses bzw. dieser im Wesentlichen frei vom Kulturmedium, d.h. das Kulturmedium repräsentiert weniger als etwa 20%, mehr bevorzugt weniger als etwa 10% und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumens des Proteinpräparates.
Die Formulierung „im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" schließt Präparate von löslichem P-Selektin-Polypeptid ein, bei denen das Protein aus chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien separiert wird, die an der Synthese des Proteins beteiligt sind. In einer Ausführungsform schließt die Formulierung „im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" Präparate von löslichem P-Selektin-Polypeptid ein, die weniger als etwa 30% (der Trockenmasse) chemische Vorstufen oder Nicht-P-Selektin-Chemikalien, mehr bevorzugt weniger als etwa 20% chemische Vorstufen oder Nicht-P-Selektin-Chemikalien, noch mehr bevorzugt weniger als etwa 10% chemische Vorstufen oder Non-P-Selektin-Chemikalien und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% chemische Vorstufen oder Nicht-P-Selektin-Chemikalien enthalten.
Lösliche P-Selektin-Polypeptide, die chimärische Proteine oder Fusionsproteine darstellen, sind für die hierin beschriebenen Zwecke ebenfalls dienlich. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff „chimärisches Protein" oder „Fusionsprotein" ein lösliches P-Selektin-Polypeptid, das mit einem nichtlöslichen P-Selektin-Polypeptid wirksam verbunden ist. Der Begriff „lösliches P-Selektin-Polypeptid" schließt dabei ein P-Selektin-Polypeptid ein, das Aminosäuresequenzen umfasst, die einer extrazellulären Domäne eines P-Selektin-Proteins oder einem biologisch aktiven Teil davon entsprechen, wohingegen sich der Begriff „nicht-lösliches P-Selektin-Polypeptid" auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bezieht, welche einem Protein entspricht, das im Wesentlichen einem P-Selektin-Polypeptid nicht homolog ist, d.h. einem Protein, das vom löslichen P-Selektin-Polypeptid verschieden ist und das sich aus dem gleichen oder einem anderen Organismus ableitet. Innerhalb des löslichen P-Selektin-Fusionsproteins kann das lösliche P-Selektin zum Beispiel die gesamte extrazelluläre Domäne eines P- Selektin-Proteins oder eines Teiles hiervon einschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein lösliches P-Selektin-Fusionsprotein zumindest eine Signalsequenz, eine Lektindomäne, eine EGF-ähnliche Wiederholung und mindestens zwei komplementbindende Domänen eines P-Selektin-Proteins. Innerhalb des Fusionsproteins soll der Begriff „wirksam verbunden" andeuten, dass das lösliche P-Selektin-Polypeptid und das nichtlösliche P-Selektin-Polypeptid miteinander im selben Rahmen fusioniert werden. Das nichtlösliche P-Selektin-Polypeptid kann mit dem N-Terminus oder dem C-Terminus des löslichen P-Selektin-Polypeptids fusioniert werden.
Zum Beispiel ist in einer bevorzugten Ausführungsform das Fusionsprotein ein lösliches P-Selektin-Immunoglobulin-Fusionsprotein, bei dem die Fc-Region, z.B. das Gelenk der Sequenzen C1 und C2 eines Immunoglobulins (beispielsweise Human-IgG1), mit dem C-Terminus der löslichen P-Selektin-Sequenzen fusioniert wird. Selektin-Immunoglobulin-Chimären können im Wesentlichen so aufgebaut werden, wie dies in WO 91/08298 beschrieben wurde. Derartige Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinanten löslichen P-Selektin-Polypeptiden erleichtern. In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein lösliches P-Selektin-Polypeptid, das an seinem N-Terminus eine heterologe Signalsequenz enthält. In bestimmten Wirtszellen (z.B. Wirtszellen von Säugetieren) kann die Expression und/oder Sekretion von löslichem P-Selektin durch Verwendung einer heterologen Signalsequenz gesteigert werden.
Die hierin beschriebenen löslichen P-Selektin-Polypeptide und Fusionsproteine können in pharmazeutische Kompositionen einbezogen und einer Person in vivo verabreicht werden. In einer beispielhaften Ausführungsform kann ein lösliches P-Selektin-Polypeptid oder Fusionsprotein zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hämophilie oder des von Willebrand's Syndroms verwendet werden.
Vorzugsweise wird ein lösliches P-Selektin-Fusionsprotein, wie es hierin beschrieben wird, mit den üblichen DNA-Rekombinationsverfahren produziert. Zum Beispiel werden DNA-Fragmente, die die verschiedenen Polypeptidsequenzen kodieren, entsprechend den herkömmlichen Techniken im selben Rahmen zusammen ligiert, beispielsweise durch Nutzung der Termini des stumpfen oder kohäsiven Endes zur Ligation, von Restriktionsenzymverdauung zur Schaffung entsprechender Termini, gegebenenfalls Füllen der kohäsiven Enden, alkalische Phosphatase-Behandlung zur Verhinderung einer unerwünschten Verbindung und der enzymatischen Ligation. Bei einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen mit herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden, einschließlich automatisierter DNA-synthesizer. Als Alternative kann die PCR-Amplifikation der Genfragmente unter Verwendung von Ankerprimern vorgenommen werden, die komplementäre Überhänge zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten verursachen, welche anschließend abgekühlt und reamplifiziert werden, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Darüber hinaus sind viele Expressionsvektoren handelsüblich verfügbar, die bereits einen Fusionsteil kodieren (z.B. ein GST-Polypeptid). Eine Nukleinsäure, die ein lösliches P-Selektin kodiert, kann in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, so dass sich der Fusionsteil im selben Rahmen mit dem löslichen P-Selektin-Polypeptid verbindet.
Varianten eines löslichen P-Selektin-Polypeptids sind für die hierin beschriebenen Zwecke ebenfalls verwendbar. Varianten des löslichen P-Selektin-Polypeptids können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch diskrete Punktmutation oder Abschneiden eines löslichen P-Selektin-Proteins. Eine Agonistenvariante eines löslichen P-Selektin-Polypeptids kann im Wesentlichen die gleichen biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form eines löslichen P-Selektin-Polypeptids oder einer Teilmenge davon behalten. Eine Antagonistenvariante eines P-Selektin-Polypeptids kann eine oder auch mehrere der Aktivitäten einer nativen Form des löslichen P-Selektin-Polypeptids, z.B. durch kompetitive Modulation einer P-Selektin-Aktivität (z.B. einer hämostatischen Aktivität) eines löslichen P-Selektin-Polypeptids hemmen. Somit können spezifische biologische Effekte durch Behandlung mit einer Variante einer begrenzten Funktion hervorgebracht werden. Zum Beispiel hat die Behandlung einer Person mit einer Variante, die eine Teilmenge der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Proteins besitzt, weniger Nebenwirkungen für eine Person im Vergleich zu der Behandlung mit der natürlich vorkommenden Form eines löslichen P-Selektin-Polypeptids.
In einer Ausführungsform können Varianten eines löslichen P-Selektin-Polypeptids, die entweder als lösliche P-Selektin-Agonisten (Mimetics) oder als lösliche P-Selektin-Antagonisten fungieren, durch Herausfiltern von Mutanten, z.B. Trunkationsmutanten, eines löslichen P-Selektin-Polypeptids für den löslichen P-Selektin-Polypeptidagonisten oder die Antagonistenaktivität, identifiziert werden. Die Aktivität einer Variante des löslichen P-Selektin-Polypeptids kann bei einem Tiermodell beurteilt werden, wie bei hierin beschriebenen und als Beispiel angeführten Tiermodellen, z.B. eine Maus mit P-Selektindefizit oder einer Maus mit einem von-Willebrand-Faktordefizit.
Nukleinsäuremoleküle, die lösliche P-Selektin-Polypeptide kodieren
Isolierte Nukleinsäuremoleküle, die lösliche P-Selektin-Polypeptide oder biologisch aktive Teile davon kodieren, können für die Herstellung von löslichen P-Selektin-Polypeptiden verwendet werden. Es sind Nukleotidsequenzen, die P-Selektin beim Menschen (GenBank-Zugangsnummern NM_003005 und M25322), bei der Ratte (GenBank-Zugangsnummern NM_013114 und L23088), der Maus (GenBank-Zugangsnummern NM_011347 und M87861), und dem Rind (GenBank-Zugangsnummer L12041) kodieren, offengelegt worden.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) und Analoga der DNA oder RNA einschließen, die unter Verwendung von Nukleotidanaloga erzeugt wurden. Das Nukleinsäuremolekül kann einsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise eine doppelsträngige DNA.
Der Begriff „isoliertes Nukleinsäuremolekül" schließt Nukleinsäuremoleküle ein, die von anderen Nukleinsäuremolekülen separiert sind, welche in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind. Zum Beispiel schließt der Begriff „isoliert" in Bezug auf eine genomische DNA, Nukleinsäuremoleküle ein, die aus dem Chromosom separiert sind, welches mit der genomischen DNA natürlich assoziiert ist. Vorzugsweise ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen, die die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, auf natürliche Weise flankieren (d.h. Sequenzen, die sich an den 5' und 3' -Enden der Nukleinsäure befinden). Zum Beispiel kann in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte Nukleinsäuremolekül, welches das lösliche P-Selektin kodiert, weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen enthalten, die auf natürliche Weise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle flankiert, aus der die Nukleinsäure stammt. Darüber hinaus kann ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, im Wesentlichen von anderem zellulärem Material oder, wenn mit Hilfe von Rekombinationstechniken produziert, von Kulturmedium oder, wenn chemisch synthetisiert, im Wesentlichen von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien frei sein.
Ein Nukleinsäuremolekül, das lösliches P-Selektin, ein lösliches P-Selektin-Fusionsprotein oder einen Teil davon kodiert, kann unter Verwendung der üblichen Techniken der Molekularbiologie isoliert werden (z.B. wie sie bei Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) beschrieben wurden.
Die Nukleinsäure kann mittels cDNA, mRNA oder alternativ mittels genomischer DNA als Schablone und entsprechende Oligonukleotidprimere nach den üblichen PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen entsprechenden Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Des Weiteren können Oligonukleotide, die den löslichen P-Selektinsequenzen entsprechen, mit Hilfe der üblichen Synthesetechniken hergestellt werden, z.B. unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers.
Ein Nukleinsäurefragment, das einen „biologisch aktiven Teil" eines löslichen P-Selektin-Polypeptids kodiert, kann durch Isolieren eines Teils der Nukleotidsequenz eines P-Selektin-Gens mit biologischer P-Selektin-Aktivität unter Expremieren des kodierten Teils des P-Selektin-Polypeptids (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Beurteilung der Aktivität des kodierten Teils des P-Selektin-Polypeptids hergestellt werden.
Dem versierten Fachmann wird weiter klar sein, dass durch Mutation in die Nukleotidsequenz, die ein lösliches P-Selektin-Polypeptid kodiert, Änderungen eingeführt werden können, was wiederum zu Änderungen der Aminosäuresequenz des kodierten löslichen P-Selektin-Polypeptids führt, ohne die funktionelle Fähigkeit des löslichen P-Selektin-Polypeptid zu ändern. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen an den „nichtessentiellen" Aminosäureresten führen, in der Sequenz eines P-Selektin-Gens vorgenommen werden. Ein „nichtessentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der aus der Wildtypsequenz eines löslichen P-Selektin-Polypeptids verändert werden kann, ohne die biologische Aktivität zu ändern, wohingegen ein „essentieller" Aminosäurerest für die biologische Aktivität erforderlich ist. Zum Beispiel sagt man den Aminosäureresten, die unter den löslichen P-Selektin-Proteinen von den verschiedenen Spezies konserviert sind, nach, dass sie einer Änderung besonders unzugänglich sind.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein lösliches P-Selektin-Polypeptid kodiert, kann durch Einführen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, Hinzufügungen oder Deletionen in die Nukleotidsequenz eines P-Selektin-Gens geschaffen werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Hinzufügungen oder Deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Mutationen können in eine Nukleinsäuresequenz mit Hilfe der üblichen Techniken eingeführt werden, beispielweise eine ortsspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese. Vorzugsweise werden herkömmliche Aminosäure-substitutionen an einem oder mehreren vorherberechneten nichtessentiellen Aminosäureresten vorgenommen. Eine „herkömmliche Aminosäuresubstitution" ist eine, bei der der Aminosäurerest durch einen solchen Aminosäurerest ersetzt wird, der eine ähnliche Seitenkette besitzt. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind nach dem Stand der Technik bereits definiert worden. Zu diesen Familien gehören Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein, nichtpolaren Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucine, Proline, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigte Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatische Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Somit wird ein vorausberechneter nichtessentieller Aminosäurerest in einem löslichen P-Selektin-Polypeptid vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ersetzt. Als Alternative können in einer anderen Ausführungsform Mutationen zufällig an allen löslichen P-Selektin-kodierenden Sequenzen oder Teilen davon eingeführt werden, wie durch Sättigungsmutagenese, wobei die resultierenden Mutanten rekombinant expremiert und einem biologischen Aktivitätsscreening unterworfen werden, um diejenigen Mutanten zu identifizieren, die Aktivität behalten, z.B. in einem hier beschriebenen Tiermodell.
Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, welche ein lösliches P-Selektin-Polypeptid (oder einen Teil davon) kodiert, können zur Herstellung von löslichen P-Selektin-Polypeptiden verwendet werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure zu transportieren, mit der sie verknüpft ist. Ein Typ Vektor ist das „Plasmid", welches eine ringförmige, doppelsträngige DNA-Schleife darstellt, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden. Ein anderer Typ Vektor ist ein viraler Vektor, bei dem weitere DNA-Segmente in das Viralgenom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle in der Lage, in die sie eingeführt werden (z.B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z.B. nichtepisomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle bei Einführung in die selbige integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren in der Lage, die Expression von Genen, mit denen sie wirksam verknüpft sind, zu lenken. Derartige Vektoren werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren zur Nutzung bei rekombinanten DNA-Techniken oftmals in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können die Begriffe „Plasmid" und „Vektor" austauschbar benutzt werden, da der Plasmid die gebräuchlichste Form des Vektors ist. Jedoch können auch andere Formen von Expressionsvektoren, wie virale Vektoren, verwendet werden (z.B. replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und adenoverbundene Viren, die gleichwertige Funktionen erfüllen).
Die rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine Nukleinsäure in einer Form, die für die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen einschließen, die auf der Grundlage der für die Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt werden, die mit der zu expremierenden Nukleinsäuresequenz wirksam verknüpft sind. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektor soll „wirksam verknüpft" bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse mit regulatorischen Sequenzen in einer Weise verknüpft ist, die die Expression der Nukleotidsequenz gestattet (z.B. in einem in-vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird). Der Begriff „regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Verstärker und andere Expressionssteuerungselemente (z.B. Polyadenylierungssignale) einschließen. Solche regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel bei Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben. Regulatorische Sequenzen schließen solche Sequenzen, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Typen von Wirtszellen steuern, und solche ein, die die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen (z.B. gewebespezifische regulatorische Sequenzen) steuern. Dem Fachmann auf diesem Gebiet wird klar sein, dass die Gestaltung eines Expressionsvektors von solchen Faktoren abhängen kann wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Expressionsniveau des gewünschten Proteins und ähnlichem. Die Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, um somit lösliche P-Selektin-Polypeptide zu produzieren.
Die rekombinanten Expressionsvektoren können für die Expression von P-Selektin-Polypeptiden oder Fusionsproteinen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen konzipiert werden. Zum Beispiel können lösliche P-Selektin-Polypeptide oder Fusionsproteine in bakteriellen Zellen wie E. coli, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen expremiert werden. Geeignete Wirtszellen werden des Weiteren bei Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) diskutiert. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, beispielsweise unter Verwendung von T7 Promotor-regulatorische Sequenzen und T7-Polymerase.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten wird am häufigsten in E. coli mit Vektoren durchgeführt, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression entweder von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Die Fusionsvektoren lagern dem darin kodierten Protein eine Anzahl von Aminosäuren an, gewöhnlich dem Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: 1) der Erhöhung der Expression von rekombinantem Protein; 2) der Erhöhung der Löslichkeit und/oder Stabilität des rekombinanten Proteins und 3) der Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins, indem es als Ligand bei der Affinitätsreinigung fungiert. Oftmals wird bei den Fusionsexpressionsvektoren eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindung des Fusionsteils und des rekombinanten Proteins eingeführt, um die Separation des rekombinanten Proteins vom Fusionsteil im Anschluss an die Reinigung des Fusionsprotein zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre verwandten Erkennungssequenzen schließen den Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase ein. Typische Fusionsexpressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. und Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathione-S-transferase (GST), Maltose-E-bindendes Protein bzw. Protein A, mit dem Zielrekombinationsprotein fusionieren.
Beispiele geeigneter induzierbarer Nichtfusions-E. coli-Expressionsvektoren sind pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60–89). Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor stützt sich auf die Wirts-RNA-Polymerasetranskription von einem Hybrid trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression vom pET 11d-Vektor stützt sich auf die Transkription von einem T7 gn10-lac-Fusionspromotor, der durch eine koexpremierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird durch Wirtsstämme BL21(DE3) oder HMS174(DE3) aus einem residenten Prophage bereitgestellt, der das T7 gn1-Gen unter transkriptioneller Steuerung des lacUV 5-Promotors trägt.
Eine Strategie zur Maximierung der rekombinanten Proteinexpression in E. coli besteht darin, das Protein in ein Wirtsbakterium zu exprimieren, das eine beeinträchtigte Kapazität zur proteolytischen Aufspaltung des rekombinanten Proteins aufweist (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119–128). Eine weitere Strategie besteht darin, die Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor einzusetzenden Nukleinsäure zu verändern, so dass die einzelnen Codons für die jeweilige Aminosäure jene sind, die vorzugsweise in E. coli genutzt werden (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111–2118). Eine solche Veränderung der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung kann mit den üblichen DNA-Synthesetechniken vorgenommen werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der lösliche P-Selektin-Expressionsvektor ein Hefeexpressionsvektor. Beispiele für Vektoren der Expression bei Hefe 5. cerevisiae sind pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) EMBO J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113–123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) und picZ (InVitrogen Corp, San Diego, CA).
Als Alternative können lösliche P-Selektin-Polypeptide unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren in Insektenzellen expremiert werden. Zu den Baculovirus-Vektoren, die für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen zur Verfügung stehen (z.B. Sf 9-Zellen), gehören die Serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die Serie pVL (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31–39).
Des Weiteren wird eine lösliches P-Selektin kodierende Nukleinsäure unter Verwendung eines Säugetierexpressionsvektors in Säugetierzellen expremiert. Beispiele für Säugetierexpressionsvektoren sind pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187–195). Wenn in Säugetierzellen verwendet, werden die Steuerfunktionen des Expressionsvektors oft durch virale regulatorische Elemente gewährleistet. Beispielsweise leiten sich die gebräuchlichen Promotoren von Polyom, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian Virus 40 ab. Andere geeignete Expressionssysteme sowohl für prokaryotische als auch eukaryotische Zellen siehe die Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsh, E. F., und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Darüber hinaus ist der rekombinante Säugetierexpressionsvektor in der Lage, die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem besonderen Zellentyp zu steuern (z.B. werden gewebespezifische regulatorische Elemente verwendet, um die Nukleinsäure zu expremieren). Gewebespezifische regulatorische Elemente sind in der Technik bekannt. Nichteinschränkende Beispiele geeigneter gewebespezifischer Promotoren sind der Albumin-Promotor (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268–277), lymphoidspezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235–275), insbesondere Promotoren von T-Zellenrezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729–733) und Immunglobuline (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729–740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741–748), neuronenspezifische Promotoren (z.B. der Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473–5477), endotheliale zellspezifische Promotoren (z.B. KDR/flk-Promotor; U.S. Patent Nr. 5,888,765), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al. (1985) Science 230: 912–916), und säugerdrüsenspezifische Promotoren (z.B. Milchmolkepromotor; U.S. Patent Nr. 4,873,316 und die europäische Anmeldungspublikation Nr. 264,166). Entwicklungsregulierte Promotoren sind ebenfalls eingeschlossen, zum Beispiel die Hox-Promotoren der Maus (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374–379) und der α-Fötoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537–546).
Die Expressionscharakteristika eines endogenen P-Selektin-Gens innerhalb einer Zelllinie oder einem Mikroorganismus können durch Einsetzen eines heterologen DNA-regulatorischen Elementes in das Genom einer stabilen Zelllinie oder eines klonierten Mikroorganismus modifiziert werden, so dass das eingesetzte regulatorische Element wirksam mit dem endogenen P-Selektin-Gen verknüpft wird. Zum Beispiel kann ein endogenes P-Selektin-Gen, das normalerweise transkriptionell still" ist, z.B. ein P-Selektin-Gen, das normalerweise nicht expremiert ist oder erst bei sehr niedrigen Werten in einer Zelllinie oder einem Mikroorganismus expremiert wird, durch Einsetzen eines regulatorischen Elementes zu aktivieren, welches in der Lage ist, die Expression eines normalerweise expremierten Genproduktes in jener Zelllinie oder jenem Mikroorganismus zu fördern. Alternativ dazu kann ein transkriptionell stilles, endogens P-Selektin-Gen durch Einsetzen eines nichtselektiven regulatorischen Elementes, das an den Zelltypen fungiert, aktiviert werden.
Es kann auch ein heterologes regulatorisches Element in eine stabile Zelllinie oder einen klonierten Mikroorganismus eingesetzt werden, so dass es mit einem endogenen P-Selektin-Gen wirksam verknüpft wird, und zwar unter Anwendung von Techniken, wie der gezielten homologen Rekombination, die dem Fachmann gut bekannt und beschrieben sind, z.B. bei Chappel, U.S. Patent Nr. 5.272.071; PCT-Publikation Nr. WO 91/06667, veröffentlicht am 16. Mai 1991.
Wirtszellen, in die ein lösliches P-Selektin-Nukleinsäuremolekül eingeführt wird, können zur Herstellung des löslichen P-Selektin-Polypeptids verwendet werden. Die Begriffe „Wirtszelle" und „rekombinante Wirtszelle" werden hierin austauschbar verwendet. Es versteht sich, dass diese Begriffe sich nicht nur auf die Zelle des speziellen Subjektes beziehen, sondern auch auf die Nachkommen oder die potenziellen Nachkommen einer solchen Zelle. Da in den nachfolgenden Generationen entweder auf Grund von Mutation oder durch Umwelteinflüsse bestimmte Veränderungen auftreten können, werden diese Nachkommen eventuell nicht mit der Stammzelle identisch sein, fallen aber dennoch in den Geltungsumfang des Begriffes, wie er hierin verwendet wird.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eine eukaryotische Zelle sein. Zum Beispiel kann ein lösliches P-Selektin-Polypeptid oder Fusionsprotein in bakteriellen Zellen wie E. coli, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (beispielsweise hämopoetische Zellen, Leukozyten, Endothelzellen der umbilikalen Vene des Menschen (HUVEC), mikrovaskuläre Endothelzellen des Menschen (HMVEC), Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) expremiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem versierten Fachmann bekannt.
Eine Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen mit den herkömmlichen Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Wie hierin verwendet, sollen sich die Begriffe „Transformation" und „Transfektion" auf eine Vielzahl von nach dem Stand der Technik anerkannten Techniken zur Einführung einer fremden Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle beziehen, darunter die Kopräzipitation mit Calciumphosphat- oder Calciumchlorid, die DEAE-dextranvermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Methoden für die Transformation oder Transfektion von Wirtszellen sind bei Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), und in anderen Laborhandbüchern zu finden.
Es ist bekannt, dass für eine stabile Transfektion von Säugetierzellen, je nach Expressionsvektor und angewendeter Transfektionstechnik nur ein kleiner Bruchteil von Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird im Allgemeinen ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker sind soche, die gegenüber Medikamenten beständig sind, z.B. G418, Hygromycin und Methotrexat. Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker kodiert, kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingeführt werden, wie jener, der ein lösliches P-Selektin-Polypeptid kodiert, kann aber auch auf einem gesonderten Vektor eingeführt werden. Zellen, die stabil mit eingeführter Nukleinsäure transfiziert wurden, können durch Arzneimittelselektion identifiziert werden (z.B. werden Zellen, die das selektierbare Markergen eingebaut haben, überleben, während die anderen Zellen absterben).
Die Wirtszelle, wie z.B. eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann verwendet werden, um ein lösliches P-Selektin-Polypeptid oder Fusionsprotein zu produzieren (d.h. zu expremieren). Zum Beispiel wird eine Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein lösliches P-Selektin-Polypeptid oder ein Fusionsprotein kodiert, eingeführt worden ist) in einem geeigneten Medium kultiviert, so dass ein lösliches P-Selektin-Polypeptid oder Fusionsprotein produziert wird. Im Weiteren wird dann das lösliche P-Selektin-Polypeptid oder Fusionsprotein aus dem Medium oder der Wirtszelle isoliert.
Pharmazeutische Kompositionen
Das lösliche P-Selektin-Polypeptid kann eingebaut werden. Solche Kompositionen umfassen typischerweise das lösliche P-Selektin-Polypeptid und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Wie hierin verwendet, soll die Formulierung „pharmazeutisch akzeptabler Träger" jedwede Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und ähnliches, die mit der pharmazeutischen Verabreichung verträglich sind, einschließen. Die Verwendung dieser Medien und Mittel für pharmazeutische Wirkstoffe ist nach dem Stand der Technik allgemein bekannt. Sofern die herkömmlichen Medien oder Mittel nicht mit der aktiven Verbindung unverträglich sind, wird deren Anwendung in den Kompositionen erwogen. Ergänzende Wirkstoffe können ebenfalls in die Kompositionen eingearbeitet werden.
Die pharmazeutische Komposition wird als mit dem beabsichtigten Verabreichungsweg verträglich formuliert. Als Beispiele für Verabreichungswege wären zu nennen die parenterale, z.B. die intravenöse, intradermale, subkutane, orale (z.B. Inhalation), transdermale (topische), transmukosale, ophthalmische und die rektale Verabreichung, darunter das direkte Einbringen in den Krankheitsherd. Lösungen oder Suspensionen, die für die parenterale, intradermale oder subkutane Applikation eingesetzt werden, können die folgenden Komponenten enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser für die Injektion, Salzlösung, fixierte Öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel, antibakterielle Mittel, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie Askorbinsäure oder Natriumbisulphit; Chelatbildner wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zur Einstellung der Tonizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder Laugen, wie Salzsäure oder Natriumhydroxid, eingestellt werden. Die parenterale Zubereitung kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Fläschchen aus Glas oder Kunststoff für Mehrfachdosen verschlossen werden.
Pharmazeutische Kompositionen, die für die Anwendung durch Injizieren geeignet sind, schließen sterile wässrige Lösungen (sofern wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die improvisierte Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein. Für die intravenöse Verabreichung wären als geeignete Träger physiologische Salzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, NJ) oder phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) zu nennen. In allen Fällen muss die Komposition steril sein und sollte sie in dem Maße fluid sein, dass eine leichte Injizierbarkeit gegeben ist. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil und gegen die verunreinigende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilze, geschützt sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglycol o.ä.) sowie geeignete Mischungen daraus enthält. Die entsprechende Fließfähigkeit kann z.B. durch Verwendung eines Überzugs aus Lecithin, bei der Dispersion durch Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße und durch Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen gewährleistet werden. Das Einwirken von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel, wie zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Askorbinsäure, Thimerosol und ähnliches, verhindert werden. In vielen Fällen werden vorzugsweise isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole, wie Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid in die Komposition einbezogen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Kompositionen kann dadurch erreicht werden, dass man ein Mittel in die Komposition einbezieht, das die Absorption verzögert, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einbeziehen des löslichen P-Selektin-Polypeptids in der erforderlichen Menge in einem entsprechenden Lösungsmittel mit einem der obengenannten Bestandteile oder, nach Erfordernis, einer Kombination aus den obengenannten Bestandteilen, mit anschließender Filtrationssterilisation hergestellt werden. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einbeziehen des löslichen P-Selektin-Polypeptids in einen sterilen Träger hergestellt, der ein basisches Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile aus der obigen Aufzählung enthält. Bei sterilen Pulvern für die Herstellung steriler injizierbarer Lösungen können als bevorzugte Zubereitungsmethoden das Vakuumtrocknen und das Gefriertrocknen genannt werden, wodurch ein Pulver aus dem Wirkstoff plus dem zusätzlich erwünschten Bestandteil aus der vorher sterilfiltrierten Lösung erhalten wird.
Oral zu verabreichende Kompositionen enthalten im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Trägerstoff. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder zu Tabletten gepresst werden. Für die Zwecke der oralen therapeutischen Verabreichung kann das aktive, lösliche P-Selektin-Polypeptid mit Arzneimittelträgerstoffen eingearbeitet und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Oral zu verabreichende Kompositionen können auch unter Verwendung eines fluiden Trägers als Mundwasser hergestellt werden, wobei die Komponente im fluiden Träger mit dem Mund aufgenommen, im Mundraum verteilt und dann ausgespuckt oder geschluckt wird. Pharmazeutisch verträgliche Bindemittel und/oder Adjuvanzien können als Bestandteil der Komposition ein bezogen werden. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und ähnliches können einige der folgenden Bestandteile oder Verbindungen ähnlicher Art enthalten: ein Bindemittel wie mikrokristalline Zellulose, Tragantgummi oder Gelatine; einen Hilfstoff, wie Stärke oder Lactose, ein Zersetzungsmittel wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; einen Schmierstoff wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel wie kolloides Siliciumdioxid; ein Süßungsmittel wie Saccharose oder Sacharin; oder einen Geschmacksstoff wie Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangenaroma.
Für die Verabreichung durch Inhalation wird lösliches P-Selektin-Polypeptid in Form eines Aerosolspray aus einem Druckbehälter oder einem Spender bereit gestellt, der ein geeignetes Treibmittel, z.B. ein Gas, wie Kohlendioxid, oder einen Nebelstoff enthält.
Die systemische Verabreichung kann auch mit transmucosalen oder trans dermalen Mitteln erfolgen. Für die transmucosale oder transdermale Verabreichung werden Durchdringungsmittel passend zu der zu durchdringenden Barriere in der Rezeptur eingesetzt. Solche Durchdringungsmittel sind im Fachgebiet allgemein bekannt und schließen beispielsweise für die transmucosale Verabreichung Reinigungsmittel, Gallensalze und Derivate der Fusidinsäure ein. Die transmucosale Verabreichung kann durch Verwendung von Nasensprays oder Zäpfchen erfolgen. Für die transdermale Verabreichung wird das lösliche P-Selektin-Polypeptid zu Wundsalben, Salben, Gels oder Cremes verarbeitet, wie dies nach dem Stand der Technik allgemein bekannt ist.
Das lösliche P-Selektin-Polypeptid kann auch in Form von Zäpfchen (z.B. mit herkömmlichen Zäpfchenbasen, wie Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder Retentionseinläufen für die rektale Verabreichung verarbeitet werden.
In einer Ausführungsform wird das lösliche P-Selektin-Polypeptid mit Trägerstoffen hergestellt, die die Verbindung gegen schnelles Verlassen des Körpers schützen, wie Rezepturen für die gesteuerte Freigabe, darunter Implantate und mikrogekapselte Verabreichungssysteme. Es können auch biologisch abbaubare, biologisch verträgliche Polymere verwendet werden, wie z.B. Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Die Methoden zur Herstellung solcher Rezepturen sind den auf diesem Gebiet Versierten bekannt. Die Substanzen können auch handelsüblich von Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. bezogen werden. Es können auch liposomale Suspensionen (einschließlich Liposome, die auf die Infektion von Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene) abzielen, als pharmazeutisch akzeptable Träger verwendet werden. Diese können mit den Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden, z.B. nach der Methode, wie sie im US-Patent Nr. 4.522.811 beschrieben ist.
Es ist besonders vorteilhaft, im Hinblick auf eine einfache Verabreichung und Gleichmäßigkeit der Dosierung orale oder parenterale Kompositionen in einheitlicher Dosierung zu formulieren. „Einheitliche Dosierungsform", wie hierin verwendet, bezieht sich auf physisch diskrete Einheiten, die sich als einheitliche Dosierungen für den zu behandelnde Proband eignen; wobei die jeweilige Einheit eine vorbestimmte Menge von löslichem P-Selektin-Polypeptid enthält, die so berechnet wurde, dass der gewünschte therapeutische Effekt in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger eintritt.
Toxizität und theurapeutische Wirkung des löslichen P-Selektin können mit den üblichen pharmazeutischen Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren, z.B. zur Bestimmung der LD₅₀-Rate (die tödliche Dosis für 50% der Population) und der ED₅₀-Rate (der Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist) bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischer und therapeutischer Wirkung ist der therapeutische Index und kann als Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden.
Die aus den Zellkulturanalysen und Tierstudien erhaltenen Daten können bei der Formulierung eines Dosierungsbereiches zur Anwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung dieser Verbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich zirkulierender Konzentrationen, die den ED₅₀-Wert mit geringer oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereiches je nach angewendeter Dosierungsform und Verabreichungsweg schwanken. Die therapeutisch wirksame Dosis kann zunächst aus Zellkulturanalysen abgeschätzt werden. Eine Dosis kann dann in Tiermodellen formuliert werden, um einen zirkulierenden Plasmakonzentrationsbereich zu erreichen, der den IC₅₀-Wert einschließt (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbe maximale Hemmung der Symptome erreichen lässt), wie sie in der Zellkultur bestimmt wurde. Derartige Informationen können dazu dienen, die nützlichen Dosen beim Menschen genauer festzulegen. Die Plasmawerte können gemessen werden, zum Beispiel durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie.
Wie hierin definiert, reicht die therapeutisch wirksame Menge des löslichen P-Selektin-Polypeptids (d.h. die wirksame Dosis) von etwa 0,001 bis 30 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise etwa 0,01 bis 25 mg/kg Körpergewicht, mehr bevorzugt von etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht, und noch mehr bevorzugt von etwa 1 bis 10 mg/kg, 2 bis 9 mg/kg, 3 bis 8 mg/kg, 4 bis 7 mg/kg, oder 5 bis 6 mg/kg Körpergewicht. Dem versierten Fachmann wird klar sein, dass bestimmte Faktoren auf die Dosierung, die zur wirksamen Behandlung einer Person erforderlich ist, Einfluss haben, darunter die Schwere der Erkrankung oder Störung, die vorherigen Behandlungen, der allgemeine Gesundheitszustand und/oder das Alter des betreffenden Probands und andere noch vorhandene Krankheiten, sich jedoch darauf nicht beschränkend. Darüber hinaus kann die Behandlung einer Person mit einer therapeutisch wirksamen Menge an löslichem P-Selektin-Polypeptid eine einzelne Behandlung oder vorzugsweise eine Reihe von Behandlungen einschließen.
In einem bevorzugten Beispiel wird eine Person mit löslichem P-Selektin-Polypeptid im Bereich von zwischen etwa 0,1 und 20 mg/kg Körpergewicht, einmal pro Woche und etwa 1 bis 10 Wochen lang, vorzugsweise zwischen 2 bis 8 Wochen, eher noch etwa zwischen 3 bis 7 Wochen, und vorzugsweise eher noch etwa 4, 5 oder 6 Wochen lang, behandelt. Es dürfte auch klar sein, dass sich die wirksame Dosis von zur Behandlung eingesetztem, löslichem P-Selektin-Polypeptid im Verlaufe einer speziellen Behandlung erhöhen oder verringern kann.
Diese Erfindung wird des Weiteren durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch nicht als Einschränkung aufzufassen sind.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 HÄMOSTATISCHES POTENZIAL BEI TIEREN MIT ERHÖHTEN NIVEAUS VON LÖSLICHEM P-SELEKTIN
Transgenische Mäuse, die P-Selektin bei fehlender zytoplasmischer Domäne (ΔCT-Mäuse) expremieren, sind durch Genersatz mittels homologer Rekombination in embryonischen Stammzellen erzeugt worden (Hartwell, D. W. et al. J Cell Biol (1998) 143: 1129–1141). Diese mutanten Tiere weisen ein erhöhtes Maß an löslichem P-Selektin im Plasma auf.
Dieses Beispiel beschreibt Untersuchungen des hämostatischen Potenzials bei ΔCT-Mäusen im Vergleich zu wilden Kontrolltieren.
A. Fibrin-Bildung in einer Perfusionskammer
Die Fibrinbildung von nichtantikoaguliertem Blut aus der Wildtyp-Mäusen (WT), ΔCT-Mäusen und Mäusen mit P-Selektin-Defizit (P-sel –/–) (Mayadas, T. N. et al. Cell (1993) 74: 541–554) wurde ex vivo in einer Perfusionskammer verglichen. Bei diesen Mäusen wurden die Leukozyten-Rollung und neutrophile Extravasation sowie die Hämostase gegenübergestellt (Subramaniam, M. et al. Blood (1996) 87: 1238–1242).
Kurz gesagt, es wurden Glaskapillarröhren (Innendurchmesser 0,56 mm) mit 1 mg/ml humanen fibrillarem Collagen, Typ III, (Sigma, St. Louis) wie vorher beschrieben (Andre, P. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol (1996) 16: 56–63) beschichtet. Die Mäuse wurden mit 2,5% Tribromethanol (0,15 ml/10 g) anästhesiert. Nichtantikoaguliertes Blut wurde unter Verwendung einer Kanüle 25G direkt aus der Vena cava der Mäuse entnommen und mit einem Silastic-Schlauch durch die collagenbeschichtete Perfusionskammer perfundiert. Zwei Minuten lang wurde eine Durchflussmenge von 220 μl/Minute mit einer Spritzenpumpe aufrechterhalten (Harvard Apparatus), die distal zur Kammer angebracht war, wobei nach der Gleichung γ = 4 Q/πr³ eine Schergeschwindigkeit von 212 s^–1 resultierte. Unmittelbar nach der Blutperfusion wurden die thrombotischen Ablagerungen, die sich auf der Collagenoberfläche gebildet hatten, 20 Sekunden lang mit PBS gespült und in eiskaltem 2,5%igen kakodylatgepuffertem Glutaraldehyd (pH 7,4) bei der gleichen Schergeschwindigkeit fixiert. Die Perfusionskammer wurde dann aus dem Strömungssystem entnommen und 24 Stunden lang in einem frisch zubereiteten Fixativpuffer bei 4°C fixiert. Unter Lichtmikroskopie wurde dann nach Epon-Einbettung eine en face-Visualisierung der thrombotischen Ablagerungen vorgenommen.
1 ist ein Foto der Phasen-Kontrast-mikroskopischen Untersuchung der thrombotischen Ablagerungen, die sich nach einer 2-minütigen nichtantikoagulierten Blutperfusion (Blutstrom von links nach rechts) gebildet hatten. Der weiße Pfeil weist auf den plättchenreichen Thrombus hin; der schwarze Pfeil zeigt auf das Fibrinende, das distal den Plättchenthrombus gebildet hatte. Wie in 2 dargestellt, wurde in 4 von 11 Perfusionskammern, die mit Tieren des Wildtyps betrieben wurden (eine Perfusionskammer pro Tier), ein Fibrinende distal zum Plättchenaggregat festgestellt. In 8 von 9 Perfusionskammern, die mit ΔCT-Mäusen betrieben wurden, war ein Fibrinende vorhanden. Außerdem war das Fibrinende von den ΔCT-Mäusen erheblich länger als das bei den Wildmäusen beobachtete. Keine der Perfusionskammern, die mit Blut betrieben wurde, welches ein P-Selektin-Defizit aufwies, ergab ein Fibrinende. Der statistische Vergleich zwischen der Fibrinbildung in den 3 Genotypen wurde unter Zuhilfenahme des Log-Rank-Test durchgeführt. Zum Vergleich der Länge des Fibrinendes wurde ein Student-t-Test herangezogen.
B. Konzentrationen des löslichen P-Selektins und Fibrinogens im Plasma
Die Konzentration des löslichen P-Selektins im Plasma wurde mit einem modifizierten Sandwich-ELISA-Verfahren, wie es bereits beschrieben wurde (Hartwell, D. W. et al. J Cell Biol (1998) 143: 1129–1141), gemessen. Kurz gesagt, die Plasmaproben von Mäusen des Wildtyps (WT) und von ΔCT-Mäusen wurden zwei Stunden lang bei 37°C mit Platten inkubiert, die mit monoklonalem Anti-Maus-P-Selektin-Antikörper beschichtet waren (RB 40.34, Pharmingen Corp., San Diego, CA). Nach dem Waschen wurde ein biotinylierter Kaninchen-Anti-P-Selektin-Antikörper (Pharmingen Corp., San Diego, CA) zugegeben und 2 Stunden lang inkubiert. Es wurde dann ExtrAvidin-konjugierte, alkalische Phosphatase zugegeben und die Aktivität mit p-Nitrophenylphosphate ermittelt (Sigma Chemical Co., St Louis, MO). Die Platten wurden bei 405 nm in einem Epson LX-300 ELISA-Leser gelesen (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA). Der Plasmawert des Fibrinogens wurde nach dem Sigma Diagnostics-Verfahren Nr. 886 (St. Louis, MO) gemessen und in mg/dL ausgedrückt.
Wie in nachstehender Tabelle 1 dargestellt, wurde im Plasma von ΔCT-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine dreifache Erhöhung der Konzentration des löslichen P-Selektins festgestellt. Im Gegensatz dazu wurde bei den Plasma-Fibrinogenspiegeln dieser Tiere keine erhebliche Differenz festgestellt.
TABELLE 1
C. Hämorrhagische Läsionen bei einer lokalen Shwartzman-Reaktion
Die lokale Shwartzman-Reaction ist eine hämorrhagische und nekrotische Läsion, die durch Endotoxin und Cytokine induziert wird, wobei es sich hierbei um ein prototypisches Modell für die Wechselbeziehung zwischen inflammatorischen und hämostatischen Systemen handelt. Kurz gesagt, wurden 12 bis 14 Wochen alte, altersangepasste männliche Wildtyp-Mäuse (WT) und ΔCT-Mäuse am Tag 0 durch eine subkutane Injektion von Escherichia coli LPS 055: B5 (Difco Laboratories, Detroit, MI) mit 100 μg/Maus in 0,1 ml steriler phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) geprimet. Vierundzwanzig Stunden später (Tag 1) wurde rekombinantes TNF-alpha (Genzyme, Cambridge, MA) mit 0,3 μg/Maus an der gleichen Hautstelle, wie beschrieben, injiziert (Subramaniam, M et al. Blood (1996) 87: 1238–1242). Am Tag 2 wurden die hämorrhagischen Läsionen untersucht und ohne Kenntnis der Mausgenotypen auf einer Punkteskala von 0 bis 4 bewertet. Hämatoxylin-Eosin-gefärbte Paraffin-Schnitte wurden dann aus der Läsionsstelle präpariert und der Grad der inflammatorischen Zellinfiltration sowie Hämorrhagie mikroskopisch an Hand einer Skala von 0 bis 4 bewertet.
Die makroskopische und mikroskopische Auswertung der Injektionsstellen ließ erkennen, dass nach 48 Stunden die durchschnittliche Größe der hämorrhagischen Läsionen in ΔCT-Mäusen etwa 50% derjenigen bei der Wildform betrug (siehe 3). Im Vergleich zu den mit Human-IgG1 beimpften Tieren (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) war eine besonders signifikante Verringerung der Hämorrhagie bei Tieren der Wildform zu beobachten, die mit löslichem P-Selektin-Ig (1 μg/g; Pharmingen Corp., San Diego, CA) perfundiert wurden, welches eine Stunde vor dem Versuch mit TNFα injiziert worden war.
D. Fibrin-Ablagerung bei einer lokalen Shwartzman-Reaktion
Paraffin-Schnitte von der Shwartzman-Läsionsstelle bei Wildtyp-Mäusen, denen – wie oben beschrieben – Human-IgG1 oder lösliches P-Selektin injiziert worden war, wurden entparaffiniert und anschließend mit Avidin D-Lösung und Biotin-Blockierlösung blockiert (Vector, Burlingame, CA), und dann mit einem Kaninchen-Antihuman-Fibrinogen-Antikörper gefärbt (Verdünnung 1:1000; A0080, Dako, Carpinteria, CA), der mit Mausfibrin/-fibrinogen kreuzreagiert. Die Schnitte wurden dann mit einem biotinylierten Ziegen-Antikaninchen-Sekundärantikörper (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA), und einer ABC-Mixlösung (Vector, Burlingame, CA) behandelt. Die Entwicklung erfolgte durch Behandeln der Schnitte mit einem AEC-Substrat-Kit für Meerrettich-Peroxidase (Vector, Burlingame, CA). Die Schnitte wurden dann 5 Minuten lang mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Alle Behälter, die eine Fibrinfärbung außerhalb der Behälterwandung aufwiesen, wurden als „undicht" klassifiziert. Behälter, die eine Fibrinfärbung an der Innenfläche der Endothelzellen ohne Fibrin außerhalb der Behälterwand aufwiesen, wurden als „Ring" eingestuft. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Im Vergleich zu den Tieren, die mit Human-IgG1 perfundiert wurden, wiesen Wildtyptiere, denen lösliches P-Selektin injiziert worden war, eine erhebliche Verringerung des Prozentsatzes der „undichten" Behälter sowie eine Erhöhung des Prozentsatzes der „Ring"behälter auf.
E. Plasmagerinnungszeit
Die Plasmagerinnungszeit von Wildtyp-Mäusen, ob unbehandelt oder infundiert entweder mit Human-IgG1 (Kontrolle) oder löslichem P-Selektin (s-P-sel), von Mäusen mit P-Selektin-Defizit sowie ΔCT-Mäusen, entweder unbehandelt oder infundiert mit Human-rekombinant PSGL-1 (r-PSGL-1), wurde wie folgt bestimmt. Kurz gesagt, wurde 1 ml Blut dem retroorbitalen Venenplexus mit gewöhnlichen Mikrohematocrit-Kapillarröhrchen abgenommen und in Polypropylenröhren, die 10% Endvolumen der Säure-Citrat-Dextrose enthielten (ACD: 38 mM Zitronensäure, 75 mM Trinatriumcitrat, 100 mM Dextrose) gesammelt. Das plättchenarme Plasma wurde durch 25-minütiges Zentrifugieren bei 1.500 g vorbereitet, dann 2 Minuten lang bei 15.000 g zentrifugiert, um etwaige verunreinigende Zellen aus dem Plasma zu entfernen. Die Plasmagerinnungszeit wurde unter Rühren (800 Umdrehungen pro Minute) bei 37°C in einem Aggregometer durch Zugabe eines gleichen Volumens vorgewärmten CaCl₂-Lösung (20 mM) zum Plasma in einem Silikonröhrchen induziert.
Wie in 5 dargestellt, wiesen im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen die ΔCT-Mäuse eine erhebliche Verringerung der Gerinnungszeit auf. Außerdem wurde am Tag 4 bei den ΔCT-Mäusen, denen intravenös (an den Tagen 0 und 2) Human-Rekombinant PSGL-1 IgG (10 mg/kg) injiziert worden war, eine erhebliche Erhöhung der Gerinnungszeit beobachtet. Im Gegensatz dazu verringerte die Injektion von löslichem P-Selektin bei Mäusen der Wildform im Vergleich zu der IgG-behandelten Kontrollgruppe die Gerinnungszeit erheblich.
F. Mikropartikel im Mäuseplasma
Die Niveaus der Mikropartikel, die in vivo bei Wildtyp-Mäusen, sei es unbehandelt oder infundiert mit Human-IgG1 (Kontrolle) oder löslichem P-Selektin (s-P-sel), und bei ΔCT-Mäusen zirkulieren, wurde wie folgt bestimmt. Kurz gesagt, wurde das plättchenarme Plasma wie oben beschrieben vorbereitet. Anschließend wurden 300 μl plättchenarmes Plasma pro Maus abgenommen, wobei drei Proben des plättchenarmen Plasmas von Mäusen des gleichen Genotyps zusammen in einem Pool vereinigt, im Verhältnis von 1:3 mit Puffer (10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl₂, 136 mmol/L NaCl, pH 7,4) verdünnt und 1,5 Stunden lang bei 100.000 g zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde verworfen und die Pellets der Mikropartikel wurden in einem feststehenden Volumen (120 μl) des gleichen Puffers erneut suspendiert.
An einem Becton-Dickinson FACSCalibur (Franklin Lakes, NJ) mit CellQuest-Software (Becton-Dickinson, San Jose, CA) wurde dann die durchfluss-zytometrische Analyse durchgeführt. Die Lichtstreuungs- und Fluoreszenzkanäle wurden auf logarithmische Verstärkung (Vorwärtsstreuung E00 mit einem Schwellwert von 12 und Seitenstreuung 300) eingestellt. Um die Gesamtpopulation der Mikropartikel zählen zu können, wurden 30 μl Aliquote 15 Minuten lang im Dunkeln mit Calcein AM (0,25 μg/ml; Molecular Probes, Eugene, OR) inkubiert. Die Gesamtzahl der Ereignisse wurde für ein eingestelltes Intervall von 10 Sekunden gezählt.
6 zeigt, dass die Anzahl der Mikropartikel sich bei den ΔCT-Mäusen im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren um das 1,9fache erhöht hat. Des Weiteren wurde, als den Wildtyp-Mäusen intravenös lösliches P-Selektin-Ig injiziert worden war, im Vergleich zum Human-IgG1 eine 2,7fache Zunahme bei den Mikropartikeln beobachtet.
Um den Ursprung der prokoagulanten Aktivität festzustellen, wurden Proben der Mikropartikel 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Schaf-Antikaninchen-Gewebefaktor IgG (American Diagnostica Inc., Greenwich, CT) eingefärbt, der einen Mausgewebefaktor erkennt (5 μg/ml Endkonzentration). Als sekundärer Antikörper wurde ein FITC-konjugierter Kaninchen-Antischaf-IgG (Verdünnung 1:1000; Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA) verwendet. Als Kontrolle wurde eine identische Konzentration von Kontroll-IgG-Antikörpern verwendet (Ratten-IgG, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; FITC-konjugiertes Schaf-IgG, Caltag Laboratories, Burlingame, CA). Die Mikropartikel wurden mittels Durchfluss-Zytometrie analysiert.
7 zeigt, dass es eine erhöhte Anzahl von Mikropartikeln gibt, die den Gewebefaktor im Plasma von ΔCT-Mäusen expremieren.
G. Behandlung von ΔCT-Mäusen mit löslichem PSGL-Ig
Die Infusion von löslichem PSGL-Ig verringert den prokoagulanten Phenotyp von ΔCT-Mäusen, wie er durch einen erheblichen Rückgang bei der Anzahl der Mikropartikel und einer verlängerten Gerinnungszeit des Plasmas sichtbar wird. Die Infusion von Kontroll-Ig hatte keine derartige Wirkung.
Die Plasmagerinnungszeit wurde bestimmt wie oben beschrieben. Zur Analyse der Mikropartikel im Plasma von ΔCT-Mäusen, die mit PSGL-Ig behandelt worden waren, wurden 200 μl Blut durch retroorbitale Punktion am Tag 0 entnommen. Erhalten wurde ein plättchenarmes Plasma, wobei 40 μl mit 260 μl PBS verdünnt und sofort auf Anzahl der Mikropartikel mittels FACS analysiert wurden. Die Mäuse wurden dann intravenös (Tage 0 und 2) mit 10 mg/kg PSGL-Ig oder Kontroll-Ig infundiert. Am Tag 4 wurden dann 200 μl Blut aus dem anderen Auge entnommen und die Anzahl der Mikropartikel bestimmt.
11A zeigt die Anzahl der in 40 μl ΔCT-Plasma vorhandenen Mikropartikel vor (hohle Balken) und nach (gefüllte Balken) zwei Infusionen von PSGL-Ig und Kontroll-Ig bei ΔCT-Mäusen (* = p < 0,05).
11B zeigt, dass die Gerinnungszeit am Ende des Experiments (z.B. nach 4 Tagen) bei Mäusen, die mit löslichem PSGL-Ig behandelt worden waren (gefüllte Balken), erheblich länger war als bei der Ig-behandelten Kontrollgruppe (hohler Balken) (* = p < 0,05). Diese Daten zeigen, dass die Hemmung des löslichen P-Selektin den prokoagulanten Zustand in vivo verringert.
BEISPIEL 2 AKTIVITÄT DES LÖSLICHEN P-SELEKTIN BEI MÄUSEN MIT VON-WILLEBRAND-FAKTOR-DEFIZIT UND MÄUSEN MIT HÄMOPHILIE A
Mäuse mit einem von-Willebrand-Factor(vWF)-Defizit besitzen nur etwa 20% des Wertes am Faktor VIII der Wildtypen (Antihämophiliefaktor) und haben daher Schwierigkeiten bei der Fibringerinnung (Denis, C. et al. Proc Natl Acad Sci USA (1998) 95: 9524–9529). Bei Mäusen mit Hämophilie A fehlt der Faktor VIII völlig (Bi, L. et al. (1995) Nature Genetics 10: 119–121). Dieses Beispiel beschreibt die hämostatische Aktivität von löslichem P-Selektin bei diesen Tieren.
A. Gewebefaktoraktivität in plättchenarmem Plasma
Aus dem im Pool aufbewahrten Plasma von Mäusen mit vWF-Defizit (vWF –/–), die mit löslichem P-Selektin-Ig (n = 2) oder IgG1 (Kontrolle; n = 3) infundiert worden waren, wurde plättchenarmes Plasma präpariert. Die Mikropartikel wurden durch wiederholtes Zentrifugieren des plättchenarmen Plasmas hergestellt. Kurz gesagt, der erste Zentrifugationsschritt bei 12.000 g von 2 Minuten Dauer wurde durchgeführt, um etwaige verunreinigende Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde dann mit einer Lösung von 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, pH 7,2 verdünnt und 90 Minuten lang bei 200.000 g ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die pelletierten Mikropartikel wurden (1/2 des anfänglichen Volumens) in einer Lösung aus 10 mM HEPES, 136 mM NaCl, pH 7,4 erneut suspendiert. Die Bestimmung der Gewebefaktoraktivität der Mikropartikellösung wurde über ihre Fähigkeit gemessen, die Aktivierung des Faktors X (15 nM) durch den Faktor VIIa (5 nM) in Gegenwart von 1 mM CaCl₂ zu fördern. Die Reaktion ließ man 20 Minuten lang bei 37°C laufen und stoppte sie dann durch Zugabe eines Überschusses an EDTA (5 mM Endkonzentration). Bei der Endkonzentration von 0,3 mM wurde ein chromogenes Substrat des Faktors Xa, Spectrozyme^® fXa, zugesetzt. Die Änderung des Absorptionsvermögens bei 405 nm mit der Zeit wurde unter Verwendung eines Plattenlesegerätes, das mit Kinetiksoftware ausgestattet war (DYNEX Technologies, Inc.) unmittelbar aufgezeichnet. Die linearen Änderungen des Absorptionsvermögens stehen in direkter Korrelation mit der Konzentration des bei der Analyse ermittelten Faktors Xa.
Wie aus nachstehender Tabelle 2 ersichtlich ist, war die Gewebefaktoraktivität der Lösung der Mikropartikel aus Mäusen mit vWF-Defizit, welchen lösliches P-Selektin-Ig infundiert worden war, 2,1 mal größer als die der Kontrollmäuse, die mit IgG1 infundiert worden waren.
TABELLE 2
B. Prokoagulante Mikropartikelerzeugung durch Infusion von löslichem P-Selektin-Ig
Die Konzentrationen der Mikropartikel, die in vivo bei Mäusen mit vWF-Defizit zirkulieren, welche entweder mit Human-IgG1 (Kontrolle) oder löslichem P-Selektin-Ig (sP-sel-Ig) infundiert worden waren, wurde wie oben beschrieben bestimmt. Aus 8 wird deutlich, dass im Vergleich zum Human-IgG1 (Kontrolle) die Anzahl der Mikropartikel zunahm, wenn Mäusen mit vWF-Defizit intravenös lösliches P-Selektin-Ig injiziert wurde.
C. Prothrombin-Gerinnungszeit
Die Bestimmung der Prothrombin-Gerinnungszeit (PT) ist ein globaler Koagulations-Screeningtest. Es geht hierbei um einen extrinsischen Koagulationsweg, der mit der Aktivierung des TF-VII(a)-Komplexes beginnt. Die PT-Zeit wird bei vorgewärmten (37°C) plättchenarmen Plasma nach Zugabe von Thromboplastin als Quelle des Gewebefaktors und von Ca²⁺ gemessen.
Die Gerinnungszeit für verdünntes Prothrombin wurde gemessen, nachdem die dem Pool entnommene plättchenarme Plasmaprobe (0,1 ml) mit 0,2 ml verdünntem Kaninchengehirn-Thromboplastin (IL TEST PT) vermischt worden war. Die Gerinnungszeit wurde durch Fotometrienachweis der ersten gebildeten Fibrinfäden bestimmt. 9 zeigt eine verlängerte Prothrombin-Gerinnungszeit bei Plasma mit vWF-Defizit (vWF –/–) im Vergleich zum Wildtyp (wt), als die Thromboplastin-Konzentration abgenommen hatte. Dies kann durch den normalen Spiegel von 20% für den Faktor VIII erklärt werden, wie er bei Mäusen mit vWF-Defizit vorgefunden wird.
Die Gerinnungszeit bei Mäusen mit vWF-Defizit, die entweder mit löslichem P-Selektin-Ig oder IgG1 (Kontrolle) infundiert worden waren, wurde bei hoher Verdünnung des Thromboplastins (1:20.000) geprüft, da bekannt ist, dass bei dieser Verdünnung die Prothrombin-Gerinnungszeit vorzugsweise gewebefaktorabhängig ist. Im Vergleich zu Mäusen mit vWF-Defizit, die mit IgG1 infundiert worden waren, verkürzte die Infusion von löslichem P-Selektin-Ig bei Mäusen mit vWF-Defizit die Prothrombin-Gerinnungszeit um 28%.
D. Blutungszeit
Die Blutungszeit wurde so gemessen, wie dies von Dejana, et al. (1979) Thromb. Res. 15: 199–201 beschrieben worden war. Kurz gesagt, wurde Mäusen mit einem Faktor III-Defizit 1,2 μg lösliches P-Selektin-Ig (P-sel-Ig) oder Human-IgG1 Kontrolle pro Gramm Körpergewicht der Maus injiziert. Sechs Stunden später wurden die Mäuse in eine Rückhaltevorrichtung gesetzt, und ein distales 3 mm großes Segment aus dem Schwanz mit einer Rasierklinge abgetrennt. Der Schwanz wurde sofort in 0,9% isotonische Salzlösung bei 37°C getaucht, wobei die Schwanzspitze sich 5 cm unter dem Körper befand. Die Blutungszeit wurde als die Zeit definiert, die erforderlich war, bis der Blutstrom aufhörte. Die Infusion von löslichem P-Selektin reduzierte die Blutungszeit bei Mäusen mit Hämophilie A (Mäuse mit Faktor VIII-Defizit).
Wie auf 10 dargestellt ist, verringerte sich im Vergleich zu Mäusen mit Hämophilie A, welche mit Human-IgG1 behandelt worden waren, die Blutungszeit erheblich für Mäuse mit Hämophilie A, die mit löslichem P-Selektin-Ig behandelt wurden.
E. Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT)
Die Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT) ist ein globaler Koagulations-Screeningtest. Es handelt sich hierbei um einen intrinsischen Koagulationsweg.
Die Wirkung von löslichem P-Selektin auf die aktivierte partielle Thromboplastinzeit und die Plasmagerinnungszeit bei Mäusen mit Faktor VIII-Defizit (Mäuse mit Hämophilie A) wurde wie folgt bestimmt. Kurz gesagt, wurden Mäuse mit Hämophilie A mit 1,2 μg P-selektin-Ig oder Human-IgG1 pro g Körpergewicht behandelt. Die Mäuse ließ man sechs Stunden nach der Perfusion in ACD bluten. Das plättchenarme Plasma wurde dann wie oben beschrieben präpariert. Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) wurde mit APTT-Reagens bestimmt, wobei die Gerinnung durch Zugabe von Calciumionen ausgelöst wurde. APTT und Plasmagerinnungszeit sind bei den mit löslichem P-Selektin-Ig-behandelten Mäusen mit Hämophilie A reduziert.
Wie in 14 dargestellt, war im Vergleich zu den Mäusen, welche mit Human-IgG1 behandelt worden waren (p < 0,0013, bestimmt durch einen unpaarigen t-Test), der APTT-Wert bei den mit löslichem P-Selektin-Ig-behandelten Mäusen mit Hämophilie A kleiner. Die Gerinnungszeit des Plasmas von mit löslichem P-Selektin-Ig-behandelten Mäusen mit Hämophilie A nach Zugabe von Calciumionen war im Vergleich zu den mit Kontroll-IgG1 behandelten Mäusen erheblich reduziert (p < 0,0058, bestimmt durch einen unpaarigen t-Test).
Die vorstehenden Beispiele demonstrieren die hämostatische Aktivität des löslichen P-Selektins. Die Infusion des löslichen P-Selektins bei einer Maus ruft einen prokoagulanten Zustand im Tier hervor. Wenn solch ein Tier verletzt wird, wird an der Stelle der Gefäßverletzung schneller Fibrin abgelagert, wodurch sich der Austritt von Blut aus den Blutgefäßen verringert. Das Plasma des mit löslichem P-Selektin infundierten Tieres gerinnt schneller. Transgenische Tiere, die höhere Konzentrationen von löslichem P-Selektin expremieren (ΔCT-Mäuse) bilden auch leichter Fibrin als Wildtyptiere und sind bei einer hämorrhagischen Verletzung auch vor einem übermäßigen Blutaustritt geschützt. Im Gegensatz dazu haben Tiere, denen P-Selektin in jeglicher Form fehlt, eine erhöhte hämorrhagische Reaktion und eine etwas längere Blutungszeit als der Wildtyp. Diese Daten zeigen, dass die Konzentration des löslichen P-Selektins ein Prädiktor für das Koagulationspotenzial bei einem Säugetier ist.
Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass eine Infusion von löslichem P-Selektin in eine Maus die Anzahl der Mikropartikel, welche den Gewebefaktor im Blut enthalten, erhöht. Gleichermaßen besitzen transgenische Mäuse, die höhere Konzentrationen von löslichem P-Selektin als normal expremieren, mehr gewebefaktorhaltige Mikropartikel in Zirkulation. Eine Infusion von löslichem PSGL-1 (ein Ligand pro Inhibitor von P-Selektin) reduziert die Anzahl der gewebefaktorhaltigen Mikropartikel und verlängert die Gerinnungszeit des Plasmas bei diesen Mäusen. Durch Modulieren der P-Selektinaktivität, beispielsweise durch Modulieren der Konzentrationen des löslichen P-Selektins, kann entweder das hämostatische Potenzial bei einem Patienten erhöht oder gesenkt werden und ist somit für die Diagnose und Behandlung von hämostatischen Störungen nützlich.
BEISPIEL 3 LÖSLICHES P-SELEKTIN ERZEUGT IM MENSCHLICHEN BLUT MIKROPARTIKEL
Um weiter zu demonstrieren, wie lösliches P-Selektin die prokoagulante Aktivität hervorruft, wurde ein entsprechendes in vitro-System entwickelt. Die Erzeugung von Mikropartikeln nach Zugabe von 15 μg/ml Human-P-Selektin-Ig-Chimere oder Kontroll-Human-IgG1 wurde wie oben beschrieben bestimmt. Menschliches Blut wurde in ACD gesammelt. Die Blutproben von vier Spendern, jeweils gesondert behandelt, wurden bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden unter aseptischen Bedingungen verarbeitet, um eine LPS-Verunreinigung zu vermeiden. Die Erzeugung der Mikropartikel wurde mittels Durchflusszytometrie in plättchenarmem Plasma, das mit PBS verdünnt worden war, analysiert. Vorwärts- und Seitwärtsstreuung wurden für die Quadrantenanalyse herangezogen, um die neu gebildeten großen prokoagulanten Mikropartikel zu quantifizieren. Die gewebefaktorpositiven Mikropartikel wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Mikropartikel wurden mit einem FITC-konjugierten Maus-Antihuman-Gewebefaktor (American Diagnostica^TM) gefärbt.
Wie in 12A dargestellt, war nach 6 Stunden Inkubation mit löslichem P-Selektin die Anzahl der prokoagulanten Mikropartikel im Vergleich zur Human-IgG-Kontrolle um 30% erhöht (* = p < 0,04).
Wie in 12B dargestellt, war die Anzahl der gewebefaktorpositiven Ereignisse durch Inkubation mit löslichem P-Selektin-Ig sechs Stunden lang um 30% erheblich erhöht (* = p < 0,05).
BEISPIEL 4 LÖSLICHES P-SELEKTIN VERKÜRZT DIE GESAMTE BLUT- UND PLASMAGERINNUNGSZEIT IM MENSCHLICHEN BLUT
Die Gesamtgerinnungszeit für Blut und Plasma, beide unter Zugabe von Calciumionen, im menschlichen Blut wurde nach Zusatz von 15 μg/ml Human-P-Selektin-Ig-Chimere oder Kontroll-Human-IgG1 wurde wie folgt bestimmt. Das menschliche Blut wurde in ACD gesammelt. Die Blutproben von vier Spendern, jeweils gesondert behandelt, wurden bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden unter aseptischen Bedingungen verarbeitet, um eine LPS-Verunreinigung zu vermeiden. Die Gesamtgerinnungszeit des Blutes wurde in Silikonröhrchen in einem Socolot Koagulations- und Plättchenanalysegerät (Sienco^TM) gemessen.
Wie in 13A dargestellt, war die Gesamtgerinnungszeit des menschlichen Blutes, das mit löslichem P-Selektin inkubiert worden war, im Vergleich zu dem Blut, das mit IgG behandelt worden war, nach 2 Stunden um etwa 20% (* = p < 0,02) und nach 8 Stunden Inkubation um 60% (** = p < 0,004) verkürzt.
Wie in 13B dargestellt, war im Vergleich zum Plasma, das mit Kontroll-IgG behandelt worden war, und zum unbehandelten Plasma die Plasmagerinnungszeit des Blutes mit löslichem P-Selektin nach 6 Stunden Inkubation um 25% und nach 8 Stunden Inkubation um 40% verkürzt (** = p < 0,004).

Claims

Verwendung eines löslichen P-Selektin-Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hämophilie oder des von Willebrand's Syndroms.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das lösliche P-Selektin-Polypeptid eine Aminosäuresequenz der extrazellularen Domäne eines P-Selektin-Polypeptids umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das P-Selektin-Polypeptid eine Variante des nativen, löslichen P-Selektin-Polypeptids ist, und wobei die Variante P-Selektin-Aktivitat aufweist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Variante eine Aminosäuresequenz besitzt, die zumindest 70% Identität zu der Aminosäuresequenz des nativen, löslichen P-Selektin-Polypeptids aufweist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das lösliche P-Selektin-Polypeptid die Form eines Fusionsproteins hat.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Fusionsprotein ein lösliches P-Selektin-Immunoglobulin-Fusionsprotein ist, bei dem die Fc-Region des Immunglobulins am C-Terminus der löslichen P-Selektin-Sequenz fusioniert ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Immunglobulin Human-IgG1 ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die P-Selektin-Aktivitat eine prokoagulierende Aktivitat ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Hämophilie Hämophilie A ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Hämophilie Hämophilie B ist.