DE69034112T2 - Antikörper gegen Lymphozyten-assoziiertes Zelloberflächenprotein - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft menschliche Lymphocyten-assoziierte Zelloberflächenproteine.
• Hintergrund der Erfindung
• Gene, die ausschließlich durch eine einzige und keine andere Zelllinie exprimiert werden, legen häufig die Funktion dieser Zellpopulation fest. Nicht selten sind Gene durch den Zusammenbau funktionell unabhängiger Domänen entstanden, was sich in der Entwicklung neuer Gene, die Proteine mit neuen Funktionen codieren, manifestiert. Ein induzierbares endotheliales Leukocyten-Adhäsions-Molekül (ELAM-1) wird auf der Oberfläche Cytokin-behandelter Endothelzellen exprimiert. Diese Molekül ist vermutlich für die Akkumulierung von Blutleukocyten an Stellen einer Entzündung verantwortlich, indem es die Adhäsion von Zellen an die Gefäßwand vermittelt (Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9238 (1987)). Ein granuläres Membranprotein, das in Thrombocyten und Endothelzellen vorkommt und GMP-140 genannt wird, wurde cloniert und ist zu ELAM-1 homolog (Johnston et al., Blood Suppl. 1 72: 327A, (1988)).
• Zusammenfassung der Erfindung
• Die Erfindung betrifft allgemein einen Antikörper, der an das Lymphocyten-assoziierte Zelloberflächenprotein LAM-1, das Domänen enthält, die homolog sind zu Bindungsdomänen von tierischen Lectinen, Wachstumsfaktoren und C3/C4-Bindungsproteinen, bindet.
• Die cDNA-Sequenz kann aus einer Population von B-Zell-spezifischen cDNAs aus einer menschlichen Tonsillen-cDNA-Genbank isoliert werden, und die Aminosäuresequenz des Proteins ist im Wesentlichen wie in 2 gezeigt, vorzugsweise zu 80% homolog zu der Sequenz von 2 und besonders bevorzugt 90% homolog. (In diesem Zusammenhang bedeutet "im Wesentlichen wie gezeigt" eine Sequenz, die der angegebenen Sequenz ähnlich genug ist, um dieselbe Funktion zu besitzen.)
• In der Erfindung wird ein Antikörper beschrieben, der gegen das Lymphocyten-assoziierte Zelloberflächenprotein LAM-1 oder ein Fragment davon oder gegen ein Molekül entwickelt wurde, das spezifisch mit LAM-1 oder einem Fragment davon assoziiert ist, wodurch ein funktionelles Molekül erzeugt wird.
• In einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Zellen, die LAM-1 exprimieren, umfassend die Umsetzung des vorstehend beschriebenen Antikörpers mit einer Zellpopulation und Isolierung der Zellen, die den Antikörper binden. Die Bindung von Antikörpern kann auch dazu verwendet werden, um die Rezeptoraktivität von LAM-1 zu blockieren.
• Das Lymphocyten-assoziierte Zelloberflächenprotein Lam-1 ist ein einmaliges Rezeptorprotein, das bisher noch nicht identifiziert worden war. LAM-1 enthält Domänen, die zu den in verschiedenen Rezeptoren gefundenen Domänen homolog sind, ferner ist es ein neu beschriebenes Mitglied einer Genfamilie, die ELAM-1 und GMP-140 umfasst, Proteine, die bei der Zelladhäsion eine Rolle spielen. LAM-1 hat höchstwahrscheinlich eine ähnliche Funktion, es wird jedoch ausschließlich durch Lymphocyten exprimiert. Durch die Isolierung von LAM-1-codierender cDNA wurde es möglich, die Struktur dieses Moleküls zu bestimmen, wobei die cDNA dazu verwendet wurde, die Expression von LAM-1 auf Zellen zu übertragen, die dieses Gen nicht exprimieren.
• Antikörper, die mit LAM-1 reagieren, können zur Identifizierung von Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren, und zur Blockierung von dessen Funktion verwendet werden. Außerdem kann das cDNA-Proteinprodukt zur Entwicklung antagonistischer Liganden verwendet werden, welche die Lymphocyten-Adhäsion und die Funktion beeinträchtigen können und deshalb zur Behandlung von Zuständen, wie Gewebeschädigung und Metastasierung von Krebszellen, verwendet werden können.
• Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und aus den Patentansprüchen deutlich.
• In den Zeichnungen zeigen die 1A und 1B die Struktur des LAM-1-cDNA-Clons.
• 2 zeigt die bestimmte cDNA-Nucleotidsequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz von LAM-1.
• Die 3A, 3B und 3C zeigen die Homologien von LAM-1 zu anderen Proteinen.
• B-Zell-spezifische cDNAs wurden aus einer menschlichen TonsillencDNA-Genbank (ATCC #37546) isoliert, wobei eine differenzierende Hybridisierung mit markierten cDNAs, hergeleitet entweder aus B-Zell (RAJI)-RNA oder T-Zell (HSB-2)-RNA, durchgeführt wurde (Tedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 208–212 (1988)). Positive Plaques wurden isoliert und cloniert und die cDNA-Insertionen wurden in Plasmid pSP65 (Promega, Madison, WI) subcloniert. Nucleotidsequenzen wurden unter Verwendung des Verfahrens von Maxam und Gilbrt (Meth. Enzymol. 65: 499 (1980)) bestimmt. Bei der Analyse der Homologie wurde für jedes Nucleotid oder jede Aminosäure in der Sequenz, wo eine Lücke oder Deletion vorlag, pro Lücke ein Abschlag von –1 festgelegt. Einer der isolierten 261 RAJI+ HSB2-cDNA-Clone, B125, enthielt eine 1,90 kb große cDNA-Insertion, die mit einer 2,4 kb-großen RNA-Spezies, die in mehreren B-Zelllinien gefunden wurde, hybridisierte (Tedder et al., a.a.O.). Dagegen hybridisierte B125 mit keinem der anderen RAJI+ HSB2-cDNA-Clone oder mit keiner mRNA aus verschiedenen T-Zelllinien. Der B125-cDNA-Clon wurde durch Restriktionskartierung und Bestimmung der Nucleotidsequenz charakterisiert. Eine 2,3 kb große cDNA in fast voller Länge, die mit B125 hybridisierte, wurde isoliert, sequenziert und pLAM-1 genannt.
• Wie in 1A dargestellt, wurde eine Restriktionskarte durch herkömmliche Einfach-, Doppel- und Dreifach-Spaltungen von pLAM-1 erhalten. Der mutmaßliche codierende Bereich ist in schwarz dargestellt. Pfeile zeigen die Richtung und das Ausmaß der Nucleotidsequenzbestimmung und die leeren Kreise bezeichnen eine 5'-Endmarkierung. In 1B ist ein schematisches Modell der Struktur der LAM-1-mRNA dargestellt. Dünne Linien bezeichnen 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzen (UT), während der dicke Strich den translatierten Bereich zeigt. Die Kästchen stellen die Lectin-ähnlichen und die dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ähnlichen Domänen und die zwei kurzen Consensus-Wiederholungs(SCR)-Einheiten dar. Das leere Kästchen bezeichnet die mutmaßliche Transmembran(TM)-Region.
• Die Expression von LAM-1-mRNA durch Zelllinien lymphoiden und nicht-lymphoiden Ursprungs wurde untersucht. Die Northern-Blot-Analyse zeigte, dass LAM-1 stark mit einer 2,6 kb großen RNA-Spezies und schwach mit einer 1,7 kb großen RNA-Spezies in Poly(A)+-RNA hybridisierte, die aus den B-Zelllinien Raji, SB, Laz-509 und GK-5 isoliert worden war. Dagegen hybridisierte RNA, die aus zwei pre-B-Zelllinien (Nalm-6, PB-697), drei B-Zelllinien (Namalwa, Daudi, BJAB), fünf T-Zelllinien (CEM, Hut-78, HSB-2, Molt-15, Molt-3), einer Myelomonocyten-Zellinie (U937 und U937, gezüchtet mit LPS) und einer erythroleukämischen (K-562)-Zelllinie isoliert worden war, nicht mit LAM-1, dies deutet darauf hin, dass die Expression dieses Gens vorzugsweise mit B-Lymphocyten assoziiert war.
• Der B125-cDNA-Clon enthielt einen 1,181 bp großen offenen Leserahmen, der ein Protein mit 372 Aminosäuren codieren konnte, wie in Figur 2 dargestellt. Die über der Aminosäuresequenz stehenden Zahlen bezeichnen die Positionen der Aminosäurereste. Die rechts stehenden Zahlen geben die Positionen der Nucleotidreste an. Die Aminosäuren sind mit dem Ein-Buchstaben-Code angegeben, ein * bezeichnet das Terminations-Codon. Die Sequenzen im Kästchen bezeichnen die Stellen für eine mögliche N-verknüpfte Glykosylierung. Hydrophobe Bereiche, die vermutlich Signal- und Transmembranpeptide identifizieren, sind unterstrichen. Der senkrechte Pfeil bezeichnet die wahrscheinlichste Position des Aminoterminus des reifen Proteins. (Vgl. von Heijne, Nucleic Acids Res. 14: 4683 (1986)).
• Die Aminosäuresequenz von LAM-1 ließ eine Struktur voraussagen, die für ein Membranglykoprotein typisch ist. Zwei potentielle Translations-Initiationsstellen wurden an den Nucleotid-Positionen 53 und 92 gefunden. Die zweite Initiationsstelle entsprach am ehesten der Consensus-Sequenz für eine optimale Initiation (A/G)CCAUG (Kozak, Cell 44: 283–292 (1986)), und darauf folgte ein hydrophober Bereich von 27 Aminosäuren, der vermutlich ein Signalpeptid repräsentiert. Mit dem Algorithmus von von Heijne konnte man voraussagen, dass der wahrscheinlichste Aminoterminus des reifen Proteins der Trp-Rest an der Aminosäureposition 52 ist. Die LAM-1-Sequenz enthielt einen zweiten hydrophoben Bereich zwischen den Aminosäuren 346 bis 368, der vermutlich ein Transmembran-Bereich ist. Das abgeleitete reife LAM-1-Protein würde einen extrazellulären Bereich von etwa 294 Aminosäuren aufweisen, der 7 potentielle Kopplungsstellen für N-verknüpfte Kohlenhydrate enthält. LAM-1 würde einen cytoplasmatischen Schwanz von 17 Aminosäuren aufweisen, der 8 basische Reste und 1 sauren Rest enthält. Die zwei cytoplasmatischen Ser-Reste sind vermutlich Substrate für die Phosphorylierung, denn die Proteinkinase C phosphoryliert Ser-Reste, die auf der Carboxyterminus Seite mehrerer basischer Reste liegen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das prozessierte LAM-1-Protein möglicherweise ein Molekulargewicht von mindestens 50 000 aufweist. Das LAM-1-Protein kann durch herkömmliche Techniken, wie z. B. durch Affinitäts-Säulenchromatographie mit einem Antikörper oder einem Liganden, aus Zelllinien, die diesen Rezeptor normalerweise exprimieren, oder aus transfizierten Zelllinien isoliert werden. Oder das Protein kann mittels in-vitro-Translation der LAM-1-cDNA synthetisiert werden.
• In LAM-1 sind bisher nicht zusammenhängende Domänen miteinander kombiniert, die in drei unterschiedlichen Molekülfamilien vorkommen: in tierischen Lectinen, Wachstumsfaktoren und C3/C4-Bindungsproteinen. Der vorgeschlagene extrazelluläre Bereich von LAM-1 enthielt eine große Zahl von Cys-Resten (7%) und wies die in 1B dargestellte allgemeine Struktur auf. Wie aus 3 ersichtlich, werden Segmente homologer Proteine gezeigt, wobei die Nummern der Aminosäurereste an jedem Ende angegeben sind. Homologe Aminosäuren sind durch Kästchen gekennzeichnet. Lücken (–) wurden in die Sequenzen eingefügt, um die Homologien zu maximieren. Die ersten 157 Aminosäuren des Proteins (3A) waren homolog zu dem Rezeptor mit geringer Affinität ("low affinity receptor") für IgE (Kikutani et al., Cell 47: 657 (1986)), dem Asialoglykoprotein-Rezeptor (Spiess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6465 (1985)) und mehreren anderen Kohlenhydrat-bindenden Proteinen (Drickamer et al., J. Biol. Chem. 256: 5827 (1981); Ezekowitz et al., J. Exp. Med. 167: 1034 (1988); Krusius et al., J. Biol. Chem. 262: 13120–13125 (1987); und Takahashi et al., J. Biol. Chem. 260: 12228 (1985)). Die in allen tierischen Lectin-Kohlenhydrat-Erkennungsdomänen konservierten Aminosäuren sind gekennzeichnet (*). Obwohl die Sequenzhomologien weniger als 30% betrugen, waren alle in tierischen Lectin-Kohlenhydrat-Erkennungsdomänen gefundenen unveränderten Reste konserviert (Drickamer, J. Biol. Chem. 263: 9557 (1988)).
• Die nächste Domäne von 36 Aminosäuren (3B) war homolog (36 bis 39%) zu dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) (Gregory, Nature 257: 325 (1975)) und den EGF-ähnlichen Wiederholungseinheiten, die in Faktor IX gefunden wurden (Yoshitake et al., Biochem. 25: 3736 (1985)), und dem Fibroblasten-Proteoglykan-Kernprotein (Krusius et al., a.a.O.).
• Unmittelbar hinter diesen Domänen lagen zwei Tandem-Domänen von jeweils 62 Aminosäuren (3C), die zu den kurzen Consensus-Wiederholungseinheiten (SCR) homolog waren, die den IL-2-Rezeptor (Leonard et al., Nature 311: 626 (1984)), den Faktor XIII (Ichinose et al., Biochem. 25: 4633, (1986)) und viele C3/C4-Bindungsproteine (Klickstein et al., J. Exp. Med. 165: 1095 (1987)); und Morley et al., EMBO J. 3: 153 (1984)) umfassen. Im Gegensatz zu allen früher beschriebenen SCR, die vier konservierte Cys-Reste enthalten, besaßen diese zwei SCR sechs Cys-Reste. Die vier konservierten Cys-Reste, die in allen SCR gefunden wurden sind in 3C durch (*) gekennzeichnet; die in LAM-1 gefundenen zusätzlichen konservierten Cys-Reste sind durch (+) gekennzeichnet. Von den multiplen SCR, die in jedem dieser Proteine vorliegen, ist die SCR dargestellt, die die höchste Homologie zu LAM-1 aufweist. Ein Zwischenstück von 15 Aminosäuren lag vor der mutmaßlichen Transmembran-Domäne.
• Die abgeleitete Aminosäuresequenz von LAM-1 ist homolog zu der Sequenz von ELAM-1 und GMP-140. Somit definieren diese zwei Proteine und LAM-1 eine neue Familie von homologen Strukturen, die durch verschiedene Zelllinien exprimiert werden und die bei zellulären Interaktionen als Rezeptoren dienen können.
• Verwendung
• Da die Wanderung und Infiltration von Lymphocyten in Bereiche einer Gewebezerstörung oder einer Verletzung von Gewebetransplantaten pathologische Prozesse auslösen oder verstärken können, sind die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Mittel, die diese Prozesse verhindern, für eine therapeutische Behandlung nützlich. LAM-1 wird als Antigen verwendet, um Antikörper gegen dieses Protein herzustellen und antagonistische Liganden zu entwickeln, welche die Lymphocyten-Adhäsion und die Funktion beeinträchtigen können. Wenn man diese Reagenzien in der Forschung einsetzt, kann man die dreidimensionale Struktur von LAM-1 bestimmen und seine Rolle bei der Lymphocyten-Funktion klären. Durch die Verabreichung dieser Reagenzien an Patienten können die pathologischen Prozesse blockiert oder abgeschwächt werden. Z. B. Subpopulationen maligner Zellen, die dieses Antigen exprimieren, würden es ermöglichen, dass der Rezeptor an der Metastasierung von Turmorzellen beteiligt ist. Die zur Blockierung der Rezeptorfunktion entwickelten Mittel können die Metastasierung und das "Homing" maligner Zellen verhindern.

Claims (8)

1. Antikörper, der an ein Lymphocyten-assoziiertes Zelloberflächenprotein bindet, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz des LAM-1 Proteins mindestens 80% homolog ist, wobei der Antikörper zelluläre Adhäsion, Migration oder Infiltration der das Protein exprimierenden Zellen in Gewebe hemmen kann.
2. Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und einen Antikörper nach Anspruch 1.
3. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1 zur Identifizierung von ein menschliches LAM-1-Protein exprimierenden Zellen in vitro.
4. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1 zur Isolierung von ein menschliches LAM-1-Protein exprimierenden Zellen.
5. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1 zur Isolierung eines menschlichen Lymphocyten-assoziierten Zelloberflächenproteins, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz des LAM-1-Proteins mindestens 80% homolog ist, oder eines immunogenen Fragments davon.
6. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1 zum Binden eines menschlichen LAM-1 Proteins in vitro.
7. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Adhäsion, Migration oder Infiltration von Zellen in Gewebe, die ein Lymphocyten-assoziiertes Zelloberflächenprotein exprimieren, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu der in 2 dargestellten LAM-1-Aminosäuresequenz mindestens 80% homolog ist.
8. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1 zum Blockieren der zellulären Adhäsion in vitro.