WO2006024367A2 - Verwendung von blockern der nkg2d-rezeptor-/nkg2d-liganden-interaktion bei autoimmunerkrankungen - Google Patents

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Michael Weller
Bettina Schreiner
Robert Weissert
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Definitions

  • the present invention relates to the use of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction blockers for the manufacture of a medicament for the treatment of autoimmune diseases.
  • Autoimmunity is based on a specific, adaptive immune response against the body's own antigens. Normally, the immune system leaves the body's own substances unmolested and fights only foreign bodies. Autoimmunity can be thought of as a result of a breakdown in tolerance to endogenous substances and / or a defective control and regulatory mechanism of the immune system. The exact causes of the emergence of autoimmune diseases are hitherto unknown. However, it is assumed that hereditary factors also play a role in addition to environmental factors. T-lymphocytes seem to be on the trigger
  • Autoimmune diseases can be subdivided into tissue-specific or organ-specific as well as systemic, ie non-organ-specific autoimmune diseases.
  • the disease multiple sclerosis is an example of an organ-specific, presumably T-cell-mediated autoimmune disease in humans.
  • cytokines involved in the induction of autoimmune diseases are blocked by antagonists, such as interleukin-1 and tumor necrosis factor- ⁇ antagonists.
  • the activating immune receptor NKG2D is expressed on natural cell (NK) cells and several T-cell subpopulations, including CD8 + T cells.
  • NK cells are an important component of the innate immune system and, as such, involved in the immune defense of viruses and tumors.
  • the interaction of signals of activating and inhibitory receptors determines the activation of NK cells.
  • cytotoxic lymphocytes that is, NK cells and CD8 + T cells, recognize virus-infected or malignant body cells, which can be eliminated as a result.
  • NK cells and CD8 + T cells recognize virus-infected or malignant body cells, which can be eliminated as a result.
  • CD8 + ⁇ ß T cells and NK cells were also shown to express NKD2D on ⁇ T cells.
  • the receptor NKG2D is constitutively expressed on the cell surface and is associated with the adapter protein DAP10. After interaction with its MHC class I-like ligands, the receptor NKG2D mediates via the adapter protein an activation signal into the cytotoxic lymphocytes.
  • MHC class I chain-like molecules A MICA
  • MICB MHC class I chain-like molecules A
  • ULBP ULl6-binding proteins 1, 2, 3 and 4
  • RAETlE ULl6-binding proteins 1, 2, 3 and 4
  • the various NKG2D ligands have different expression patterns. According to the current state of knowledge, the ligands are not or only to a small extent expressed by normal body cells while their expression is upregulated under pathological conditions, for example in transformations (eg epithelial tumors, gliomas, leukemias), infections (eg by the human cytomegalovirus (HCMV) or by Mycobacterium tuberculosis) or in cellular stress.
  • transformations eg epithelial tumors, gliomas, leukemias
  • infections eg by the human cytomegalovirus (HCMV) or by Mycobacterium tuberculosis
  • HCMV human cytomegalovirus
  • Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
  • the object of the present invention is therefore to provide substances for the preparation of a medicament which serve for the prophylaxis and / or therapy of autoimmune diseases.
  • this object is achieved by the provision of at least one blocker of the NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction, which is selected from the group comprising soluble NKG2D receptor, soluble MICA, soluble MICB, soluble ULBPl, soluble ULBP2, soluble ULBP3, soluble ULBP4, soluble RAETlL, soluble RAETlG, and allelic variants or fragments or derivatives of said blockers, as well as synthetically engineered NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction blockers.
  • NKG2D ligand expression in pancreas could be detected by diseased NOD (“nonobese diabeti ⁇ ”) mice.
  • NOD nonobese diabeti ⁇ mice
  • the same work group was also able to show that a blockade of the NGK2D Receptor by anti-NKG2D monoclonal antibody in NOD mice could prevent the onset of the disease.
  • soluble NKG2D ligands can cause them to bind to the NKG2D receptor expressed on surfaces of (inter alia) NK cells, but this can not be activated, since a cell-cell contact is presumably necessary for this purpose agile is.
  • fragment means each fragment of one of the mentioned soluble peptides, which, like the soluble protein, can bind to the NKG2D receptor.
  • derivatives means any protein modifications which have modifications that differ from the soluble protein, for example amino acid substitutions in particular at the sites of soluble proteins via which the binding of the proteins to the NKG2D receptor is not mediated. Also, such proteins or peptides derived from the blockers can be used for a use according to the invention.
  • allelic variants means all variants of nucleotide sequences of the genes coding for the proteins mentioned, which are at least heretofore known in the art: for example, 56 alleles have hitherto been identified for MICA (see for example, on the website of the EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) www.ebi.ac.uk/imgt/hla) and for MICB 16 alleles.
  • fragments, derivatives or allelic variants of the abovementioned blockers are understood as meaning all substances which have the same binding properties as the mentioned blockers of the NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction.
  • any low molecular weight synthetically produced blocker of NKG2D receptor / NKG2D-ligand interaction can be identified, for example, by adding synthetic substances, e.g. For example, by combinatorial chemistry, in the "high throughput” method, blocking of the interaction between recombinantly produced soluble MICA immobilized, for example, on microtiter plates or so-called “beads" and with recombinantly produced soluble, biotinylated NKG2D is analyzed.
  • Binding of NKG2D to MICA can be detected via streptavidin conjugates (eg, streptavidin-phycoerythrin in flow cytometry or streptavidin-horseradish peroxidase in ELISA method).
  • streptavidin conjugates eg, streptavidin-phycoerythrin in flow cytometry or streptavidin-horseradish peroxidase in ELISA method.
  • Such identified synthetic blockers can then be used in functional experiments, eg. In cytotoxic experiments with NK cells.
  • antibodies which are directed against the NKG2D receptor or fragments thereof, for example, can also be used as blockers.
  • Polyclonal antibodies can be obtained in a conventional manner by immunization of animals, in particular of rabbits, by means of Injection of the antigen or fragments thereof, and anschlie ⁇ the purification of the immunoglobulin are obtained.
  • Monoclonal anti-NKG2D receptor antibodies can be obtained according to standard protocols in accordance with the principle described by Köhler and Milstein ("Continuous cultures of fused cells secreting antibodies of predefined specificity", Nature 256: 495-497, 1975) Mice are then immunized and subsequently immortalized antibody-producing cells of the immunized animals, for example by fusion with myeloma cells., Then the supernatant of the resulting hybridomas is screened for monoclonal anti-NKG2D receptor antibodies by standard immunological assays for therapeutic or diagnostic use in humans For example, these animal antibodies may be chimerized in a conventional manner (see, for example, Neuberger et al., Recombinant possessing novel effector functions Nature 312: 604-608, 1984) or humanized (see, for example, Riechmann et al. Reshaping human antibodies for therapy ", Nature 332: 323-327, 1988).
  • the blocker used is a protein or peptide which contains an amino acid sequence which is selected from the sequences listed in the attached sequence listing with the SEQ ID No. 1 to SEQ ID NO. 15, and in particular a protein which has an amino acid sequence which is selected from the sequences having the SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 15.
  • the peptide listed in the attached sequence listing with SEQ ID NO. 1 of the attached sequence listing represents the complete (full-length) amino acid sequence of the NKG2D receptor. This has a cytoplasmic domain (AS 1-51), a transmembrane domain (AS 52-72) and an ectodomain (AS 73-216).
  • the amino acid sequence of SEQ ID No. 2 of the attached Sequence Listing herein identifies the sequence encompassing this ectodomain.
  • SEQ ID no. 3 of the attached sequence listing is the sequence of MICA * 01
  • Figure 5 identifies the sequence of MICB * 02.
  • SEQ ID NOS: 4 and 6 are each sequence sections of MICA * 01 and MICB * 02. Under the SEQ ID-Nm.
  • Se ⁇ quenzprotokolls are each the full-length sequences and sequence sections of the proteins ULBPl, ULBP2, listed ULBP3, ULBP4, RAETlL and RAETlG.
  • An overview of the already known sequences and their database identification numbers (Accession Number) can be found in the attached Table 1.
  • blockers that is, soluble NKG2D receptor, soluble MICA / B, and soluble ULBP molecules, be prepared recombinantly for use.
  • Suitable for expression are, for example, Sf9 insect cell len or eukaryotic expression systems, such as 2931 or COS7 cells.
  • the autoimmune diseases are selected from the group comprising multiple sclerosis, diabetes type I, rheumatoid arthritis, psoriasis, spondylarthritis, celiac disease, Behcet's disease, Crohn's disease, ulcerative colitis and systemic lupus erythematosus (SLE) ,
  • the use takes place in the case of thrust-shaped multiple sclerosis, preferably in the initial phase of relapsing-remitting multiple sclerosis.
  • multiple sclerosis in the inflammatory foci (plaques) i.a. T lymphocytes, B lymphocytes and macrophages, which is considered an indication of an autoimmune reaction.
  • autoantibodies against various components of the myelin sheath could be detected, for example against basal myelin proteins, proteolipid proteins or against the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG).
  • MOG myelin oligodendrocyte glycoprotein
  • recombinantly produced interferon .beta. Is currently used, in particular in the case of a scholastic disease course.
  • the autoimmune disease diabetes type I is based on a cell-mediated chronic and irreversible destruction of the insulin-producing ⁇ -cells of the pancreas, whereby a peptide presented on the ⁇ -cells is presumably recognized by autoimmune T-lymphocytes, which in turn encode the ⁇ -cells destroy.
  • Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease in which an immune response of T lymphocytes, B lymphocytes and macrophages is presumably induced by an alteration of synovial cells, which leads to antibody formation against synovial cells.
  • hydrolases, collagenases and lysosomal enzymes are released, leading to the destruction of articular cartilage.
  • a therapy is currently taking place with anti-inflammatory drugs, corticosteroids, including antirheumatic drugs, as well as anti-TNF- ⁇ antagonists.
  • NKG2D mode of action in the pathogenesis of autoimmune diseases is induction of NKG2D ligands by cellular stress or viral or bacterial infections on the cells of organs or tissues affected by autoimmunity.
  • This induced expression of NKG2D ligands could then mediate lysis of the corresponding cells by NK cells.
  • This not only destroys the corresponding tissue, but also releases a large number of autoantigens, which in turn could be taken up by antigen-presenting cells and presented via MHC molecules, which could lead to the activation of potentially autoreactive T cells.
  • autoreactive T cells could also be activated directly by NKG2D ligand expression on the affected tissue.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition which contains at least one blocker of the NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction.
  • the pharmaceutical composition contains at least one blocker selected from the group comprising soluble NKG2D receptor, soluble MICA, soluble MICB, soluble ULBPl, soluble ULBP2, soluble ULBP3, soluble ULBP4, soluble RAETLL, soluble RAETlG, and the like allelic variants or fragments or derivatives of said blockers, as well as synthetically produced blockers of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction.
  • soluble NKG2D receptor soluble MICA, soluble MICB, soluble ULBPl, soluble ULBP2, soluble ULBP3, soluble ULBP4, soluble RAETLL, soluble RAETlG, and the like allelic variants or fragments or derivatives of said blockers, as well as synthetically produced blockers of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition which contains as a blocker a protein which contains an amino acid sequence which is selected from the sequences SEQ ID-N0 listed in the attached sequence listing. 1 to SEQ ID-Wr. 15, and in particular a protein having such an amino acid sequence.
  • composition also contains several of the mentioned Blo ⁇ ker.
  • the composition may also contain other additives and / or carriers which are commonly used in the preparation of a pharmaceutical composition to be administered.
  • Such ingredients are for Diluents, binders, suspending agents, lubricants, stabilizers, etc. These include, but are not limited to, for example, water, saline, alcohols, vegetable oils, polyetylene glycols, monoglycerides, etc. An overview of such ingredients can be found, for example, in A. Tippe, "Handbook of Pharmaceutical Excepients", 3rd Edition 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.
  • the composition will be formulated, that is to say for example in the form of capsules, tablets or else liquid preparations which, for example, can also be injected or administered intravenously.
  • the administration can also be carried out depending on the patient and the disease, systemically or locally and with a subtle direction.
  • composition may have other active ingredients or drugs, such as interferons and the like.
  • the pharmaceutical composition can then be used in autoimmune diseases,. such as multiple sclerosis, type I diabetes, rheumatoid arthritis, psoriasis, spondylarthritis, celiac disease, Behcet's disease, Crohn's disease, ulcerative colitis and systemic lupus erythematosus (SLE).
  • autoimmune diseases such as multiple sclerosis, type I diabetes, rheumatoid arthritis, psoriasis, spondylarthritis, celiac disease, Behcet's disease, Crohn's disease, ulcerative colitis and systemic lupus erythematosus (SLE).
  • Fig. 1 NKG2D ligand expression in the CNS in patients with multiple sclerosis as well as in human microglia:
  • FIG. 1A Immunohistochemical staining of demyelinated CNS lesions ("plaque” or "shadow plaque") of MS patients.
  • MHC-II MHC class II molecules
  • BAMOl MIC molecules
  • MBP Major Basic Protein
  • FIG. 1B Quantification of MICA transcripts by means of real-time PCR in the CNS of healthy (“normal”) versus MS patients (“MS”) with normalization to the T98G glioma cell line and of immature dendritic cells (DC “imm”) versus mature DC (“DC mature”) versus isolated microglia.
  • Fig. 2 NKG2D ligand expression in the CNS and in microglial cells in the experimental autoimmune encephalomyelitis of mice Fig. 2A: Detection of RAE-I and NKG2D in the CNS of C57BL / 6 mice on the day of EAE induction (day 0) as well as on day 10 and 20 after EAE induction by immunoblot. The numbers represent the units of relative densitometry (day 0 normalized to 1.0). To control the amount of protein applied, ⁇ -actin was detected.
  • FIG. 2B Quantification of RAE-l ⁇ transcripts by means of real-time PCR in the CNS of C57BL / 6 mice ("normal”) and C57BL / 6 mice after EAE induction ("EAE") with standardization on the mouse Glioma cell line GL261, as well as in isolated astrocytes and microglial cells of C57BL / 6 mice.
  • Fig. 3 Effect of NKG2D blockade in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).
  • Fig. 3A Average "clinical score" of six H2-K b -MICA transgenic mice (open circles) and six non-transgenic siblings (closed circles) on days 0 to 30 after EAE induction.
  • Fig. 3B Average "clinical score" on days 0 to 25 after EAE induction of five C57BL / 6 mice on administration of soluble NKG2D (open circles, the sixth mouse showed no symptoms) and of six mice on administration of PBS (closed PBS or sNKG2D was administered on days 0, 2, 4, 6, 8, and 10 intraperitoneally.
  • Fig. 3C MOG peptide-specific T cell proliferation in mice in which EAE was induced and treated with either PBS or soluble NKG2D as described in Fig. 3B. Spleen cells were stimulated with 1 ⁇ g / ml or 10 ⁇ g / ml MOG peptide.
  • Fig. 3D Average "clinical score" on days 0 to 30 after EAE induction of six C57BL / 6 mice each with administration of soluble NKG2D (open circles) and when PBS was given (closed circles) PBS or SNKG2D was on Days 10, 12, 14, 16, 18, and 20 administered intraperitoneally.
  • Fig. 3E MOG-peptide-specific T cell proliferation in mice in which EAE was induced and treated with either PBS or soluble NKG2D as described in Fig. 3D. Spleen cells were stimulated with 1 ⁇ g / ml or 10 ⁇ g / ml MOG peptide.
  • BAMO1 mouse IgG 1
  • anti-MICA / B anti-mouse RAE-l ⁇
  • anti-mouse NKG2D R & D Systems
  • anti- ⁇ -actin Santa Cruz Biotechnologies
  • the human malignant glioma cell line T98G was developed by Dr. med. Tribolet (Lausanne, Switzerland) received.
  • the mouse glioma cell line GL261 was a gift from XO Brakefield (Harvard Medical School Boston, USA).
  • the cells were cultured in DMIM medium supplemented with 2 mM L-glutamine (Gibco Life Technologies, Paisley, UK), 10% FCS (Bio ⁇ hrom KG, Berlin, Germany) and penicillin (100 IU / ml) / streptomycin (100 ⁇ g / ml). ml; Gibco).
  • the brain tissue of the mice was isolated.
  • the tissue was suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8) with 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 2 ⁇ g / ml aprotinin, 10 ⁇ g / ml leupeptin and 100 ⁇ g / ml PMSF) disrupted by means of ultrasound.
  • lysis buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8) with 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 2 ⁇ g / ml aprotinin, 10 ⁇ g / ml leupeptin and 100 ⁇ g / ml PMSF
  • Aliquots of the tissue lysates were electrophoresed on 12% SDS-PAGE gels under non-reducing conditions and transferred to nitrocellulose.
  • the total amount of protein of the lysates was 40 ⁇ g per lane.
  • glial cells were obtained from adult patients during a surgical resection performed to treat non-tumor-related incurable epilepsy. Tissue samples were taken in regions beyond the active site. The methodological isolation and cultivation of adult human microglia has already been described, for example, by Yong et al. ("Culture of Cells from Human Brain Biopsies", pp.
  • the less adherent oligodendroglia were removed by gentle shaking.
  • the remaining microglia 1.2 x 10 5 cells (cm 2 ) were 95% pure, which could be confirmed by immunocytochemistry.
  • Mouse microglial cells were isolated from primary mixed brain cell cultures by using a modified, already described method (see Magnus et al., J. Neuropol., Ex. Neurol., 2002, 61 (9): 760-766).
  • RNA extraction and cDNA synthesis were carried out by standard methods. Quantitative analysis of gene expression was performed by QRT-PCR using the ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Rothstadt, Germany) as previously described (see Wiendl et al., Brain, 2003, 126: 1026-1035 ). The cDNA amplification was detected using SYBRGreen chemistry. The Zyklus ⁇ parameters were for two minutes at 50 0 C, for ten minutes at 95 ° C, and forty cycles each fifteen seconds dena turing at 95 0 C and one minute annealing at 60 0 C. The data were performed with the ABI PRISM® Detection system analyzed and quantified using the ⁇ C ⁇ method for relative quantification.
  • the recombinant soluble mouse NKG2D receptor without the amino-terminal cytoplasmic region and the transmembrane domain was produced in Sf9 insect cells (Invitrogen, Düsseldorf, Germany) using the BAC-to-BAC system (Gibco Life Technologies, UK) ,
  • the expression construct (SEQ ID NO: 24) has an amino terminal FLAG / hexahistidine tag sequence (see Steinle et al., "Interactions of human NKG2D with its ligands MICA, MICB and homologs of the mouse RAE-I protein family", Immunogenetics 53: 279-287, 2001)
  • the sequence of the mouse NKG2D receptor (full-length) is reproduced in the enclosed sequence listing with SEQ ID No. 23.
  • mice Female C57BL / 6 mice were purchased from Charles River Labratories (Sulzfeld, Germany). MICA transgenic C57BL / 6 mice (kindly provided by Dr. Spies, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle) express MICA * 07 cDNA under the control of an MHC class I promoter, MHC class I gene K b . For the experiments, mice were used at the age of six to eight weeks.
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • mice express a MICA * 07 cDNA constitutively under the control of an MHC class I promoter (H-2K b ) and have high concentrations of soluble MICA in the serum (45-90 ng / ml). Because of this, NKG2D expression is markedly reduced in these transgenic mice, presumably by ligand-induced downregulation, and NKG2D-mediated NKG2D effector functions are severely impaired. Compared to non-transgenic mice, a significant delay in the onset of disease symptoms was observed in the MICA transgenic mice (Figure 3A).
  • mice were given soluble NKG2D (sNKG2D) (as described under 1.8 and 1.10) to study the interaction of the ligands with the To interrupt receptor in different phases of the EAE.
  • sNKG2D soluble NKG2D
  • SNKG2D was administered on days zero to ten (early phase). It could be observed that during sNKG2D treatment during the early phase EAE broke much later (FIG. 3B). Only five of the six mice in the sNKG2D-treated group also developed disease.
  • MOG-peptide-specific T-cell proliferation of spleen mice from mice treated with sNKG2D was significantly reduced compared to spleen cells from control-treated mice (Figure 3C).
  • Table 1 SEQ ID NO. Name, Length Definition / Special Features Acc. No.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Blockern der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, insbesondere der Multiplen Sklerose, sowie zur Blockierung des NKG2D-Rezeptors, wobei die Blocker ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend löslicher NKG2D-Rezeptor, lösliches MICA, lösliches MICE, lösliches ULBP1, lösliches ULBP2, lösliches ULBP3, lösliches ULBP4, lösliches RAET1L, lösliches RAET1G, sowie allelische Varianten oder Fragmente oder Derivate der genannten Blocker, sowie synthetisch hergestellte Blocker der NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion.

Description

Verwendung von Blockern der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liαanden- Interaktion bei Autoimmunerkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Blockern der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten.
Autoiπununität beruht auf einer spezifischen, adaptiven Immun- antwort gegen körpereigene Antigene. Normalerweise lässt das Immunsystem körpereigene Substanzen unbehelligt und bekämpft nur Fremdkörper. Autoimmunität lässt sich als Ergebnis eines Zusammenbruchs der Toleranz gegenüber körpereigenen Stoffen und/oder eines defekten Kontroll- und Regulationsmechanismus des Immunsystems auffassen. Die genauen Ursachen für die Ent¬ stehung von Autoimmunkrankheiten sind bisher unbekannt. Es wird jedoch vermutet, dass neben umweltbedingten auch erbliche Fak¬ toren eine Rolle spielen. T-Lymphozyten scheinen an der Auslö-
sung der Krankheiten wesentlich beteiligt zu sein, da sie so¬ wohl als cytotoxische T-Lymphozyten als auch durch die Aktivie¬ rung von Makrophagen Gewebeschädigungen verursachen können.
Autoimmunkrankheiten lassen sich in gewebe- oder organspezifi¬ sche sowie systemische, also nicht-organspezifische Autoimmun¬ krankheiten einteilen. So ist bspw. die Erkrankung Multiple Sklerose ein Beispiel für eine organspezifische, vermutlich T- Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung beim Menschen.
Bei der T-Zell-vermittelten Immunantwort erkennen zytotoxische T-Lymphozyten körpereigene Peptide in Kontext von MHC-Klasse I Molekülen (MHC = major histocompatibility complex / Haupthisto- kompatibilitätskomplex) und führen zur Zerstörung der erkannten Zelle. Dies ist vermutlich der Fall bspw. bei der rheumatoiden Arthritis und bei dem insulinabhängigen Diabetes mellitus.
Der Nachweis von Autoimmunkrankheiten, die durch autoreaktive T-Lymphozyten verursacht werden, ist schwierig, da die Isolie¬ rung und Charakterisierung der entsprechenden autoantigenen Peptide technisch schwierig ist.
In der Praxis ist das therapeutische Vorgehen oft konfrontiert mit chronischen, langsam fortschreitenden Autoimmunkrankheiten. Zu Teilerfolgen führte der Einsatz von Immunsuppressiva und Corticosteroiden.
Andere Therapieansätze machen sich die Idee zunutze, dass be¬ stimmte Peptide die Autoimmunreaktion verhindern können. Die Peptide, die eine ähnliche Aminosäurestruktur wie das die Krankheit verursachende Selbstpeptid besitzen, binden dann zwar an die MHC-Moleküle, die von den T-Zell-Rezeptoren der autore¬ aktiven T-Zellen erkannt werden, jedoch werden die T-Zellen dadurch nicht mehr aktiviert.
Mit anderen Therapieansätzen soll erreicht werden, dass lösli¬ che Komplexe aus MHC-Molekülen, Peptid und einem Toxin an die¬ jenige T Zellen binden, die den Schaden im Organismus auslösen.
In anderen Ansätzen werden Cytokine, die bei der Auslösung von Autoimmunkrankheiten beteiligt sind, durch Antagonisten blo¬ ckiert, wie bspw. Interleukin-1- und Tumor-Nekrosis-Faktor-α- Antagonisten.
Neuere Studien haben nun Anhaltspunkte aufgezeigt, wonach der NKG2D-Rezeptor eine Rolle zumindest bei manchen Autoimmunkrank¬ heiten spielt.
Der aktivierende Immunrezeptor NKG2D wird auf natürlichen Kil¬ lerzellen (NK Zellen) und mehreren T-Zellsubpopulationen ein¬ schließlich CD8+ T Zellen exprimiert.
NK Zellen sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immun¬ systems und als solche an der Immunabwehr von Viren und Tumoren beteiligt. Dabei bestimmt das Zusammenspiel von Signalen akti¬ vierender und inhibitorischer Rezeptoren die Aktivierung von NK Zellen. Durch die Vermittlung des aktivierenden Immunrezeptors NKG2D erkennen zytotoxische Lymphozyten, das heißt NK Zellen und CD8+ T Zellen, virusinfizierte bzw. maligne Körperzellen, die infolge dessen eliminiert werden können. Außer auf CD8+ αß T Zellen und NK Zellen konnte die NKD2D-Expression auch auf γδ T Zellen gezeigt werden.
Der Rezeptor NKG2D wird konstitutiv auf der Zelloberfläche exprimiert und ist mit dem Adapterprotein DAPlO assoziiert. Nach Interaktion mit seinen MHC Klasse I-ähnlichen Liganden vermittelt der Rezeptor NKG2D über das Adapterprotein ein Akti¬ vierungssignal in die zytotoxischen Lymphozyten.
Als NKG2D-Liganden sind bisher im Menschen die MHC-Klasse-I- Ketten-ähnlichen Moleküle A (MICA), MICB und die ULl6-bindenden Proteine (ULBP) 1, 2, 3 und 4 (= RAETlE) und RAETlL sowie RAETlG identifiziert worden (siehe Steinle et al., „Interacti- ons of human NKG2D with its Ligands MICA , MICB, and homologs of the mouse RAE-I Protein Family", Immunogenetics 53:279-287, 2001; Cosman et al., „ULBPs, novel MHC Class I related Molecu- les, bind to CMV Glycoprotein UL 16 and stimulate NK Cytotoxi- city through the NKG2D Receptor", Immunity 14:123-133, 2001; Bacon et al., „Two human ULBP/RAETl molecules with transmembra- ne regions are ligands for NKG2D", J. Immunol. 173:1078-1084, 2004). In der Maus sind die NKG2D-Liganden RAE-lα, ßf γ ,δ und ε, sowie H60 und das ULBP-Homolog MULTl beschrieben worden.
Die verschiedenen NKG2D-Liganden haben unterschiedliche Expres¬ sionsmuster. Die Liganden werden nach derzeitigem Kenntnisstand nicht oder nur in geringem Umfang von normalen Körperzellen exprimiert, während unter pathologischen Bedingungen ihre Ex¬ pression hochreguliert wird, wie beispielsweise bei Transforma¬ tionen (bspw. epitheliale Tumore, Gliome, Leukämien), Infektio¬ nen (bspw. durch das humane Cytomegalovirus (HCMV) oder durch Mycobacterium tuberculosis) oder bei zellulärem Stress. Trotz der aufgezeigten Möglichkeiten zur Behandlung von Autoim¬ munkrankheiten besteht immer noch ein großes Interesse, Alter¬ nativen zu den bisher eingesetzten Therapieansätzen zu finden, da die aufgezeigten Ansätze oftmals schwerwiegende Nebenwirkun¬ gen verursachen oder nur mit großem Aufwand und unter hohen Kosten durchzuführen sind oder nur Teilerfolge erbringen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Substanzen zur Herstellung eines Arzneimittels bereitzustellen, welches zur Prophylaxe und/oder Therapie von Autoimmunkrankheiten dient.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung von zumindest einem Blocker der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden- Interaktion gelöst, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend löslicher NKG2D-Rezeptor, lösliches MICA, lösliches MICB, lös¬ liches ULBPl, lösliches ULBP2, lösliches ULBP3, lösliches ULBP4, lösliches RAETlL, lösliches RAETlG, sowie allelische Varianten oder Fragmente oder Derivate der genannten Blocker, sowie synthetisch hergestellte Blocker der NKG2D- Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion.
Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, dass durch die Gabe eines genannten löslichen Blockers der NKG2D-Rezeptor- /Liganden-Interaktion der Ausbruch von Autoiinmunkrankheiten verhindert oder zumindest gebremst werden konnte.
Ogasawara et al. („NKG2D Blockade Prevents Autoimmune Diabetes in NOD Mice", Immunity 20:757-767, 2004) zeigten, dass NKG2D- Liganden-Expression in Pankreas von erkrankten NOD-(„nonobese diabetiσ"-) Mäusen nachgewiesen werden konnte. Dieselbe Ar¬ beitsgruppe konnte auch zeigen, dass eine Blockade des NGK2D- Rezeptors durch anti-NKG2D monoklonale Antikörper in NOD-Mäusen den Ausbruch der Krankheit verhindern konnte.
Ferner konnten Groh et al. („Stimulation of T-CeIl Autoreacti- vity by Expression of NKG2D and its MIC Ligands in Arthritis", Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 100:9452- 9457, 2003) in ihren Studien zeigen, dass beim Menschen auf Synoviozyten von Patienten mit rheumatoider Athritis NKG2D- Liganden vorliegen und dass deren Interaktion mit NKG2D- Rezeptoren, die bei diesen Patienten auch auf CD4+ CD28- T- Zellen exprimiert werden, die Zerstörung von Synovialzellen bedeutend beeinflussen kann.
Jedoch ist in keiner der neueren Studien gezeigt, noch ist ein Hinweis darauf zu finden, dass durch lösliche NKG2D-Rezeptoren, MICA/B oder lösliches ULBP die NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden- Interaktion derart beeinflusst werden kann, dass der Ausbruch von Autoimmunkrankheiten verhindert oder zumindest verzögert werden kann.
Die Erfinder haben mit ihren Versuchen hingegen erstmalig ge¬ zeigt, dass durch die Gabe von löslichem NKG2D-Rezeptor der Ausbruch von Symptomen der Multiplen Sklerose deutlich gehemmt werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen somit die Möglichkeit auf, lösliche Liganden oder Fragmente davon im Rahmen einer Therapie bei Autoimmunkrankheiten einzusetzen. Darüber hinaus zeigten transgene Mäuse, die eine hohe Konzentration von lösli¬ chem MICA im Serum enthielten, ebenfalls eine ähnliche Verzöge¬ rung des Krankheitsausbruchs. Durch die Gabe von löslichem NKG2D-Rezeptor und dessen Bindung an seine (an Zelloberflächen gebundenen) Liganden wird verhin¬ dert, dass diese Liganden den auf Oberflächen von (u.a.) NK Zellen exprirαierten NKG2D-Rezeptor binden und diese aktivieren.
Andererseits kann die Gabe von löslichen NKG2D-Liganden bewir¬ ken, dass diese an den auf Oberflächen von (u.a.) NK Zellen exprimierten NKG2D-Rezeptor binden, diesen jedoch nicht akti¬ vieren können, da hierzu vermutlich ein Zell-Zell-Kontakt not¬ wendig ist.
Vorliegend bedeutet „Fragment" jedes Fragment eines der genann¬ ten löslichen Peptide, welches wie das lösliche Protein an den NKG2D-Rezeptor binden kann. Mit „Derivaten" sind jede Protein- Abwandlungen gemeint, die vom löslichen Protein abweichende Modifizierungen aufweisen, bspw. Aminosäuresubstitutionen, und zwar insbesondere an den Stellen der löslichen Proteine, über welche die Bindung der Proteine an den NKG2D-Rezeptor nicht vermittelt wird. Auch solche Proteine oder Peptide, die von den Blockern abgeleitet sind, können für eine erfindungsgemäße Verwendung eingesetzt werden.
Ferner bedeutet vorliegend „allelische Varianten" alle Varian¬ ten von Nucleotidsequenzen der für die genannten Proteine co- diernden Gene, die zumindest bisher im Stand der Technik be¬ kannt sind. So sind bspw. für MICA bisher 56 Allele identifi¬ ziert worden (siehe bspw. auf der Internetseite des EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) www.ebi.ac.uk/imgt/hla) und für MICB 16 Allele. Somit werden unter „Fragmenten, Derivaten oder allelische Vari¬ anten der genannten Blocker" alle Substanzen verstanden, die die gleichen Bindungseigenschaften wie die genannten Blocker der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion aufweisen.
Es können jedoch nicht nur die genannten Proteine als Blocker eingesetzt werden, sondern vielmehr jeder niedermolekulare synthetisch hergestellte Blocker der NKG2D-Rezeptor/NKG2D- Ligangen-Interaktion. Solche synthetisch hergestellte Blocker können bspw. dadurch identifiziert werden, dass durch Zugabe synthetischer Substanzen, die z. B. durch kombinatorische Che¬ mie hergestellt wurden, im „high throughput"-Verfahren eine Blockierung der Interaktion zwischen rekombinant hergestelltem löslichem MICA, das z .B. auf Mikrotiterplatten oder sog. „beads" immobilisiert wird, und mit rekombinant hergestelltem löslichem, biotinyliertem NKG2D analysiert wird. Eine Bindung von NKG2D an MICA kann über Streptavidin-Konjugate detektiert werden (z. B. Streptavidin-Phycoerythrin in der Durchflusszyto- metrie oder Streptavidin-Meerrettichperoxidase in ELISA- Verfahren) . Derart identifizierte synthetische Blocker können dann in funktionellen Versuchen, z. B. in Zytotoxizitätsexperi- menten mit NK Zellen, getestet werden.
Als Blocker können aber auch bspw. Antikörper eingesetzt wer¬ den, die gegen den NKG2D-Rezeptor gerichtet sind, oder Fragmen¬ te davon.
Polyklonale Antikörper können in herkömmlicher Weise durch Immunisierung von Tieren, insbesondere von Kanninchen, mittels Injektion des Antigens bzw. Fragmenten davon, und anschließen¬ der Reinigung des Immunglobulins erhalten werden.
Monoklonale anti-NKG2D-Rezeptor-Antikörper können nach Stan¬ dardprotokollen gemäß dem von Köhler und Milstein beschriebenen Prinzip („Continuous cultures of fused cells seσreting antibody of predefined specificity", Nature 256:495-497, 1975) gewonnen werden. Hierfür werden bspw. Mäuse immunisiert und anschließend antikörperproduzierende Zellen der immunisierten Tiere immorta- lisiert, bspw. durch Fusion mit Myelomzellen. Anschließend wird der Überstand der erhaltenen Hybridome mittels immunologischen Standardassays auf monoklonale anti-NKG2D-Rezeptor-Antikörper gescreent. Für den therapeutischen oder diagnostischen Einsatz im Menschen können diese tierischen Antikörper ggf. auf her¬ kömmliche Weise chimerisiert (siehe bspw. Neuberger et al., „Recombinant antibodies possessing novel effector functions" Nature 312:604-608, 1984) oder humanisiert (siehe bspw. Riechmann et al., „Reshaping human antibodies for therapy", Nature 332:323- 327, 1988) werden.
Insbesondere ist bevorzugt, wenn als Blocker ein Protein oder Peptid eingesetzt wird, das eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus den im beiliegenden Sequenzprotokoll aufge¬ führten Sequenzen mit den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID NR. 15, und insbesondere ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den Sequenzen mit der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 15.
Das im beigefügten Sequenzprotokoll aufgeführte Peptid mit der SEQ ID-Nr. 1 des beigefügten Sequenzprotokolls stellt die kom¬ plette (full-length) Aminosäuresequenz des NKG2D-Rezeptors dar. Dieser weist eine cytoplasmatische Domäne (AS 1-51), eine Transmembrandomäne (AS 52-72) und eine Ektodomäne (AS 73-216) auf. Mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID- Nr. 2 des beigefüg¬ ten Sequenzprotokolls ist vorliegend die diese Ektodomäne um¬ fassende Sequenz identifiziert. Mit der SEQ ID-Nr. 3 des beige¬ fügten Sequenzprotokolls ist die Sequenz von MICA*01, mit der SEQ ID-Nr. 5 die Sequenz von MICB*02 identifiziert. Die SEQ ID- Nrn. 4 und 6 sind jeweils Sequenzabschnitte von MICA*01 und MICB*02. Unter den SEQ ID-Nm. 7 bis 15 des beigefügten Se¬ quenzprotokolls sind jeweils die full-length Sequenzen sowie Sequenzabschnitte der Proteine ULBPl, ULBP2, ULBP3, ULBP4, RAETlL und RAETlG aufgeführt. Eine Übersicht über die bereits bekannten Sequenzen sowie deren Datenbank- Identifikationsnummern (Accession Number) findet sich in der beigefügten Tabelle 1.
Es ist bevorzugt, wenn die Blocker, also löslicher NKG2D- Rezeptor, lösliches MICA/B und lösliche ULBP-Moleküle, für die Verwendung rekombinant hergestellt werden.
Hierbei kann es von Vorteil sein, nicht das full-length Protein zu exprimieren, sondern bspw. nur bindungsrelevante Domänen der Proteine. So kann bspw. der lösliche NKG2D-Rezeptor ohne die cytoplasmatische Region und ohne die Transmembran-Domäne expri- miert werden (z. B. von Asn 80 bis VaI 216; = SEQ ID Nr. 2); lösliches MICA kann bspw. von GIu 1 bis Lys 276 (= SEQ ID-Nr. 4), lösliches MICB von GIu 1 bis Lys 276 (= SEQ ID-NR. 6), lösliches ULBPl von Asp 1 bis Lys 181 (= SEQ ID-NR. 8), lösli¬ ches ULBP2 von Asp 1 bis AIa 181 (= SEQ ID-NR. 10) und lösli¬ ches ULBP3 von Asp 1 bis AIa 181 (= SEQ ID-Nr. 12) exprimiert werden. Geeignet für die Expression sind bspw. Sf9 Insektenzel- len oder eukaryontische Expressionssysteme, wie z.B. 2931 oder COS7 Zellen.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist insbesondere bevor¬ zugt, wenn die Autoimmunkrankheiten ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Multiple Sklerose, Diabetes Typ I, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Spondylarthritiden, Zöliakie, Morbus Behcet, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Systemischer Lupus Erythematodes (SLE).
Insbesondere ist bevorzugt, wenn die Verwendung bei der schub¬ förmigen Multiple Sklerose erfolgt, vorzugsweise in der An¬ fangsphase der schubförmigen Multiplen Sklerose.
Bei der Multiplen Sklerose sind in den Entzündungsherden (Pla¬ ques) u.a. T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Makrophagen zu finden, was als Hinweis auf eine Autoimmunreaktion gewertet wird. Ferner konnten Autoantikörper gegen verschiedenen Kompo¬ nenten der Myelinschicht nachgewiesen werden, bspw. gegen basi¬ sche Myelinproteine, Proteolipid-Proteine oder gegen das Mye- lin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) . Zur Therapie der mul¬ tiplen Sklerose wird momentan insbesondere rekombinant herge¬ stelltes Interferon ß eingesetzt, insbesondere beim schubförmi¬ gen Krankheitsverlauf.
Der Autoimmunkrankheit Diabetes Typ I liegt eine zellulär ver¬ mittelte chronische und irreversible Zerstörung der insulinpro¬ duzierenden ß-Zellen des Pankreas zugrunde, wobei vermutlich ein auf den ß-Zellen präsentiertes Peptid von autoimmunen T- Lymphozyten erkannt wird, die ihrerseits die ß-Zellen zerstö¬ ren. Bei der rheumatoiden Arthritis handelt es sich um eine Autoim¬ munkrankheit, bei welcher vermutlich durch eine Veränderung von Synovialzellen eine Immunantwort von T-Lymphozyten, B- Lymphozyten und Makrophagen induziert wird, die zur Antikörper¬ bildung gegen Synovialzellen führt. Als Folge werden Hydrola- sen, Kollagenasen und lysosomale Enzyme freigesetzt, die zur Zerstörung von Gelenkknorpel führen. Eine Therapie erfolgt momentan mit Antiphlogistika, Corticosteroiden u.a. Antirheuma¬ tika, sowie mit anti-TNF-α-Antagonisten.
Eine mögliche Erklärung der NKG2D-Wirkungsweise bei der Patho¬ genese von Autoimmunkrankheiten ist eine Induktion von NKG2D- Liganden durch zellulären Stress oder virale oder bakterielle Infektionen auf den Zellen der Organe bzw. Gewebe, die von der Autoimmunität betroffen sind. Diese induzierte Expression von NKG2D-Liganden könnte dann eine Lyse der entsprechenden Zellen durch NK Zellen vermitteln. Hierdurch würde nicht nur das ent¬ sprechende Gewebe zerstört, sondern auch sehr viele Autoantige¬ ne freigesetzt, die wiederum von Antigen-präsentierenden Zellen aufgenommen und über MHC-Moleküle präsentiert werden könnten, was zur Aktivierung potentiell autoreaktiver T Zellen führen könnte. Alternativ könnten autoreaktive T Zellen auch direkt durch die NKG2D-Liganden-Expression auf dem betroffenen Gewebe aktiviert werden.
Mit der erfindungsgemäßen Verwendung wird ein Ansatz aufge¬ zeigt, mit welchem eine neue Alternative zur Behandlung der oben angegebenen Krankheiten ermöglicht wird. Die Erfinder konnten nämlich in eigenen Versuchen zeigen, dass in Mäusen bei einem Einsatz von löslichem NKG2D-Rezeptor der Ausbruch der schubförmigen Multiplen Sklerose im Vergleich zu unbehandelten Mäuse deutlich hinausgezögert werden konnte. Gleiches wurde mit MICA-transgenen Mäusen gezeigt, die hohe Serumkonzentrationen an löslichem MICA enthalten.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammen¬ setzung, die zumindest einen Blocker der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D- Liganden-Interaktion enthält.
Dabei ist bevorzugt, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung zumindest einen Blocker enthält, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend löslicher NKG2D-Rezeptor, lösliches MICA, lösliches MICB, lösliches ULBPl, lösliches ULBP2, lösliches ULBP3, lösliches ULBP4, lösliches RAETlL, lösliches RAETlG, sowie allelische Varianten oder Fragmente oder Derivate der genannten Blocker, sowie synthetisch hergestellte Blocker der NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammenset¬ zung, die als Blocker ein Protein enthält, das eine Aminosäure¬ sequenz enthält, die ausgewählt ist aus der im beigefügten Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Wr. 15, und insbesondere ein Protein, das eine solche Amino¬ säuresequenz aufweist.
Dabei ist nicht ausgeschlossen, dass die Zusammensetzung auch mehrere der genannten Bloσker enthält.
Die Zusammensetzung kann darüber hinaus auch weitere Zusatz¬ stoffe und/oder Träger enthalten, die üblicherweise bei der Zubereitung einer zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammen¬ setzung verwendet werden. Solche Inhaltsstoffe sind zum Bei- spiel Verdünnungsmittel, Bindemittel, Suspensionsmittel, Schmiermittel, Stabilisatoren usw. Dazu zählen, sind aber nicht hierauf beschränkt, z.B. Wasser, Salzlösungen, Alkohole, pflanzliche Öle, Polyetylenglycole, Monoglyceride, etc. Eine Übersicht über derartige Inhaltsstoffe findet sich beispiels¬ weise in A. Tippe, „Handbook of Pharmaceutical Excepients", 3. Edition 2000, American Pharmaceutical Association and Pharma¬ ceutical Press.
Je nach Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung, also oral oder parenteral, wird die Zusammensetzung formuliert sein, also beispielsweise in Form von Kapseln, Tabletten oder aber flüssigen Zubereitungen, die bspw. auch injiziert oder intravenös verabreicht werden können. Die Verabreichung kann ferner in Abhängigkeit vom Patienten und der Erkrankung, syste¬ misch oder lokal und subtil gerichtet vorgenommen werden.
Ferner kann die Zusammensetzung weitere aktive Inhaltsstoffe oder Arzneimittel ausweisen, wie beispielsweise Interferone und ähnliche.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann dann bei Autoimmun¬ krankheiten eingesetzt werden, . wie bspw. Multiple Sklerose, Diabetes Typ I, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Spondyl- arthritiden, Zöliakie, Morbus Behcet, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Systemischer Lupus Erythematodes (SLE).
Weitere Vorteile ergeben sich aus den Figuren und dem nachfol¬ genden Beispiel. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nach¬ stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in den nachfolgenden Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 NKG2D-Liganden-Expression im ZNS bei Patienten mit Multipler Sklerose sowie in humaner Mikroglia:
Fig. IA: Immunhistochemische Anfärbung von demyelini- sierten ZNS-Läsionen („plaque" bzw. „shadow plaque") von MS-Patienten. Gezeigt sind Anfärbungen von MHC- Klasse II Molekülen (MHC-II), MIC-Molekülen (BAMOl) und „Major Basic Protein" (MBP), sowie mit einer Isotyp¬ kontrolle.
Fig. IB: Quantifizierung von MICA Transkripten mittels Echtzeit-PCR im ZNS von gesunden („Normal") versus MS- Patienten („MS") mit Normierung auf die T98G Glioma- zelllinie, sowie von unreifen Dendritischen Zellen (DC „imm") versus reifen DC („DC mature" ) versus isolierter Mikroglia.
Fig. 2 NKG2D-Liganden-Expression im ZNS und in Mikrogliazellen bei der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis von Mäusen: Fig. 2A: Nachweis von RAE-I und NKG2D im ZNS von C57BL/6 Mäusen am Tag der EAE-Induktion (day 0) sowie am Tag 10 bzw. 20 nach EAE-Induktion mittels Immunblot. Die Zahlen geben die Einheiten der relativen Densito¬ metrie wieder (Tag 0 normiert auf 1.0). Zur Kontrolle der aufgetragenen Proteinmenge wurde ß-Aktin detek- tiert.
Fig. 2B: Quantifizierung von RAE-lδ Transkripten mit¬ tels Echtzeit-PCR im ZNS von C57BL/6 Mäusen („Normal") und C57BL/6 Mäusen nach EAE-Induktion („EAE") mit Nor¬ mierung auf die Maus-Gliomazelllinie GL261, sowie in isolierten Astrozyten und Mikrogliazellen von C57BL/6 Mäusen.
Fig. 3 Effekt der NKG2D-Blockade bei der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis (EAE) .
Fig. 3A: Durchschnittlicher „clinical score" von je sechs H2-Kb-MICA transgenen Mäusen (offene Kreise) so¬ wie sechs nicht-transgenen Geschwistern (geschlossene Kreise) an Tagen 0 bis 30 nach EAE-Induktion.
Fig. 3B: Durchschnittlicher „clinical score" an Tagen 0 bis 25 nach EAE-Induktion von fünf C57BL/6 Mäusen bei Gabe von löslichem NKG2D (offene Kreise; die sechste Maus zeigte keinerlei Symptome) sowie von sechs Mäusen bei Gabe von PBS (geschlossene Kreise). PBS bzw. sNKG2D wurde an Tagen 0, 2, 4, 6, 8, und 10 intraperitoneal appliziert. Fig. 3C: MOG-Peptid spezifische T Zeilproliferation bei Mäusen, bei denen EAE induziert wurde, und die entweder mit PBS oder mit löslichem NKG2D, wie in Fig. 3B be¬ schrieben, behandelt wurden. Milzzellen wurden mit lμg/ml oder 10μg/ml MOG-Peptid stimuliert.
Fig. 3D: Durchschnittlicher „clinical score" an Tagen 0 bis 30 nach EAE-Induktion von je sechs C57BL/6 Mäusen bei Gabe von löslichem NKG2D (offene Kreise) sowie bei Gabe von PBS (geschlossene Kreise). PBS bzw. SNKG2D wurde an Tagen 10, 12, 14, 16, 18, und 20 intraperito¬ neal appliziert.
Fig. 3E: MOG-Peptid spezifische T Zellproliferation bei Mäusen, bei denen EAE induziert wurde, und die entweder mit PBS oder mit löslichem NKG2D, wie unter Fig. 3D be¬ schrieben, behandelt wurden. Milzzellen wurden mit lμg/ml oder lOμg/ml MOG-Peptid stimuliert.
Beispiel
1 . Material und Methoden
1 . 1 Patienten
Hirne von MS-Patienten wurden immunohistochemisch untersucht. Die Studie wurde gemäß dem durch das Ethikkomitee des Universi¬ tätsklinikums Tübingen zugelassenen Protokoll durchgeführt.
1.2 Antikörper Folgende monoklonale Antikörper wurden verwendet: BAMOl (Maus IgG1), anti-MICA/B; anti-Maus RAE-lγ (R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland), anti-Maus NKG2D (R & D Systems) und anti-ß-Aktin (Santa Cruz Biotechnologies) .
1.3 Zelllinien
Die humane maligne Gliomazelllinie T98G wurde von Dr. Tribolet (Lausanne, Schweiz) erhalten. Die Maus-Gliomazelllinie GL261 war ein Geschenk von XO Brakefield (Harvard Medical School Boston, USA) . Die Zellen wurden in DMIM-Medium kultiviert, welches mit 2mM L-Glutamin (Gibco Life Technologies, Paisley, Großbritannien), 10 % FCS (Bioσhrom KG, Berlin, Deutschland) und Penicillin (100 IU/ml)/Streptomycin (100 μg/ml; Gibco) ergänzt war.
1.4 Immunoblot
Zu den angegebenen Zeitpunkten nach Induzierung der experimen¬ tellen autoimmunen Encephalomyelitis wurde das Gehirngewebe der Mäuse isoliert. Das Gewebe wurde in Lysispuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8) mit 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 2 μg/ml Aproti- nin, 10 μg/ml Leupeptin und 100 μg/ml PMSF) mittels Ultraschall aufgeschlossen. Aliquots der Gewebelysate wurden auf 12 % SDS- PAGE Gelen unter nicht-reduzierenden Bedingungen elektrophore- tisch aufgetrennt und auf Nitrozellulose überführt. Die Gesamt¬ menge an Protein der Lysate betrug 40 μg je Spur. Nach Blockie¬ rung der unspezifischen Bindungsstellen mit 5 % (w/v) Milchpul¬ ver in PBS für 30 Minuten wurden die Filter mit den spezifi¬ schen monoklonalen Antikörpern über Nacht bei 40C inkubiert, gewaschen und mit Peroxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen oder Ziegen-Anti-Ratte IgG (1:3000 verdünnt; Santa Cruz Bio- technologies, Santa Cruz, USA) drei Stunden lang bei 220C inku¬ biert. Die Primärantikörper wurden in einer Konzentration von 1 μg/ml in PBS mit 0,05 % Tween20 und 1,3 % fettarme Milch einge¬ setzt.
1.5 Isolierung der humanen Mikrogliazellen
Primäre gliale Zellen wurden aus adulten Patienten während einer chirurgischen Resektion gewonnen, welche zur Behandlung einer nicht Tumor-bezogenen unheilbaren Epilepsie durchgeführt wurde. Die Gewebeproben wurden in Regionen entnommen, die ab¬ seits der aktiven Stelle lagen. Die methodische Isolierung und Kultivierung adulter menschlicher Mikroglia wurde bereits be¬ schrieben, bspw. von Yong et al. („Culture of Cells from Human Brains Biopsies" , Protocol for Neural Cell Culture, Seite 35- 42, 1992). Hierzu wurden ein bis drei mm3 Gewebe mit 0,025 % Collagenase A und DNase (50 mg/ml) (Böhringer, Mannheim) für 45 Minuten behandelt, und anschließend mittels Passage durch ein 130 μm Nylonnetz mechanisch auftrennt. Die Zellen wurden über einen 30 %igen Percoll-Gradienten (Pharmacia) bei 15.000 rpm für 30 Minuten weiter aufgetrennt. Die Zellen, die aus der Zwischenschicht gewonnen wurden, enthielten eine gemischte gliale Zellpopulation, die aus ungefähr 65 % Oligodendroglia, 30 % Mikroglia und 5 % Astroglia bestand. Zur Anreicherung der Mikroglia wurde die gemischte Zellpopulation in Eagels MEM suspendiert, das mit 5 % FCS, 2,5 U/ml Penicillin, 2,5 mg/ml Streptomycin, 2 mM Glutamin und 0,1 % Glukose (alles von Gibco) ergänzt war, und wurde über Nacht in 25 cm2 Gewebekulturfla¬ schen oder 48-Well-Platten (Falcon, Fisher Scientific) in feuchter Atmosphäre bei 370C mit 5 % CO2 inkubiert. Die weniger adhärierenden Oligodendroglia wurden durch vorsichtiges Schüt¬ teln entfernt. Die übrigen adhärierenden Zellen, also Astroglia und Mikroglia, ließ man morphologisch über drei Tage entwi¬ ckeln. Danach wurden die weniger adhärierenden Astroglia durch rotierendes Schütteln für fünf Stunden bei 150 rpm abgespült. Die zurückbleibenden Mikroglia (1,2 x 105 Zellen(cm2) waren zu 95 % rein, was durch Immunzytochemie bestätigt werden konnte.
1.6 Isolierung von Maus-Mikrogliazellen
Maus-Mikrogliazellen wurden von primären gemischten Hirnglia- zellkulturen durch Anwendung eines modifizierten, bereits be¬ schriebenen Verfahrens isoliert (siehe Magnus et al., J. Neuro- patol. ex. Neurol. 2002, 61(9):760-766).
1.7 Real-time PCR
RNA-Extraktion und cDNA-Synthese wurden mittels Standardverfah¬ ren durchgeführt. Die quantitative Analyse der Gen-expression wurde mit QRT-PCR unter Verwendung des ABI Prism 7000 Sequenz- detektionssystems (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutsch¬ land) wie zuvor beschrieben durchgeführt (siehe Wiendl et al. Brain, 2003, 126:1026-1035). Dabei wurde die cDNA-Amplifikation unter Verwendung der SYBRGreen-Chemie nachgewiesen. Die Zyklus¬ parameter betrugen zwei Minuten bei 500C, zehn Minuten bei 95°C, sowie vierzig Zyklen mit jeweils fünfzehn Sekunden Dena- turierung bei 950C und eine Minute Annealing bei 600C. Die Daten wurden mit dem ABI PRISM® Detektionssystem analysiert und unter Verwendung des ΔCτ-Verfahrens zur relativen Quantifizie¬ rung quantifiziert. Die Grenzwertzyklen (Cτ) für die 18S rRNA (Referenz) und MICA oder RAE-I (Probe) wurden je zweimal be¬ stimmt. Ein Kalibrierungswert (100 %) wurde abgeschätzt und die relative Veränderung der Kopienzahl gemäß der Formel rl = 2 — [(Cτ Probe — Cτ Referenz) — (Cτ Kalibrierungsprobe — Cτ Kalibrie¬ rungsreferenz)] berechnet. Die folgenden spezifischen Primer wurden verwendet: 18S:5'-CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA-3 ' (SEQ ID- Nr. 16), 5'-GCT GGA ATT ACC GCG GCT-3' (SEQ ID-Nr. 17), MI- CA:5'-CCT TGG CCA TGA ACG TCA GG-3' (SEQ ID-Nr. 18), 5'-CCT CTG AGG CCT CRC TGC G-3 ' (SEQ ID-NR. 19), RAE-lδ:5'-TCC TAC CCC AGC AGA TGA AG-3' (SEQ ID-Nr. 20), 5'-CCA CTT CAG TGG CAT TTG CTG- 3' (SEQ ID-Nr. 21) .
1.8 Produktion von löslichem Maus NKG2D-Rezeptor in Insekten¬ zellen
Der rekombinante lösliche Maus NKG2D-Rezeptor ohne die amino- terminale cytoplasmatische Region und die Transmembrandomäne wurde in Sf9 Insektenzellen (Invitrogen, Karlsruhe, Deutsch¬ land) unter Verwendung des BAC-to-BAC-Systems (Gibco Life Tech¬ nologies, Großbritannien) hergestellt. Das Expressionskonstrukt (SEQ ID-Nr. 24) besitzt eine amino-terminale FLAG/Hexahistidin- Markierungssequenz (siehe Steinle et al., „Interactions of human NKG2D with its ligands MICA, MICB and homologs of the mouse RAE-I Protein family", Immungenetics 53:279-287, 2001). Die Sequenz des Maus NKG2D-Rezeptors (full-length) ist in dem beiliegenden Sequenzprotokoll mit der SEQ ID-Nr. 23 wiedergege¬ ben.
1.9 Mäuse Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden von Charles River Labratories (Sulzfeld, Deutschland) käuflich erworben. MICA-transgene C57BL/6-Mäuse (freundlicherweise überlassen von Dr. Spies, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle) exprimieren MICA*07 cDNA unter Kontrolle eines MHC-Klasse I Promotors, nämlich des MHC-Klasse I Gens Kb. Für die Experimente wurden Mäuse im Alter von sechs bis acht Wochen eingesetzt.
1.10 EAE Induktion und Behandlung
EAE (experimentelle autoimmune Encephalomyelitis) wurde bei C57BL/6-Mäusen durch subkutane Immunisierung mit 200 μg MOG3S_55Peptid in CFA (Sigma-Aldrich) induziert. Ferner wurden intraperitoneal oder intravenös 200 ng Pertussistoxin (Calbio- chem) am Tag der Immunisierung und zwei Tage danach verab¬ reicht. Körpergewicht und klinische Einordnung („Clinical Sco- res") (0 = gesund; 1 = schlaffer Schwanz; 2 = Ataxie und/oder Lähmung der Hintergliedmaßen; 3 = Lähmung der Hintergliedinaßen und/oder Lähmung der Vordergliedmaßen; 4 = Tetraparalyse; 5 = sterbend oder tot) wurden aufgezeichnet. Die Versuche wurden gemäß den NIH (National Institute of Health) Richtlinien „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" durchgeführt. Bei denjenigen Versuchen, bei welchen lösliche NKG2D-Rezeptoren (= SNKG2D) eingesetzt wurden, um die NKG2D-Liganden-/NKG2D- Rezeptoren-Interaktion zu blockieren, wurden die Tiere entweder mit löslichem Maus-NKG2D-Rezeptor (intraperitoneal) oder mit PBS behandelt (i.p.). Am Tag der Immunisierung oder am Tag zehn wurden jeweils 100 μg verabreicht und 50 μg jeweils jeden zwei¬ ten Tag bis zehn Tage nach der Immunisierung oder am Tag zwan¬ zig. 1.11 Splenozyten-Proliferations-Assay
Aus Milz gewonnene Zellsuspensionen (5 x 105-Zellen/Well) wur¬ den in 100 μl RPMI 1640-Medium mit 10 % FCS (Biochrom KG), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin (Gibco) und 50 μM 2-Mercaptoethanol (Gibco) mit MOG35-55 in unterschiedlichen Kon¬ zentrationen ausplattiert. Kontroll-Wells enthielten lediglich Respondersplenozyten plus Medium. Alle Versuchsansätze werden jeweils dreifach ausgemessen. Während des viertägigen Kultur¬ zeitraums wurden die Kulturen mit 1 μCi/Well pulsiert [Methyl- 3H]-Thymidin (Amersham) . Die Zellen wurden geerntet und die eingebaute Radioaktivität wurde anschließend in einem „Wallac 1450 Microbeta plus" Flüssigszintillationszähler augezählt.
1.12 Statistik
Die Signifikanzanalyse wurde unter Verwendung des zweiseitigen Students t-Test durchgeführt, wobei P < 0,05 als signifikant und P < OfOOl als hochsignifikant betrachtet wurde (Excel, Microsoft, USA) . P~Werte wurden mittels des Mantel log-rank Tests evaluiert (siehe Mantel: "Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration", Cancer Chemother. Rep. 50:163-170, 1966).
2. Ergebnisse
2.1 Expression von MICA in MS-Läsionen Die Expression von NKG2D-Liganden wurde in Gehirnproben von MS- Patienten und in Kontroll-ZNS-Gewebe untersucht. Im ZNS-Gewebe der normalen grauen oder weißen Substanz von MS-Gewebeproben konnte keine Immunreaktivität für MICA/B nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnte eine starke MICA/B-Expression in MS- Patientenproben detektiert werden, die im Bereich von demyeli- nisierten ZNS-Läsionen mit aktivierten, MHC Klasse II positiven Mikrogliazellen kolokalisiert (Fig. IA) . Diese Beobachtung konnte auf mRNA-Ebene bestätigt werden: Hier zeigte sich eine starke Hochregulierung der MICA mRNA in Gewebeproben entzündli¬ cher MS-Läsionen im Vergleich zu Kontrollgewebe. Entsprechend zu den Beobachtungen in vivo zeigten isolierte menschliche Mikrogliazellen, wie Dendritische Zellen, ebenfalls eine Ex¬ pression von MICA mRNA in vitro (Fig. IB) .
2.2 Expression von NKG2D-Liganden und NKG2D-Rezeptoren im Maus EAE-Modell
Nach dem Nachweis einer starken NKG2D-Ligandenexpression in MS- Gehirnproben wurde die pathogene Bedeutung der Expression die¬ ser Proteine bei einer entzündlichen ZNS-Demyelinisierung im Tiermodell anhand der MOG-induzierten EAE untersucht. Hierzu wurde die Expression des Maus-NKG2D-Liganden RAE-I und des NKG2D-Rezeptors im Verlauf der EAE im ZNS untersucht. Die Er¬ gebnisse dieser Untersuchungen sind in Figur 2 gezeigt. Ein Immunblot von Proteinen aus Gehirnen von Mäusen mit EAE zeigt, dass die die Expression von RAE-I und NKG2D im Verlauf der EAE deutlich ansteigt, während die Expression des Kontrollproteins (ß-Aktin) unverändert bleibt (Fig. 2A) . Dies deutet darauf hin, dass im Verlauf der EAE Mikrogliazellen aktiviert wurden und NKG2D-positive Lymphozyten in das Gehirn eingewandert sind. Diese Ergebnisse konnten auch auf der mRNA-Ebene bestätigt werden. Auch die relative Expression der RAE-lδ mRNA ist in Gehirngewebe von Mäusen mit EAE (an Tag 20 nach der Induktion) um ein Vielfaches höher als in normalen Kontroll-Gehirngewebe (Fig. 2B) . In isolierten Maus-Mikrogliazellen, nicht jedoch auf Astrozyten, konnten ebenfalls erhöhte RAE-lδ Transkriptmengen nachgewiesen werden (Fig. 2B) .
2.3 MICA-transgene Tiere sind weniger empfänglich für MOG- induzierte EAE.
Für die Untersuchung der Bedeutung der NKG2D-Rezeptor/NKG2DL- Liganden-Interaktion bei der entzündlichen ZNS Demyelinisierung wurde der Krankheitsverlauf von MOG-induzierter EAE in MICA- transgenen C57BL/6-Mäusen untersucht. Diese Mäuse exprimieren eine MICA*07 cDNA konstitutiv unter Kontrolle eines MHC Klasse I Promotors (H-2Kb) und weisen hohe Konzentrationen an lösli¬ chem MICA im Serum auf (45-90 ng/ml) . Aufgrund dessen ist bei diesen transgenen Mäusen die NKG2D Expression deutlich vermin¬ dert, vermutlich durch eine Liganden-induzierte Herabregulati¬ on, und NKG2D-vermittelte NKG2D-Effektorfunktionen sind stark beeinträchtigt. Im Vergleich zu nicht-transgenen Mäusen wurde bei den MICA-transgenen Mäusen eine bedeutende Verzögerung des Ausbruchs der KrankheitsSymptome beobachtet (Fig. 3A).
2.4 Blockierung von NKG2D-Liganden mit löslichem NKG2D- Rezeptor schützt Tiere vor MOG-induzierter EAE. Um zu untersuchen, ob eine Blockierung der NKG2D-Rezeptor- /NKG2D-Liganden-Interaktion den Verlauf der EAE beeinflussen kann, wurde den Mäusen lösliches NKG2D (sNKG2D) (wie unter 1.8 sowie 1.10 beschrieben) verabreicht, um die Interaktion der Liganden mit dem Rezeptor in unterschiedlichen Phasen der EAE zu unterbrechen. Hierzu wurde SNKG2D an den Tagen null bis zehn (Frühphase) verabreicht. Es konnte beobachtet werden, dass bei einer sNKG2D-Behandlung während der Frühphase EAE deutlich später ausbrach (Fig. 3B) . Es erkrankten auch nur fünf der sechs Mäuse in der sNKG2D-behandelten Gruppe. Darüber hinaus war die MOG-Peptid-spezifische T-Zellproliferation von Milzzel¬ len aus Mäusen mit sNKG2D-Behandlung im Vergleich zu Milzzellen von Kontroll-behandelten Mäusen signifikant reduziert (Fig. 3C) .
Als nächstes wurde der EAE-Verlauf bei einer Verabreichung von SNKG2D in der Spätphase (Tag 10 bis 20) untersucht. Hierbei ergab sich keine Verbesserung im Krankheitsverlauf im Vergleich zu Kontroll-behandelten Tieren (Fig. 3D) . Entsprechend war die MOG-Peptid-spezifische T-Zell-Proliferation auch nicht durch die Verabreichung von löslichem NKG2D-Rezeptor beeinflusst (Fig. 3E).
Insgesamt entwickelten alle Tiere, die mit dem Peptid MOG-35_55 immunisiert wurden, starke EAE-Symptome, jedoch hatte eine frühe Behandlung mit löslichem NKG2D-Rezeptor einen stark posi¬ tiven Effekt, da hierdurch der Krankheitsausbruch deutlich verzögert werden konnte.
Tabelle 1 SEQ ID-Nr. Name, Länge Definition/Besonderheiten Acc. Nr.
SEQ ID-Nr. 1 NKG2D (Homo sapiens) NKG2D-Typ II integrales Acc_P26718 Membranprotein Full-length,
1-51 Cytoplasm. Domäne 216 AS
52-72 Transmembranregion
73-216 Ektodomäne
SEQ ID-Nr. 2 NKG2D (Homo sapiens) Ektodomäne -
SEQ ID-Nr. 3 MICA*01 (Homo sapiens) MHC-Klasse-I Ketten¬ AAA21718
Full-length, 383 AS verwandtes Protein
SEQ ID-Nr. 4 MICA*01 (Homo sapiens)
GIu 1 bis Lys 276
SEQ ID-Nr. 5 MICB*02 (Homo sapiens) MHC-Klasse-I Ketten¬ AAC39847
Full-length, 383 AS verwandtes Protein
SEQ ID-Nr. 6 MICB*02 (Homo sapiens)
GIu 1 bis Lys 276
SEQ ID-Nr. 7 ULBPl (Homo sapiens) ULBPl Protein AAK13081
Full-length, 244 AS
SEQ ID-Nr. 8 ULBPl (Homo spaiens)
Asp 1 bis Lys 181
SEQ ID-Nr. 9 ULBP2 (Homo sapiens) ULBP2 Protein AAK13082
Full-length, 246 AS
SEQ ID-Nr. 10 ULBP2 (Homo sapiens)
Asp 1 bis AIa 181
SEQ ID-Nr. 11 ULBP3 (Homo sapiens) ULBP3 Protein AAK13083
Full-length, 244 AS
SEQ ID-Nr. 12 ULBP3 (Homo sapiens)
Asp 1 bis AIa 181
SEQ ID-Nr. 13 ULBP4 (Homo sapiens) ULBP4 Protein AAP15166
Full-length, 263 AS SEQ ID-Nr. Name, Länge Definition/Besonderheiten Acc. Nr.
SEQ ID-Nr. 14 RAETlGl (Homo sapiens) RAETlGl AAO22238 Full-length, 334 AS
SEQ ID-Nr. 15 RAETlL (Homo sapiens) Retinole Acid Early AAK91503 Transcript 1 Full-length, 246 AS
SEQ ID-Nr. 22 NKG2D-L (Mus musculus) NKG2D-L AAC24356 Full-length, 232 AS
SEQ ID-Nr. 23 NKG2D-S (Mus musculus) NKG2D Homolog AAC28245 Full-length, 219 AS
SEQ ID-Nr. 24 NKG2D löslich NKG2D Ektodomäne (Mus musculus) AS 4-11: Flag-tag, 168 AS AS 15-20: Hexahistidin-tag AS 21-26: Linker AS 27-169: Ektodomäne

Claims

60Patentansprüche
1• Verwendung von zumindest einem Blocker der NKG2D-Rezeptor- /NKG2D-Liganden-Interaktion zur Herstellung eines Arznei¬ mittels zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, dadurch gekennzeichnet, dass der Blocker ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend löslicher NKG2D-Rezeptor, lösliches MICA, lösliches MICB, lösliches ULBPl, lösliches ULBP2, lösli¬ ches ULBP3, lösliches ULBP4, lösliches RAETlL, lösliches RAETlG, sowie allelische Varianten oder Fragmente oder De¬ rivate der genannten Blocker, sowie synthetisch herge¬ stellte Blocker der NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden- Interaktion.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Blocker ein Protein eingesetzt wird, das eine Amino¬ säuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 15.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Blocker ein Protein eingesetzt wird, das eine A- minosäuresequenz besitzt, die ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 15.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass ein Blocker eingesetzt wird, der rekom- binant hergestellt wurde.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass die Verwendung bei Krankheiten erfolgt, 61
die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Multiple Sklerose, Diabetes Typ I, rheumatoide Arthritis, Psoria¬ sis, Spondylarthritiden, Zöliakie, Morbus Behcet, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) .
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verwendung bei der schubförmigen Multiplen Sklerose erfolgt.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Verwendung in der Anfangsphase der schubförmigen Multiplen Sklerose erfolgt.
8. Verwendung von gegen den NKG2D-Rezeptor gerichteten Anti¬ körpern zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Spondylarthritiden, Zöliakie, Morbus Behcet, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Systemischer Lupus Erythe¬ matodes (SLE) .
9. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend zumindest einen Blocker der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Inter- aktion.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Blocker ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, löslicher NKG2D-Rezeptor, anti-NKG2D- Rezeptor-Antikörper, lösliches MICA, lösliches MICB, lös¬ liches ULBPl, lösliches ULBP2, lösliches ULBP3, lösliches 62
ULBP4, lösliches RAETlL, lösliches RAETlG, sowie alleli¬ sche Varianten oder Fragmente oder Derivate der genannten Blocker, sowie synthetisch hergestellte Blocker der NKG2D- Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Blocker ein Protein eingesetzt wird, das eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 15.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Blocker ein Protein eingesetzt wird, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 15.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, insbeson¬ dere zur Behanldung von Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, Spondylarthritiden, Zöliakie, Morbus Behcet, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) .
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