DE69532996T2

DE69532996T2 - Peptidanaloge des menschlichen basischen myelinproteins

Info

Publication number: DE69532996T2
Application number: DE69532996T
Authority: DE
Inventors: Nicholas Ling; Amitabh Gaur; Paul J. Conlon; Lawrence Steinman
Original assignee: Neurocrine Biosciences Inc
Current assignee: Neurocrine Biosciences Inc
Priority date: 1994-11-18
Filing date: 1995-11-16
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2015-11-17
Also published as: EP0792287A1; NO972264D0; DK0792287T3; JPH10509172A; MX9703643A; WO1996016086A1; ATE266043T1; US20020086976A1; ES2218559T3; CA2204147A1; AU4405896A; EP0792287B1; NO972264L; EP1440980A3; US6329499B1; PT792287E; DE69532996D1; EP1440980A2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Verfahren zur Behandlung multipler Sklerose durch Verwendung von Peptidanaloga des menschlichen Myelin basischen Proteins.
Hintergrund der Erfindung
Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische, entzündliche Erkrankung, die ungefähr 250.000 Individuen in den Vereinigten Staaten betrifft. Obwohl der klinische Verlauf durchaus variabel sein kann, manifestiert sich die häufigste Form durch wiederaufkommende neurologische Mängel, insbesondere Paralyse, sensorische Mängel und Augenprobleme.
Der entzündliche Prozess kommt hauptsächlich in der weißen Masse des zentralen Nervensystems vor und wird durch T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Makrophagen vermittelt. Diese Zellen sind für die Demyelinierung von Axonen verantwortlich. Die charakteristische Läsion in MS wird bedingt durch ihr makroskopisches Erscheinungsbild das Plaque genannt.
Von multipler Sklerose wird angenommen, dass sie aus pathogenen T-Zellen hervorgeht, die die Mechanismen, die Eigentoleranz etablieren, umgehen und normales Gewebe angreifen. Die T-Zellreaktivität gegenüber dem Myelin basischen Protein kann eine kritische Komponente in der Entwicklung von MS sein. Die in Läsionen gefundenen pathogenen T-Zellen haben eine eingeschränkte Heterogenität des Antigenrezeptors (TCR). Die aus Plaques isolierten T-Zellen zeigen eine Neuanordnung einer eingeschränkten Anzahl von Vα- und Vβ-Gensegmenten. Zudem zeigen die TCRs verschiedene dominante Aminosäuremotive in der dritten komplementaritätsbestimmenden Region (CDR), die die hauptsächliche Antigenkontaktstelle darstellt. Insgesamt wurden drei CDR Motive in T-Zellklonen identifiziert, von denen bekannt ist, dass sie ein Epitop innerhalb der Aminosäuren 82–106 des Myelin basischen Proteins erkennen. Diese Moti ve wurden in 44% der neu angeordneten TCR-Sequenzen gefunden, die ein bestimmtes Vβ-Gen involvieren, das in T-Zellen neu angeordnet ist, die aus Gehirn von zwei Patienten mit MS isoliert wurden.
Eine definitive Behandlung von MS wurde bisher nicht etabliert. Historisch wurden Corticosteroide und ACTH verwendet, um MS zu behandeln. Im Wesentlichen verringem diese Medikamente die entzündliche Reaktion durch die Toxizität gegenüber Lymphozyten. Die Genesung von akuten Verschlechterungen kann beschleunigt werden, aber diese Medikamente verhindern zukünftige Attacken oder verhindern die Entwicklung zusätzlicher Behinderungen oder die chronische Progression von MS nicht (Carter und Rodriguez, Mayo Clinic Proc. 64: 664, 1989; Weiner und Hafler, Ann. Neurol. 23: 211, 1988). Zusätzlich machen die starken Nebenwirkungen der Steroidbehandlungen diese Medikamente für die langfristige Verwendung nicht wünschenswert.
Andere toxische Verbindungen wie Azathioprin, ein Purinantagonist, Cyclophosphamid und Cyclosporin wurden verwendet, um die Symptome von MS zu behandeln. Wie die Corticosteroidbehandlung sind diese Medikamente im besten Falle für einen kurzen Zeitraum vorteilhaft und hochtoxisch. Die Nebenwirkungen umfassen erhöhte Krebshäufigkeit, Leukopenien, toxische Hepatitis, gastrointestinale Probleme, Bluthochdruck und Nephrotoxizität (Mitchell, Cont. Clin. Neurol. 77: 231, 1993; Weiner und Hafler, supra). Antikörperbasierende Therapien, die auf T-Zellen gerichtet sind wie Anti-CD4-Antikörper, werden derzeit zur Behandlung von MS untersucht. Jedoch können diese Mittel unerwünschte Nebenwirkungen durch die Schwächung der Immunität des Patienten bewirken.
Kürzlich wurden Cytokine wie IFN-γ und IFN-β verabreicht, um zu versuchen, die Symptome von MS zu mildern. Jedoch wurde eine Pilotstudie, die IFN-γ involvierte, beendet, da 7 von 18 Patienten, die mit diesem Medikament behandelt wurden, eine klinische Verschlechterung innerhalb eines Monats nach Beginn der Behandlung erfuhren. Zudem gab es eine Erhöhung in der spezifischen Reaktion auf MBP (Weiner und Hafler, supra).
Betaseron, ein modifiziertes Betainterferon, wurde kürzlich zur Verwendung in MS-Patienten zugelassen. Obwohl die Betaseronbehandlung einige Verbesserung in den Verschlechterungsraten aufzeigte (Paty et al., Neurology 43: 662, 1993), gab es keinerlei Unterschied in der Geschwindigkeit der klinischen Verschlechterung zwischen behandelten und Kontrollgruppen (IFNB MS Study Group, Neurology 43: 655, 1993; Paty et al., supra). Es wurden üblicherweise Nebenwirkungen beobachtet. Die häufigste dieser Nebenwirkungen war Fieber (40%–58% der Patienten), erkältungsartige Symptome (76% der Patienten), Kälteempfinden (46% der Patienten), Mylagien (41% der Patienten) und Schwitzen (23% der Patienten). Zusätzlich waren Reaktionen an der Injektionsstelle (85%) einschließlich Entzündung, Schmerzen, Hyperempfindlichkeit und Nekrose üblich (IFNB MS Study Group, supra; Connelly, Annals of Pharm. 28: 610, 1994).
In Hinblick auf die mit den existierenden Behandlungen von MS assoziierten Problemen gibt es einen starken Bedarf an verbesserten Behandlungen, die wirksamer sind, und nicht mit solchen Nachteilen assoziiert sind. Die vorliegende Erfindung nutzt die Verwendung von Peptidanaloga, die eine T-Zellreaktion auf menschliches Myelin basisches Protein antagonisiert, um wirksam MS zu behandeln, während gleichzeitig weitere damit verbundene Vorteile zur Verfügung gestellt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Peptidanalogon zur Verfügung gestellt, umfassend mindestens sieben aufeinander folgende Aminosäuren, ausgewählt aus den Resten 86 bis 99 von menschlichem Myelin basischen Protein aus 1, einschließlich Rest 91, wobei das L-Lysin an Position 91 zu einer anderen Aminosäure verändert ist, oder Rest 97, wobei das L-Arginin an Position 97 zu einer anderen Aminosäure verändert ist, oder Rest 95, wobei das L-Threonin an Position 95 zu einer anderen Aminosäure verändert ist, und wobei das Peptidanalogon 2 bis 5 Veränderungen zu einer Aminosäure anders als die Aminosäuren, die in dem nativen Protein an der Position vorhanden sind, enthält, und wobei das Peptidanalogon a) um die Bindung von nativem MBP Peptid an MHC kompetetiv ist, b) nicht die Zellteilung einer MBP (87–99) reaktiven T-Zelllinie verursacht, und c) die Induktion von experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE) durch MBP (87–99) in Nagern inhibiert.
In einer Ausführungsform umfasst das Peptidanalogon mindestens sieben Aminosäuren, ausgewählt aus den Resten 86 bis 99, wobei das L-Lysin in Position 91 geändert ist und ein bis drei zusätzliche L-Aminosäuren, die aus den Resten 86, 87, 88, 95, 98 oder 99 ausgewählt sind, in eine andere Aminosäure verändert sind. In einer zweiten verwandten Ausführungsform ist das L-Threonin in Position 95 verändert und ein bis drei zusätzliche Aminosäuren, die aus den Resten 86, 87, 88, 91, 98 und 99 oder 86, 87, 88, 97, 98 und 99 in eine andere Aminosäure verändert sind. In einer dritten verwandten Ausführungsform ist L-Arginin in Position 97 verändert und ein bis drei zusätzliche Aminosäuren, die aus den Resten 86, 87, 88, 95, 98 oder 99 ausgewählt sind, sind in einer anderen Aminosäure verändert.
In einem anderen Satz an Ausführungsformen umfasst das Peptidanalogon die Reste 83–99 des menschlichen Myelin basischen Proteins, wobei das Peptidanalogon vorzugsweise zwei bis fünf Veränderungen enthält. In bevorzugten Aspekten dieser Erfindung haben die Peptidanaloga die veränderten Reste 89, 91, 95 oder 97 zu Alanin und die zusätzlichen Aminosäuren sind in die korrespondierende Aminosäure in der D-Form verändert.
In anderen Ausführungsformen umfassen Peptidanaloga mindestens sieben Aminosäuren, die aus den Resten 86 bis 99 von menschlichem Myelin basischen Protein ausgewählt sind, bei denen entweder L-Lysin in Position 91, L-Threonin in Position 95 oder L-Arginin in Position 97 in eine andere Aminosäure verändert sind und zusätzlich sind die N-terminalen und C-terminalen Aminosäuren verändert, um die Proteolyse nach Verabreichung des Peptidanalogons zu verringern. In einem bevorzugten Aspekt liegen die N- und/oder C-terminalen Aminosäuren in der D-Form vor. In anderen Ausführungsformen umfassen die Peptidanaloga mindestens sieben Aminosäuren, die aus den Resten 86 bis 99 des menschlichen Myelin basischen Proteins ausgewählt sind, bei denen entweder L-Lysin in Position 91, L-Threonin in Position 95 oder L-Arginin in Position 97 in eine andere Aminosäure verändert sind und zusätzlich bis zu drei andere Aminosäureänderungen durchgeführt werden. Jeglicher Rest zwischen 86–99 kann verändert werden, außer, dass in einem Peptidanalogon, in dem der Rest 91 verändert ist, Rest 97 nicht verändert werden kann. In gleicher Weise kann in einem Peptidanalogon, in dem Rest 97 verändert wurde, Rest 91 nicht verändert werden.
Andere Ausführungsformen stellen Peptidanaloga zur Verfügung, die mindestens sieben Aminosäuren umfassen, die aus den Resten 86 bis 99 des menschlichen Myelin basischen Proteins ausgewählt sind, bei dem entweder L-Lysin in Position 91, L-Threonin in Position 95 oder L-Arginin in Position 97 in eine andere Aminosäure verändert ist. In bevorzugten Aspekten werden die Reste 91, 95 oder 97 zu entweder Alanin oder der korrespondierenden D-Aminosäure verändert.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung stellen eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die ein Peptidanalogon gemäß den oben genannten Ausführungsformen umfasst, bei der das Peptidanalogon in einem physiologisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten ist.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden sich durch Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung und beigefügten Zeichnungen ergeben. Zusätzlich werden unten verschiedene Bezüge gezeigt, die bestimmte Prozeduren oder Zusammensetzungen in größerem Detail aufzeigen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die DNA und angenommene Aminosäuresequenz für menschliches Myelin basisches Protein.
2 zeigt die Reaktion von ablaufenden Lymphknotenzellen aus Lewis Ratten, die 9–10 Tage zuvor mit MBP (87–99) auf 10 μM MBP (87–99) immunisiert worden waren, Medium, das nicht verwandte Peptid Motilin und sechs verschiedene MBP-Analoga. A, L-Alanin; k, D-Lysin; t, D-Threonin; r, D-Arginin.
3 ist eine Grafik, die die proliferative Reaktion der T-Zelllinie NBI auf Rest 91-substituierte Analoga des menschlichen Myelin basischen Proteins (87–99) zeigt. Es wurden zehn verschiedene Substitutionen untersucht. Es wurde die proliferative Reaktion der Ratten T-Zelllinie in Reaktion auf Konzentrationen der Peptidanaloga im Bereich von 0 bis 150 μM bestimmt. Das Ausmaß der Proliferation wird als Zähler pro Minute gezeigt; Standardabweichungen vom Durchschnitt waren weniger als ±10%. MOT, Motilin, ein Peptid, das mit MBP nicht verwandt ist; MBP (87–99), menschliche Myelin basische Proteinreste 87–99; K, Lysin; R, Arginin; N, Asparagin; H, Histidin; L, Leucin, S, Serin; G, Glycin; k, D-Lysin; E, Glutaminsäure; F, Phenylalanin; A, Alanin.
4 ist eine Grafik, die die proliferative Reaktion der T-Zelllinie NBI auf Rest 95-substituierte Analoga des menschlichen Myelin basischen Proteins (87–99) aufzeigt. Es wurden zehn verschiedene Substitutionen untersucht. Es wurden die proliferative Reaktion der Ratten T-Zelllinie in Reaktion auf Konzentrationen der Peptidanaloga im Bereich von 0 bis 150 μM bestimmt. Das Ausmaß der Proliferation wird als Zähler pro Minute gezeigt; Standardabweichungen des Durchschnitts betrugen weniger als ±10%. MOT, Motilin, ein mit MBP nicht verwandtes Peptid; MBP (87–99), menschliche Myelin basische Proteinreste 87–99; T, Threonin; A, Alanin; t, D-Threonin; G, Glycin; I, Isoleucin; Y, Tyrosin; Q, Glutamin; S, Serin; K, Lysin; E, Glutaminsäure; N, Histidin.
5 ist eine Grafik, die die proliferative Reaktion der T-Zelllinie NBI auf Rest 97-substituierte Analoga des menschlichen Myelin basischen Proteins aufzeigt. Es wurden elf verschiedene Substitutionen untersucht. Es wurde die proliferative Reaktion der T-Zellen auf Konzentrationen der Peptidanaloga im Bereich von 0 bis 150 μM bestimmt. Das Ausmaß der Proliferation wird als Zähler pro Minute gezeigt. MBP 87–99, Myelin basisches Protein (87–99); R, Arginin; a, D-Alanin; r, D-Arginin; G, Glycin; K, Lysin; Q, Glutamin; E, Glutaminsäure; T, Threonin; L, Leucin; F, Phenylalanin; H, Histidin; A, Alanin.
6 ist eine Grafik, die die Fähigkeit der Peptidanaloga von MBP aufzeigt, die Proliferation von Ratten T-Zellen zu hemmen, die mit MBP reaktiv sind. Es wird die proliferative Reaktion von ablaufenden Lymphknotenzellen von Ratten gezeigt, die mit MBP (87–99) auf 16,7, 50 oder 150 μM von jedem Analogon immunisiert worden waren oder 5 μM MBP (87–99). Analoga wurden in der Gegenwart von 5 μM MBP (87–99) hinzugefügt. Das Ausmaß der Proliferation wird als Zähler pro Minute gezeigt. Die Kontrollen bestanden nur aus MBP (87–99) bei 5 μM und nur Medium. h88/A91 bezeichnet ein repräsentatives Peptidanalogon von MBP (87–99) mit einem D-Histidin am Rest 88 und Alanin am Rest 91; h88/A91/p99 bezeichnet ein anderes repräsentatives Peptidanalogon von MBP (87–99) mit D-Histidin bei 88, Alanin bei Rest 91 und D-Prolin bei Rest 99.
7 ist eine Grafik, die die Hemmung der EAE-Induktion in Lewis-Ratten nach Injektion mit MBP (87–99) zeigt. Pfeile zeigen die Tage an, an denen entweder PBS (Kontrolle) oder das h88/A91 Peptidanalogon verabreicht wurden. EAE wurde als 0 aufgezeichnet, keine Symptome; 1, Schwanzparalyse; 2, Hinterbeinschwäche; 3, Hinterbeinparalyse; 4, Hinter- und Vorderbeinparalyse.
8 zeigt die Aminosäuresequenz im Einzelbuchstabencode für die Reste 83 bis 99 des menschlichen Myelin basischen Proteins und die Aminosäuresequenzen der Peptidanaloga NBI-5719, NBI-5748, NBI-5765, NBI-5788 und NBI-5789. Ein Strich zeigt die Aminosäureidentität auf. MBP (83–99), Myelin basische Proteinreste 83 bis 99; a, D-Alanin; A, L-Alanin; K, L-Lysin; L, L-Leucin.
9 ist eine Grafik, die die Hemmung der EAE-Induktion in Lewis-Ratten nach der Injektion von MBP (83–99) zeigt. In Lewis-Ratten wurden MBP (83–99) am Tage 0 injiziert. Am Tag 9 wurden die Ratten entweder mit einem Kontrollpeptid, Pottwalmyoglobin (110–121) oder dem Peptidanalogon NBI-5788 injiziert. Jeder Datenpunkt zeigt den Durchschnitt der klinischen Bewertung von sechs Tieren.
10 ist eine Grafik, die die Hemmung der EAE-Induktion in Lewis-Ratten nach Injektion mit MBP (83–99) zeigt. Die Lewis-Ratten wurden mit MBP (83–99) am Tage 0 injiziert. Am Tag 9 wurden den Ratten entweder ein Kontrollpeptid, Pottwalmyoglobin (110–121) oder das Peptidanalogon NBI-5788 injiziert. Jeder Datenpunkt zeigt den Durchschnitt der klinischen Bewertung von sechs Tieren.
11 ist eine Grafik, die die Hemmung der EAE-Induktion in Lewis-Ratten nach Injektion mit MBP (83–99) zeigt. Den Lewis-Ratten wurde MBP (83–99) am Tage 0 injiziert. Am Tag 9 wurde den Ratten entweder ein Kontrollpeptid, Pottwalmyoglobin (110–121) oder das Peptidanalogon NBI-5765 injiziert. Jeder Datenpunkt zeigt den Durchschnitt der klinischen Bewertung von sechs Tieren.
12 ist eine Grafik, die die Hemmung der EAE-Induktion in SJL/J-Mäusen nach Injektion mit MBP (87–99) zeigt. Den Gruppen von Mäusen wurden intraperi toneal auf wöchentlicher Basis für vier Wochen entweder ein Kontrollpeptid oder das Peptidanalogon NBI-5719 oder NBI-5765 injiziert. Jeder Datenpunkt stellt den Durchschnitt der klinischen Bewertung von zehn Mäusen dar.
13 ist eine Grafik, die die Fähigkeit eines Peptidanalogons von MBP illustriert, die Proliferation eines Dr2a-beschränkten, menschlichen T-Zellklons zu hemmen, der mit MBP reaktiv ist. Es wird die proliferative Reaktion des T-Zellklons, der mit verschiedenen Konzentrationen an MBP (83–99) und 50 Mikromolar von entweder dem Peptidanalogon oder Pottwalmyoglobin, dem Kontrollpeptid, inkubiert wurde, gezeigt.
14 ist eine Grafik, die die Fähigkeit der Peptidanaloga von MBP zeigt, die Proliferation eines Dr2a-einschränkten, menschlichen T-Zellklons zu hemmen, der mit MBP reaktiv ist. Es wird die proliferative Reaktion des T-Zellklons, der mit verschiedenen Konzentrationen des MBP (83–99) und 50 Mikromolar von entweder dem Peptidanalogon oder Pottwalmyoglobin, dem Kontrollpeptid, inkubiert wurde, gezeigt.
15 ist eine Grafik, die die Fähigkeit eines Peptidanalogons von MBP aufzeigt, die Proliferation eines Dr2a-einschränkten, menschlichen T-Zellklons zu hemmen, der mit MBP reaktiv ist. Es wird die proliferative Reaktion des T-Zellklons, der mit verschiedenen Konzentrationen von MBP (83–99) und 50 Mikromolar von entweder dem Peptidanalogon oder Pottwalmyoglobin, dem Kontrollpeptid, inkubiert wurde, gezeigt.
16 ist eine Grafik, die die Fähigkeit eines Peptidanalogons von MBP illustriert, die Proliferation eines Dr2b-eingeschränkten, menschlichen T-Zellklons zu hemmen, der mit MBP reaktiv ist. Es wird die proliferative Reaktion des T-Zellklons, der mit verschiedenen Konzentrationen an MBP (83–99) und 50 Mikromolar von entweder dem Peptidanalogon oder Pottwalmyoglobin, dem Kontrollpeptid, inkubiert wurde, gezeigt.
17 ist eine Grafik, die die Fähigkeit eines Peptidanalogons von MBP zeigt, die Proliferation eines Dr2b-einschränkten, menschlichen T-Zellklons zu hemmen, der mit MBP reaktiv ist. Es wird die proliferative Reaktion des T-Zellklons, der mit verschiedenen Konzentrationen des MBP (83–99) und 50 Mikromolar von entweder dem Peptidanalogon oder Pottwalmyoglobin, dem Kontrollpeptid, inkubiert wurde, gezeigt.
18 ist eine Grafik, die die Fähigkeit eines Peptidanalogons von MBP aufzeigt, die Proliferation eines Dr2b-einschränkten, menschlichen T-Zellklons zu hemmen, der mit MBP reaktiv ist. Es wird die proliferative Reaktion des T-Zellklons, der mit verschiedenen Konzentrationen von MBP (83–99) und 50 Mikromolar von entweder dem Peptidanalogon oder Pottwalmyoglobin, dem Kontrollpeptid, inkubiert wurde, gezeigt.
19 ist eine Grafik, die die Fähigkeit eines Peptidanalogons von MBP aufzeigt, die Proliferation eines Dr2b-einschränkten, menschlichen T-Zellklons zu hemmen, der mit MBP reaktiv ist. Es wird die proliferative Reaktion des T-Zellklons, der mit verschiedenen Konzentrationen von MBP (83–99) und 50 Mikromolar von entweder dem Peptidanalogon oder Pottwalmyoglobin, dem Kontrollpeptid, inkubiert wurde, gezeigt.
20 ist eine Grafik, die die Fähigkeit eines Peptidanalogons von MBP aufzeigt, die Proliferation eines Dr2b-einschränkten, menschlichen T-Zellklons zu hemmen, der mit MBP reaktiv ist. Es wird die proliferative Reaktion des T-Zellklons, der mit verschiedenen Konzentrationen von MBP (83–99) und 50 Mikromolar von entweder dem Peptidanalogon oder Pottwalmyoglobin, dem Kontrollpeptid, inkubiert wurde, gezeigt.
21 ist eine Grafik, die die Herstellung von TNF-α und IFN-γ durch einen Dr2b-eingeschränkten, menschlichen T-Zellklon 5F6, zeigt, der mit MBP reaktiv ist. Der T-Zellklon wurde in der Gegenwart von 3 μM MBP (93–99) mit entweder 10 μM NBI-5788 oder Pottwalmyoglobin oder nur Medium inkubiert. Die Expressionsmenge von TNF-α oder IFN-γ wird als pg/ml gezeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Bevor mit der Erfindung fortgefahren wird, kann es für das Verständnis davon hilfreich sein, die Definitionen bestimmter Begriffe und Abkürzungen aufzuzeigen, die hiernach verwendet werden.
"Menschliches Myelin basisches Protein" ("MBP" bezeichnet ein Protein, das in dem Cytoplasma menschlicher Oligodendrogliazellen zu finden ist. Die Nukleotidsequenz und vorgeschlagene Aminosäuresequenz von menschlichem MBP wird in 1 gezeigt.
Obwohl diese nicht in 1 gezeigt werden, sind verschiedene molekulare Formen des menschlichen Myelin basischen Proteins, die durch differenzielles Splicing oder posttranslationale Modifikation generiert werden, auch vom Umfang dieser Erfindung mitumfasst.
"Peptidanaloga" des Myelin basischen Proteins sind mindestens sieben Aminosäuren in Länge und enthalten mindestens einen Unterschied in der Aminosäuresequenz zwischen dem Analogon und nativem menschlichen Myelin basischen Protein, wobei einer dieser ein Unterschiede im Rest 91, 95 oder 97 liegt. Es sei denn, dieses wird anderweitig angezeigt, bezieht sich eine genannte Aminosäure auf die L-Form. Eine L-Aminosäure aus dem nativen Peptid kann in jegliche andere der 20 in Proteinen üblicherweise zu findenden L-Aminosäuren geändert werden, jegliche der korrespondierenden D-Aminosäuren, seltene Aminosäuren wie 4-Hydroxyprolin und Hydroxylysin oder eine Nicht-Proteinaminosäure wie β-Alanin und Homoserin. Auch umfasst vom Umfang der Erfindung sind Aminosäuren, die mittels chemischer Mittel wie Methylierung (z. B. α-Methylvalin), Amidierung der C-terminalen Aminosäure durch ein Alkylamin wie Ethylamin, Ethanolamin und Ethylendiamin und Acylierung oder Methylierung einer Aminosäureseitenkettenfunktion (z. B. Acylierung der Epsilonaminogruppe von Lysin) geändert wurden.
"Rest 83", "Rest 89", "Rest 91", "Rest 95" und "Rest 97" (auch Position 83, Position 89, Position 91, Position 95 und Position 97 genannt) bezeichnen jeweils die Aminosäuren 83, 89, 91, 95 und 97 des menschlichen Myelin basischen Proteins wie es in 1 gezeigt wird oder die Aminosäure in einer vergleichbaren Position. Genauer gesagt betrifft das Zahlensystem für diese Reste die Aminosäureposition innerhalb des nativen menschlichen Proteins unabhängig von der Länge des Peptids oder der Aminosäureposition innerhalb des Peptids.
Die Aminosäuren werden durch ihren Standard Dreibuchstaben- oder Einbuchstabencode bezeichnet. Wenn dieses nicht anderweitig zum Ausdruck gebracht wird, ist die L-Form der Aminosäure vorgesehen. Wenn der Einbuchstabencode verwendet wird, bezeichnet ein Großbuchstabe die L-Form und ein kleiner Buchstabe die D-Form. Der Einbuchstabencode ist wie folgt: A, Alanin; C, Cystein; D, Asparginsäure; E, Glutaminsäure; F, Phenylalanin; G, Glycin; N, Histidin; I, Isoleucin; K, Lysin; L, Leucin; M, Methionin; N, Asparagin; P, Prolin; Q, Glutamin; R, Arginin; S, Serin; T, Threonin; V, Valin; W, Tryptophan und Y, Tyrosin.
Peptidanaloga des Myelin basischen Proteins
Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung Peptidanaloga zur Verfügung, umfassend mindestens sieben Aminosäuren, ausgewählt aus den Resten 83–99 des menschlichen Myelin basischen Proteins und umfassend eine Änderung des natürlich vorkommenden L-Lysins in Position 91, L-Threonins in Position 95 oder L-Arginins in Position 97 in eine andere Aminosäure. In einem Aspekt umfasst das Peptidanalogon eine zusätzliche Veränderung von einer bis drei L-Aminosäuren in den Positionen 86, 87, 88, 91, 95, 97, 98 und/oder 99 des menschlichen Myelin basischen Proteins, so lange 91 und 97 nicht beide in dem gleichen Peptidanalogon verändert werden. In einem anderen Aspekt weist das Peptidanalogon zusätzlich N-terminale und/oder C-terminale Reste auf, die in eine Aminosäure geändert wurden, so dass die Proteolyse nach Verabreichung an einen Patienten im Vergleich zu einem Peptidanalogon ohne diese zusätzlichen Änderungen verringert wird. In einem weiteren Aspekt umfasst das Peptidanalogon von MBP mindestens sieben Aminosäuren, die aus den Resten 86–99 ausgewählt sind und hat einen der Reste in Position 91, 95 oder 97 in eine Aminosäure verändert, die nicht in nativen MBP Protein vorhanden ist. Zusätzlich zu solchen Einzelveränderungen können ein bis drei zusätzliche Veränderungen der Reste 86 bis 99 vorgenommen werden, so lange die Reste 91 und 97 nicht in dem gleichen Peptidanalogon verändert werden. In einem noch weiteren Aspekt umfasst das Peptidanalogon von MBP die Reste 83 bis 99, wobei das L-Lysin in Position 91 in eine andere Aminosäure geändert wurde und zwei bis vier zusätzliche Aminosäuren, die aus den Resten 83 bis 90 und 92 bis 99 ausgewählt sind, in eine andere Aminosäure verändert sind. Vorzugsweise wird mindestens eine Aminosäure mit einer geladenen Aminosäure substituiert. Zusätzlich können die N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäuren in eine D-Aminosäure verändert werden.
Die Peptidanaloga haben vorzugsweise 7 bis 17 Aminosäuren und sind im Allgemeinen nicht länger als 20 Aminosäuren. Besonders bevorzugte Peptidanaloga haben 14 bis 17 Aminosäuren in Länge. Die Reste 83, 89, 91, 95 und 97, die jeweils L-Glutaminsäure, L-Phenylalanin, L-Lysin, L-Threonin und L-Arginin in dem nativen menschlichen Protein sind, sind Schlüsselreste. Innerhalb der Erfindung müssen Analoga eine Aminosäure, die nicht L-Lysin in Position 91 ist, eine Aminosäure, die nicht L-Threonin in Position 95 ist, oder eine Aminosäure, die nicht L-Arginin in Position 97 ist, aufweisen.
Wie oben erwähnt liegt jegliche Aminosäureveränderung in Position 91 im Umfang dieser Erfindung. Bevorzugte Peptidanaloga umfassen die Änderung von L-Lysin in jegliche der folgenden Aminosäuren: D-Lysin, Alanin, Glycin, Glutaminsäure, Phenylalanin, Arginin, Asparagin, Histidin, Leucin oder Serin. Diese Aminosäuren umfassen sowohl konservative (ähnliche Ladung, Polarität, Hydrophobizität und Größe) wie auch nichtkonservative Aminosäuren. Obwohl man typischerweise erwarten würde, dass nur nichtkonservative Aminosäureänderungen eine therapeutische Wirkung zur Verfügung stellen, betreffen unerwarteterweise sogar konservative Änderungen (z. B. Arginin) die Funktion des Peptidanalogons im Vergleich zu dem nativen Peptid deutlich. Eine solche Diversität der Substitution wird des Weiteren durch die Tatsache illustriert, dass die oben bevorzugten Aminosäuren hydrophob und hydrophil, geladen oder ungeladen, polar oder nicht polar sind.
Zusätzlich befindet sich auch jegliche Aminosäuresubstitution in Rest 95 innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Bevorzugte Peptidanaloga enthalten Änderungen von L-Threonin in eine der folgenden Aminosäuren: D-Threonin, Alanin, Glycin, Isoleucin, Tyrosin, Glutamin, Serin, Lysin, Glutaminsäure und Histidin. Andere bevorzugte Änderungen sind nicht konservative Aminosäuren. Besonders bevorzugte Änderungen sind Alanin oder D-Threonin.
In ähnlicher Weise liegt jegliche Aminosäureänderung in Position 97 im Umfang dieser Erfindung. Bevorzugte Peptidanaloga umfassen eine Änderung von L-Arginin zu D-Alanin, D-Arginin, Glycin, Lysin, Glutamin, Glutaminsäure, Threonin, Leucin, Phenylalanin, Histidin oder Alanin. Andere bevorzugte Änderungen sind zu nicht konservativen Aminosäuren. Besonders bevorzugte Änderungen sind Alanin und D-Arginin.
Des Weiteren liegen jede Aminosäure in Position 83 und Position 89 innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Bevorzugte Peptidanaloga enthalten Änderungen von L-Glutaminsäure in Rest 83 in eine der folgenden Aminosäuren: D-Alanin, L-Alanin, D-Glutaminsäure und L-Phenylalanin in Position 89 zu Alanin, Leucin, Valin, Isoleucin.
Zusätzlich wird in bestimmten Ausführungsformen mindestens eine andere Aminosäure, ausgewählt aus den Resten 86, 87, 88, 89, 95, 98 oder 99 geändert. In solchen Ausführungsformen ist, wenn zwei andere Aminosäuren verändert werden, dann eine vorzugsweise aus den Resten 86, 87, 88 oder 89 ausgewählt und die andere ist aus den Resten 98 oder 99 ausgewählt. Alternativ dazu können bis zu drei Änderungen in jeglicher Position durchgeführt werden. In anderen Ausführungsformen werden mindestens zwei bis vier Aminosäuren (zusätzlich zu Position 91) verändert. In solchen Ausführungsformen sind die geänderten Aminosäuren vorzugsweise aus den Positionen 83, 84, 89 und 98 ausgewählt.
Mit diesen allgemeinen Überlegungen im Hinterkopf haben Peptidanaloga innerhalb des Umfangs der Erfindung eine Änderung des Restes 91, Restes 95 oder des Restes 97. Ein Satz bevorzugter Peptidanaloga hat Doppeländerungen. In einer Ausführungsform ist Rest 91, wie oben erwähnt, verändert, Rest 87 ist in D-Valin geändert, Rest 88 zu D-Histidin oder Rest 99 zu D-Prolin. In ähnlicher Weise ist in einer anderen Ausführungsform Rest 97 wie oben verändert und entweder wird Rest 87 zu D-Valin, Rest 88 zu D-Histidin oder Rest 99 zu D-Prolin geändert. In einer noch weiteren Ausführungsform wird Rest 95 wie oben erwähnt verändert und Rest 87 wird zu D-Valin, Rest 88 zu D-Histidin oder Rest 99 zu D-Prolin geändert.
Ein zweiter Satz bevorzugter Peptidanaloga hat drei Substitutionen. In einer Ausführungsform wird der Rest 91 in Alanin verändert, Rest 87 wird zu D-Valin geändert oder Rest 88 wird zu D-Histidin verändert und Rest 99 wird zu D-Prolin verändert. In einer anderen Ausführungsform wird der Rest 97 zu Alanin verändert, Rest 88 wird zu D-Histidin verändert und Rest 99 zu D-Prolin. In einer noch weiteren Ausführungsform wird Rest 95 zu Alanin verändert, Rest 88 wird zu D-Histidin verändert und Rest 99 zu D-Prolin. In einer noch anderen Ausführungsform wird der Rest 83 zu D-Alanin verändert, Rest 89 wird zu Alanin verändert und Rest 91 wird zu Alanin verändert.
Ein dritter Satz bevorzugter Peptidanaloga hat vier Substitutionen. In einer Ausführungsform wird Rest 83 zu D-Alanin verändert, Rest 84 wird zu Lysin verändert, Rest 89 wird zu Leucin verändert und Rest 91 wird zu Alanin verändert. In einer anderen Ausführungsform wird Rest 83 zu D-Alanin verändert, Rest 84 wird zu Lysin verändert und die Reste 89 und 91 werden zu Alanin verändert.
Ein vierter Satz bevorzugter Peptidanaloga hat fünf Substitutionen. In einer Ausführungsform werden die Reste 83 und 98 zu D-Alanin verändert, Rest 84 wird zu Lysin verändert und die Reste 89 und 91 werden zu Alanin geändert. In einer anderen Ausführungsform werden die Reste 83 und 89 zu D-Alanin geändert, Rest 84 wird zu Lysin geändert, Rest 89 wird zu Leucin geändert und Rest 91 wird zu Alanin geändert.
Peptidanaloga können durch Standardchemietechniken synthetisiert werden, einschließlich der Synthese durch ein automatisiertes Verfahren. Im Allgemeinen werden Peptidanaloga durch Festphasen-Peptidsynthese hergestellt, die die Kopplung von jedem geschützten Aminosäurerest an einen Harzträger involviert, vorzugsweise ein 4-Methylbenzhydrylaminharz, durch Aktivierung mit Dicyclohexylcarbodiimid, um ein Peptid mit einem C-terminalen Amid zu ergeben. Alternativ dazu kann ein Chlormethylharz (Merrifield-Harz) verwendet werden, um ein Peptid mit einer freien Carbonsäure am C-Terminus zu ergeben. Seitenkettenfunktionelle Gruppen werden wie folgt geschützt: Benzyl für Serin, Threonin, Glutaminsäure und Asparginsäure; Tosyl für Histidin und Arginin; 2-Chlorbenzyloxycarbonyl für Lysin und 2,6-Dichlorbenzyl für Tyrosin. Nach der Kopplung wird die t-Butyloxylcarbonyl-Schutzgruppe auf der Alphaaminofunktion der hinzugefügten Aminosäure durch Behandlung mit Trifluoressigsäure, gefolgt von Neutralisierung mit Di-Isopropylethylamin, entfernt. Der nächste geschützte Rest wird dann auf die freie Aminogruppe gekoppelt, was die Peptidkette verlängert. Nachdem mindestens ein Rest hinzugefügt wurde, wird die geschützte Peptidharzkette mit Wasserstofffluorid behandelt, um das Peptid vom Harz zu spalten sowie die seitenkettenfunktionellen Gruppen zu entschützen. Das Rohrprodukt kann weiterhin durch Gelfiltration, HPLC, Partitionschromatografie oder Ionenaustauschchromatografie aufgereinigt werden.
Die Peptidanaloga innerhalb der vorliegenden Erfindung sollten (a) um die Bindung von nativem MBP-Peptid an MHC (z. B. 87–99 in Ratten; 83–99 in Menschen) kompetitiv sein; und (b) nicht die Zellteilung einer MBP (87–99) reaktiven T-Zelllinie verursachen; und (c) die Induktion von experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE) durch MBP (87–99) in Nagern hemmen.
Daher können mögliche Peptidanaloga durch (1) einem Assay, der die kompetitive Bindung an MHC misst, (2) einem Assay, der eine T-Zellproliferation misst, und (3) einen Assay, der die Induktionshemmung von EAE untersucht, auf ihre Fähigkeit hin untersucht werden, MS zu behandeln. Solche Analoga, die die Bindung der nativen Peptide hemmen, stimulieren die Proliferation von MBP-reaktiven Zelllinien nicht und hemmen die Entwicklung von EAE durch natives menschliches MBP (87–99) und sind nützliche Therapeutika. Obwohl nicht wesentlich, kann eine weitere Sicherheitsuntersuchung durchgeführt werden, um zu zeigen, dass das Analogon nicht selbst EAE induziert.
Die Bindung der Peptide an MHC-Moleküle kann an ganzen Zellen untersucht werden. In Kürze, Lewis-Rattenmilzzellen werden für 3 Stunden kultiviert, um es anhaftenden Zellen zu erlauben, an Polystyrolpetrischalen zu haften. Nichthaftende Zellen werden entfernt. Haftende Zellen, die Zellen enthalten, die MHC-Klasse II Moleküle exprimieren, werden durch das Abschaben der Schalen gesammelt. Die Bindung der Peptidanaloga an Zellen wird durch ein Fluoreszenzassay gemessen. In diesem Assay werden haftende Milzzellen mit verschiedenen Konzentrationen der Peptidanaloga vermischt und für eine Stunde bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wird Biotin-markiertes MBP (87–99) zu den Kulturwells hinzugefügt. Die Zellen werden für eine weitere Stunde inkubiert und dann dreimal in Medium gewaschen. Phycoerythrinkonjugiertes oder Fluorescein-konjugiertes Streptavidin wird zusammen mit einem Fluorochrom-markierten OX-6 oder OX-17 monoklonalen Antikörper hinzugefügt, der jeweils mit Ratten MHC-Klasse II I-A oder I-E reagiert. Die Zellen werden zweimal vor der Analyse durch Flusscytometrie gewaschen. Die Fluoreszenzintensität wird durch das Abziehen des Fluoreszenzwertes, der aus Zellen erhalten wurde, die nur mit Phycoerythrin-Streptavidin allein (Kontrollfärbung) gefärbt wurden, von dem Fluoreszenzwert, der mit Biotin-markiertem MBP nativen Peptid plus Phycoerythrin-Streptavidin (experimentelle Färbung) erhalten wird, berechnet. Die Färbung ohne Analogon etabliert einen 100% Wert. Die Prozenthemmung wird für jedes Analogon berechnet und als IC₅₀-Werte ausgedrückt. Ein Peptidanalogon mit einem IC₅₀-Wert von weniger als 100 μM ist für weitere Untersuchungen geeignet.
Kandidatenpeptidanaloga werden des Weiteren auf ihre Eigenschaft hin untersucht, die Proliferation von T-Zelllinien zu bewirken oder zu hemmen. Zwei verschiedene Assays können als Alternativen verwendet werden. Der erste misst die Fähigkeit des Analogons, die Proliferation von T-Zellen in einer direkten Weise zu bewirken. Der zweite misst die Fähigkeit des Peptidanalogons die Proliferation von T-Zellen, die durch natives MBP-Peptid induziert wird, zu hemmen.
In dem direkten Proliferationsassay können MBP (87–99) reaktive T-Zelllinien als Zielzellen verwendet werden. T-Zelllinien werden aus Lymphknoten etabliert, die aus Ratten entnommen wurden, denen MBP (87–99) injiziert wurde. Die Lymphknotenzellen werden isoliert und für 5 bis 8 Tage mit MBP (87–99) und IL-2 als Quelle von T-Zellwachstumsfaktoren kultiviert. Es werden lebende Zellen gewonnen und eine zweite Runde der Stimulation mit MBP (87–99 oder 83–99) und bestrahlten Milzzellen als Quelle von Wachstumsfaktoren durchgeführt. Nach 5 bis 6 Passagen in dieser Weise wird das proliferative Potenzial der Zelllinien bestimmt. Es werden MBP-reaktive Zellen in dem Proliferationsassay verwendet. In diesem Assay werden die T-Zelllinien für drei Tage mit verschiedenen Konzentrationen des Peptidanalogons und bestrahlten autologen Milzzellen kultiviert. Nach drei Tagen werden 0,5–1,0 μCi [³H]-Thymidin für 12–16 Stunden hinzugefügt. Die Kulturen werden geerntet und die aufgenommenen Zähler bestimmt. Durchschnittliche Zähler pro Minute (CPM) und die Standardabweichung vom Durchschnitt werden aus Dreifachkulturen bestimmt.
Als eine Alternative zur Verwendung der oben beschriebenen T-Zelllinien können ablaufende Lymphknotenzellen von Lewis-Ratten, denen MBP (87–99) injiziert worden war, verwendet werden. Vorzugsweise wird dieser Assay in Verbindung mit dem Proliferationsassay unter Verwendung von T-Zelllinien verwendet. In Kürze, Lewis-Ratten wird subkutan MBP (87–99) Peptid in vollständigem Freund's-Adjuvanz injiziert. Neun bis zehn Tage später werden ablaufende Lymphknotenzellen isoliert und Einzelzellsuspen sionen hergestellt. Lymphknotenzellen werden mit verschiedenen Konzentrationen der Peptidanaloga für drei Tage in einer Feuchtluftkammer, die 6,5% CO₂ enthält, inkubiert. Nach der Inkubation werden die Kulturen pulsartig mit 1–2 μCi [³H]-Thymidin für 12–18 Stunden versehen. Die Kulturen werden auf Fiberglasfiltern geerntet und in einem Szintillationszähler gezählt. Die durchschnittlichen Zähler pro Minute (CPM) und die Standardabweichung vom Durchschnitt werden aus Daten berechnet, die in Dreifachkulturen bestimmt wurden. Peptidanaloga, die Ergebnisse ergeben, die mehr als drei Standardabweichungen unterhalb der Durchschnittsreaktion einer vergleichbaren Konzentration an MBP (87–99) liegen, werden als nicht stimulierend angesehen. Peptidanaloga, die die Proliferation bei Konzentrationen von weniger als oder gleich 50 μM stimulieren, werden als für weitere Untersuchungen geeignet angesehen.
Der zweite oder alternative Assay ist ein Kompetitionsassay für die T-Zellproliferation. In diesem Assay werden Antigen-präsentierende Milzzellen zuerst bestrahlt und dann mit nativem MBP (87–99) Peptid für 2–4 Stunden inkubiert. Diese Zellen werden dann gewaschen und weiter mit T-Zellen kultiviert, die mit MBP (87–99) reaktiv sind. Verschiedene Konzentrationen von Kandidatenpeptidanaloga werden in die Kulturen für weitere 3 Tage gegeben. Nach diesem Inkubationszeitraum wird jede Kultur pulsartig mit 1 μCi [³H]-Thymidin für weitere 12–18 Stunden versehen. Die Kulturen werden dann auf Fiberglasfiltern geerntet und wie oben gezählt. Durchschnittliche CPM und Standardabweichung vom Durchschnitt werden aus Daten berechnet, die in Dreifachkulturen bestimmt wurden. Peptidanaloga, die die Proliferation zu ungefähr 25% bei einer Konzentration von 50 μM oder mehr hemmen, sind für eine weitere Untersuchung geeignet.
Menschliche T-Zellen, die mit MBP (83–99) reaktiv sind, können alternativ verwendet werden, um die Fähigkeit des Peptidanalogons zu messen, die Proliferation von T-Zellen zu hemmen, die durch natives MBP (83–99) Peptid induziert wird. MBP-spezifische T-Zellen können wie zuvor durch Martin et al., J. Immunol. 148: 1359–1366, 1992 beschrieben gewonnen werden. In Kürze, T-Zelllinien werden durch Kultur von menschlichen T-Zellen mit bestrahlten, DR-passenden, peripheren Blutzellen in MEM, supplementiert mit 2 mM L-Glutamin, 50 μg/ml Gentamicin, Penicillin und Streptomycin, 100 Uml rIL-2 und 10% menschlichem AB negativen Serum etabliert. Die Proliferation dieser T-Zellen wird durch Kultivierung eines Klons mit verschiedenen Konzentrationen (1,1–30 μM) nativem MBP (89–99) Peptid, 50 μM des Peptidanalogons oder SWM- Peptid in der Gegenwart von bestrahlten DR-passenden, peripheren Blutzellen kultiviert, gefolgt durch Inkubation für ungefähr 60 Stunden, die Zellen werden mit ³H-Thymidin für 12 Stunden gepulst und geerntet. Die Menge an aufgenommenem ³H-Thymidin wird gemessen.
Wie im Detail unten diskutiert wird, kann die Herstellung von Cytokinen auch untersucht werden. Insbesondere die TNF-α- und IFN-γ-Produktion sind besonders interessant. Von diesen proentzündlichen Cytokinen wird angenommen, dass sie eine Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. In Kürze, ein T-Zellklon wird in der Gegenwart des stimulierenden MBP-Peptids und des Peptidanalogons oder Kontrollpeptids (SWM) oder nur Medium inkubiert. Nach einer 24 ständigen Inkubation werden die Mengen an TNF-α und IFN-γ im Überstand unter Verwendung kommerziell verfügbarer EIA-Kits (Endogen, Cambridge, MA) bestimmt.
Kandidatenpeptide, die um die Bindung mit MBP (87–99) an MHC kompetitieren und keine direkte Proliferation der T-Zelllinie bewirken oder die Proliferation durch MBP (87–99) hemmen können, werden weiterhin auf ihre Fähigkeit untersucht, die Induktion von EAE durch MBP (87–99) zu hemmen. In Kürze, 500 μg MBP (87–99) werden als eine Emulsion in vollständigem Freund's Adjuvanz, supplementiert mit hitzegetötetem Mycobacterium tuberculosis (H37Ra), injiziert. Die Ratten werden subkutan an der Basis des Schwanzes mit 200 μl der Emulsion injiziert. Die Ratten werden in zwei Gruppen aufgeteilt. Ungefähr 2 Tage vor der Krankheitsinduktion (üblicherweise 10 Tage nach der Injektion von MBP (87–99)) werden die Ratten intraperitoneal entweder mit PBS oder Peptidanaloga in PBS injiziert. Die Tiere werden auf klinische Anzeichen auf einer täglichen Basis durch einen Beobachter beobachtet, der das Behandlungsprotokoll nicht kennt. EAE wird auf einer Skala von 0–4 bewertet: 0, klinisch normal; 1, leichte Schwanzparalyse; 2, Hinterbeinschwäche; 3, Hinterbeinparalyse; 4, Vorder- und Hinterbeine sind betroffen. Peptidanaloga, die mit 5 mg/kg oder weniger (ungefähr 1 mg pro Ratte) injiziert wurden, werden als die Entwicklung von EAE als hemmend angesehen, wenn es eine 50%ige Verringerung in der durchschnittlichen kumulativen Bewertung über sieben Tage nach dem Beginn der Erkrankungssymptome in der Kontrollgruppe gibt.
Zusätzlich können als Sicherheitsmaßnahme, aber nicht wesentlich für diese Erfindung, geeignete Peptidanaloga auf die direkte Induktion von EAE untersucht werden. Wie im Detail in Beispiel 2 beschrieben wird, werden verschiedene Mengen der Peptidanaloga an der Basis des Schwanzes der Ratten injiziert und die Ratten werden täglich auf Anzeichen von EAE untersucht. Ein Peptidanalogon, von dem nicht angenommen wird, dass es EAE bewirkt, hat eine durchschnittliche kumulative Bewertung von weniger als oder gleich 1 über sieben Tage, wenn 1 mg (5 mg/kg) in vollständigem Freund's Adjuvanz injiziert wird.
Behandlung und Verhinderung von multipler Sklerose
Die Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung sind in Verfahren zur Behandlung und Prävention der multiplen Sklerose durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Peptidanalogons des menschlichen Myelin basischen Proteins, wie es hierin beschrieben wird, nützlich. Patienten, die für eine solche Behandlung geeignet sind, können durch Kriterien identifiziert werden, die eine Diagnose klinisch eindeutiger MS etablieren, wie sie durch den Workshop der Diagnose von MS definiert wurden (Poser et al., Ann. Neurol. 13: 227, 1983). In Kürze, ein Individuum mit klinisch eindeutiger MS hatte zwei Attacken und einen klinischen Beweis von entweder zwei Läsionen oder einen klinischen Beweis von einer Läsion und einen paraklinischen Beweis von einer anderen separaten Läsion. Eindeutige MS kann auch durch den Nachweis von zwei Attacken und oligoklonalen Band von IgG in cerebrospinaler Flüssigkeit nachgewiesen werden oder durch die Kombination einer Attacke, klinischem Nachweis von zwei Läsionen und einer oligoklonalen Bande von IgG in cerebrospinaler Flüssigkeit. Leicht geringe Kriterien werden für die Diagnose von wahrscheinlicher klinischer MS verwendet.
Die wirksame Behandlung der multiplen Sklerose kann auf verschiedene Arten untersucht werden. Die Entsprechung jeglicher der folgenden Kriterien zeigt eine wirksame Behandlung an. Es werden drei Hauptkriterien verwendet: EDSS (die erweitere Behinderungsstatusskala), das Erscheinen von Verschlechterungen oder MRI (magnetische Resonanzbelichtung).
Die EDSS ist ein Mittel zur Bewertung der klinischen durch MS bedingten Einschränkung (Kurtzke, Neurology 33: 1444, 1983). Acht funktionale Systeme werden für den Typ und die Schwere der neurologischen Beeinträchtigung beurteilt. In Kürze, vor der Behandlung werden Patienten in den folgenden Systemen beurteilt: Pyramidal, Cerebella, Hirnstamm, sensorisch, Darm und Blase, Sicht, cerebral und andere. Nachuntersuchungen werden in bestimmten Intervallen durchgeführt. Die Skala liegt im Bereich von 0 (normal) bis 10 (Tod durch MS). Eine Verringerung um einen ganzen Schritt definiert eine wirksame Behandlung im Kontext der vorliegenden Erfindung (Kurtzke, Ann. Neurol. 36: 573–79, 1994).
Verschlechterungen werden als die Erscheinung eines neuen Symptoms definiert, das der MS zuzuschreiben ist und durch eine geeignete neue neurologische Abnormalität begleitet wird (IFNB MS Study Group, supra). Zusätzlich muss die Verschlechterung mindestens 24 Stunden andauern und es muss ihr eine Stabilität oder Verbesserung für mindestens 30 Tage vorausgehen. In Kürze, die Patienten werden einer standardneurologischen Untersuchung durch einen Kliniker unterzogen. Die Verschlechterungen sind entweder mild, moderat oder schwer gemäß den Änderungen in der neurologischen Bewertungsskala (Sipe et al., Neurology 34: 1368, 1984). Es wird eine jährliche Verschlechterungsrate und ein Anteil an verschlechterungsfreien Patienten bestimmt. Die Therapie wird als wirksam angenommen, wenn es einen statistisch signifikanten Unterschied in der Rate oder dem Anteil von verschlechterungsfreien Patienten zwischen der behandelten Gruppe und der Placebogruppe für eine dieser Messungen gibt. Zusätzlich kann auch die Zeit zur ersten Verschlechterung und die Verschlechterungsdauer und Schwere gemessen werden. Ein Maß der Wirksamkeit als Therapie in dieser Hinsicht ist ein statistisch signifikanter Unterschied in der Zeit bis zur ersten Verschlechterung oder der Dauer und Schwere in der behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe.
MRI kann verwendet werden, um aktive Läsionen unter Verwendung von Gadolinium-DTPA-verstärkter Belichtung (McDonald et al. Ann. Neurol. 36: 14, 1994) oder die Lokalisation und das Ausmaß der Läsionen unter Verwendung von T₂-gewichteten Techniken zu messen. In Kürze, es werden Basislinien-MRIs erhalten. Die gleiche Belichtungsebene und Patientenposition werden für jede folgende Studie verwendet. Die Positionierung und Belichtungssequenzen werden dergestalt ausgewählt, um den Läsionsnachweis zu maximieren und die Läsionsverfolgung zu erleichtern. Die gleiche Positionierung und Beleuchtungssequenzen werden in den anschließenden Studien verwendet. Die Gegenwart, Lokalisierung und das Ausmaß von MS-Läsionen werden durch Radiologen bestimmt. Die Flächen der Läsionen werden hervorgehoben und Scheibe für Scheibe als Gesamtläsionsfläche zusammengefasst. Es können drei Analysen durchgeführt werden: Nachweis von neuen Läsionen, Geschwindigkeit des Erscheinens aktiver Läsion, Prozentanteiländerung in der Läsionsfläche (Paty et al., Neurology 43: 665, 1993). Eine Verbesserung bedingt durch die Therapie wird etabliert, wenn es eine statistisch signifikante Verbesserung in einem individuellen Patienten ergibt im Vergleich zur Basislinie oder in einer behandelten Gruppe gegenüber einer Placebogruppe.
Kandidatenpatienten zur Prävention können durch die Gegenwart genetischer Faktoren bestimmt werden. Zum Beispiel hat eine Mehrheit der MS-Patienten HLA-Typ DR2a und DR2b. Die MS-Patienten mit genetischen Dispositionen für MS, die zur Behandlung geeignet sind, fallen in zwei Gruppen. Erstere sind Patienten mit früher Erkrankung des Rückfalltyps. Eingangskriterien würden Erkrankungsdauer von mehr als einem Jahr, eine EDSS-Bewertung von 1,0 bis 3,5, Verschlechterungsrate von mehr als 0,5 pro Jahr und eine Freiheit von klinischen Verschlechterungen von zwei Monaten vor der Studie umfassen. Die zweite Gruppe würde Leute mit Erkrankungsprogression von mehr als 1,0 EDSS-Einheit/Jahr über die letzten zwei Jahre umfassen.
Die Wirksamkeit des Peptidanalogons im Kontext der Erfindung wird basierend auf den folgenden Kriterien bewertet: Häufigkeit der MBP-reaktiven T-Zellen, die durch eingeschränkte Verdünnung bestimmt wird, Proliferationsreaktion auf MBP-reaktive T-Zelllinien und Klone, Cytokinprofile von T-Zelllinien und Klone von MBP, die aus Patienten etabliert werden. Die Wirksamkeit wird durch die Verringerung in der Häufigkeit reaktiver Zellen, eine Verringerung in der Thymidinaufnahme mit verändertem Peptid im Vergleich zu Nativem und eine Verringerung in TNF und IFN-α etabliert. Klinische Messungen umfassen die Rückfallgeschwindigkeit in ein oder zwei Jahresintervallen und eine Veränderung in EDSS, einschließlich der Progressionszeit von der Basislinie von 1,0 Einheiten auf der EDSS, die sechs Monate andauert. Auf einer Kaplan-Meier-Kurve, zeigt eine Verzögerung in der andauernden Progression der Behinderung eine Wirksamkeit an. Andere Kriterien umfassen eine Änderung in der Fläche und dem Volumen der T2-Bilder auf dem MRI und die Anzahl und das Volumen von Läsionen, die durch Gadolinium-verstärkte Bilder bestimmt werden.
Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung können entweder allein oder als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden. In Kürze, pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere der Peptidanaloga, die hierin beschrieben werden, umfassen, in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch oder physiologisch erträglichen Trägermitteln, Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen. Solche Zusammensetzungen können Puffer wie neutral gepufferte Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung und ähnliche, Kohlenhydrate wie Glucose, Mannose, Sucrose oder Dextrane, Mannitol, Proteine, Polypeptide oder Aminosäuren wie Glycin, Antioxidanzien, chelatisierende Mittel wie EDTA oder Glutathion, Adjuvanzien (z. B. Aluminiumhydroxid) und Konservierungsmittel umfassen. Zusätzlich können pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch einen oder mehrere zusätzliche aktive Inhaltsstoffe enthalten, wie z. B. Cytokine wie β-Interferon.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können für die Art der angezeigten Verabreichung formuliert werden, einschließlich z. B. zur oralen, nasalen, venösen, intracranialen, intraperitonealen, subkutanen oder intramuskulären Verabreichung. Innerhalb anderer Ausführungsformen der Erfindung, können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen als Teil eines langsam freisetzenden Implantats verabreicht werden. In noch weiteren Ausführungsformen können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Lyophilisat unter Verwendung geeigneter Hilfsstoffe, die eine Stabilität als Lyophilisat zur Verfügung stellen können, und zur anschließenden Rehydrierung formuliert werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer Weise verabreicht werden, die für die zu behandelnde Krankheit (oder zu verhindernde) geeignet ist. Die Menge und Häufigkeit der Verabreichung wird durch solche Faktoren zu bestimmen sein, wie der Zustand des Patienten und die Art und Schwere der Erkrankung des Patienten. Innerhalb bestimmter bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung kann das Peptidanalogon oder die pharmazeutische Zusammensetzungen, die hierin beschrieben werden, in einer Dosierung im Bereich von 5 bis 50 mg/kg verabreicht werden, obwohl geeignete Dosierungen durch klinische Versuche bestimmt werden können. Patienten können auf therapeutische Wirksamkeit durch MRI, EDSS und Zeichen einer klinischen Verschlechterung, wie sie oben beschrieben werden, beobachtet werden.
Die folgenden Beispiele werden im Wege der Illustration und nicht im Wege der Einschränkung angeboten.
BEISPIEL 1
Herstellung der Peptide
Die Peptide wurden durch das Festphasenverfahren auf einem Peptidsynthetisiergerät (Beckmann Modell Nr. 990) synthetisiert. Peptide mit einem amidierten Carboxylterminsus wurden mit einem p-Methylbenzhydrylaminharz (MBHA-Harz) hergestellt; für Peptide mit einem freien Carboxyterminus wurde ein mit der geeigneten geschützten Aminosäure gekoppeltes Merrifield-Harz verwendet. Beide Harze wurden von Bachem Fine Chemicals (Torrance, CA) erworben. Derivatisierte Aminosäuren (Bachem Fine Chemicals), die in der Synthese verwendet wurden, hatten die L-Konfiguration, es sei denn, dieses wird anderweitig zum Ausdruck gebracht, und die N-α-Aminofunktion wurde ausschließlich mit der t-Butyloxycarbonylgruppe geschützt. Die funktionellen Seitenkettengruppen wurden wie folgt geschützt: Benzyl für Serin, Threonin, Glutaminsäure und Asparaginsäure; Tosyl für Histidin und Arginin; 2-Chlorbenzyloxycarbonyl für Lysin und 2,6-Dichlorbenzyl für Tyrosin. Die Kopplung der carboxyterminalen Aminosäure an den MB-HA-Harz wurde mit Dicyclohexylcarbodiimid durchgeführt und die anschließenden Aminosäuren wurden mit Dicyclohexylcarbodiimid gemäß Ling et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4302, 1984) gekoppelt. Nachdem die letzte Aminosäure eingebracht worden war, wurde die t-Butoxycarbonylschutzgruppe entfernt und das Peptid-Harz-Konjugat mit einer Mischung aus 14 ml Wasserstofffluorsäure (HF), 1,4 ml Anisol und 0,28 ml Methylethylsulfid pro Gramm Harzkonjugat bei –20°C für 0,5 St. und bei 0°C für 0,5 St. behandelt. HF wurde im Vakuum bei 0 entfernt und das resultierende Peptid und die Harzmischung wurden zweimal mit Diethylether und alternativ dazu zweimal mit Chloroform und Diethylether gewaschen. Das Peptid wurde fünf Mal mit 2 M Essigsäure extrahiert und der Extrakt lyophylisiert. Das lyophylisierte Produkt wurde zuerst auf einer Sephadex G-25 fine (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) aufgereinigt, in 30% Essigsäure entwickelt, um die trunkierten Fragmente und anorganischen Salze zu entfernen (Ling et al., 1984). Danach wurden die Peptide weiter durch CM-32 Carboxymethylcellulose Kationaustauschchromatographie (Ling et al., 1984) aufgereinigt. Die endgültige Aufreini gung wurde durch Partitionschromatographie auf Sephadex G-25 fine (Ling et al., 1984) erreicht. Das synthetische Produkt wurde durch Aminosäureanalyse, massenspektroskopische Analyse und Umkehrphasen-HPLC charakterisiert.
BEISPIEL 2
Immunisierungen und EAE-Induktion
MBP-Peptid und Peptidanaloga wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) aufgelöst und mit einem gleichen Volumen an unvollständigem Freund's Adjuvanz emulgiert, das mit 4 mg/ml hitzeinaktiviertem Mycobacterium tuberculosis H37Ra in Öl (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI) supplementiert worden war. Ratten wurden subkutan an der Basis des Schwanzes mit 0,1–0,2 ml immunisiert, die 500 μg des Peptids in der Emulsion enthalten und täglich auf klinische Anzeichen untersucht. EAE wurde auf einer Skala von 0–4 wie folgt bewertet: 0, klinisch normal; 1, geschwächter Schwanz; 2, Hinterbeinschwäche; 3, Hinterbeinparalyse; 4, Vorder- und Hinterbeine sind betroffen.
BEISPIEL 3
Langzeit T-Zelllinien
Antigenspezifische Langzeit T-Zelllinien wurden unter Verwendung des Verfahrens, das durch Ben-Nun et al. (Eur. J. Immunol. 11: 195, 1981) entwickelt wurde, hergestellt. Lewis-Ratten wurden mit MBP (87–99) oder MBP (83–99) wie oben beschrieben injiziert. Neun bis zehn Tage später wurden ablaufende Lymphknotenzellen (10⁷/ml) für 5–8 Tage in Stimulationsmedium (Dulbecco's modified Eagle's medium, supplementiert mit 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum (Hyclon Laboratories, Logan, UT) zusammen mit 10–20 μM des MBP (87–99) Peptids und 15 U/ml IL-2 kultiviert. Nach 5 bis 8 Tagen Kultur wurden überlebensfähige Zellen an der Zwischengrenze nach Ficoll-Hypaque Abtrennung gesammelt und dreimal gewaschen. Diese Zellen wurden bei 1 × 10⁷ Zellen/ml in Medium mit 5 × 10⁵ bestrahlten (3000 Rad) autologen Milzzellen als Hilfszellen und 10–20 μM MBP (87–99) rekultiviert. Nach 5 bis 6 Stimulationszyklen wurden die Platten auf die Fähigkeit der Zellen untersucht, in Reaktion auf MBP (87– 99) zu proliferieren. Positive Linien wurden in 24-Well Flachbodenplatten transferiert und erneut stimuliert.
BEISPIEL 4
MHC-Bindungsassay
Die Fähigkeit von MBP-Peptiden und Peptidanaloga, MHC zu binden, wurde gemessen. Ein Assay, der die Bindung der Peptide an MHC-Moleküle auf Antigen- präsentierenden Zellen (APC) charakterisiert, wurde eingesetzt (Mozes et al., EMBO J. 8: 4049, 1989; Gautam et al., PNAS 91: 767, 1994). Milzzellen wurden für drei Stunden in Dulbecco's modified Eagle's Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum (Hyclone Laboratories, Logan, UT) supplementiert worden war, in Standard-Polystyrolpetrischalen (100 × 15 mm) in einem 37°C Inkubator, der 6,5% CO₂ enthält, kultiviert. Danach wurden nicht haftende Zellen entfernt und die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen. Haftende Zellen wurden unter Verwendung eines Zellspachtels gesammelt. Die Bindung der MBP (87–99) Analoga wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzassays gemessen. In Kürze, es wurden 5 × 10⁵ haftende Milzzellen in Färbepuffer (PBS, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin) mit verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 0–400 μM MBP-Analoga in Einzelwells von U-geformten 96 Well Mikrotiterplatten vermischt und für eine Stunde bei 37°C in einem 6,5% CO₂-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 μM Biotin-markiertes MBP natives Peptid zu den Kultur-Wells für eine Stunde hinzugefügt. Die Zellen wurden drei Mal mit dem Färbepuffer gewaschen. Phycoerythrin-konjugiertes- oder Fluoreszenz-konjugiertes Streptavidin (Becton Dickinson, San Jose, CA) wurde als Reagenz des zweiten Schrittes hinzugefügt (1 μg/Well) zusammen mit 1 μg/Well fluorochrommarkiertem OX-6- oder OX-17- monoklonalen Antikörpern (Pharmingen, San Diego, CA), die jeweils mit Ratten MHC-Klasse II I-A oder I-E reagieren. Die Zellen wurden zwei Mal vor der cytofluorometrischen Analyse auf einem FACScan (Becton Dickinson) gewaschen. Die Fluoreszenzintensität wurde für jede Probe durch das Abziehen der Fluoreszenz, die aus OX-positiven Zellen erhalten wurde, die mit Phycoerythrin-Streptavidin allein gefärbt wurden (Kontrollfärbung) von der Fluoreszenz, die mit OX-positiven Zellen erhalten wurde, die mit Biotin-markiertem MBP plus Phycoerythrin-Streptavidin gefärbt wurden, berechnet. Die Prozenthemmung wurde für jedes Analogon berechnet und als IC₅₀-Werte ausgedrückt.
Das Peptidanalogon h88/A91, das D-Histidin in Position 88 und Alanin in Position 91 enthält, kompetierte genauso wirksam wie MBP (87–99) um das MHC gegen MBP (87–99). Bei 200 μM hemmte MBP (87–99) die Bindung um 68,4% und h88/A91 hemmte die Bindung um 67,64%. Bei 100 μM hemmte MBP (87–89) die Bindung um 40% und a83, A89, A91 hemmte die Bindung um 25%.
BEISPIEL 5
Antigenspezifischer Lymphknotenzellproliferationsassay
Weibliche Lewis-Ratten im Alter von ungefähr sechs Wochen wurden von Harlan Sprague, Indianapolis, erworben. MBP-Peptide wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) aufgelöst und mit einem gleichen Volumen an vollständigem Freund's Adjuvanz (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI), supplementiert mit 2 mg/ml hitzeinaktiviertem mycobacterium tuberculosis H37Ra in Öl (Difco) emulgiert. Ratten wurden subkutan in die Basis des Schwanzes mit 0,1 ml immunisiert, das 100 μg des Peptids in der Emulsion enthält. Neun bis zehn Tage nach der Immunisierung wurden die Ratten geopfert, der Lymphknoten entfernt und eine Einzelzellsuspension hergestellt. Die Zellen wurden auf 5 × 10⁶ Zellen pro ml in Stimulationsmedium resuspendiert, das Dulbecco's modified Eagle's Medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) enthält, supplementiert mit 2 Mercaptomethanol (5 × 10^–5 M), L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin (100 μg/ml), Streptomycin (100 μg/ml), und 1% normalem Rattenserum.
Für den Assay wurden 100 μl der Lymphknotenzellsuspension zu 96-Well Flachbodenplatten in der Gegenwart eines gleichen Volumens an Medium hinzugefügt, das 10 μM verschiedener Peptide enthält (einschließlich: Motilin als negative Kontrolle; MBP87–99; nur Medium oder Alanin oder D-Aminosäure an Position 91, 95 oder 97 substituiert). Die Kulturen wurden dann bei 37°C in befeuchteter Luft inkubiert, die 7,5% CO₂ enthält. Nach drei Tagen Inkubation wurde 1 μCi tritiertes Thymidin (20 Ci/mM; New England Nuclear) zu jedem Well hinzugefügt und die Platten wurden für weitere 12–16 Stunden reinkubiert. Die Platten wurden dann mit einem Matrix Filtermate Harvester (Packard) geerntet und unter Verwendung eines Automatic Direct Beta Counter (Pa ckard) gezählt. Durchschnittliche Cpm (Cpm) und die Standardabweichung vom Durchschnitt wurden aus Dreifachwells berechnet.
Wie in 2 zu sehen ist, stimulierte MBP (87–99) Lymphknotenzellen im Vergleich zu den Peptidanaloga. Alaninveränderungen in den Positionen 95 und 97 und D-Aminosäureveränderungen in den Resten 91, 95 und 97 versagten dahingehend, Zellen oberhalb des Kontrollpeptids Motilin zu stimulieren.
BEISPIEL 6
Antigenspezifischer T-Zelllinienproliferationsassay
Assays für den antigenspezifischen Proliferationsassay von T-Zelllinien wurden in 96-Well-Flachbodenmikrotiterplatten wie beschrieben durchgeführt (Zamvil et al., Nature 317: 355–358, 1985; Offner et al., J. Immunol. 148: 1706–1711, 1992; Gold et al., J. Immunol. 148: 1712–1717, 1992; Karin et al., J. Exp., Med. 180: 2227–2237, 1994). T-Zelllinien wurden wie in Beispiel 3 beschrieben etabliert. Eine erste 1 : 10 Verdünnung einer 1,5 mM Stammlösung MBP oder der Peptidanaloga wurde in Zellkulturmedium gegeben. Die Proben wurden durch dreifache Serienverdünnungen (Endvolumen 100 μl) verdünnt. Die darauf reagierenden kontinuierlichen T-Zellen wurden auf 4 × 10⁵ Zellen pro ml resuspendiert und 50 μl Proben wurden zu jedem Well (5 × 10⁴ Zellen pro Well) hinzugefügt. Ungefähr 1 × 10⁶ bestrahlte (3000 R) Milzzellenfutterzellen wurden auch zu jedem Well hinzugefügt. Die Kulturen wurden dann bei 37°C in befeuchteter Luft, die 7,5% CO₂ enthält, für drei Tage inkubiert. 12 bis 16 Stunden vor dem Ernten wurde 0,5–1,0 μCi [³H]-Thymidin (20 Ci/mM; New England Nuclear) zu jedem Well hinzugefügt und die Kulturen reinkubiert. Die Platten wurden dann mit einem Matrixfiltermate Harvester (Packard) geerntet und unter Verwendung eines Automatic Direct Beta Counters (Packard) gezählt. Durchschnittliche Cpm und die Standardabweichung vom Durchschnitt wurden aus Dreifachwells berechnet.
Wie in den 3, 4 und 5 zu sehen ist, versagte ein Analogon mit einer Substitution in Position 91, 95 oder 97 dahingehend, die Proliferation einer MBP (87–99)-reaktiven T-Zelllinie zu stimulieren. Die Wirkung war dramatisch, weil sogar 150 μM des Peptid analogons 1 bis 2 Logarithmen weniger wirksam in der Bewirkung einer Proliferation war.
BEISPIEL 7
Antagonismus des T-Zellproliferationsassays
T-Zellantagonismus wurde in einem vorgepulsten Proliferationsassay, wie er durch De Magistris et al. (Cell 58: 625, 1992) beschrieben wird, mit kleinen Änderungen nachgewiesen. Antigen- präsentierende Milzzellen wurden γ-bestrahlt (3000 Rad) und unter Schütteln bei einer Konzentration von 10⁷ Zellen/Well mit 0,2– 2,0 μM des nativen Peptids MBP (87–99) in Stimulationsmedium in 10 ml Gewebekulturplatten 2 bis 4 Stunden bei 37°C in befeuchteter Luft, die 6,5% CO₂ enthält, inkubiert. Milzzellen wurden dann gewaschen und bei einer Konzentration von 5 × 10⁵ Zellen/Well in U-förmigen 96 Well Mikrotiterplatten zusammen mit 5 × 10⁴ ruhenden MBP (87–99) reaktiven T-Zellen rekultiviert. Verschiedene Konzentrationen der antagonistischen Peptide im Bereich von 5–50 μM wurden für weitere 72 Stunden hinzugefügt. Jedes Well wurde mit 0,5–1 μCi [³H]-Thymidin (spezifische Aktivität von 10 Ci/mmol) für die letzten 12 bis 16 Stunden gepulst. Die Kulturen wurden dann auf Fiberglasfiltern geerntet und die proliferative Reaktion als CPM ± SEM ausgedrückt.
Die in 6 gezeigten Daten zeigen, dass das doppelt veränderte Peptidanalogon h88/A91 und das dreifach veränderte Peptidanalogon h88/A91/p99 die Proliferation einer MBP-reaktiven T-Zelllinie wesentlich hemmten. Das dreifach veränderte Analogon bewirkte eine Hemmung bei 50 μM und höherer Konzentration, während das zweifach geänderte Analogon eine Hemmung bei 150 μM bewirkte.
BEISPIEL 8
Behandlung von 87–99 induzierter EAE in Lewis-Ratten
Weibliche Lewis-Ratten im Alter von 6–8 Wochen wurden mit 500 μg MBP (87–99) in CFA, das 500 μg Mycobacterium tuberculosis enthält, in die Basis des Schwanzes in einem 200 μl Volumen injiziert. Die Ratten wurden in Gruppen von 5 aufgeteilt. Die Kontrollgruppe erhielt 0,5 ml PBS und die Behandlungsgruppe erhielt h88/A91-Peptidanalogon (1 mg/5 ml PBS) interperitoneal zwei Mal an den Tagen 9 und 10 nach der Immunisierung. Die Tiere wurden auf einer täglichen Basis auf Erkrankungssymptome untersucht. EAE wurde mit der folgenden Skala dokumentiert: 0, keine Symptome; 1, Schwanzparalyse; 2, Hinterbeinschwäche; 3, Hinterbeinparalyse; 4, Hinter- und Vorderbeine sind betroffen.
Die Daten aus zwei verschiedenen Experimenten wurden als mittlere kumulative Bewertung von 5 Tieren (7) erhalten. Nicht behandelte Kontrolltiere entwickelten einen höheren Erkrankungsgrad, wohingegen das h88/A91-Analogon des MBP-Peptids 87–99 in zwei Experimenten in der Verhinderung der Entwicklung von EAE wirksam war. Obwohl das Analogon erst kurz vor dem Anfang offensichtlicher Symptome gegeben wurde, war es in der Lage, die Entwicklung von EAE zu beenden.
BEISPIEL 9
Induktion der EAE durch Peptidanalogon
Die Fähigkeit der Peptidanaloga, EAE zu bewirken, wird in vivo untersucht. Ratten wurden mit MBP (87–99) oder h88/A91-Peptidanalogon wie in Beispiel 2 beschrieben, injiziert. Die Tiere wurden täglich auf Anzeichen von EAE hin untersucht. Ratten, die MBP (87–99) erhalten, hatten eine 100%ige Inzidenz (18/18 Ratten) an EAE mit einer durchschnittlichen maximalen klinischen Bewertung von 2,4 ± 0,2. Im Gegensatz dazu hatten 0/12 Ratten, die das Peptidanalogon h88/A91 erhalten hatten, EAE. Daher induziert dieses Peptidanalogon EAE nicht.
BEISPIEL 10
Behandlung von EAE mit Peptidanaloga
Das 91 K > A Peptidanalogon ist in der Lage, den adoptiven Transfer der Erkrankung durch T-Immunzellen in dem Lewis-Rattenstamm (Karin et al. 1994) zu hemmen. Eine weitere Charakterisierung der Wirkungen der APL auf das Immunsystem wurde in Lewis-Ratten untersucht, die mit HBP injiziert worden waren.
In diesem System wurde eine experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE) in zwölf weiblichen Lewis-Ratten durch Injektion von MBP (83–99) Peptid in vollständigem Freund's Adjuvanz (CFA) an der Basis des Schwanzes, ausgelöst. Neun Tage danach wurden die Ratten in zwei Gruppen von sechs Tieren aufgeteilt und subkutan mit 13,2 mg/kg von entweder dem Peptidanalogon oder einem Kontrollpeptid, Pottwalmyoglobi, (SWM) (110–121) injiziert. Die Tiere wurden täglich auf Erkrankungssymptome untersucht und in einer Blindstudienweise auf einer nicht linear steigenden Skala von 0 bis 4 mit Inkrementen bewertet, die eine steigende Paralyse darstellen. Jede einzelne Bewertung wurde mit der Gruppe vermittelt, um die durchschnittliche klinische Bewertung zu erhalten. Die Ergebnisse aus einem solchen Experiment werden in 9 gezeigt.
Wie in 9 zu sehen ist, betrug die Erkrankungsschwere in solchen Tieren, die mit dem APL NBI-5788 (8) behandelt wurden, ungefähr eine 50%ige Verringerung im Vergleich zu der Kontrollgruppe. 10 zeigt die durchschnittliche Erkrankungsschwere der Ergebnisse aus drei separaten Therapieexperimenten. Das APL NBI-5788 verringerte signifikant die Schwere und Dauer der Erkrankung in diesem Modellsystem. 11 zeigt die Ergebnisse der Behandlung unter Verwendung eines anderen APLs, NBI-5765 (8). Dieses APL verringert auch signifikant die Stärke der Erkrankung in der behandelten Gruppe im Vergleich zu Kontrolltieren.
Obwohl diese Ergebnisse eindeutig anzeigen, dass APL die Entwicklung von EAE hemmt, wurde auch ein murines Tiermodellsystem der EAE entwickelt. Die SJL/J (H-2⁵) Maus entwickelt eine chronisch wiederkehrende Form von EAE als Reaktion auf die Immunisierung mit MBP (83–99) Peptid in der Gegenwart von Pertussisvakzin. Die Fähigkeit der Peptidanaloga NBI-5719 und NBI-5765, die Krankheit zu hemmen, wurde untersucht (siehe 12).
Gruppen von 10 Tieren wurden intraperitonial wöchentlich für 4 Wochen 20 mg/kg von entweder einem Kontrollpeptid oder dem Peptidanalogon injiziert. Die Tiere wurden dann auf die Krankheit hin über die 2–3 Monate beobachtet. Wie in 12 zu sehen ist, entwickelten SJL/J-Mäuse Symptome von EAE, beginnend ungefähr am Tag 20 in der Kontrollgruppe, die ungefähr 3 Wochen andauerte. Angefangen am Tag 70 kam es zu einem Rückfall, der eine durchschnittliche klinische Bewertung von ungefähr 1 erreichte. Jedoch reduzierte die wöchentliche Injektion mit dem APL NBI-5765 oder NBI-5719 für vier Wochen nicht nur die Stärke der Erkrankung in der ersten Phase, sondern auch die Schwere des Rückfalls. Dieses ist besonders erstaunlich, da die Tiere dem APL für ungefähr einen Monat nicht ausgesetzt waren.
BEISPIEL 11
Wirkungen der Peptidanaloga auf die menschliche T-Zellproliferation
Es wurde die Fähigkeit der Peptidanaloga NBI-5719, 5748, 5765, 5788 und 5789, die menschliche T-Zellproliferation zu beeinflussen, untersucht. Eine konstante Menge an Peptidanalogon oder des Kontrollpeptids SWM (50 μM) wurde mit verschiedenen Konzentrationen des nativen MBP (83–99) Peptids (1,1–30 μM) in der Gegenwart von bestrahlten DR passenden, peripheren Blutzellen und T-Zellklonen, die aus verschiedenen MS-Patienten abgeleitet worden waren, kultiviert. Menschliche T-Zellen (1 × 10⁶) wurden mit DR passenden, bestrahlten, peripheren Blutzellen (PBL, 5 × 10⁶) in Medium kultiviert, das IMDM enthält, das mit 3 μM MBP 83–99, 2 mM L-Glutamin, 50 μg/ml Gentamicin/Pennicillin/Streptomycin, 100 U/ml rIL 2 und 10% menschlichem AB-negativen Serum supplementiert ist. Die Zellen wurden für ungefähr 60 Stunden kultiviert, mit tritiertem Thymidin für 12 Stunden pulsbehandelt und geerntet. Die Menge an aufgenommenem tritierten Thymidin wurde gemessen und die Daten wurden als Durchschnitt plus oder minus der Standardabweichung vom Durchschnitt der Wiederholungsproben dargestellt. Repräsentative Ergebnisse werden in den 13 und 14 gezeigt.
Wie in 13 zu sehen ist, hemmte das Peptidanalogon NBI-5788, das mit MBP (83 –99) (83E > a, 84N > K, 89F > L und 91 K > A) korrespondiert, die Fähigkeit eines menschlichen Dr2a-eingeschränkten T-Zellklons, auf verschiedene Konzentrationen von MBP (83–99) zu reagieren, wobei das irrelevante Peptid (Pottwalmyoglobin, SWM 110–121) wenig Wirkung auf die proliferative Kapazität der T-Zellen hatte. 14 zeigt, dass alle Peptide die Fähigkeit der Dr2a-eingeschränkten T-Zellen hemmten, auf native MBP-Peptide in einer konzentrationsabhängigen Weise zu reagieren.
Die Stärke von NBI-5788 wurde dann durch verschiedene Konzentrationen des APL (2, 10 oder 50 μM) in der Gegenwart verschiedener Mengen an nativem MBP (83–99) (1,1–30 μM) bestimmt. Wie in 15 zu sehen ist, ändert NBI-5788 sowohl bei 10 wie auch bei 50 μM die Fähigkeit der Dr2a-T-Zelllinie, auf MBP (83–99) zu reagieren, es wurde jedoch keinerlei signifikante Hemmung mit dem irrelevanten Peptid SWM beobachtet.
Es wurde die Fähigkeit des Peptidanalogons, die proliferative Reaktion auf MBP-reaktive T-Zellen zu hemmen, die aus Dr2b (DrB1*1501) Individuen isoliert worden waren, bestimmt. Eine konstante Menge an NBI-5788 (50 μM) wurde mit verschiedenen Konzentrationen des nativen Peptids (1,1–30 μM) in der Gegenwart bestrahlter DR passender, peripherer Blutzellen und T-Zellklone, die aus verschiedenen MS-Patienten abgeleitet worden waren, kultiviert.
16, 17 und 18 zeigen die Ergebnisse unter Verwendung von drei verschiedenen T-Zelllinien. Jeder T-Zellklon variiert in der Menge des aufgenommenen Thymidins als Reaktion auf das MBP-Peptid. Nichtsdestotrotz hemmte NBI-5788 die Fähigkeit der T-Zellklone, auf das MBP-Peptid in einer konzentrationsabhängigen Weise zu reagieren. Das irrelevante Peptid SWM hatte wenig Einfluss auf die Fähigkeit der T-Zellen, auf das MBP-Peptid zu reagieren.
19 zeigt die Fähigkeit von NBI-5719, NBI-5748, NBI-5765, NBI-5788 und NBI-5789, die MBP-abhängige Proliferation des Dr2b-eingeschränkten, menschlichen T-Zellklons 5F6 zu hemmen. Wie oben mit den Dr2b-eingeschränkten T-Zellen (14) zu sehen ist, hemmte das APL die MBP-abhängige Proliferation in einer konzentrationsabhängigen Weise. Jedoch hatte das Kontrollpeptid SWM wenig Wirkung auf die proliferative Reaktion.
20 zeigt die Fähigkeit von NBI-5719 und NBI-5765, die MBP- abhängige Proliferation des Dr4 Dw4 eingeschränkten menschlichen T-Zellklons MS-1 zu hemmen. Wie oben mit den Dr2-eingeschränkten T-Zellen zu sehen ist, hemmte das APL die MBP-abhängige Proliferation in einer konzentrationsabhängigen Weise.
Die Fähigkeit des Peptidanalogonliganden, die Cytokin-Produktion zu beeinflussen, wurde danach gemessen. Der Dr2b-eingeschränkte T-Zellklon 5F6 wurde in der Ge genwart von 3 μM MBP-Peptid mit entweder 10 μM NBI-5788 oder SWM oder nur Medium inkubiert. Als eine Kontrolle wurden Zellen in der Gegenwart von Medium allein inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Überstände entfernt und die Mengen an Tumornektrosefaktor alpha (TNF-α) und Interferon-γ (IFN-γ) unter Verwendung kommerziell verfügbarer EIA-Kits bestimmt.
Wie in 21 zu sehen ist, stimulierte MBP die Produktion von sowohl TNF-α wie auch IFN-γ (jeweils ungefähr 200 und 160 pg/ml). Jedoch hemmte der Peptidanalogonligand NBI-5788 dramatisch die Produktion von beiden proentzündlichen Cytokinen auf ungefähre die Mengen, die mit Medium allein zu erzielen sind. Das irrelevante Peptid SWM hatte eine minimale Wirkung auf die Cytokinproduktion. Sogar bei Konzentrationen von 50 μM stimulierte keines der Peptidanaloga NBI-5719, NBI-5748, NBI-5765, NBI-5788 oder NBI-5789 die Cytokinproduktion oberhalb des Hintergrunds (Daten werden nicht gezeigt).

Claims

Peptidanalogon, umfassend mindestens sieben aufeinanderfolgende Aminosäuren, ausgewählt aus den Resten 86 bis 99 von menschlichem Myelin basischen Protein aus 1, einschließlich Rest 91, wobei das L-Lysin an Position 91 zu einer anderen Aminosäure verändert ist, oder Rest 97, wobei das L-Arginin an Position 97 zu einer anderen Aminosäure verändert ist, oder Rest 95, wobei das L-Threonin an Position 95 zu einer anderen Aminosäure verändert ist, und wobei das Peptidanalogon 2 bis 5 Veränderungen zu einer Aminosäure anders als die Aminosäuren, die in dem nativen Protein an der Position vorhanden sind, enthält, und wobei das Peptidanalogon a) um die Bindung von nativem MBP Peptid an MHC kompetetiv ist, b) nicht die Zellteilung einer MBP (87–99) reaktiven T-Zellinie verursacht, und c) die Induktion von experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE) durch MBP (87–99) in Nagern inhibiert.
Peptidanalogon nach Anspruch 1, umfassend 7 bis 12 Aminosäuren.
Peptidanalogon nach Anspruch 1 oder 2, wobei das L-Lysin an Position 91 oder das L-Arginin an Position 97 zu einer anderen Aminosäure verändert ist, weiter umfassend Verändern von einem bis drei weiteren Resten, ausgewählt aus Resten 86–90, 92–96, 98 und 99 zu einer anderen Aminosäure.
Peptidanalogon nach Anspruch 1 oder 2, wobei das L-Threonin an Position 95 zu einer anderen Aminosäure verändert ist, weiter umfassend Verändern von einem bis drei weiteren Resten, ausgewählt aus Resten 86–90, 92–94 und 96–99, von Resten 86–94, 96,98 und 99 zu einer anderen Aminosäure.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei 1 bis 3 L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Valin an Position 86, Valin an Position 87, Histidin an Position 88, Threonin an Position 95, Threonin an Position 98 und Prolin an Position 99 zu einer Aminosäure anders als die Aminosäure verändert sind, die in dem nativen Protein an dieser Position vorhanden ist.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Rest 91 zu Alanin verändert ist.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Rest 95 zu Alanin verändert ist.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Rest 97 zu Alanin verändert ist.
Peptidanalogon nach den Ansprüchen 6,7 oder 8, wobei mindestens einer von Rest 87 zu D-Valin verändert ist, Rest 88 zu D-Histidin verändert ist und Rest 99 zu D-Prolin verändert ist.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei Rest 88 zu einer Aminosäure verändert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Serin, Glutaminsäure, Tyrosin, Leucin, D-Histidin, Glutamin, Phenylalanin und Lysin.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die N-terminale Aminosäure und die C-terminale Aminosäure zu einer anderen Aminosäure verändert sind, so dass nach der Verabreichung des Peptidanalogons in vivo eine Proteolyse verringert wird.
Peptidanalogon nach Anspruch 11, wobei die N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäuren D-Aminosäuren sind.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei L-Lysin an Position 91 zu einer nicht-konservativen Aminosäure verändert ist.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei Rest 91 zu einer Aminosäure verändert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Asparagin, Histidin, Leucin, Serin, Glycin, Glutaminsäure, Phenylalanin, Alanin und D-Ly-sin.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das L-Threonin an Position 95 zu einer nicht-konservativen Aminosäure verändert ist.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und 15, wobei Rest 95 zu einer Aminosäure verändert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alanin, D-Threonin, Glycin, Isoleucin, Tyrosin, Glutamin, Serin, Lysin, Glutaminsäure und Histidin.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das L-Arginin an Position 97 zu einer nicht-konservativen Aminosäure verändert ist.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und 17, wobei der Rest 97 zu einer Aminosäure aus der Gruppe bestehend aus D-Alanin, D-Arginin, Glycin, Lysin, Glutamin, Glutaminsäure, Threonin, Leucin, Phenylalanin, Histidin und Alanin verändert ist.
Peptidanalogon nach Anspruch 1, umfassend Reste 83 bis 99 von menschlichem Myelin basischen Protein von 1, wobei das L-Lysin an Position 91 zu einer anderen Aminosäure verändert ist und zwei bis vier zusätzliche L-Aminosäuren, ausgewählt aus Resten 83 bis 90 und 92 bis 99 zu einer Aminosäure verändert sind, die anders ist, als die in dem nativen Protein an dieser Position vorhandene Aminosäure.
Peptidanalogon nach Anspruch 19, wobei L-Lysin an Position 91 zu Alanin verändert ist.
Peptidanalogon nach Anspruch 19 oder 20, eine Substitution von Phenylalanin an Position 89 mit einer anderen Aminosäure einschließend.
Peptidanalogon nach Anspruch 19, 20 oder 21, wobei die N-terminale Aminosäure und/oder C-terminale Aminosäure zu einer anderen Aminosäure verändert ist.
Peptidanalogon nach Anspruch 92, wobei die N-terminale Aminosäure und/oder C-terminale Aminosäure zu einer D-Aminosäure verändert ist.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei mindestens eine der zusätzlichen L-Aminosäuren, ausgewählt aus Resten 83 bis 90 und 92 bis 99, mit einer geladenen Aminosäure substituiert ist.
Peptidanalogon nach Anspruch 1, umfassend mindestens sieben aufeinanderfolgende und nichtveränderte Aminosäuren, ausgewählt aus den Resten 86 bis 99 von menschlichem Myelin basischen Protein, wobei das L-Lysin, das Position 91 entspricht, zu einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Asparagin, Histidin, Leucin, Serin, Glycin, Glutaminsäure, Phenylälanin, Alanin und D-Lysin verändert ist, und wobei die N-termina-le Aminosäure und/oder die C-terminale Aminosäure zu einer anderen Aminosäure verändert ist, so dass nach der Verabreichung des Peptidanalogons in vivo die Proteolyse verringert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptidanalogon nach einem der voranstehenden Ansprüche in Kombination mit einem physiologischen akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 25 zur Verwendung bei der Behandlung von multipler Sklerose.