DE69331501T2

DE69331501T2 - Unterdrückung der Proliferation von T-Zellen mittels Peptidfragmenten des basischen Proteins aus Myelin

Info

Publication number: DE69331501T2
Application number: DE69331501T
Authority: DE
Inventors: Ahmad Al-Sabbagh; David Allen Hafler; Ariel Miller; Howard M. Weiner
Original assignee: Autoimmune Inc
Current assignee: Autoimmune Inc
Priority date: 1992-04-09
Filing date: 1993-04-09
Publication date: 2002-08-29
Anticipated expiration: 2013-04-10
Also published as: NO943755L; JPH08500083A; AU680824B2; ES2172044T3; JP3434510B2; EP0650498A1; KR100295606B1; ATE170874T1; EP0650498A4; IL105347A0; DE69320967T2; EP0863155A1; AU4282493A; PT863155E; BR9306272A; WO1993021222A1; KR950700934A; CA2133749A1; EP0863155B1; NO317049B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die aus dem gesamten Fragment 84-10² von hMBP oder einem Teil davon bestehen, diese Peptide enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen und Verwendungen der Peptide.

Hintergrund der Erfindung

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische Entzündungskrankheit der weißen Hirn- und Rückenmarkssubstanz des menschlichen zentralnervösen Systems, und es wird angenommen, daß sie Autoimmunätiologie besitzt. Abgesehen von ihrer Ätiologie wird MS von Autoimmunangriff auf das Nervengewebe begleitet. Zum Beispiel ist die Krankheit durch auffällige T-Zell- und Makrophageninfiltrate in Nervengewebe (d. h. das Gehirn, Rückenmark, periphere Nerven oder assoziierte Zelltypen), Demyelinisierung und neurologischer Dysfunktion charakterisiert. Myelin Basisches Protein (MBP) ist von den gegenwärtigen Erfindern, ihren Mitarbeiten und anderen ausgiebig als ein Autoantigen in der Krankheit studiert worden, sowohl wegen seiner Rolle als ein induzierendes Mittel in dem Haupttiermodell von MS, experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE), als auch seiner Rolle in der menschlichen Krankheit postvirale Encephalomyelitis. Zusätzlich haben die gegenwärtigen Erfinder und ihre Mitarbeiter MBP als ein "bystander Antigen" (Serien-Nr. 843,752, supra) untersucht.
Eine Haupthypothese in bezug auf die Pathogenese von MS ist, daß T-Zellen, die mit Myelin Basischem Protein in der weißen Hirn- und Rückenmarkssubstanz des ZNS reagieren, den Entzündungsprozess initiieren. Eine andere Hypothese ist, daß T-Zellen, die mit Proteolipidprotein (PLP) reagieren, den Entzündungsprozess initiieren. Die Demonstration, daß aktivierte T-Zellen, die für Myelin Basisches Protein (MBP) spezifisch sind, aus MS Patienten isoliert werden können (Allegretta, M. et al., Science: 247: 778, 1990), impliziert weiter MBP reaktive T-Zellen in der Pathogenese der Krankheit. Die Arbeit der gegenwärtigen Erfinder zeigt ebenfalls, daß MBP reaktive T-Zellen anschließend nach Initiation des Entzündungsprozesses, in der Pathologie der Krankheit involviert sind. (Wie unten detaillierter beschrieben sein wird, zeigen die gegenwärtigen Erfinder, daß gesunde Individuen ebenfalls oft MBP-spezifische T-Zellen haben, jedoch im Gegensatz zu solchen von MS Patienten, sind MBP-spezifische T-Zellen von gesunden Individuen nicht aktiviert.)
Die gegenwärtigen Behandlungen für MS sind lediglich lindernd und involvieren die Verabreichung von Arzneimitteln, die in einer nicht spezifischen Weise wirken, um die Immunantwort in der Person zu supprimieren. Beispiel für solche Arzneimittel sind Cyclophosphamid, Imuran (Azathioprin) und Cyclosporin A. Steroidverbindungen wie Prednison und Methylprednisolon werden ebenfalls in vielen Fällen verwendet. Diese Arzneimittel haben eine limitierte Wirksamkeit gegen MS. Gebrauch von solchen Arzneimittel ist durch ihre Toxizität beschränkt und durch die Tatsache, daß sie "globale" Immunsuppression nach verlängertem Gebrauch induzieren, d. h. sie regulieren ebenfalls die normale protektive Immunantwort gegen pathogene Mikroorganismen runter, wodurch das Risiko an Infektion steigt. Zusätzlich besteht für Patienten, die für verlängerte Zeitspannen global immunsupprimiert werden, ein erhöhtes Risiko bestimmte bösartige Krankheiten zu entwickeln.
Mehr Details über die auftretenden immunologischen Prozesse sind von experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE), dem primären Tiermodell für MS, bekannt. EAE kann in kleinen Säugern leicht durch Immunisierung mit Myelin Basischem Protein (MBP) in einem geeigneten Adjuvans oder durch adoptiven Transfer durch die Injektion von CD4&spplus;, MBP reaktiven T-Zellen induziert werden (Alvord Jr, E.C., et al. eds. in Experimentel Allergic Encephalomyelitis: A Useful Model for Multiple Sclerosis, A.R. Liss, N.Y., 1984: Makhtarian, D.E., et al. Nature 305: 356, 1984: Ben-Nun, A. et al. J. Immunol. 129: 303, 1982). Die T-Zellen, die EAE sowohl in Mäusen als auch in Ratten induzieren, genannt encephalitogene Zellen, erkennen spezifisch Peptide, die den immundominanten Regionen von MBP entsprechen. Die Präsentation dieser Regionen gegenüber den T-Zellen tritt auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) in Assoziation mit spezifischen (engl. unique) Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II Molekülen auf. Es sollte betont werden, daß immundominante Regionen von MBP, d. h. der Teil des Proteins, der am häufigsten von MBP reaktiven T-Zellen des CD4&spplus;-Typs erkannt wird, sich unterscheidet, abhängig von der Spezies des Wirtssäugers und kann ebenfalls abhängig von der Spezies an MBP variieren, trotz der Tatsache, daß die Aminosäuresequenz von MBP sehr hohe Interspezies-Homologie aufweist. Wie oben von den gegenwärtigen Erfinder und ihren Mitarbeitern entdeckt, ist zum Beispiel ist ein immundominantes Epitop des menschlichen MBPs in Menschen in der Untersequenz des menschlichen MBP Moleküls, das die Aminosäuren 84-10² umfaßt, enthalten. Ein anderes immundominantes Epitop kann in der Untersequenz des menschlichen MS Moleküls, welches die Aminosäuren 143-168 umfaßt, gefunden werden. Dies wird durch die Spezifität von menschlichen T-Zellen bewiesen, die von Individuen isoliert wurden, welche an MS leiden (verwandte Patentanmeldung Serien-Nr. 502,559 (WO-A-9115525) und Beispiel 1 unten). Die immundominante Region von Maus MBP ist Aminosäuren 1-9, wenn Mäusen verabreicht (Zamvil et al., Nature 324: 258, 1986) und die von Ratten MBP ist Aminosäuren 68-88, wenn Ratten verabreicht (Burns et al., J. Exp.Med. 169: 27, 1989). Auf der anderen Seite ist die immundominante Region von Meerschweinchen MBP in Ratten innerhalb der Reste 75-84 lokalisiert (Hashim, G. Myelin: Chemistry and Biologiy, Alan R. Liss, N.Y. 1980).
Basierend auf der Arbeit, die in dem EAE System durchgeführt wurde, werden alternative Therapien für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten im allgemeinen und MS im besonderen entwickelt. U.S. Patentanmeldung Serien-Nr. 65,794 (WO-A-8810307), eingereicht am 24. Juni 1987 (nun fallengelassen) und gleichzeitig anhängige internationale Patentanmeldung PCT/US88/02139 (WO-A-9108760), eingereicht am 24. Juni 1988, nun in der nationalen Phase als U.S. Anmeldung Serien-Nr. 07/460,852 und eine Änderungsanmeldung dieser Anmeldung, U.S. Anmeldung Serien-Nr. 07/596,936 (WO-A-9206708) offenbaren, daß orale oder enterale Verabreichung von sowohl gesamtem Myelin Basischem Protein als auch krankheitsinduzierende und nichtinduzierende Fragmente und Analoga davon wirksam beim Supprimieren von akuter monophasicher EAE sind und nützlich beim Supprimieren von MS Symptomen sind, wenn ähnlich verabreicht.
Die folgenden gleichzeitig anhängigen im allgemeinen übertragenen Patentanmeldungen sind ebenfalls von Interesse: U.S. Patentanmeldung Serien-Nr. 454,806, eingereicht am 20. Dezember 1989 (WO-A-9108760) offenbart Aerosolverabreichung von Autoantigenen, krankheitsunterdrückende Fragmente des Autoantigens und Analoga davon als eine effektive Behandlung zum Behandeln von T-Zell-vermittelten Autoimmunkrankheiten wie MS.
U.S. Anmeldung Serien-Nr. 07/487,732, eingereicht am 20. März 1990 (WO-A-9112816), betitelt "Enhancement of the Down Regulation of Autoimmun Diseases by Oral Administration of Autoantigens" offenbart synergistische Mittel (Verstärker) zum Gebrauch bei oraler Verabreichung von Autoantigenen, krankheitsunterdrückende Fragmente und Analoga davon als wirksame Behandlungen von T-Zell-vermittelten Autoimmunkrankheiten.
U.S. Anmeldung Serien-Nr. 07/843,752 (WO-A-9112816), offenbart Verfahren und Zusammensetzungen zum Behandeln von Autoimmunkrankheiten, oral oder durch Inhalation durch Verabreichung von "bystander" Antigenen. "Bystander" Antigene sind gewebespezifische Antigene, die an dem Ort des Autoimmunangriffs vorhanden sind und die Fähigkeit haben, nachdem sie oral verabereicht wurden, T-Suppresserzellen zu generieren, welche wiederum Immunangriff auf das betroffene Gewebe supprimieren. "Bystander" Antigene sind nicht notwendigerweise Autoantigene und sind nicht notwendigerweise selbst das Ziel eines Immunangriffs. (In der Tat gibt es Hinweise, daß sich das immunsuppressive Epitop/e eines Autoantigens von dem immundominanten Epitop/en davon unterscheidet, obwohl immundominante Epitope (welche nach oraler Verabreichung Suppression ausüben) als "Bystander" Antigene beim Supprimieren eines Immunangriffs agieren können, der gegen andere Teile des selben Antigens oder Teile von anderen Antigenen in dem betroffenen Gewebe gerichtet ist.) Jedoch müssen "Bystander Antigene" (a) spezifisch für das betroffene Gewebe sein und (b) die Fähigkeit besitzen, T-Suppressorzellen nach oraler Verabreichung hervorzurufen (engl. to elicit).
T-Zellrezeptoren sind aus zwei unterschiedlichen Ketten an Proteinmaterial zusammengesetzt. Bestimmte T-Zellrezeptoren (TCRs), zusammengesetzt aus V-beta (Vß) Ketten und V-alpha (VA) Ketten, sind dafür bekannt, MBP zu erkennen. In SJL/PL Mäusen erkennen encephalitogene T-Zellen (d. h. krankheitsinduzierend wenn Mäusen verabreicht), die diese Rezeptoren besitzen, ein N-terminales Maus-MBP-Peptid (Reste 1-9), das von einem MHC-Molekül (Zamvil, S. S., et al., Nature 324: 258, 1986) präsentiert wird, welches durch das Mausgen H-2 kodiert wird. Die Mehrheit an T-Zelirezeptoren, die dieses Peptid, welches in Verbindung mit dem MHC präsentiert wird, erkennen, werden von den Maus-TCR-Genen VB8.2 und VA2 oder VA4 kodiert. In Lewis Ratten sind TCR Gensegmente, die mit den Maus VB8.2 und TCR VA2 Genen homolog sind, in encephalitogenen T-Zellen gefunden worden, die MBP-Reste 68-88 in dem Zusammenhang mit dem Lewis Ratten MHC erkennen (Burns, F.R., et al., J. Exp.Med.169: 27, 1989). Es ist gezeigt worden, daß Verabreichung eines VB8.2 spezifischen monoklonalen Antikörpers (d. h. ein Antikörper, der das Produkt VB8.2, das von dem korrespondierenden Gen exprimiert wird, erkennt) an Mäuse beim Behandeln von muriner EAE wirksam ist. Immunisierung mit Peptiden, die spezifisch der TCR VB8.2 Aminosäuresequenz entsprechen, verbessert EAE in der Lewis Ratte (Vanderbark, A.A., et al., Nature 341 : 541-544, 1989; Howell, M.D. et al., Science: 246, 668; 1989). Martin et al. (J. Exp. Med. 173, 1991) offenbaren mono-spezifische T-Zellinien aus MS-Patienten, die ein MBP-Peptid mit der Kernsequenz Aminosäuren 89-99 erkennen.
Martin et al. offenbaren das Vorhandensein immunogener Epitope in MBP unter Verwendung Alanin-substituierter Peptide. Jedoch sind die Regionen eines Autoantigens (wie MBP), die sich als immundominante Regionen verhalten, Spezies-spezifisch. Es ist bisher weder bestimmt worden, ob herkömmliche V-Gene Verwendung in TCR V-Genen unter T-Zellen in Menschen existiert, die immundominante Regionen von MBP erkennen, noch wurden diese immundominanten Regionen positiv in MS Patienten identifiziert.
Es ist nun gefunden worden, daß orale Verabreichung von multiplen Dosen und kleinen Mengen von ganzen Antigenen, die encephalitogene immundominante Epitope enthalten, diesen Typ an aktiver Suppression hervorrufen. Auf der anderen Seite induziert i.v. Verabreichung von ganzem Autoantigen (oder von ein oder mehreren encephalitogenen immundominanten Epitop-enthaltenden Fragmenten davon) ebenfalls Suppression, jedoch nur von Immunangriffs-T-Zellen, die Epitope des Autoantigens erkennen. Der letztgenannte Typ an Suppression, von dem angenommen wird, daß er via dem Mechanismus der klonalen Anergie verläuft, wird ebenfalls nach oraler Verabreichung von einzelnen Dosen und großen Mengen an Antigenen beobachtet, die encephalitogene Epitope umfassen, spezifisch immundominante Epitope, besonders wenn solche Antigene von Proteaseinhibitoren begleitet werden.
Für menschliches MBP, ein Protein, von dem angenommen wird, daß es ein Autoantigen für MS ist, hat ausführliches Testen durch die gegenwärtigen Erfinder Fragmente des Proteins aufgezeigt, die Epitope inkorporiert haben, welche durch eine große Anzahl an MBP spezifischen Immunangriffs-T-Zellen (CD4&spplus;) erkannt werden, die von MS Patienten isoliert wurden. Solche Fragmente, die immundominante Epitope umfassen, sind wahrscheinliche Kandidaten zur Verabreichung an Patienten, die an MS leiden, mit dem Ziel, die Autoimmunantwort zu supprimieren und besonders die Funktion von MBP- reaktiven T-Zellen zu supprimieren, die für Autoimmunangriff auf Nervengewerbe verantwortlich sind. Bis zu diesem Punkt beabsichtigt die vorliegende Erfindung nicht nur orale Verabreichung solcher Peptidfragmente an Säuger, die ein Bedürfnis für solch eine Behandlung haben, sondern ebenfalls parenterale Verabreichung solcher Fragmente.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, immunsuppressive Mittel zur Verfügung zu stellen, spezifisch Fragmente von menschlichem MBP und Verfahren zum Benutzen dieser Fragmente, um menschliche T-Zellfunktionen zu supprimieren.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen und pharmazeutische Formulierungen zur Verfügung zu stellen, die diese Fragmente von menschlichem MBP umfassen und nützlich für orale und/oder parenterale Verabreichung an Menschen sind und Verfahren zum Benutzen solcher Formulierungen.
Noch ein anderes Ziel dieser Erfindung ist es, ein Peptidfragment von MBP, welches ein immundominantes Epitop inkorporiert hat, als ein Reagenz zur Verfügung zu stellen, das benutzt werden könnte, um die Spezifität von menschlichen T-Zellen zu bestimmen.
Ein weiteres Ziel ist es, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die MBP reaktive T-Zellen anergisieren oder aktive Suppression solcher T-Zellen verursachen, wobei das letztere z. B. durch Suppression von Proliferation von MBPreaktiven T-Zellen sichtbar gemacht wird.
Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann im Licht der vorliegenden Beschreibung, Zeichnungen und Ansprüche offensichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Säulendiagramm, das die Frequenz von MBP reaktiven T-Zellen zeigt, die aus MS Patienten (linke Abbildung) und gesunden Kontrollen (rechte Abbildung) isoliert wurden, welche spezifisch mit verschiedenen menschlichen MBP- Peptidfragmenten reagieren.
Fig. 2a und 2b illustrieren graphisch die Suppression von EAE (induziert durch i.p. Inoculation mit MBP spezifischen encephalitogenen T-Zellen) durch Transfer von Milzzellen von Tieren, die oral mit MBP toleranzinduziert wurden.
Fig. 3 zeigt die Suppression von adoptiv transferierter EAE durch Co-transfer von CD4&spplus; verarmten oder CD8" verarmten T-Zellen von MBP gefütterten Mäusen.
Fig. 4 ist ein Säulendiagramm der DTH Antworten, die mit dem Ausmaß an Protektion (falls überhaupt) gegen EAE Induktion durch Co-transfer zusammen mit CD4 T-Zellen von verschiedenen T-Zellunterklassen von MBP gefütterten Tieren assoziiert sind.
Fig. 5 ist ein Säulendiagramm der quantitativen histologischen Analyse, die als Durchschnittszahl von Enzündungsfoci ausgedrückt wurde, welche aus dem ZNS (d. h. dem Parenchym und der Meninge) von Mäusen, die mit verschiedenen T-Zellunterklassen aus MBP gefütterten Mäusen injiziert worden waren, isoliert wurden.
Fig. 6a zeigt die Suppression von aktiv induzierter EAE durch intravenöse (IV) Verabreichung von MBP; Fig. 6b zeigt den Effekt von IV-Verabreichung von MBP auf adoptiv transferierte EAE und die Unfähigkeit von Milzzellen von IV-toleranzinduzierten Tiere Suppression zu verleihen, wenn sie mit einer encephalitogenen MBP Linie auf native Tiere co-transferiert werden.
Fig. 7 ist ein Säulendiagramm, das die Variation in Suppression von EAE, nach oraler (A) oder IV (B) Verabreichung von verschiedenen MBP Peptiden zeigt.
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung der Fähigkeit von verschiedenen Peptiden, die basierend auf der immundominanten Epitopregion von menschlichem MBP konstruiert wurden (menschliche MBP Aminosäurerestenr. 84-10²), um Proliferation von menschlichen MBP reaktiven T-Zellklonen zu stimulieren. Abbildung A: Effekt des Auslassens von ein oder mehreren N-terminalen Aminosäuren; Abbildung B: Effekt des Auslassens von ein oder mehreren C-terminalen Aminosäuren.
Fig. 9 ist ein Graph der Fähigkeit eines 15-mers (menschliche MBP-Aminosäurerestenr. 85-99), Proliferation von vier verschiedenen menschlichen T-Zellklonen zu stimulieren, verglichen mit der Fähigkeit von MBP-Peptiden 84-10² und 86-97 solche Proliferation zu stimulieren.
Fig. 10 ist ein Diagramm, das TCR/MHC Kontakte für die 85-99 und 88-10&sup4; menschlichen MBP-Peptide und ein vorgeschlagenes Motiv für diese Interaktion zeigt.
Fig. 11 ist ein Diagramm, das die Induktion von Proliferation von T-Zellklonen gegen die menschlichen 85-99 MBP-Peptide der vorliegenden Erfindung zeigt, im Vergleich zu der Proliferation, die in diesen Klonen durch das native MBP- Protein induziert wird.
Fig. 12 ist ein Autoradiogramm, das PCR Amplifikation von cDNAs von 18 T-Zelllinien zeigt, welche von fünf MS Patienten erzeugt wurden und welche mit MBP-Resten 84-10² reagierten.
Fig. 13 ist ein Autoradiogramm einer Southern Blot Analyse von TCR VB und JB Genverwendung für MBP reaktive T-Zellinien, die aus peripherem Blut eines MS Patienten erzeugt wurden.
Fig. 14 ist eine Serie von Säulendiagrammen, die die Reaktivität von T-Zellen zeigt, die von MSD Patienten isoliert wurden und Kontrollen von verschiedenen Regionen des menschlichen MBP-Polypeptides im Zusammenhang, ob diese Patienten bestimmte MHC-Antigene haben.
Fig. 15 T-Zellen, die vorher mit freiem Peptidantigen stimuliert wurden, reagieren nicht auf Antigenstimulierung. T-Zeliklon Ob.1A12.8 wurde entweder direkt mit MBP-Peptid 84-10² oder mit einer DR2+ B-Zellinie (9010) oder L-Zelltransfektant stimuliert, die mit 84-10² für 2 Std. bei 37ºC radioaktiv markiert (engl. pulsed) worden waren und wurden auf Proliferation getestet. Endkonzentration von Peptid in Vertiefungen nach einer Stimulation ist angezeigt. Wie in Abbildung A gezeigt, resultierten alle drei Stimuli in äquivalenter T-Zellproliferation. Sieben Tage später wurden T-Zellen gewaschen und erneut auf Antwort auf 84-10² (5 ug/ml) oder B-Zellen oder L-Zellen, die mit 84-10² (100 ug/ml) radioaktiv markiert waren, getestet. Wie in Abbildung B gezeigt, reagierten T-Zellen, die ursprünglich mit hohen Konzentrationen an 84-10² stimuliert worden waren, nicht auf irgendeine sekundäre Antigenstimulierung.
Fig. 16 Nichtreaktivität von T-Zellen kann durch Zusetzen von B-Zellen nicht verhindert werden. T-Zellklon Ob.1A12.8 wurde für sieben Tage unter primärer Stimulierung entweder alleine oder in der Anwesenheit von 84-10² kultiviert, mit dem Zusatz von entweder MHC Klasse II passenden (engl. matched) (9010) oder nicht passenden (9009) bestrahlten transformierten B-Zellen in den angegebenen Mengen, wurde dann gewaschen und auf Proliferation auf entweder MBP 84-10² Peptid (5 ug/ml) oder rIL-2 (10³ u/ml) getestet. T-Zellen, die in Abwesenheit von Peptid herangezogen worden waren (Kreise), waren vollständig in der Lage nach der sekundären Antigenstimulierung zu proliferieren, während solche, die mit Peptid (Rechteck) herangezogen worden waren, nicht auf Antigen reagierten, unabhängig von dem Zusatz von B-Zellen. Proliferation von IL-2 war äquivalent in allen Zeilpopulationen.
Fig. 17 Kinetik von T-Zellanergie. T-Zellklon Ob.1A12.8 wurde für 0 bis 168 Stunden in 5 ug/ml 84-10² kultiviert, gewaschen und auf Proliferation auf 84-10² oder (L-2 getestet. Fehlerbalken repräsentieren SMF (engl. SME) von CPM aus Dreifachkulturen. Daten von zwei übereinstimmenden aber verschiedenen Experimenten wurden zusammengeführt, um alle Zeitpunkte zu repräsentieren.
Fig. 18 Anergisierte T-Zellen fahren fort CD3 zu exprimieren. T-Zellklon Ob.1A12.8 wurde in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 5 ug/ml 84-10² für vier Tage kultiviert, gewaschen und sowohl auf Zelloberflächenphänotyp und Proliferationsantwort analysiert. Zellen wurden mit Kontroll-mAk Mslg-FITC oder OKT3 FITC (Coulter) für 30 Minuten bei 4ºC markiert, zweimal gewaschen und dann in 1% Formalin fixiert und durch Flußzytometrie analysiert. T-Zellen derselben Primärkultur wurden auf Proliferation zu B-Zellen (9010), die mit 84-10² oder rIL-2 markiert oder nicht markiert worden waren, getestet.
Fig. 19 Aktivierung von anergisierten T-Zellen durch verschiedene Stimuli. T-Zellklon Ob.1A12.8, der in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 84-10² für sieben Tage kultiviert worden war, wurde gewaschen und auf Proliferation auf logarithmische Titration von αCD3 + PMA, T11&sub2; + T11&sub3;, PMA + Ionomycin und rlL-2 getestet. Endkonzentration oder Ascitesverdünnung jedes Reagenz ist auf der x-Achse ausgedrückt. PMA-Konzentfationen sind unter Konzentrationen für αCD3 oder Ionomycin aufgeführt.
Fig. 20 Anergisierte T-Zellen sind durch ihre Fähigkeit, [Ca²+]i nach antigener Stimulierung freizusetzten, inhibiert. Ob.1A12.8 wurde ± 5 ug/ml 84-10² für sieben Tage kultiviert, gewaschen und mit 2 ug/ml lndo-1 zur Analyse von [Ca²+]i geladen. Sekundäre Stimulierung durch Ionomycin (100 ug/ml), αCD3 (1/30 Asc Verd.) oder B-Zellen (9010), die + 100 ug/ml 84-10² markiert worden waren, wurde an durch Pfeilen bezeichneten Punkten einem Flußzytometer zugesetzt. Für APC Stimulierung wurden Zellen aus dem flußzytometer entfernt und für 1 Minute zentrifugiert (durch ausgefüllte Balken repräsentiert). Prozentantwort für jede Probe repräsentiert % an Zellen über der Grundlinie (Post-Stimulus minus Prä-Stimulus).
Fig. 21 Cytokinproduktion von anergisierten T-Zellen. A. T-Zellklon Ob.1A12.8 wurde mit oder ohne 84-10² für zwei Tage kultiviert, gewaschen, mit oder ohne 10 ng/ml PMA + 1 ug/ml Ionomycin oder 5 ug/ml 84-10² ± 10 ng/ml PMA für vier Stunden bei 37ºC stimuliert. Gesamtzell RNA wurde durch das RNAzoI B Verfahren für Northern Analyse extrahiert. Klammern geben zwei verschiedene Northern Blots von identischen Proben an, welche jeweils mit einer β-Aktin Kontrollsonde zusätzlich zu cytokinspezifischen Sonden hybridisiert wurden. Ungefähre Größen der mRNA-Banden sind aufgeführt. B. Ob.1A12.8 wurde für zwei Tage ± 84-10² kultiviert, gewaschen und mit 84- 10² oder rlL-2 als eine Positivkontrolle stimuliert. Überstände wurden nach 20 Stunden von Sekundärkultur gesammelt und 1 : 3 in Kulturen von HT-2 Zellen verdünnt. Proliferation von HT-2 Zellen repräsentiert die Anwesenheit von IL-2 im Überstand von 84-10² stimulierten nicht anergisierten T-Zellen und war in der rlL-2 Positivkontrolle am höchsten.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Peptide bereit, die aus dem gesamten Fragment 84-10² von hBMP oder einem davon Teil bestehen, wobei das Peptid einen Alaninrest an Position 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 enthält und das Peptid mindestens Fragment 85-99 von hBMP enthält, wobei das Peptid die Eigenschaft hat, in vitro die Proliferation von T-Zellen zu stimulieren, die von MS-Patienten stammen und die das gesamte Fragment von hBMP erkennen.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine oral wirksame Menge der Peptide und einen physiologisch verträglichen Träger oder ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel umfasst.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine parenteral wirksame Menge der Peptide und einen physiologisch verträglichen Träger oder ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Peptide zum Herstellen eines Medikamentes zum Verändern der Immunfunktion von CD4 T-Zellen, die mit Myelin-basischem Protein reaktiv sind, in einem an multipler Sklerose leidenden Säuger bereit, wobei das Peptid über die parenterale Route appliziert und in einer Menge verabreicht wird, die bewirkt, dass die Immunfunktion verändert wird.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung des Peptides zum Herstellen eines Medikaments zum Unterdrücken einer Autoimmunantwort bei einem Säuger bereit, wobei es sich um die Art von Autoimmunantwort handelt, die bei multipler Sklerose festgestellt wird, wobei das Peptid oral verabreicht wird.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Wie hier benutzt, schließt "Suppression" jede meßbare reproduzierbare Reduktion der T-Zellproliferation in Antwort auf Faktoren, die normalerweise solche Zellen stimulieren, ein. Es sollte jedoch betont werden, daß die vorliegende Erfindung sich lediglich mit der Suppression von Proliferation von zerstörerischen T-Zellen beschäftigt, d. h. Proliferation von T-Zellen, die Autoimmunangriff (CD4&spplus; T-Zellen spezifisch für ein Selbst-Antigen, z. B. MBP) fördern. In der Tat ist die Fähigkeit, Suppression in einer beschränkten Weise zu induzieren, ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung, wobei die Suppression von zerstörerischen T-Zellen, die spezifisch für ein Selbst-Antigen sind, das Ergebnis der Wahl des Fragments oder der Fragmente von verabreichtem MBP ist und/oder dem Verfahren der Verabreichung, wie unten diskutiert.
Die Suppression der zerstörerischen T-Zellproliferation kann ebenfalls indirekt gemessen werden, d. h. wie gesehen durch eine Reduktion in Symptomen einer Krankheit, welche direkt oder indirekt durch Immunangriffs-T-Zellproliferation verursacht wird, wie die Beschädigung von neuralem Gewebe, welche bei MS beobachtet wird, oder der Abnahme in der Anzahl oder der Schwere von MS Attacken, die von MS Patienten erlitten werden. Beschädigung von neuralem Gewebe kann z. B. durch magnetische Resonanzdarstellung (MRI) und Messung der Anzahl und Schwere von darin sichtbaren Läsionen bestimmt werden. Reduktion der Anzahl oder Schwere von MS Attacken kann z. B. durch klinische Begutachtung von Patienten bestimmt werden. Verfahren für sowohl MRI als auch klinische Begutachtung sind in Fachkreisen gut bekannt.
Der Begriff "Autoantigen" wird als jede Substanz definiert, die normalerweise in einem Säuger gefunden wird, die in einer anormalen Situation nicht länger als "selbst" von den Lymphozyten oder Antikörpern dieses Säugers erkannt wird und durch das immunregulatorische System angegriffen wird, als wären sie eine fremde Substanz. Mit anderen Worten ist ein Autoantigen ein Antigen, das Ziel von Autoimmunzerstörung ist. Die reine Anwesenheit von Antikörpern oder sogar T-Zellen (des CD4&spplus;-Typs), die spezifisch für ein natives Antigen sind, manifestiert es nicht als ein Autoantigen. MBP und PLP (Proteolipidprotein) sind Beispiele für Autoantigene in MS.
"Immundominantes Epitop" eines Autoantigens (wie MBP) bedeutet eine antigene Determinante, die durch eine wesentliche Anzahl, einschließlich, jedoch nicht limitiert auf eine Mehrheit (obwohl nicht notwendigerweise eine absolute Mehrheit) an T-Zellen eines sensitiven Säugers erkannt wird, wobei solche T-Zellen eine Immunantwort gegen dieses Autoantigen verstärken oder helfen zu verstärken (engl. mount), falls der sensitive Säuger ebenfalls ein betroffener Säuger ist. (Es ist aus dieser Diskussion offensichtlich, daß ein "sensitiver" Säuger nicht ein betroffener Säuger sein muß.)
"Immundominante Regionen" oder "immundominante Domänen" eines Autoantigens sind hier als solche Regionen der Aminosäuresequenz eines solchen Autoantigens definiert, welche ein immundominantes Epitop enthalten. Die Strukturen (und/oder Lokalisation innerhalb des MBPs oder eines anderen autoantigenen Moleküls) der immundominanten Epitope (und Regionen) von MBP oder eines andern Autoantigens variieren abhängig von dem Wirt und sind daher wirtspezifisch. Die gegenwärtigen Erfinder haben in der Tat Hinweise gesammelt, daß der Grund, daß immundominante Epitope wirtspezifisch sind, der ist, daß sie ein Motiv umfassen müssen (von dem angenommen wird, das es in einem Peptidfragment von ungefähr 8 bis ungefähr 15 Aminosäuren in Länge enthalten ist), welches an den Haupthistokompatibilitätskomplex des Wirtes bindet. Dieses Motif variiert zwischen verschiedenen Spezies (der MHC variiert gleichermaßen) und kann ebenfalls Polymorphismus unter Mitgliedern derselben Spezies zeigen.
Der Ausdruck "Analog" von Fragmenten von MBP schließt Verbindungen ein, die strukturell mit den Fragmenten von MBP so verwandt sind, daß sie dieselbe biologische Aktivität wie das MBP-Fragment besitzen. Die biologische Aktivität, auf die sich in dieser Definition bezogen wird, ist die Fähigkeit, eine T-Zell-vermittelte oder T-Zell-abhängige Autoimmunantwort nach Verabreichung des MBP-Fragmentes zu supprimieren oder alternativ die Fähigkeit, Proliferation von T-Zellen, die verantwortlich sind für oder zum Autoimmunangriff beitragen, zu supprimieren oder die Fähigkeit von T-Zellen erkannt zu werden, welche ein immundominantes Epitop von MBP erkennen. Ein Beispiel für ein Analog des Fragmentes MBP 84-10² ist das Fragment MBP 84-102tyr, wobei Aminosäure 10² gegen Tyrosin ausgetauscht wurde. Wie aus Fig. 8 gesehen werden kann, hat dieser Austausch wenig oder keinen Effekt auf die Fähigkeit des MBP-Fragmentes Proliferation der MBP reaktiven T-Zellinie zu stimulieren. Weiterhin wird von den Aminosäuresubstitutionen nicht angenommen, daß sie einen Effekt auf die Löslichkeit oder Pharmakokinetik eines Fragmentes haben, wegen der relativ kleinen Größe der vorliegenden Fragmente. Es sollte angemerkt werden, daß ein "Analog" nicht dieselbe Aktivität im selben Außmaß zeigen muß, z. B. ein "Analog" muß als ein Suppressor nicht so potent wie ein tatsächliches Fragment des nativen Antigens sein.
Andere Analoga der relevanten menschlichen MBP-Epitope konnten basierend auf der Fähigkeit konstruiert werden, daß diese Analoge den MHC binden und von dem relevanten T-Zellrezeptor (beides kann in vitro getestet werden) erkannt werden.
Wie hier benutzt sind "T-Zellen" oder "T-Lymphozyten" als Immunsystemzellen definiert, die von Stammzellen abstammen, die in hämatopoetischen (d. h. blutbildenden) Geweben lokalisiert sind. Es gibt drei große Kategorien an T-Zellen: Helferzellen, Suppressorzellen und cytotoxische Zellen. T-Zellen exprimieren entweder das CD4 Antigen (und werden dann als CD4&spplus; T-Zellen bezeichnet) oder das CD8 Antigen (in welchem Fall sie als CD8&spplus; T-Zellen bezeichnet werden) auf ihrer Zelloberfläche. Die Expression von CD4 oder CD8 Antigenen durch periphere (zirkulierende) T-Zellen korreliert mit der Funktion und Spezifität der T-Zelle. "Helfer T-Zellen", die CD4&spplus; sind, erkennen Antigene und Klasse II MHC Moleküle und führen Helfer- oder regulatorische Funktionen aus. "Cytotoxische" und "Suppressor" T-Zellen (die CD8&spplus; sind), erkennen Antigene und Klasse I MHC Moleküle und führen cytotoxische und Suprressor-Funktionen aus.
"Aktive Suppressionen" ist die Suppression von Immunfunktion, wobei die Suppression das Ergebnis der Induktion von zusätzlichen Immunzellen ist, spezifisch, regulatorische (Suppressor) T-Zellen.
"Klonale Anergie" ist die Suppression von Immunfunktion durch Induktion in Immunzellen, spezifisch Immunangriffs-T-Zellen, in einem Stadium von Nichtreakivität und spezieller, Nichtreaktivität auf Präsentation des Antigens, gegen welche diese Zellen normalerweise spezifisch sind und auf das hin sie normalerweise proliferieren würden. La Salle, J. et al. J. Exp. Med., 176: 177-186 Juli 1992. Anergisierte T-Zellen scheinen in jeder Hinsicht normal zu sein, außer daß sie "abgeschaltet" zu sein scheinen. Sie sind nicht aktiviert und - in der Abwesenheit von zugesetztem Interleukin-2 (IL-2)- prolifierieren sie nicht nach Präsentation des Antigens, das sie erkennen. Falls IL-2 zugesetzt wird, werden die Zellen de-anergisiert und beginnen auf Präsentation des Antigens hin zu proliferieren.
Wie hier benutzt ist "Behandlung" gemeint als sowohl die prophylaktische Behandlung einschließend, um eine Autoimmunkrankheit; die die Symptome von MS hat (oder die Manifestierung von klinischen Symptomen davon), als auch die therapeutische Behandlung einschließend, d. h., die Suppression oder jede meßbare Linderung von einem oder mehreren Symptomen nach dem Einsetzen einer Krankheit, die die Symptome von MS zeigt.
"Rezeptor abgeleitete Peptide" sind hier als Peptide definiert, die die Aminosäuresequenzen von (oder enthalten in) VB17 und/oder VB12 des T-Zellrezptors oder Analoga davon haben, als auch andere Mittel (wie kontinuierte VB17- oder VB12-enthaltende T-Zellen), die, wenn einem Säuger verabreicht, der an einer Krankheit leidet, die die Symptome von MS hat, ein oder mehrere solcher Symptome supprimieren. (Die minimale Sequenzlänge des aktiven Peptids der vorliegenden Erfindung ist ungefähr 20 Aminosäuren. Es gibt kein besonderes Maximum, solange die Aktivität erhalten wird. Zum Beispiel kann der gesamte TCR oder gesamte T-Zellen benutzt werden).
"MHC" oder "Haupthistokompatibilitätskomplex" wird als eine komplexe Reihe an Säugerzelloberflächenproteinen definiert, die auf der Oberfläche von aktivierten T-Zellen, Makrophagen und anderen Immunsystemzellen vorhanden sind. Der MHC spielt eine zentrale Rolle in vielen Aspekten der Immunität, sowohl beim Präsentieren von Histokompatibilitäts- (oder Transplantations-) Antigenen als auch beim Regulieren der Immunantwort gegen herkömmliche (fremde Antigene). Es gibt zwei Typen an MHC Proteinmolekülen, Klasse I und Klasse II. Die menschlichen MHC Gene sind auf menschlichem Chromosom 6 lokalisiert und die Maus MHC Gene sind in dem H-2 genetischen Locus auf Mauschromosom 17 lokalisiert.
"Klasse II MHC Moleküle" sind Membranglycoproteine, die einen Teil des MHCs bilden. Klasse II MHC Moleküle werden hauptsächlich auf Zellen des Immunsystems, einschließlich B-Zellen, Makrophagen, Hirnastrocyten, epidermalen Lagerhans' Zellen, dendritischen Zellen, Thymusepithel und Helfer T-Zellen gefunden. Klasse II MHC Moleküle sind neben anderen Phänomenen, in die Regulierung der Immunantwort während Gewebeabstoßung, Stimulierung von Antikörperproduktion, Transplantat-gegen-Wirtsreaktionen und in der Erkennung von "selbst" (oder autologen) Antigenen, involviert. In der Beschreibung unten soll MHC austauschbar mit "Klasse II MHC" benutzt werden. Die MHC Gene werden als "MHC Gene" bezeichnet. T-Zellen initiieren eine Immunantwort, wenn sie Antigen Präsentierenden Zellen (APCs) begegnen, wie mononukleären Phagocyten (Makrophagen, Monocyten), Langerhans' Zellen oder follikulären dentritischen Zellen, die anfänglich antigene Fragmente eines Protenis aufnehmen, prozessieren (verdauen) und auf ihrer Oberfläche präsentieren (in Verbindung mit ihrem MHC).
CD4&spplus; T-Zellen erkennen Antigenmoleküle ausschließlich, wenn das Protein prozessiert ist und Peptidfragemente davon durch APCs präsentiert werden, die Klasse II MHC Moleküle exprimieren.
"T-Zelirezeptoren" oder "TCR" ist hier als der Antigenerkennungsrezeptor definiert, der auf der Oberfläche von T-Zellen vorhanden ist, daher der Rezeptor ist, der ein Molekül bindet, welches das Immunsystem erkennt - und als ein Antigen präsentiert (obgleich das Molekül fremd oder autolog ist, wobei das letztere der Fall ist bei einer Autoimmunkrankheit). Die Mehrheit an T-Zellen exprimiert einen TCR, der aus einem Disulfid-verbundenen Heterodimerprotein besteht, welches eine Alpha (A) und eine Beta (B) Kette enthält, wobei eine Minderheit an T-Zellen zwei andere Ketten (Gamma und Delta) exprimiert. Der TCR ist aus einer A und einer B Kette zusammengesetzt, wobei jede eine variable und eine konstante Region umfaßt. (Tilinghast, J.P. et al. Science 233: 879, 1986; Concannon, P. et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 83: 6589, 1986, Kimura, N. et al. J. Exp. Med. 164: 739, 1986; Toyonaga, B. et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 82: 8624, 1985). Die variable Region umfaßt wiederum ein "variables", ein "Diversitäts-' und "Zusammenfügungs" Segment. Es wird postuliert, daß die Verbindung zwischen dem variablen, Diverisitäts- und Zusammenfügungs-Segment eine Stelle der Antigenerkennung durch T-Zellen ist. Siehe ebenso Ho, H.Z. et al. lmmunogenetics. 1982, 15: 509-517: Olerup, O. et al. Tissue Antigens, 1987, 30: 135-138; Opelz, G., et al. Tissue Antigens, 1977, 9: 54-58: Danska, J.S., et al. J. Exp. Med., 1990, 172 : 27-33, Kempkis, B., et al., J. Immunol. 1991, 147: 2467-2473: Sellins, K.S., et al. J. Immmunol. 1992, 149: 2323- 2327.
T-Zellerkennung eines Antigens spiegelt eine drei-molekulare Interaktion zwischen dem T-Zellrezeptor (TCR), dem MHC Molekül der APC und einem Peptide oder Peptiden wider, die durch die APC via einer Spalte oder Tasche in der dreidimensionalen Struktur des Klasse II MHC Moleküls prozessiert werden. (Bjorkman, P.J. et al., 1987 Nature. 329: 506 und 329: 512)). Der Teil des Proteins, der am häufigsten auf der APC Oberfläche präsentiert und von der T-Zelle erkannt wird, ist das immundominante Epitop.
In dem Tiermodell (EAE) wurden T-Zellrezeptoren benutzt, die einen Teil der tierischen VB8.2 Sequenz umfassen, um die Krankheit zu behandeln und es wurde gezeigt, daß sie durch Eliminieren von krankheitsinduzierenden T-Zellen agieren. Im besonderen wurden in dem Tiermodell Peptide bestimmt, die die Sequenzen Thr-Leu-Cys-Ala-Ser- Ser und Thr-Leu-Cys-Ala-Ser-Arg umfassen, welche exponierten (Oberflächen-) Teilen von Maus und Ratten VB8.2 entsprechen können (in Maus- und Rattenmodellen), um das Autoimmunkrankheitsmodell durch Eliminieren von Helfer T-Zellen zu bekämpfen.
Die Erfinder haben eine Region von menschlichem MBP identifiziert, welche ein immundominantes Epitop von menschlichem MBP in einem menschlichen Wirt enthält. Dieses Epitop liegt in einem bestimmten Teil der menschlichen MBP Aminosäuresequenz (Reste Nr. 82-10&sup4;). Wie in Beispiel 1 unten gezeigt, haben die gegenwärtigen Erfinder die menschlichen MBP Aminosäurereste Nr. 84-10² als eine immundominate Domäne von menschlichem MBP identifiziert, welche durch eine Mehrheit an peripheren T-Zellen erkannt werden, die von Patienten isoliert wurden, welche an MS leiden. Zusätzliche experimentelle Arbeit hat bestimmt, daß das immundominante Epitop in dieser Domäne weiter innerhalb der menschlichen MBP Aminosäuren Nr. 85-99 lokalisiert ist. Diese Daten sind in Beispiel 3 gezeigt. (Es scheint durch Interferenz der Daten in Beispiel 3, daß das minimale menschliche MBP Fragment, in dem das vorstehende menschliche immundominante Wirtsepitop liegen kann, für einige T-Zellklone das Fragment 87-98 ist. Jedoch erkennen alle T-Zellklone, die mit 84-10² reagieren, das Fragment 85-99.)
Experimente, die das Model von MS, EAE, involvieren, haben gezeigt, daß Proteinfragmente, einschließlich korrespondierende immundominante Epitope von Meerschweinchen MBP und Rinder MBP effektiv bei der Suppression der Symptome der Krankheit in Ratten sind, wenn sie den Tieren, die unter der Krankheit leiden, oral verabreicht werden (verwandte Patentanmeldung Serien-Nr. 07/596,936 und Beispiel 2 unten), obwohl einige nichtinduzierende Fragmente potentere Suppressoren als induzierende Fragmente sind. Weiterhin ist gezeigt worden, daß diese oral ausgelöste Suppression auf die Induktion von CD8&spplus; Suppressor T-Zellen zurückzuführen ist (Lider et al., J. of Immunol, 142 : 748, 189). Einige Experimente sind von anderen in Tieren unter Verwendung von encephalitogenen Fragmenten von MBP durchgeführt worden: siehe z. B. Swierkosz, J.E., 1977, J. Immunol. 119: 1501-1506; Su, X-M et al., 1991, J. Neuroimmunol. 34: 181- 190 (i.v. Gebrauch von MBP Fragmenten - wurde bestimmt in Mäusen encephalitogen zu sein - gekoppelt an Milzzellen, um adoptiv transferierte EAE in Mäusen zu lindern);
Avrilionis, K. et al., 1991, J. Neuroimmunol. 35: 201-210 (i.v. Gebrauch von Liposomengebundenem menschlichem MBP Peptidfragment in Meerschweinchen - wurde gezeigt encephalitogen zu sein, wenn Meerschweinchen verabreicht - um EAE zu supprimieren, die durch das selbe Fragment induziert wurde, und i.p. und s.c. Gebrauch des freien Peptids für denselben Zweck).
So können die Peptide der vorliegenden Erfindung vorteilhaft bei dem Entwurf von spezifischen immunsuppressiven Präparationen sein, die solche Peptide enthalten, welche wiederum nützlich für die Suppression von zerstörerischer T-Zellprofileration sind. Zum Beispiel ist gezeigt worden, daß Peptide, die die Sequenzen des menschlichen MBPs umfassen, Anergie in menschlichen MBP spezifischen CD4&spplus; T-Zellen induzieren oder T- Suppressorzellen induzieren, die spezifisch für De-Myelinsierung sind, konstruiert und für solche Zwecke benutzt werden können. Siehe z. B. Beispiele 1 und 2 unten. Weiter zeigen die in Beispiel 2 berichteten Ergebnisse an, daß das Verfahren und Protokoll der Verabreichung der toleranzinduzierenden Mitteln den Mechanismus beeinflußt, der zur Suppression der Autoimmunreaktion führt. So sind Peptidfragmente, die ein immundominantes Epitop von menschlichem MBP in Menschen inkorporiert haben, wirksam beim Inhibieren von Proliferation von MBP reaktiven CD4&spplus; menschlichen T-Zellen in vitro und es wird erwartet, daß sie durch denselben Mechanismus wirksam sind, wenn sie via dem i.v. Weg Menschen verabreicht werden. Von denselben epitopen Peptiden wird erwartet, daß sie wirksam sind beim Induzieren von Suppression von Autoimmunangriffen auf menschliches neurales Gewebe, wenn sie den Menschen oral verabreicht werden. Die gegenwärtigen Erfinder haben ebenfalls Hinweise dafür, daß ein ganzes MBP (welches die vorstehenden zwei immundominanten Epitopregionen umfaßt) Suppression via Hervorrufen von Suppressor T-Zellen (aktive Suppression) induzieren kann, wenn MBP oral in kleinen Mengen und multiplen Dosen verabreicht wird. Dasselbe Antigen wird oral verabreicht, jedoch in großen Mengen und einer einzigen Dosis, ebenfalls Suppression via Anergie induzieren. Schließlich gibt es Hinweise, daß beide Mechanismen der Suppression durch Einstellen des oralen Verabreichungsprotokolls von MBP zwischen den beiden oben identifizierten Extrema ausgelöst werden kann.
Ohne zu beabsichtigen an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die orale oder enterale Verabreichung von immundominanten Fragmenten von MBP Suppressor T-Zellen veranlassen kann, hervorgerufen zu werden, was wiederum die T-Zellen supprimiert, welche zu dem Autoimmunangriff auf ein neurales Gewebe (d. h., das Gehirn, Rückmark, periphere Nerven oder assoziierte Zelltypen) beitragen. Es wird angenommen, daß Nervengewebeschaden, der die Pathologie ausmacht, die in Patienten gesehen wird, welche an MS leiden, ein direktes Ergebnis solch eines Autoimmunangriffs ist. Da dieser Toleranzinduktionsmechanismus die aktive Induktion von regulatorischen (Suppressor -) T-Zellen involviert, die für die Suppression der Immunreaktivität von Zellen in der Umgebung von Gewebe unter Immunangriff verantwortlich sind, ist dies ein Beispiel für aktive Suppression.
Die gegenwärtigen Erfinder haben viel Datenmaterial an experimentellen Hinweisen dafür gesammelt, daß aktive Suppression bei dem Hervorufen von toleranzinduzierten Antigen-spezifischen T-Suppressorzellen stattfindet, welchen an den Ort (Orte) des Körpers gelenkt werden, wo das Antigen, gegen welches diese T-Suppressoren spezifisch sind, gefunden werden kann. Dieser Ort schließt das Gewebe unter Immunangriff ein. Wenn sie dieses Antigen treffen, scheiden die T-Suppressoren suppressive Cytokine aus, wie den nicht spezifischen immunsuppressiven Faktor TGF-β und Interleukin-4 (IL-4), welche Autoimmunantworten, einschließlich Autoimmunangriff, supprimieren. (Siehe verwandte Patentanmeldung Serien-Nr. 843,752 (WO-A-9316724.)
Im Gegensatz dazu wird angenommen, das intravenöse Verabreichung (oder subcutane oder intraperitoneale Verabreichung) der MBP Fragmente, die immundominante Epitope inkorporiert haben, zu einer lmmunsuppression durch einen anderen Mechanismus als klonale Anergie führt. Klonale Anergie oder Nichtreaktivität von T-Zellen wurde der Antigenpräsentation in der Abwesenheit von geeigneten co-stimulierenden Faktoren zugeschrieben. Jenkins. M.K. PNAS, 84: 5409-5413, 1987. Die exakte Identität der involvierten Faktoren ist schlecht definiert, jedoch wurden lösliche Cytokine (z. B. B-7, ED- CI und eine geeignete intrazelluläre Calciumkonzentration) als daran beteiligt angesehen (ingl. implicated). Neuere Hinweise legen jedoch nahe, daß sogenannte "negative Signale" anstatt der Abwesenheit von co-stimulierenden Faktoren für Anergie verantwortlich sind. Diese Signale wurden jedoch noch nicht definiert. Siehe LaSalle J.M. et al., J. Exp. Med., 176: 177-186, Juni 1992. Anstatt die T-Zellklone zu induzieren zu profilieren, verursacht Präsentation von Antigen durch die APCs ohne die co-stimulierenden Faktoren (und/oder in der Anwesenheit der negativen Signale) die T-Zellen eher nach Antigenstimulierung nicht reaktiv zu werden, während sie jedoch reaktiv gegen IL-2 bleiben und so als anergisiert beschrieben werden. (Jenkins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5409, 1987: Mueller et al. Ann. Rev Immunol. 7: 455, 1989; Schwartz et al., Science 248: 1349, 1990). So werden Autoimmunantwort-fördernde Klone, die spezifisch für ein Autoantigen wie MBP sind, nicht länger als Antwort auf das Antigen proliferieren, wodurch die Immunangriffsreaktionen reduziert werden, die den Gewebeschaden verursachen, welcher für die Autoimmunkrankheitssymptome verantwortlich ist, wie der Neuralgewebeschaden, der bei MS beobachtet wird.
Suppression durch klonale Anergie kann von aktiver Suppression unterschieden werden (und ist in den Experimenten unten so unterschieden worden) durch adoptive Transferexperimente, welche die Fähigkeit oder Unfähigkeit von Suppressor T-Zellen testen, die von einem toleranzinduzierten Tier auf ein nicht toleranzinduziertes Tier übertragen wurden, zur Suppression der Immunfunktion in dem letztgenannten Tier zu führen. T-Zellentransfer führt zur Suppression, falls der Suppressionsmechanismus aktiv ist, d. h., falls es Hervorrufen von T-Suppressorzellen involviert und nicht auftritt, falls der Suppressionsmechanimus passiv ist, d. h., falls klonale Anergie involviert ist. Die in Beispiel 2 berichteten Ergebnisse illustrieren Fälle, in denen jeder Mechanismus der Immunsuppression involviert ist und zeigen, daß der Suppressionsmechanismus von einem oder mehreren der folgenden abhängig ist: (i) von der Substanz, die verabreicht wird, um Toleranz zu induzieren (z. B. immundominante Epitopfragmente von MBP induzieren aktive Suppression via dem oralen Weg und Anergie via dem parenteralen Weg); (ii) von dem Weg der Verabreichung des toleranzinduzierenden Antigens (z. B. induzieren nur Epitope, die von Angriffs-T-Zellen erkannt werden Anergie via dem i.v. Weg); und (iii) von der Menge und Frequenz der Verabreichung (z. B. induziert oral verabreichtes MBP aktiv Suppression, wenn in kleinen Mengen und multiplen Dosen gegeben und passive Suppression, wenn in großen Mengen und in einer einzigen Dosis oral gegeben).
Die Daten zeigen, daß sowohl encephalitogene und nicht encephalitogene Fragmente von MBP aktive Suppression hervorrufen können, wenn oral verabreicht, wobei diese nicht encephalitogenen Fragmente, die ein immunsuppressives Epitop inkorporiert haben, nur via aktive Suppression arbeiten und nur, wenn via dem oralen Weg verabreicht. Die encephalitogenen Fragmente (die ein immundominantes Epitop inkorporiert haben) können ebenso Anergie via dem oralen Weg hervorrufen, falls in großen Mengen und einzelnen Dosen verabreicht.
Diese Ergebnisse haben wichtige Seitenaspekte (engl. ramifications) für den Entwurf von toleranzinduzierenden Mitteln und Verfahren, die auf MBP als einem Toleranzinduktor basieren. So können abhängig von dem Typ der erwünschten Immunsuppression sowohl bestimmte Verfahren der Verabreichung als auch bestimmte Fragmente benutzt werden. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, ein oder mehrere krankheitsfördemde Epitoppeptide via dem i.v. oder s.c. oder i.p. Weg und (gleichzeitig) ein oder mehrere immunsuppressive Epitoppeptide via dem oralen Weg zu benutzen.
Es ist ebenfalls vorgesehen, daß toleranzinduzierende Verfahren, die Kombinationen von Verabreichungswegen und/oder Protokollen und/oder autoantigenen Fragmenten involvieren, sich als die wirksamsten herausstellen können. Wie von einem Fachmann verstanden werden wird, ist die Wirksamkeit eines Fragmentes oder Kombination von Fragmenten (oder eine Kombination von einem Fragment und ganzem Antigen) und die Wirksamkeit eines Verfahrens (oder Kombinationen von Verfahren) der Verabreichung eines MBP Fragmentes eine Funktion des Alters, Geschlechtes, Gewichtes, der körperlichen Verfassung und des Krankheitszustands des zu behandelnden Individuums und des gleichzeitigen Gebrauches oder Abwesenheit von anderen Fragmenten oder Behandlungen. Folglich muß das benutzte Fragment (Fragmente) und das Verfahren der Verabreichung in wesentlichen Teilen auf diesen Faktoren basierend bestimmt werden und muß unter Umständen experimentell von Fall zu Fall bestimmt werden. Solche Bestimmung benötigt jedoch nicht mehr als Routineversuchsarbeit in Anbetracht der Beispiele und Anleitungen, die hier enthalten sind.
Peptide, die auf den Sequenzen von menschlichem MBP basieren, können für Gebrauch in der vorliegenden Erfindung, wie in Beispiel 1 identifiziert, unter Verwendung von gut bekannten Festphaseverfahren synthetisiert werden (Merrifield R.B. Fed. Proc. Soc. Ex. Biol., 21: 412, 1962 und J. Am. Chem. Soc 85: 2149, 1963; R. Mitchell A.R. et al., J. AM. Chem. Soc. 98: 7357, 1976; Tam, J. et al., J. Am. Chem. Soc. 10&sup5;: 6442, 1983), vorzugsweise unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Peptidsyntheseapparates (wie der von Applied Biosystems, Foster City, CA hergestellte) und den Anleitungen des Herstellers folgend. Alternativ können solche Peptide durch rekombinante DNA Verfahren synthetisiert werden, wie in Fachkreisen gut bekannt ist (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1982 siehe S. 51-54 und S. 412-30). Zum Beispiel können diese Peptide als DNA Expressionsprodukte nach Inkorporation von DNA Sequenzen erhalten werden, die das gewünschte Fragment von MBP, isoliert aus der gewünschten Spezies, in Expressionsvektoren kodieren und Einführen solcher Vektoren in geeignete eukaryotische oder prokaryotische Wirte, die die gewünschten Peptide einzeln oder als Teil von Fusionspeptiden oder -proteinen exprimieren, von denen sie später durch gut bekannte Verfahren isoliert werden können.
Peptidanaloga können unter Verwendung der bekannten Aminosäuresequenzen, die wie unten offenbart von dem menschlichen MBP Gen kodiert werden, entworfen werden, unter Verwendung der synthetischen oder rekombinierten Verfahren, die unten beschrieben sind und den Verfahren von z. B. Eyler, E.B., in Advances in Experimental Medicine and Biology 21: 259-281, 1978. Zum Beispiel kann ein Peptid, das eine Sequenz hat, die auf der Aminosäuresequenz des gewünschten Fragmentes von MBP basiert, sich jedoch von der exakten Aminosäuresequenz unterscheidet, chemisch unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren synthetisiert werden. Solch ein Peptid kann auf seine Wirkung auf MBP reaktive CD4&spplus;T-Zellen getestet werden unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens zum Identifizieren einer genaueren Lage innerhalb der Aminosäuren 84-10² für dieses bestimmte immundominate Epitop von menschlichem MBP oder des in Beispiel 4 zum Testen von Binden an den T-Zellrezeptor und an den MHC beschrieben Verfahrens. Ein auf MBP basierendes Peptid kann in vitro auf Wirksamkeit oral in Menschen getestet werden, durch Inkontaktbringen von gesammelten isolierten peripheren MBP spezifischen Suppressor T-Zellen von Individuen mit dem Peptid, um zu bestimmen, ob sie proliferieren. Zusätzlich oder alternativ können diese isolierten Suppressor T-Zellen getestet werden, um zu bestimmen, ob sie suppressive Cytokine wie TGF-β und/oder IL-4 nach Inkontaktbringen mit einem MBP Peptid ausschütten. (Siehe z. B. der Gebrauch des "Transwellsystems" in gleichzeitig anhängiger US Anmeldung Serien-Nr. 843,752 (WO-A-9316724), die der PCT US92/01705 entspricht, ausgenommen, daß der Gebrauch von Milzzellen als APCs nicht notwendig ist; das MBP Peptid kann benutzt werden, um die Zellen zu induzieren TGF-β auszuschütten.) MBP-spezifische T-Suppressorzellen können isoliert werden durch Inkontaktbringen mit MBP und Bestimmen der Proliferation, gefolgt von Bindungsstudien unter Verwendung von anti-CD8&spplus;-Antikörpern.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls pharmazeutische Formulierungen und Dosisformen für oralen oder parenteralen Gebrauch bei der Suppression von Autoimmunangriffs-T-Zellfunktion in Menschen zur Verfügung, besonders in solchen Individuen, die an MS leiden. Im allgemeinen enthalten solche Dosisformen ein oder mehrere Peptide gemäß der Erfindung, welches Fragmente von menschlichem MBP und Analoga davon sind, in einer Menge, die wirksam zum Supprimieren von Proliferation von Immunangriffszellen sind. Suppression der Funktion, welche in einer in vitro Suppression von Immunangriffszellen resultiert, wie MBP-spezifische CD4&spplus;T-Zellen und/oderAbschwächung von ein oder mehreren Symptomen von MS in einem Patienten, der gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt worden ist, wird als im Rahmen der Erfindung liegend betrachtet. Für Suppression und Symptomabschwächung siehe Definitionsteil oben.
Die T-Zell-suppressiven Peptide der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zusätzliche nicht von MBP abstammende Aminosäuresequenzen umfassen, die vor oder hinter der auf MBP basierenden Sequenzen liegen, solange diese zusätzlichen Sequenzen die suppressive Funktion dieser Peptide nicht vereiteln. Testen solcher Konstrukte auf immunsuppressive Aktivität kann leicht unter Verwendung von z. B. ein oder mehreren der hier beschriebenen Testverfahren durchgeführt werden.
Die pharmazeutischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung können als optionale Bestandteile pharmazeutisch verträglich Trägerstoffe, Träger, Verdünnungsmittel, solubilisierende oder emulgierende Mittel und Salze von dem Typ, die in Fachkreisen gut bekannt sind, enthalten. Nicht limitierende Beispiele solcher Substanzen schließen 0,5 N Kochsalzlösung in destilliertem Wasser für parenteralen Gebrauch und Lactose für oralen Gebrauch ein.
Die Fragmente von menschlichem MBP können oral oder durch Inhalation zusammen mit synergistischen Mitteln verabreicht werden, welche die Wirksamkeit der Immunsuppression verstärken können. Nicht limitierende Beispiele von synergistischen Mitteln zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung schließen bakterielle Lipopolysaccharide von einer großen Anzahl an gram-negativen Bakterien, wie verschiedene Unterarten von E. coli und Salmonella (LPS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Difco, Detroit, MI; BIOMOL Res. Labs. Plymouth, PA), Lipid A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; ICN Biochemicals, Cleveland, OH; Polysciences, Inc., Warrington, PA) und immunregulatorische Lipoproteine wie Peptide, die kovalent an Tripalmitoyl-S-glycarylcysteinyl-seryl-serin (P3C55) gebunden sind, ein, welche, wie in Deres, K. et al., (Nature. 342: 561-564, 1989) offenbart, erhalten werden können oder "Brauns" Lipoprotein von E. coli, welches, wie in Braun, V., Biochim. Biophys. Acta 435 : 335-337, 1976 offenbart, erhalten werden kann. LPS ist bevorzugt und Lipid A ist besonders bevorzugt. Lipid A ist besonders bevorzugt zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung, da es weniger toxisch ist als das gesamte LPS Molekül. LPS zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung kann aus gram-negativen Bakterien extrahiert werden und unter Verwendung des Verfahrens von Galanes et al., (Eur. J. Biochem 9: 245, 1969) und Skelly, R.R. et al., (lnfect. Immun. 23: 287, 1979) gereinigt werden.
Die wirksame Menge eines synergistischen Mittels, z. B. LPS oder Lipid A, welche zusammen mit dem MBP Fragment verabreicht werden soll, reicht weit von ungefähr 0,15 und 15 mg pro kg Körpergewicht des Säugers pro Tag und vorzugsweise von 0,3 und 12 mg pro kg des Säugers pro Tag.
Der Verabreichungsweg der suppressiven Mittel der vorliegenden Erfindung ist in einer oralen oder parenteralen Form oder Kombinationen davon. Orale Verabreichung schließt orale, enterale oder intragastrale Verabreichung ein, wobei oral bevorzugt ist. Parenterale Verabreichung schließt intraperitoneale, subcutane, intradermale und besonders bevorzugt intravenöse Verabreichungswege ein.
Im allgemeinen wird das auf MBP-basierende Peptid oder Analog oral einem menschlichen Patienten in einer Menge verabreicht, die von ungefähr 10 ug und ungefähr 20 mg pro Verabreichung rangiert, vorzugsweise zwischen ungefähr 100 ug und 250 ug. Die Menge wird rhythmisch in einer einzigen Dosisform oder multiplen Dosisformen verabreicht (engl. pulseadministered). Eine Dosis von 1 mg fünfmal täglich ist ein Beispiel für eine effektive Menge für Gesamt-MBP, um aktive Suppression auszuüben. Für Anergie sind 10-20 mg an MBP parenteral Beispiele für eine wirksame Menge. Es ist wünschenswert die Patienten zu überwachen, um die Dosis und Frequenz der Verabreichung zu optimieren. Die exakte Menge und Frequenz der Verabreichung an einen Patienten kann abhängig von dem Stadium, Frequenz der Manifestation und Schwere der Krankheit des Patienten und der körperlichen Verfassung des Patienten variieren, wie in Fachkreisen gut bekannt ist. Solche Optimierung wird vorzugsweise von Fall zu Fall durchgeführt. Optimierung der für Immunsuppression notwendigen Dosis stellt, in Anbetracht der hier offenbarten Richtlinien, keine übermäßigen experimentellen Arbeiten dar. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können pharmazeutische orale Formulierungen oder Dosisformen gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls durch Inhalation, vorzugsweise in Aerosolform, verabreicht werden. Der Inhalationsweg der Verabreichung ist bevorzugt nicht über die nasale Passage, sondern durch die Bronchien- und Lungenschleimhäute. Das MBP Fragment und verwandte Verbindungen der vorliegenden Erfindung können Menschen als trockene Pulverteilchen oder als eine in einem Trägergas (z. B. Luft oder N&sub2;) suspendierte atomisierte wäßrige Lösung verabreicht werden. Bevorzugte Aerosol-pharmazeutische Formulierungen können z. B. eine physiologische verträgliche gepufferte Kochsalzlösung umfassen.
Die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung kann Neben- Inhalationsverabreichung von pharmazeutischen Formulierungen in Form eines Aerosolsprays unter Verwendung z. B. eines Zerstäubers, wie solche, beschrieben in US Patent Nr. 4,624,251, erteilt am 25. November 1986; 3,703,173, erteilt am 21. November 1972; 3,561,444, erteilt am 9. Februar 1991 und 4,635,627, erteilt am 13. Januar 1971, involvieren. Das Aerosolmaterial wird von dem zu behandelnden Individuum inhaliert.
Andere Systeme der Aerosolverabreichung, wie der unter Druck stehende geeichte Dosisinhalator (MDI) und der Trockenpulverinhalator wie in Newmann, S.P. in Aerosols and the Lung, Clarke, S.W. und Davia, D. eds. S. 197-224 Butterworths, Londen, England 1984 offenbart, können benutzt werden, wenn die vorliegende Erfindung ausgeführt wird.
Aerosolverabreichungssysteme des hier offenbarten Typs sind von vielen kommerziellen Quellen, einschließlich Fisons Corporation (Bedford, MA), Schering Corp. (Kenilworth, NJ) und American Pharmoseal Co. (Valencia, CA), erhältlich.
Es wird erwartet, daß kleineren Mengen des Fragmentes von MBP der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Aerosolverabreichung zur Behandlung benötigt werden, da dieser Effekt festgestellt wurde, wenn EAE mit Gesamt-MBP und Adjuvans-Arthritis mit Collagen behandelt wurde, wie in gleichzeitig anhängiger US Patentanmeldung Serien-Nr. 454,486, eingereicht am 20. Dezember 1998 (US-A-4980014), offenbart ist. Weiter erscheint es, daß die Immunsuppression, die durch Inhalation des Fragmentes von MBP induziert wird, durch den aktiven Suppressionsmechanismus auftritt, ähnlich zur oralen Verabreichung. Weiner, H.L, et al., FASEB 4(7): 2102, 1990. Die Mengen des Fragmentes von MBP der vorliegenden Erfindung, die in einer Aerosoldosisform verabreicht werden können, wären zwischen ungefähr 0,015 mg und ungefähr 1,5 mg pro kg Körpergewicht eines Säugers pro Tag und können optional ein synergistisches Mittel in Mengen enthalten, die von ungefähr 0,05 und ungefähr 15 mg pro kg Körpergewicht des Säugers pro Tag rangieren und können in Einzeldosisform oder multipler Dosisform verabreicht werden. Die exakte zu verabreichende Menge wird abhängig von dem Stadium und der Schwere der Krankheit eines Patienten und des körperlichen Zustandes des Patienten variieren.
Dosisformen für parenterale Verabreichung werden im allgemeinen von ungefähr 1 bis ungefähr 200 mg eines Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung pro Dosis pro Person enthalten und vorzugsweise ungefähr 10 mg bis ungefähr 100 mg. Die vorstehende Beschreibung von inerten optionalen Bestandteilen und Feineinstellung von Mengen und Verabreichungsplänen, die oben mit bezug auf orale Formulierungen angegeben sind, betreffen nur parenterale Formulierungen.
Es wird anerkannt werden, daß der Inhalt einer Einheit an aktivem Bestandteil oder Bestandteilen, die in einer einzelnen oralen oder parenteralen Dosis jeder Dosisform enthalten sind, selbst keine wirksame Menge zum Behandeln von MS darstellen muß, da die notwendige wirksame Menge durch Verabreichung einer Vielzahl an Dosiseinheiten erreicht werden kann.
Die unten in Beispielen 1-3 beschriebenen Verfahren können benutzt werden, um die Wirksamkeit der Verfahren der vorliegenden Erfindung zu messen und die Menge und sowohl die Frequenz der Verabreichung der krankheitsunterdrückenden Mittel der vorliegenden Erfindung zu optimieren, als auch die Fragmente und das zur Verabreichung benutzte Verfahren.
T-Zellen können aus peripherem Blut oder Hirnflüssigkeit eines Patienten isoliert, amplifiziert und wie in Beispielen 1-3 beschrieben kloniert werden (bevor und/oder nach Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung). Antikörper (entweder polyklonal oder monoklonal) können erhalten werden, welche gegen die MBP Peptide der vorliegenden Erfindung gerichtet sind (unter Verwendung von in Fachkreisen gut bekannten herkömmlichen Verfahren), um auf die Anwesenheit von MBP reaktiven T-Zellen im peripheren Blut eines Patienten zu testen und spezifischer auf die Anwesenheit von aktivierten MBP reaktiven CD4&spplus; T- Zellen vor und/oder nach Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls nützlich beim Identifizieren von Individuen mit T- Zelle, die mit MBP reagieren, unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1.
Die vorliegende Erfindung wird weiter unten in spezifischen Arbeitsbeispielen beschrieben, welche beabsichtigt sind, die vorliegende Erfindung zu illustrieren ohne ihren Bereich einzuschränken.

BEISPIEL 1: IDENTIFIZIERUNG DER HAUPTIMMUNDOMINANTEN REGION VON MENSCHLICHEM MBP

MBP wurde aus menschlichem Gehirngewebe extrahiert und auf einer cm-52 Säule (Lieferant: Wattmann Biosystems Ltd., Maidstone, Kent, U.K.) gereinigt, unter Verwendung des höchsten Molekulargewichtes (engl. molecular weight peak) (18Kd) wie beschrieben (Chou, F.C.-H. et al., J. Biol. Chem. 251: 2671, 1976). MBP Peptide wurde unter Verwendung eines Festphasenverfahrens synthetisiert oder wurden von einem kommerziellen Labor erhalten (Biosearch Lab Inc., San Raphael, CA) und wurden durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) wie folgt gereinigt: jede Peptid-enthaltende Präparation wurde in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) bei 1 mg/ml aufgenommen. Sie wurde dann in einer HPLC Säule (Rainin reverse Phase C4 oder C18) unter Verwendung eines 0-70% Acetonitrilgradienten, der 0,1% TFA enthielt, prozessiert. Höchste Konzentrationen (engl. peaks) wurden bei 214 nm detektiert. Die benutzten MBP Peptidfragmente sind unten in Tabelle 1 dargestellt. Jedoch ist die Sequenz von menschlichem MBP publiziert. Daher sind nur die Nummern, die die Aminosäurereste bezeichnen, welche in jedem Peptid enthalten sind, notwendig. Tabelle 1
Ein schnelles T-Zellklonierungsverfahren wurde benutzt, um zu untersuchen, ob es immundominante Epitope im menschlichen MBP gab, die mit Klasse II MHC Phänotypen reagieren und die Frequenz solcher Reaktivität. Eine Gesamtzahl von 15.824 kurzzeitigen T-Zellinien wurde von 51 menschlichen Individuen durch Kultivieren mononukleärer peripherer Blutzellen (PMN) mit gereinigtem MBP (100 ug) nach 3 Tagen später generiert und dann jede 3-4 Tage durch Zusetzen von Interleukin-2 (IL-2; von ABI, Columbia, MD) und 2 Einheiten rekombinatem Interleukin-4 (IL-4; Genzym, Bosten, MA). Am Tag 13 der Kultur wurde eine Probe jeder Linie auf Reaktivität gegen MBP unter Verwendung des folgenden Proliferationstest getestet: T-Zellklone (1 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung) wurden dreifach ausplattiert und mit geeigneten Stimuli (d. h., 100 ug Gesamt-MBP oder 5% IL-2) für 72 Stunden bei 37ºC, 90% Feuchtigkeit, 5% CO&sub2; in Flachbodenmikrotiterplatte (Costar) mit 96 Vertiefungen co-kultiviert. Die Zellen wurden radioaktiv mit 2 uCl [³H]TdR (2C1/mmol, New England Nuclear, Bosten, MA) für die letzten 18 Stunden der Kultur markiert (engl. pulsed). APCs wurden durch Markierung (engl. pulsing) von menschlichen mit Epstein-Barr-Virus transformierten B-Zellen (das Virus ist kommerziell erhältlich von ATCC) oder L-Zellen hergestellt, welches Mauszellen sind, die mit menschlichem DR2 (L-Zellen sind kommerziell erhältlich von ATCC unter Hinterlegungsnummer ATCC-CCL1 und können gemäß dem Verfahren von Wilkinson, D. et al., J Exp. Med.. 1988, 167: 1442-1458 transfiziert werden unter Verwendung von DNA, die DR2 kodiert, wie bei Wu, S. et al., J. Immunol., 1987, 138: 2953) transfiziert sind.
B-Zellen oder L-Zellen wurden bei 1 · 10&sup6; Zellen/Vertiefung in vollständigem Medium entweder in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 40 pM MBP oder Phospholipidprotein (PLP) für 2 Stunden bei 37ºC benutzt, zweimal mit 4ºC Hanks (Whittaker) gewaschen, gefolgt von Bestrahlung mit 5000 Rad. bei 4ºC. Um T-Zellen ohne akzessorische APCs zu stimulieren, wurden 2 uM an MBP, PLP oder geeignetem Fragment direkt den Zellen für eine Zeitspanne der Kultur zugesetzt: 48 Stunden, gefolgt von Markierung mit Thymogen und dann geerntet. Zehntausend APCs wurden für 100.000 T-Zellklone benutzt.
T-Zellinien, von denen gezeigt wurde, daß sie mit MBP oder PLP reagieren, wurden dann unter Verwendung desselben Verfahrens auf Reaktivität gegen überlappende Oligopeptid 20-mere getestet, welche die menschliche MBP Sequenz, wie in Tabelle 1 oben gezeigt, umfassen. MBP- und PLP-Reaktivitäts-Frequenz-Analyse wurde sowohl an Patienten mit definierter "relapsing-remitting" MS (wie durch Magnetresonanzdarstellung (MRI) und klinische Untersuchung diagnostiziert) als auch an Patienten mit anderen neurologischen Krankheiten und an normalen Individuen (in Alter und Geschlecht zu den MS Patienten passend) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten gezeigt. Tabelle 2
*MS = Multiple Sklerose
**N = Neurolgisch
Patienten mit MS waren Kaukasier und hatten gut charakterisierte "relapsing-remitting" Krankheit mit mindestens zwei Steigerungen in den letzten 24 Monaten und positiven Läsionen zur Zeit der Blutentnahme, wie unter Verwendung von MR) beobachtet. Individuen mit anderen zentralnervösen Krankheiten hatten die folgenden Diagnosen: 1-3 Wochen nach entweder zerebrovaskulärem Unfall (n = 4), Gehirntrauma mit ZNS Blutung (n = 4) oder metastasierender Hirntumor (n = 2). Die Gesamtanzahl mit MBP oder PLP reaktiven T-Zellinien und die Gesamtzahl an erzeugten T-Zellinien sind in Tabelle 2 gezeigt ("Ag" bedeutet "Antigen"). Zusätzlich wurde die Frequenz an MBP und PLP-reaktiven Linien jeweils für jedes Indidividuum getrennt berechnet durch Teilen der Anzahl an MBP reaktiven Linien durch die Gesamtzahl an erzeugten Linien und die Durchschnittswerte +/- SMF (statistischer mittlerer Fehler) sind angegeben. Dieselben Schlußfolgerungen können in Anbetracht der Reaktivität gegen PLP gezogen werden, obwohl in einem geringeren Ausmaß als Reaktivität gegen MBP oder seine Fragmente.
Während die Frequenz an Linien, die mit allen Fragmenten von MBP reagieren, in Individuen mit MS leicht höher war, verglichen mit anderen Individuen, war dieser Anstieg jedoch statistisch nicht signifikant. Wie jedoch unten diskutiert, reagierte eine signifikant größere Anzahl der MBP reaktiven Zellinien von MS Patienten mit den Fragmenten, einschließlich Aminosäuren 84-10², wodurch so diese Peptide und die korrespondierenden Fragmente von MBP als immundominante Epitope von MBP enthaltend identifiziert wurden, welche aktiv in der Entwicklung von MS sind.
Von einer Gesamtzahl von 302 Zellinien von Patienten mit MS, die expandiert werden und bestätigt werden konnten mit MBP in wiederholten Analysen zu reagieren, reagierten 140 (46,4%) mit MBP Resten 84-10² und ungefähr 70-80% reagierten mit entweder MBP Resten 84-10² oder 143-168. In den Kontrollgruppen erkannten 11 von einer Gesamtzahl von 100 MBP reaktiven T-Zellinien (11%) das 84-10² Peptid und ungefähr 34% erkannten entweder das 84-10² oder das 143-168 Peptid. Die aktuelle Frequenz von T-Zellinien, die von dem peripheren Blut abstammten, welche mit jedem MBP Peptid jedes einzelnen Individuums reagierten, wurde berechnet. Die Durchschnittswerte für Patienten mit MS und die Kontrollindividuen sind in der rechten Spalte von Tabelle 2 gezeigt. Die korrespondierenden immundominanten Peptide von PLP können durch dieselben wie hier für die MBP Peptide beschriebenen Verfahren identifiziert werden.
Die Frequenz von MBP-Peptid spezifischen Zellinien aus normalen Individuen und andere neurologische Krankheitskontrollen waren praktisch identisch und wurden daher für die Analyse kombiniert. Die durchschnittliche Frequenz von T-Zellinien aus Individuen mit MS, die selektiv mit MBP Resten 84-10² reagierten, war größer als mit Kontrollen (Fig. 1). Es wurden ebenfalls signifikante aber weniger bemerkenswerte Anstiege in Reaktivität gegen MBP Reste 61-82 und 124-142 in MS Patienten beobachtet, während sowohl MS als auch Kontrollindividuen hohe Frequenzen an T-Zellinien zeigten, die mit MBP Resten 143-168 reagierten. IL-2 wurde benutzt, um die T-Zellinien zu selektionieren, die aktiviert waren. Nach primärer Stimulierung mit IL-2 erkannten die so aktivierten Zellinien MBP Peptide.
Ausweitung dieser Kenntnisse auf größer Populationen von MS Patienten wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren durchgeführt. Zusätzliche 132 T-Zelllinien (63 von MS Patienten und 88 von normalen Kontrollen) wurden mit den in Tabelle 3 unten berichteten Ergebnissen untersucht. Zusammenfassend unterstützen diese Ergebnisse die Schlußfolgerung, daß Peptide, die MBP Aminosäurereste 84-10² enthalten, die immundominanten Domänen vom MBP sind. Tabelle 3 Tabelle 4
a95% Gültigkeitsgrenze
b nichtdetektierbar bei der benutzten Zellkonzentration
durchT-Test berechnet.
Die vorstehenden Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß nach primärer Stimulierung von MBP spezifischen T-Zellen mit IL-2 eine dramatisch höhere Anzahl an zusätzlichen MBP reaktiven T-Zellklonen in MS Patienten identifiziert werden kann (verglichen mit Kontrollen). Dies zeigt an, daß MBP reaktive T-Zellklone durch Inkontaktbringen mit IL-2 de-aktiviert werden können (möglicherweise de-anergisiert), worauf sie im Anschluß daran reaktiv gegen MBP Peptide werden.

BEISPIEL 2: MECHANISMUS DER INDUKTION VON IMMUNTOLERANZ

Die Experimente in diesem Beispiel wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit von Suppression von EAE unter Verwendung verschiedener Fragmente von MBP zu vergleichen und orale und intravenöse Verabreichung des Proteinfragmentes zu vergleichen und um Behandlung des Krankheitszustandes zu vergleichen, wenn er induziert oder adoptiv transferiert wurde. Induzierte EAE tritt auf, wenn MBP benutzt wird, um einen Wirt zu immunisieren und intramuskulär zusammen mit Adjuvant verabreicht wird, während adoptiv transferierte Krankheit auftritt, wenn eine MBP reaktive Zellinie aktiviert und dann in ein Tier injiziert wird. (Siehe Induktion von EAE - Abschnitt unten für genaue Angaben.) In diesem Beispiel wurden die folgenden Materialien und Verfahren benutzt.
Tiere. Weibliche Lewis-Ratten, 6-8 Wochen alt, wurden von Harlan-Sprague Dawley Inc. (Indianapolis, IN) erhalten. Tiere wurden in den Harvard Medical School Tierpflegeeinrichtungen beherbergt und unter Standardlaborbedingungen und Wasser ad libitum gehalten. Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Komitees für Pflege von Labortieren des Laboratory Research Council (Pub. #DHEW:NIH, 85-23, überarbeitet 1985) gehalten.
Antigene und Reagentien. Meerschweinchen MBP wurde aus Gehirngewebe durch das modifizierte Verfahren von Deibler et al., (Prep. Biochem. 2: 139, 1972) gereinigt. Proteininhalt und - Reinheit wurden durch Gelelektrophorese und Aminosäureanalyse überprüft. Concanavalin A und Histon wurden von Sigma (St. Louis, MO) erhalten. Peptide; wurden in der Peptideinheit des Zentrums für neurologische Krankheit, Brigham and Women's Hospital, synthetisiert und auf HPLC gereinigt. Die Aminosäuresequenzen der synthetisierten Peptide sind 21-40, MDHARHGFLPRHRDTGILDS (immunsuppressive Epitopregion wenn Ratten oral verabreicht); 71-90 SLPQKSQRSQDENPWHF (immundominante encephalitogene Region in Ratten); 151-170, GTLSKIFKLGGRDSRS.
Induktion von Toleranz. Für orale Toleranz oder aktive Suppression wurden Ratten durch Magenintubation mit einer 18-gauge rostfreien Tierfütterungsnadel (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ) mit 1 mg an MBP, gelöst in 1 ml PBS oder PBS alleine, gefüttert. Tiere wurden fünfmal in Intervallen von 2-3 Tagen gefüttert, wobei die letzte Fütterung zwei Tage vor Immunisierung stattfand. Für intravenöse Toleranz oder klonale Anergie wurden Ratten mit 0,1 mg an MBP, MBP Peptiden oder Histon, gelöst in 0,1 ml PBS oder PBS alleine, injiziert. Tiere wurden fünfmal via der Okularvene in Intervallen von 2-3 Tagen injiziert, wobei die letzte Injektion 2 Tage vor Immunisierung stattfand.
Induktion von EAE. Für aktiv induzierte Krankheit wurden Lewis-Ratten mit 25 ug an Meerschweinchen-MBP in 50 ul an PBS, emulgiert in einem gleichen Volumen an vollständigem Freunds Adjuvans (VFA), das 4 mg/ml an Mycobakterium tuberculosis (Difco) enthielt, in den Ballen des linken Fußes immunisiert. Für adoptiv transferierte EAE wurde eine MBP aktive T-Zellinie von Ratten etabliert, die mit MBP in VFA immunisiert worden waren und gemäß dem Verfahren von Ben-Nun et al., (Euro. J. Immunol. 11: 195, 1982) aufgezogen und gehalten worden waren. Encephalitogene Zellen wurden nach Aktivierung durch Kultur mit Concanavalin A (ConA) (2 um/ml) unter Verwendung bestrahlter Thymozyten aus immunisierten Tieren als APCs gesammelt. Zellen wurden aus Kulturen via einem Ficol Hypaque Gradienten (Hypaque 1077, Sigma) geerntet und vor Transfer zweimal in PBS gewaschen. 5 · 10&sup6; encephalitsgene Zellen wurden intraperitoneal in 0,1 ml PBS in bestrahlte (750 Rad., 24 Stunden früher) Empfängerratten injiziert. Zellviabilität von sowohl Modulator- als auch encephalitogenen Zellen wurde durch Trypanblauausschluß bestimmt und war größer als 90%. In allen Experimenten wurden 5 Tiere pro Experimentgruppe benutzt.
Reinigung von T-Zelluntergruppen für adoptiven Transfer von Protektion nach oraler Toleranzinduktion. Verarmung an Lymphozytenuntergruppen wurde durch negative Selektion unter Verwendung von magnetischen Kügelchen gemäß einem veränderten Verfahren von Cruikshank et al., (J. Immunol. 138: 3817, 1987) durchgeführt.
Milzzellen wurden mit einer 1 : 10 Verdünnung von Maus anti-Ratten CD8 oder CD4 monoklonalem Antikörper (jeweils Klone 0)98 oder W3/23, Serotec/Bioproducts, lndianapolis, IN) für 30 Minuten auf Eis inkubiert, zweimal gewaschen und dann zu vorgewaschenen magnetischen Teilchen mit einem durchschnittlichen Durchschnitt von 4,5 um (M-450), die mit Ziegen = anti-Maus IgG kovalent verknüpft waren (Dynal, Fort Lee, NJ) zugesetzt. Die Menge an benutzten magnetischen Kügelchen wurde als 10-mal größer als die geschätzte Zielzellpopulation berechnet. Die Zellen wurden mit den Kügelchen in 0,5 ml an RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 10% fetalem Kälberserum, in einem 10 ml Rundbodentestgefäß (Nung) für 30 Minuten auf Eis unter leichtem Schütteln alle 5 Minuten inkubiert. Nach Inkubation wurden die Kügelchen/Zellsuspension mit 5 ml an Medium gewaschen und die Zell-mAk-Kügelchenkomplexe wurde in einem starken magnetischen Feld unter Verwendung eines Magnetpartikelsammlers (Dynal-MPC-1) für 2 Minuten von nicht aktivierten Zellen getrennt. Der Überstand wurde entfernt und die Prozedur wurde zweimal wiederholt, um die nichtadhärente Fraktion zu erhalten. Die Zellen in den CD4&spplus; und CD8&spplus; verarmten Populationen waren > 95% CD4&spplus;CD8&supmin; oder CD4CD8&spplus;, wie durch indirekte Flußzytometrie demonstriert. Gesamtmilzpopulationen von MBP gefütterten oder Kontrolltieren (5 · 10&sup6; Zellen in /ml an Proliferationsmedien) wurden in der Anwesenheit von Con-A (2 ug/ml) kultiviert. Verarmte Populationen wurden bei einer Konzentration von 2,5 · 10&sup6; Zellen pro ml kultiviert. Die resultierenden Untergruppen wurden als Modulatorzellen benutzt.
Klinische Bewertung Tiere wurden in einem Blindversuch (engl. blinded fashion) jeden Tag auf Anzeichen von EAE begutachtet. Klinische Schwere von EAE wurde wie folgt bewertet: 0 keine Krankheit; 1 hängender Schwanz; 2 Hinterbeinparalyse; 3 Hinterbeinparaplegie, Inkontinenz; 4 Tetraplegie; und 5 Tod. Zeitdauer der Krankheit wurde durch Zählen der Gesamtanzahl an Tagen vom Einsetzen der Krankheit (gewöhnlich Tag 10 oder 11 nach aktiver Immunisierung und 3 bis 5 Tage nach adoptivem Transfer der Krankheit) bis zur vollständigen Genesung jedes Tieres gemessen.
Testen auf Hypersensibilität vom verzögerten Typ (DTH) DTH wurde durch Injizieren von 25 ug an MBP in PBS subkutan in das Ohr getestet. Dicke wurde vor und nach 48 Stunden nach Injektion unter Verwendung eines Mikrometerkalipers (engl. micrometer calipers) (Mitutoyo, Japan) von einem Beobachter in einem Blindversuch gemessen.
Der Unterschied an Ohrdicke vor und nach lnkontaktbringen mit Antigen (engl. challenge) wurde für jedes Tier aufgezeichnet und das Ergebnis wurde als Durchschnitt für jede experimentelle Gruppe ± SMF ausgedrückt.
Histolosie Histologische Analyse von pathologischen Änderungen wurde in Ratten mit adoptiv transferierter EAE durchgeführt. Rückenmarke wurden an Tag 15 nach adoptivem Transfer entfernt und mit 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert. Paraffinschnitte wurden hergestellt und mit Luxol fast Blue-Hämatoxylin und Eosin durch Standardverfahren gefärbt (Sobel et al., J. Immunol. 132: 2393, 1984). In einer identischen Weise wurden Proben von Rückenmarkgewebe von jedem Tier entnommen und Anzahl an entzündlichen Foci pro Schnitt (Anhäufungen von > 20 oder mehr aggregierten entzündlichen Zellen) in Parenchym und Meninges wurden in einem Blindversuch bewertet (Sobel et al., supra).
Statistische Analyse Klinische Gradeinteilungen wurden mit einem "two tailed Wilcoxon rank sum test" zum Bewerten der Proben analysiert. Chi-Quadrat-Analyse wurde beim Vergleichen der Häufigkeit von Krankheit zwischen Gruppen benutzt und Vergleich von Durchschnitten wurde unter Verwendung des Studenten T-Tests durchgeführt. Für einzelne Experimente wurden fünf Tiere pro Gruppe benutzt.

ERGEBNISSE

Suppression von adoptiv transferierter EAE durch orale Toleranzinduktion gegen MPB Um die Wirkung von vorheriger oraler Verabreichung von MBP auf adoptiv transferierte EAE zu bewerten, wurden MBP-gefütterte und Kontrollratten intraperitoneal mit 5 · 10&sup6; MBP spezifischen, Con-A stimulierten encephalitogenen Zellinie inokuliert. MBPreaktive Zellen wurden zwei Tage nach der letzten Fütterung transferiert. Fig. 2a stellt in einem Diagramm die klinischen Werte von Tieren dar, die oral gegen MBP toleranzinduziert wurden und dann mit den MBP spezifischen Zellen (schwarze Kreise) inokuliert wurden und vergleicht sie mit den klinischen Werten von naiven Tieren, die ähnlich inokuliert wurden (offene Kreise). Wie in dieser Figur gezeigt, hat orale Verabreichung von MBP keinen Effekt auf adoptiv transferierte EAE. Die gegenwärtigen Erfinder schlagen vor, daß das Scheitern von oralen Toleranzinduktion, um adoptiv transferierte EAE zu supprimieren, auf die Tatsache zurückzuführen ist, daß die transplantierten encephalitogenen T-Zellen aktiviert sind und der Lage sind, schnell zu dem Zielorgan zu wandern, wobei sie Immunangriff initiieren, bevor eine ausreichende Anzahl an Suppressor-T- Zellen zu den Lymphknoten wandert; und (iii) zu dem Zielorgan (Hirn) wandern. So scheint das Verhältnis von regulatorischen zu encephalitogenen Zellen, die in dem Zielorgan anwesend sind und die Wahl des Zeitpunkts für ihren Eintritt kritisch zu sein.
Jedoch war adoptiv transferierte EAE supprimiert, wenn Milzzellen aus oral toleranzinduzierten Tieren mit den encephalitogenen Zellen auf native Rezipienten co-transferiert wurden (Fig. 2B), was anzeigt, daß bereits hervorgerufene Suppressor-T-Zellen erfolgreich Krankheit verhindern können, selbst wenn sie mit Immunangriffszellen zusammen verabreicht werden.
Fig. 2B stellt in einem Diagramm die klinischen Werte von Tieren dar, die mit 5 · 10&sup6; encephalitogenen Zellen und mit 1,5 · 10&sup6; Milzzellen von Tieren, die oral gegen MBP toleranzinduziert wurden, co-injiziert wurden. Für Co-transfer wurden Zellen aus oral toleranzinduzierten Tieren mit encephalitogenen Zellen gemischt und injiziert (schwarze Kreise). Wie ebenfalls in Fig. 2B gezeigt, wurde ähnliche Projektion beobachtet, wenn encephalitogene und Modulatorzellen getrennt in die rechten und linken Flanken (offene Kreise) injiziert wurden, was anzeigt, daß die protektive Wirkung nicht auf die Interaktion zwischen Suppressor-T-Zellen und Angriffs-T-Zellen zurückzuführen ist. Die klinischen Werte der positiven Kontrolltiere in Fig. 2B sind durch schwarze Quadrate angezeigt.
Suppression von adoptiv transferierter EAE ist abhängig von CD8&spplus; T-Zellen von oral toleranzinduzierten Tieren Um zu bestimmen, ob Suppression von adoptiv transferierter EAE von einer spezifischen T-Zelluntergruppe abhängig war, wurden Milzzellen von MBP gefütterten Tieren an CD4&spplus; + oder CD8&spplus; T-Zelluntergruppen vor adoptivem Transfer verarmt und als Modulatoren benutzt. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde adoptiver Transfer der Protektion durch Transfer von CD8&spplus; verarmten Milzzellen verhindert, nicht jedoch durch Transfer von CD4&spplus; verarmten Milzzellen (jeweils durchschnittlicher Maximalwert = 2, 3 ± 0,2 versus 0,7 ± 0,2, p < 0,01). Offene Quadrate: nicht selektionierte Milzzellpopulation, schwarze Kreise CD4&spplus; verarmte Milzzellen; offene Kreise: CD8&spplus; verarmte Milzzellen.
Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ assoziiert mit adoptiv transferierter EAE es wurde eine Korrelation zwischen DTH-Reaktionen und der Suppression von aktiv induzierter EAE folgend auf orale Toleranz gefunden (Miller et al., J. Exp. Med. 174: 791, 1991; Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 42211, 1992). Um zu bestimmen, ob eine ähnliche Korrelation bei adoptiv transferierter EAE besteht, wurden DTH- Reaktionen gemessen. Wie in Fig. 4 gezeigt, entwickelten sich deutliche DTH-Reaktion in Tieren, die adoptiv transferierte EAE durchliefen und DTH-Reaktionen wurden durch den Co-transfer von Milzzellen aus oral gegen MBP toleranzinduzierten Tieren supprimiert. Die supprimierten DTH-Reaktionen wurden durch Verarmung an CD8&spplus;, jedoch nicht CD4 T-Zellen vor den Transfer verhindert. (A Ohrschwellung von CD4&spplus; verarmten versus CD8'" verarmten = 0,6 ± 0,1 versus 1,8 ± 0,2, p < 0,01).
Wirkung von Co-Transfer von Zellen von oral durch MBP toleranzinduzierten Tieren auf ZNS Histologie in adoptiv transferierter EAE Orale Verabreichung von MBP supprimiert ZNS-Entzündung in aktiv induzierter EAE (Higgins et al., J. Immunol. 140 : 440, 1988). Trotzdem beeinflussen nicht alle immunspezifischen immunmodulatorischen Behandlungen von EAE, die klinische Krankheit unterdrücken, ZNS-Entzündung (Offner et al., Science 251: 4430, 1991). Wie in Fig. 5 gezeigt, gab es verringerte Entzündung in sowohl dem Parenchym als auch der Meninges, wenn Zellen von MBP-gefütterten Tieren transferiert wurden und diese Suppression wurde beobachtet, wenn CD4&spplus; verarmte, nicht jedoch CD8&spplus; verarmte Modulatormilzzellen aus oral toleranzinduzierten Tieren transferiert wurden. Anzahl an ZNS (Parenchym + Meninges) entzündlichen Foci für die spezifischen Gruppen waren wie folgt: Kontrolle = 76 ± 8,2 : MBP-gefüttert = 3,8 + 1,8 : CD4&spplus; verarmt = 2,8 ± 1,0 : CD8&spplus; verarmt = 65 ± 4: (p < 0,01, MBP-gefüttert und CD4&spplus; verarmt versus Kontrolle oder CD8 verarmt).
Suppression von aktiv induzierter und adoptiv transferierter EAE nach IV Verabreichung von MBP Wie in Fig. 6A gezeigt, supprimierte intravenöse (IV) Injektion von MBP deutlich EAE, die aktiv durch Immunisierung mit MBP/CFA (durchschnittlicher Maximalwert = 0,5 ± 0,2 versus kontrollinjiziertes Histon = 3,0 ± 0,3 : p < 0,01) induziert worden war, in einer analogen Weise zu Suppression durch orale Toleranzinduktion mit MBP. Im Gegensatz zu oraler Toleranzinduktion, die jedoch nicht gegen adoptiv transferierte EAE schützte (Fig. 2A), supprimierte IV Injektion von MBP ebenfalls adoptiv transferierte EAE (durchschnittlicher Maximalwert = 0,4 ± 0,2 versus Kontrolle = 3,2 ± 0,2; p < 0,01) (Fig. 6B). Jedoch im Gegensatz zu oraler Toleranzinduktion konnte Schutz vor Krankheit nicht adoptiv mit Milzzellen von IV toleranzinduzierten Tieren transferiert werden, wenn solche Zellen mit einer MBP-encephalitogenen Linie (durchschnittlicher Maximalwert = 2,8 ± 0,2 versus Kontrolle p = N.S.) co-transfiziert worden waren (Fig. 6B).
SuDDression von EAE nach oraler oder IV Verabreichung von MBP Peptiden Um den Mechanismus von oraler versus IV Toleranz weiter zu untersuchen, wurden MBP Peptide, die jeweils encephalitogene und nicht encephalitogene Regionen von MBP umfaßten, sowohl oral als auch intravenös vor Immunisierung für aktiv induzierte Krankheit verabreicht. MBP Peptid 71-90 von Meerschweinchen-MBP ist enzephalitogen in Lewis-Ratten (Swanborg et al., J. Immunol. 114: 191, 1975). Wie in Fig. 7 gezeigt, trat Suppression von EAE via IV Toleranzinduktion nur mit Gesamt-MBP und encephalitogenem Peptid 71-90 auf, nicht jedoch mit Meerschweinchen MBP Peptid 21-40. Orale Toleranzinduktion mit 21-40 war jedoch wirksam beim Supprimieren von EAE. Meerschweinchen Peptid 21-40 wurde ausgewählt, da Experimente zeigten, daß TGF-β Ausschüttung von TGF-β aus Milzzellen von Ratten auslöste, die oral gegen Gesamt-MBP toleranzinduziert waren. Miller, A. et al., FASEB 6: 1686, 1992. Kontrollmeerschweinchen MBP Peptid 131-'150 supprimierte rlicht, wenn entweder oral oder intravenös verabreicht. Es ist anzumerken, daß zusätzlich zu der Suppression via dem IV Weg encephalitogenes MBP Peptid 71-90 ebenfalls supprimierte, wenn es oral gegeben wurde. Dieses Ergebnis zeict an, daß Peptide, die von der immundominanten Domäne eines gegebenen MBPs gegen einen gegebenen Wirt stammen, T-Zellfunktion supprimieren können, wenn sie oral oder intravenös verabreicht werden, jedoch nicht so bei verschiedenen Mechanismen, abhängig von dem Weg und dem Protokoll der Verabreichung.
Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß es grundsätzliche Unterschiede in dem Mechanismus von Suppression von EAE zwischen oral und parenteral (z. B. intravenös) verabreichtem MBP gibt. Die Ergebnisse deuten an, daß oral verabreichtes Antigen hauptsächlich via der Erzeugung von aktiver Suppression agiert, wohingegen parenteral verabreichtes Antigen via klonaler Anergie agiert. Die Unfähigkeit von Milzzellen von IV toleranzinduzierten Tieren adoptiv transferierte EAE zu supprimieren unterstützt diese Schlußfolgerung spezifisch. Zusätzlich waren verschiedene Fragmente von MBP mehr oder weniger wirksam bei der Suppression mit den verschiedenen Verabreichungswegen (siehe z. B. Fig. 7). Die vorliegenden Kenntnisse können vorteilhaft beim Entwerten von immunsuppressiven Verfahren basierend auf antigengesteuerter Toleranz, wie das Verfahren der vorliegenden Erfindung, benutzt werden.

BEISPIEL 3: FEINEINSTELLUNG DER DETERMINATION DES IMMUNDOMINAN- TEN EPITOPS VON MENSCHLICHEM MBP IN MENSCHEN DURCH BEWERTEN DER FÄHIGKEIT VON ÜBERLAPPENDEN PEPTIDEN MBP-SPEZIFISCHE T- ZELLKLONE ZU STIMULIEREN

Unter Verwendung des in Beispiel 1 oben beschriebenen Zellproliferationstestes wurde die Fähigkeit eines Peptids, welches aus der immundominanten Domäne von menschlichem MBP besteht (d. h., die Sequenz der Aminosäuren 84-102), eingeschätzt T-Zellproliferation zu stimulieren und mit der einer Reihe von Peptiden verglichen, die Aminosäuresequenzen haben, welche N-terminale und C-terminale progressive Verkürzungen der immundominanten Domäne repräsentieren. Wie in Fig. 8 gezeigt, (und Tab. 5 unten) proliferierten die getesteten T-Zellinien mit einer N-terminalen Verkürzung bis zu Aminosäure 85, nach der es einen dramatischen Abfall in der Fähigkeit des Fragmentes gab, Proliferation zu aktivieren. Progressive C-terminale Verkürzung beeinflußt Stimulierungsfähigkeit schnell drastisch, wobei Verkürzung bis lediglich Rest 99 Epitopfunktion nicht wesentlich beeinflußt. In Abwesenheit von C-terminaler Verkürzung, wie in Fig. 8 gezeigt, scheint Verlust an Aminosäuren 85 und 86 ebenfalls von dem getesteten Klon toleriert zu werden. In Fig. 9 wurden vier verschiedene T-Zellklone mit Gesamt-MBP 84- 102 Peptid und mit Peptiden 85-99 und 86-97 in Kontakt gebracht, um zu testen, ob verschiedene Peptide Unterschiede in Proliferation von verschiedenen Klonen verursachen. Obwohl individuelle Klone inhärente unterschiedliche Fähigkeiten in der Anwesenheit eines epitopen Peptides zu proliferieren haben, war die Fähigkeit eines bestimmten Peptides Proliferation eines Klones zu verursachen trotzdem qualitativ von Klon zu Klon ähnlich. Aus diesen Untersuchungen erscheint es, daß das Fragment Aminosäuren 85-99 ein minimales immundominantes Fragment umfaßt, das in der Lage ist, T-Zellaktivität für alle T-Zellklone zu stimulieren.
Tabelle 5 unten führt die Fähigkeit von menschlichen MBP (84-102) spezifischen T-Zellklonen in der Anwesenheit von MBP (84-102) Peptid und verkürzten oder modifizierten Versionen dieses Peptides zu proliferieren auf. Die Zahlen in der Matrix sind Peptidkonzentrationen (exprimiert in Mikromolar) die 50% maximale Stimulierung der T-Zellklone ergeben. Maximale Stimulierung der T-Zellklone wurde durch lnkontaktbringen derselben mit nicht modifiziertem nicht verkürztem MBP (84-102) abgeschätzt. Der Fettdruck bezeichnet "50" und "> 50" bedeutet einen fünffachen oder mehr als fünffachen Verlust an stimulativer Aktivität verglichen mit dem nicht verkürzten nicht modifizierten MBP (84-102) Peptid. Tabelle 5
*Mehr als ein fünffacher Verlust an Aktivität verglichen mit dem MBP (84-102) Peptid.

BEISPIEL 4: T-ZELLERKENNUNG DER ALANINANALOGPEPTIDE VON MBP85-99- REAKTIVEN T-ZELLKLONEN

Fig. 11 zeigt die Bindung jedes Peptids an MHC (linke Säule) und an einen T-Zellklon (rechte Abbildung). DRB1 1501 transfizierte L-Zellen präsentieren das immundominante MPB (84-102) Peptide den autoreaktiven T-Zellen. APCs wurden mit dem MPB (84-102) Peptide (100 ug/ml) für B-Zellinien und 50 ug/ml für DR Transfektanten markiert, mit 5000 Rad bestrahlt und mit den T-Zeliklonen für drei Tage co-kultiviert, gefolgt von einer kurzen Thymidinmarkierung. Die Ergebnisse (3H-Thymidinaufnahme verglichen mit nativem Peptide) sind in schwarzen Dreiecken ausgedrückt (90% der maximalen Stimulierung) grau mit Kreuzen (> 50% der maximalen Stimulierung) hellgrau (> 10% der maximalen Stimulierung) und weiß (keine Aktivität). Die Ergebnisse zeigen, daß das Val in Position 898 und das Phe in Position 92 an MHC Bindung beteiligt sind. Verkürzungs- Daten legen nahe, daß das Isoleucin an Position 95 ebenfalls an MHC Bindung beteiligt ist. T-Zellrezeptorkontaktpunkte schließen His in 90, Phe in 91 und Lys in 93 ein.
T-ZeIlklon Hy.2E11 toleriert eine Arg Substitution anstelle von Lys in 93 aber der Ob T- Zellklone nicht. Thc vorgeschlagene Bindungsmotive für DRB1&spplus;1501 und DRBS*0101 sind in Fig. 10. Die Pfeile nach oben zeigen Bindung an den DR Rezeptor und die Pfeile nach unten zeigen Bindung an den MHC von APC an.
Eine Reihe von analogen Peptiden wird sowohl zu den konservativen als auch nichtkonservativen Aminosäuresubstitutionen in Positionen 88-95 synthetisiert werden, welche benutzt werden. Zum Beispiel wird die negativ geladene Asparaginsäure mit einem anderen negativ geladenen Rest (Glutaminsäure), einer Aminosäure mit demselben Ausmaß aber keiner Ladung (Asparagin), einer Aminosäure mit der entgegengesetzten Ladung (Lys) und zuletzt mit einer kleinen Aminosäure, wie Ala substituiert werden. Es müssen ungefähr 60 Peptide synthetisiert werden.
Vorläufige Daten deuten an, daß die 148-162 Region von MBP das minimale Epitop für das dominante Epitop 143-168 ist. Wenn die Kernregion dieses Peptids unter Verwendung der in Beispielen 2 und 3 dargestellten Verfahren definiert ist, eine ähnliche Analyse wie in diesem Beispiel 4 für MBP Peptide 85-99 dargestellt.
Analoge Peptide werden für DR26-(DRB1 1501), DR2a-(DRB5 0101), DR4, DR7 und DQ1.1 Bindung analysiert werden. Diese Analyse wird weiter aufklären, welche Aminosäurereste in MHC Bindung involviert sind. Analoge Peptide, die nicht weniger als 10-mal die Bindungskapazität des nativen Peptides haben, werden benutzt werden, um T-Zellrezeptorspezifität zu untersuchen.

BEISPIEL 5: VERFAHREN

MBP wurde aus menschlichem Himgewebe extrahiert und gereinigt und auf einer cm-52 Säule unter Verwendung des größten Molekulargewichtes (engl. molecular weight peak) (18kD), wie beschrieben, gereinigt (Chou, F. C.-H. et al., J. Biol. Chem. 251: 2671, 1976). MBP Peptide wurden unter Verwendung eines Festphaseverfahrens synthetisiert und von einem kommerziellen Labor (Biosearch Lab Inc. San Raphael, CA) erhalten und durch Hochdruck Flüssigchromatographie gereinigt. Die benutzten MBP Peptidfragmente sind unten in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6
T-Zelirezeptor TCR VB Gengebrauch wurde durch Polymerase Kettenreaktions (PCR) Amplifikation unter Verwendung einer Liste an TCR VB Primern, gefolgt von Southern Blotting bestimmt. T-Zellinien wurden aus mononukleären peripheren Blutzellen durch zwei Runden an Stimulierung mit MBP etabliert, gefolgt von Stimulierung mit einem immundominanten menschlichen MBP Peptid (Aminosäurereste 84-102), deren Immundominanz durch Proliferationstests (wie beschrieben in Beispiel 6) unter Verwendung der Tabelle 6 Liste von 13 überlappenden MBP Peptiden bestimmt worden war. Nach einer dritten Runde an Stimulierung mit ihrem spezifischen MBP Peptide wurde RNA aus MBP reaktiven T-Zellkultursedimenten (20.000-50.000 Zellen) durch Extraktion mit Guanidium-Isothiocyanat/Phenol-Chloroform und Isopropanolpräzipitation in der Anwesenheit von Träger tRNA extrahiert. Einzelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von Oligo-dT und AMV-Reverser Transkriptase (beide kommerziell erhältlich von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) synthetisiert. PCR (Polymerase Kettenreaktion wie in US Patent Nr. 4,800,159, erteilt am 24. Januar 1989; 4,683,195, erteilt am 28. Juli 1987 und 4,683,202, erteilt am 28. Juli 1987 offenbart) Amplifikation wurde unter Verwendung einer Liste von 19 Oligonukleotiden (spezifisch für veröffentlichte TCR VB Familien - VB 1-20, Tabelle 7), die der CDR2 Region der TCR B-Kette entsprachen und einem CB (konstante Region der B-Kette) Primer (Tabelle 7) durchgeführt (wie in Tilinghast, J.P. et al., Science 233: 879, 1986; Concannon, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci 83: 6598, 1986, Kimura, N. et al., J. Exp. Med. 16: 739, 1986; Toyonaga, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8624, 1985; Kimura N. et al., Eur. J. Immunol. 17: 375, 1987). Amplifikationen wurden in dreißig Zyklen (94ºC 1 Min., 55ºC 2 Min., 72ºC 3 Min.) unter Verwendung von 1 Mikrogramm jedes Primers in 50 Mikroliter-Reaktionen durchgeführt. Amplifizierte Produkte wurde auf 1% Agarosegelen getrennt, auf Nitrocellulose transferiert und Southern Blots wurden mit einer internen Oligonukleotid TCR-CB Sonde (Tabelle 7) hybridisiert. Sonden waren am Ende mit ³²P gamma-ATP und T4-Polynukleotidkinase (Bethesda Research Labs.) zu einer spezifischen Aktivität von 10&sup8;ApM(cpm)/ug markiert und wurden mit 6 · SSC/5 · Denhardt's/0,05% Pyrophosphat/100 ug/ml denaturierter DNA/0,5% SDS für 18 Stunden bei 37ºC hybridisiert. Die Blots wurden bei einer Endstringenz von 6 · SSC/70ºC gewaschen und für 2-18 Stunden autoradiographiert. T-Zellinien, die für mehr als zwei VB Segmente positiv waren, wurden als nicht von einer einzelnen MBP reaktiven T-Zelle abstammend angesehen und daher von der Analyse ausgeschlossen.
Zum Sequenzieren wurden Amplifikationen von cDNAs mit einem VB17 Primer (Tabelle 7) durchgeführt, der spezifisch für das Leadersegment, das eine interne Pst I Restriktionsschnittstelle enthielt, durchgeführt. Amplifizierte DNA wurde mit Proteinase K behandelt, Phenol/Chloroform extrahiert, Ethanol präzipitiert und mit Restriktionsendonukleasen Bgl II und Pst I verdaut (kommerziell erhältlich z. B. von Bethesda Research Labs., su ra). Gel-gereinigte DNA wurde in M13 mp 18 ligiert und einzelsträngige DNA wurde mit dem Dideoxy-Verfahren sequenziert (Sanger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74: 5463). Negative Kontrollen wurden während des Verfahrens eingeschlossen, um auf mögliche Kontamination der RNA Proben oder Reagenzien, die für cDNA Synthese und Amplifikationen benutzt wurden, zu testen. Die benutzten VB, CB und JB2.1 Primer- Sequenzen sind unten in Tabelle 7 dargestellt.
Amplifizierte und nicht amplifizierte Proben wurden getrennt behandelt, Reagenzien wurden in kleine Einheiten aufgeteilt und auf die Anwesenheit von amplifiziertem Material getestet und negative Kontrollen wurden für verschiedene experimentelle Schritte miteingeschlossen (RNA Isolierung, cDNA Synthese, PCR Amplifikation). Tabelle 7

BEISPIEL 6: IDENTIFIZIERUNG VON VB GENVERWENDUNG IN T-ZELLEN. DIE VON MS PATIENTEN ISOLIERT WURDEN

Zwei Reihen an Experimenten wurden durchgeführt, um die Gültigkeit des oben beschriebenen Ansatzes zu testen. Zuerst wurde gezeigt, daß alle Tabelle 7 Primer, ausgenommen VB 20, in der Lage waren, die DNA von peripheren Blut-T-Zellen zu amplifizieren (Fig. 12). Zweitens wurde die Spezifität von PCR Amplifikationen durch Analyse der VB Genverwendung in 69 unabhängigen T-Zellklonen untersucht, die vorher durch Einzelzellklonierung mit Mitogen etabliert worden waren (wie Phytohämagglutin, - "PHA" - und Interleukin 2). Bedingt durch die erhaltene hohe Klonierungseffizienz stellten diese Klone eine repräsentative Analyse der VB Genverwendung unter peripheren Blut-T- Zellen dar. TCR VB Genverwendung konnte für 65/69 (94,2%) dieser T-Zellklone bestimmt werden, was anzeigt, daß ein großer Anteil des TCR VB Repertoires durch die VB Primer abgedeckt war. Während 58 dieser Klone (84%) positiv für ein einzelnes VB waren, waren 7 Klone (10,1%) doppelt positiv, üblicherweise bedingt durch die Anwesenheit von zwei rearrangierten und exprimierten TCR VB Genen.
Die TCR VB Genverwendung wurde dann in fünfundsechzig MBP spezifischen T-Zellirlien analysiert, die von fünf Patienten mit klinisch definierter "relapsing-remitting" MS etabliert worden waren. Repräsentative Southem Blots von MBP reaktiven T-Zellinien sind in Fig. 12 gezeigt und VB Genverwendung für alle Zellinien, die untersucht wurden, ist in Tabelle 8 unten gezeigt. Tabelle 8 Tabelle 5 (Fortsetzung)
Einundfünfzig dieser Linien reagieren mit MBP Resten 84-102, während vierzehn T-Zellinien spezifisch für MBP Reste 143-168 waren. Einunddreißig MBP T-Zellinien, die v mit MBP Aminosäureresten 84-102 reagierten, wurden von MS Patient Hy (Patient 1 Tabelle 8) analysiert. Es wurde gefunden, daß dreiundzwanzig dieser T-Zellinien (74%) das VB17 Gensegment benutzen, während acht andere Zellinien durch entweder VB2, VB7 oder VB14 Gensegmente restringiert waren. Diese Ergebnisse zeigen an, daß VB17 das Haupterkennungselement in T-Zellinien dieses MS Patienten ist, welches mit MBP Resten 84-102 reagiert. VB17 Verwendung wurde ebenfalls unter 6/20 T-Zellinien gefunden, die von vier anderen Patienten untersucht worden waren (Patienten 2-5, Tabelle 8). Das zweite TCR VB, das von T-Zellinien von diesen vier Patienten benutzt wurde, war VB12, welches in 7/20 T-Zellinien, die mit MBP Resten 84-102 reagierten, gefunden wurde (Tabelle 8, Fig. 12). Dieses V8 ist homolog bis zu dem Maus VB8.2, welches der hauptsächlich benutzte TCR unter encephalitogenen T-Zellen in Mäusen und Ratten ist (Burns, F.R. et al., J. Exp. Med. 169: 27, 1989).
MS Patient Cy exprimierte sowohl die DR2 als auch DRw11 Antigene und hatte daher T-Zellen, die entweder die immundominante MBP Region (84-102 Reste) oder die MBP Reste 143-168 erkannten. Dies bot die Gelegenheit TCR VB Verwendung unter T-Zellen zu vergleichen, die mit verschiedenen MBP Determinanten reagieren (Fig. 12). Von sieben Linien, die auf MBP Reste 84-102 proliferierten, exprimierten drei VB12 und eine exprimierte VB17 (Tabelle 8). Im Gegensatz dazu, benutzten 6/9 T-Zellinien, die die MBP Reste 143-168 erkannten, VB14 und nur jeweils eine Linie benutzte die TCR VB12 und VB17 TCR Gene (Tabelle 8). Southern Blot Analyse von fünf T-Zellinien, die mit MBP Resten 84-102 (VB12: Cy.2C2, Cy.3F6) oder MBP Resten 143-168 (VB14: Cy.1 E6, Cy.2B12, Cy.2E2) reagierten, sind in Fig. 12 gezeigt.
Während VB12/VB13 relativ häufig unter normalen peripheren Blut-T-Zellen ist (ungefähr 18%), ist VB17 signifikant weniger häufig (ungefähr 3%), wie durch quantiative PCR abgeschätzt wurde. Im Gegensatz dazu wurde VB17 in 34/63 (53,9%) T-Zellinien gefunden, die mit MBP Resten 84-102 reagierten, während es nur in 3/32 (9,4%) TCR VB Genen in durch Mitogen zufällig gebildeten (engl. random mitogen derived) T-Zellklonen anwesend war, die durch Einzelzellklonierung aus einem normalen Individuum erhalten worden waren (Moretta, A. et al., J. Epp. Med. 157: 743, 1983; Hafler, D.A. et al., J. Exp. Med. 167 : 1313, 1988). Diese Daten zeigen an, daß der VB17 TCR selektiv in die Erkennung der immundominanten MBP 84-102 Region involviert ist.
Um zu zeigen, daß das TCR Gensegment, daß durch TCR identifiziert worden war, das VB kodierende Gen war, welches benutzt wurde, um das MBP Peptid zu erkennen, wurden zwei VB17 positive T-Zellinien (Hy.2H9 und Hy.2G5) durch limitierende Verdünnung kloniert (Moretta, supra). 11/11 einzelne Klone, die von diesen zwei Zellinien etabliert wurden, die sowohl mit MBP als auch mit MBP Resten 84-102 reagierten, waren VB17+. Drei dieser Klone wurden weiter unter Verwendung der vollständigen Liste von VB Primern analysiert und es wurde gefunden, daß sie alle für die anderen VB Segemente negativ waren.
Es wurde gefunden, daß die VB Segmente von vier T-Zellinien aus Patient Hy 100% homolog zu der veröffentlichten VB17 Sequenz waren (wie offenbart in Kimura N., et al., Eur. J. Immunol. 17: 375, 1987). Diese Sequenzanalyse bestätigt, daß spezifische VB Segemente in der Tat unter Verwendung dieses Ansatzes amplifiziert wurden. Analyse der VDJ Sequenz (Diversität-Verbindung) zeigt an, daß alle vier dieser T-Zellen das gleiche Verbindungssegement JB2.1 benutzten, und daß 3/4 von ihnen dieselbe VDJ Sequenz hatten (Tabelle 7). Um zu bestimmen, wie häufig das JB2.1 Gensegment von VB17+ T-Zellen benutzt wurde, wurden die DNAs von 20 Zellinen von MS Patient Hy unter Verwendung der VB17 Primer-Kombination mit einem CB Primer oder einem JB2.1 Primer amplifiziert (Fig. 13). Es wurde gefunden, daß alle diese Linien positiv für sowohl VB17 als auch JB2.1 Gensegmente waren, während die negativen Kontrollen (RNA extrahiert aus allen Zellinien und nicht zu cDNA konvertiert und Reagenzien, die für cDNA Synthese und Amplifikation benutzt wurden) in PCR und Southem Blotting negativ waren. Diese Daten zeigen eine starke Selektion für die VB17-JB2.1 Sequenzelemente in mit MBP Resten 84-102 reaktiven T-Zellinien, die von Patient Hy abstammen.
Zwei andere T-Zellinien, die den durch PCR-Analyse identifizierten VB17 TCR nutzten und MBP-Reste 84-102 aus MS-Patienten Fn und Ns erkannten, wurden sequenziert und mit Sequenzen von TCR VB aus MS-Patient Hy verglichen (Tabelle 8). Während die VB17-Gensegmentsequenz innerhalb T-Zellen reaktiver MBP-Reste 84-102 von diesen drei Patienten identisch waren, wurden verschiedene JB-Sequenzelemente gefunden. Drei Ergebnisse zeigen eine gemeinsame VB-Genverwendung in T-ZeIlen, die ein immundominantes-MBP-Peptid zwischen verschiedenen Individuen erkennen. Im Gegensatz dazu wurde gemeinsame JB-Gensegmentverwendung unter T-Zellen gefunden, die von demselben Individuum abstammten, jedoch nicht zwischen verschiedenen Individuen.
Vier der fünf untersuchten Patienten waren positiv für das Krankheitsassoziierte DR2 Allel, während Patient Tw HLA-DR3, DR4 war. Trotzdem waren drei VB12NB17 restringierte Zellinien unter vier analysierten Zellinien dieses MS-Patienten vorhanden (Tabelle 8), was anzeigt, daß gemeinsame MHC-Klasse II Antigene nicht obligatorisch für gemeinsame TCR VB-Genverwendung in bezug auf Erkennung von MBP-Peptid 84-102 sind.

BEISPIEL 7: IDENTIFIZIERUNG DER HAUPTIMMUNDOMiNANTEN REGION DES MBP

Ein schnelles T-Zell-Klonierungsverfahren wurde verwendet, um zu untersuchen, ob es immundominante Epitope auf menschlichem MBP, das mit Klasse II MHC-Phänotypen reagiert, gibt und die Frequenz solcher Raktivität. Eine Gesamtzahl von 15.824 kurzzeitigen T-Zellinien wurde von 51 Individuen durch Kultivieren mononukleärer peripherer Blutzellen (PMN) mit gereinigtem MBP (wie in Beispiel 5 oben erhalten) erzeugt, gefolgt drei Tage später und dann alle 3-4 Tage durch Zusatz von Interleukin-2 (IL-2) und Interleukin-4 (IL-4) (Genzyme, Boston, MA). An Tag 13 der Kultur wurde eine Probe von jeder Linie auf Reaktivität gegen MBP getestet. Linien, die mit MBP reagierten, wurden dann auf Reaktivität gegen überlappende Oligopeptid 20-mere, die die menschliche MBP-Sequenz, wie in Tabelle 6 oben gezeigt, enthalten, getestet. Für MHC-Restriktionsexperimente wurden Linien, die mit einem MBP-Peptid reagierten, für zwei weitere Zyklen re-stimuliert, zuerst mit MBP und dann mit dem spezifischen MBP-Fragment, das von der Linie erkannt wurde. In einer Untergruppe von Patienten wurde die Frequenz von T-Zellen, die Proteolipidprotein (PLP), ein anderes hauptencephalitogenes ZNS- Antigen erkennen, untersucht.
MBP- und PLP-Frequenzanalyse wurden an Patienten mit definierter "relapsingremitting" MS (wie durch Magnetische Resonanzdarstellung - "MRI" und klinische Untersuchung) durchgeführt, als auch an Patienten mit anderen neurologischen Krankheiten und normalen Individuen (alle an Alter und Geschlecht den MS-Patienten angepaßt).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8A unten gezeigt. TABELLE 8A
Patienten mit MS waren Kaukasier und hatten gut charakterisierte "relapsing-remitting" Krankheit mit mindestens zwei Steigerungen in den letzten 24 Monaten und positiven Läsionen zur Zeit der Blutentnahme, bei Magnetischer Resonanzdarstellung (MRI). Individuen mit anderen zentralnervösen Krankheiten hatten die folgenden Diagnosen: 1-3 Wochen nach entweder zerebrovaskulärem Unfall [4], Gehimtrauma mit ZNS Blutung [4]; metastasierender Himtumor [2]. Die Gesamtanzahl mit MBP oder PLP reaktiven T- Zellinien und die Gesamtzahl an erzeugten T-Zellinien sind in Tabelle 8A gezeigt ("Ag" bedeutet "Antigen"). Zusätzlich wurde die Frequenz an MBP und PLP reaktiven Linien jeweils für jedes Indidividuum getrennt berechnet durch Teilen der Anzahl an MBPreaktiven Linien durch die Gesamtzahl an erzeugten Linien und die Durchschnittswerte +/- SMF (statistischer mittlerer Fehler) sind angegeben.
Während die Frequenz an Linien, die mit allen Fragmenten von MBP reagieren, in Individuen mit MS leicht höher war, verglichen mit anderen Individuen, war dieser Anstieg jedoch statistisch nicht signifikant. Es war mehr Reaktivität gegen PLP in Patienten mit MS vorhanden im Vergleichzu Individuen mit anderen neurologischen Krankheiten, dies erreichte jedoch ebenfalls keine statistische Signifikanz.
Von einer Gesamtzahl von 302 Zellinien von Patienten mit MS, die expandiert werden und bestätigt werden konnten mit MBP in wiederholten Analysen zu reagieren, reagierten 140 (46,4%) mit MBP Resten 84-102. In den Kontrollgruppen erkannten 11 von einer Gesamtzahl von 100 MBP reaktiven T-Zellinien (11%) dieses Peptid. Die aktuelle Frequenz von T-Zellinien, die von dem peripheren Blut abstammten, welche mit jedem MBP Peptid jedes einzelnen Individuums reagierten, wurde berechnet. Die Durchschnittswerte für Patienten mit MS und die Kontrollindividuen sind in der zweiten Spalte rechts von Tabelle 2 gezeigt.
50.000 T-Zellinien wurden dreifach mit 50.000 bestrahlten APC, MNC (mononukleäre Zellen) (Hafler, D.A., et al., J. Ex. Med. 167: 1313, 1988) für 72 Stunden in Rundbodenmikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und die Vertiefungen wurden mit [³H]-Thymidin für mindestens 18 Stunden an Kultur radioaktiv markiert (engl. pulsed). APC MNC wurden entweder alleine kultiviert, mit 100 Mikrogramm/ml an synthetischem MBP-Peptid 84-102 behandelt (wurde als die optimale Konzentration von Peptid zum Induzieren von Proliferation bestimmt) oder mit 100 Mikrogramm/ml an MBP markiert.
Die durchschnittliche Anzahl pro Minute (CPM) Werte für jeweils drei sich entsprechende Vertiefungen (engl. triplicate wells) sind in Tabelle 9 gezeigt. DR und DQw Haplotypen sind angegeben und Haplotypen, die mit dem Patienten (obere Zeile) übereinstimmten, der positiv für DR2, DR7, DQw1, DQw3 war, sind unterstrichen.
Proliferation von T-Zeilinien, die eine Liste von verschiedenen mononukleären Zeiten (MNC) als Antigen Präsentierende Zellen (APC) benutzen, sind gezeigt. Fünf mit MBP- Aminosäureresten 84-102 aus Patient Hy reagierende T-Zellinien wurden durch wiederholte Zyklen an Stimulierung mit autologen bestrahlten MNC expandiert, mit synthetischem Peptid 84-102 behandelt und auf Erkennung dieser Region von MBP untersucht.
Für diese Studien wurde die Liste von fünf T-Zellinien, die mit MBP-Resten 84-102 reagierten, mit autologen APC MNC in der Anwesenheit von monoklonalen Antikörpern (mAks) (Endkonzentration von 1: 100), die verschiedene MHC-Klasse II Genprodukte erkennen wie oben ausplattiert. (Die benutzte Nomenklatur für die Antikörper ist von dem 10. Internationalen Histokompatibilitäts-Workshop; ihre Spezifität ist ebenfalls angegeben). Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 unten dargestellt. TABELLE 9
Die Frequenz von MBP-Peptide spezifischen Zellinien aus normalen Individuen und andere neurologische Krankheitskontrollen waren praktisch identisch und wurden daher für die Analyse kombiniert. Die durchschnittliche Frequenz von T-Zellinien aus Individuen mit MS, die selektiv mit MBP Resten 84-102 reagierten, war größer als mit Kontrollen (Fig. 1). Es wurden ebenfalls signifikante aber weniger bemerkenswerte Anstiege in Reaktivität gegen MBP Reste 61-82 und 124-142 in MS Patienten beobachtet, während sowohl MS, als auch Kontrollindividuen hohe Frequenzen an T-Zellinien zeigten, die mit MBP Resten 143-168 reagierten. Der DR2, DQw1 Haplotyp war sehr selten in den Kontrollindividuen und häufiger in Patienten mit MS (Tabelle 9). Eine Assoziation wurde zwischen dem DR2-Phänotypen und sowohl dem Verhältnis oder auch der Frequenz von T-Zellinien, die mit MBP-Resten 84-102 reagierten, beobachtet (Fig. 14).
Um zu bestimmen, ob T-Zellreaktivität gegen MBP-Reste 84-102 mit DR2, DQw1 Expression in nicht-MS Individuen assoziiert war, wurden zusätzliche 6 normale Individuen mit DR2, DQw1 Phänotyp untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 14 gezeigt.
Eine DR2 Assoziation wurde ebenfalls unter Kontrollen in bezug auf das Verhältnis in T-Zellinien beobachtet, die mit MBP-Resten 84-102 reagierten (DR2&spplus;Kontrollen, 31,0 ± 10-.8%; DR2-, 10,1 ± 0,4%), obwohl die Gesamtfrequenz an Linien, die mit dieser Region an MBP reagierten, geringer war als in Patienten mit MS (Fig. 14). Obwohl DQw1 in Kopplungs-Dissoziation (engl. einhage-dissociation) mit sowohl DR2 als auch mit DR1 und DRw10 vorliegt, zeigt unabhängige Analyse von Peptidreaktivität keine Assoziation mit DQw1 Phänotypexpression.
Der DRw11 Phänotyp war häufiger in Kontrollen als in Patienten mit MS (Tabelle 8A). DRw11 war positiv mit der Frequenz von Linien assoziiert, die reaktiv gegen MBP-Reste 142-168 in Patienten mit MS und Kontrollen sind, jedoch nicht mit der Frequenz von Linien, die mit MBP-Resten 84-102 reagieren (Fig. 13). Reaktivität gegen MBP-Reste 31- 50, die vorwiegend in Kontrollindividuen beobachtet wurde, war mit DRw11 assoziiert. Andere MHC-Assoziationen wurden nicht beobachtet.
Die MHC-Assoziation mit Resten der T-Zellinien, die mit einem immundominanten MBP- Epitop reagierten, wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 unten gezeigt. Spezifischer, es wurde bestimmt, ob die MHC-Haplotypen benutzt wurden, um in den T-Zellinien, die mit einem immundominanten MBP-Epitop reagierten, Antigen zu präsentieren. TABELLE 10
Monoklonale Antikörper-Blockierungsstudien von fünf T-Zellinien, die mit MBP-Resten 84-102 reagierten, legten nahe, daß DR uncl DQ-Moleküle als Restriktionselemente fungieren können. Unter Klonen, die durch anti-DR mAk blockiert wurden, proliferierte Klon 2E11 in Reaktion auf MBP-Reste 84-102 mit der Liste an DR2+APC während 2C9 und 2H9 nur mit autologen APC (Tabelle 10) proliferierten. Die Erkennung von Peptid durch Klone 1A8 und 3A10, die partiell mit anti-DQ mAks blockiert waren, waren auf APCs aus dem Responder beschränkt und ein oder zwei APC-Donorindividuen, die DQw1 exprimierten.
Um weiter die Beziehung zwischen MHC-Expression und Frequenz an T-Zellreaktivität gegen immundominante MBP-Epitope zu untersuchen, wurde eine Familie mit einem betroffenen Geschwisterteil, das sowohl DR2 als auch DRw11-Phänotypen exprimierte, untersucht.
Die Familienmitglieder eines MS-Patienten, der DR2, DQw1; DRw11, DRw52, DQw1 Klasse II MHC-Haplotypen exprimierte, wurden auf die Frequenz von T-Zellinien untersucht, die mit MBP-Resten 84-102 und 143-168 reagierten.
Eine Gesamtzahl von 1.728 individuellen T-Zellinien wurde von beiden Eltern und vier Geschwistern erzeugt und die Anzahl an Linien, die mit entweder MBP-Peptid 84-102 oder 143-168 reagierten, wurde bestimmt.
2 · 105 MNC in jedem der 288 Vertiefungen (drei Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen) wurden mit MBP (10 Mikrogramm/ml) für jedes Individuum wie oben dargestellt kultiviert. Am Tag 16 wurde jede T-Zellinie auf Reaktivität zu synthetischen Peptiden, die mit den MBP-Resten 84-102 und 143-168 korrespondierten, untersucht. Die Anzahl an Linien, die mit jedem Peptid reagierten (Stimulationsindex S1 > 3, delta ApM > 500), die pro Individuum erzeugt worden waren; werden gezeigt. Die aktuellen Stimulationsindizes waren im allgemeinen > 20, P1 und P2 = Eltern; S1 - S3 = Geschwister. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 unten dargestellt. TABELLE 11
Der DR2+, DRw11 + Patient hatte eine hohe Frequenz an T-Zellinien, die sowohl mit MBP-Resten 84-102 als auch 143-168 reagierten. Das DRw11 + Elternteil erkannte-vorzugsweise MBP-Reste 143-168, während das DR2 + Elternteil vorzugsweise MBP- Reste 84-102 erkannte. Die Frequenz an MBP-Peptid reaktiven Linien war jedoch niedriger als die von Patienten. Ein Geschwistemteil war DR2+ und erkannte vorzugsweise MBP-Reste 84-102. Vön zwei HLA-identischen Geschwistern mit DR4, DQw3/DRw6, DQw1 reagierte einer mit MBP-Peptid 84-102 während der andere es nicht tat. Obwohl DQw1 Erkennung von MBP-Resten 84-102 einschränken kann, können andere Faktoren wie vererblicher TCR-Polymorphismus T-Zellreaktivität gegen das MBP-Autoantigen in einem der DR4, DQw3/DRw6, DQw1 Geschwisterteile beeinflußt haben. Diese Familien Kopplungsanalyse legte nahe, daß optimale Erkennung von immundominanten MBP-Epitopen spezifische Klasse II MHC-Allele sowohl in Patienten mit MS als auch in Kontrollen benötig. Insgesamt deuten diese Studien an, daß, obwohl Kontrollindividuen, die DR2 exprimieren, vorzugsweise dieselbe MBP-Determinante erkennen im Vergleich zu DR2+ MS-Patienten, ihre Frequenz in dem Blut geringer als die von Patienten mit MS ist.

BEISPIEL 7A: SEQUENZIEREN VON VB17 TCR

Die T-Zellrezeptor VB17 + PCR-Produkte von sechs klonierten T-Zellinien die mit MBP- Resten 84-1 02 (Patienten Hy, Fr und Ns) reagierten wurden durch das Dideoxyverfahren, wie in Beispiel 5 beschrieben, sequenziert. Die DNAs wurden unter Verwendung von PCR-Primem für die VB17-Leadersequenz und die in Beispiel 5 oben beschriebene TCR CB-Region amplifiziert. Die amplifizierte DNA wurde in M13 kloniert und unter Verwendung des bekannten Dideoxyverfahrens (3 M13 Plaques pro T-Zellinie) sequenziert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 unten dargestellt. TABELLE 12
Es sollte oben angemerkt werden, daß die VB17-Sequenz von allen 4 T-Zellinien, die von dem MS-Patienten Hy etabliert wurden, 100% homolog zu der publizierten VB17-Sequenz sind.
Das folgende ist eine Konkordanz zwischen dem 3-Buchstaben und dem 1-Buchstabencode für Aminosäuren. Sie ist aus Bequemlichkeitsgründen dargestellt.
Asparaginsäure (Asp, D)
Glutaminsäure (Glu, E)
Lysin (Lys. K)
Arginin (Arg, FI)
Histidin (His, H)
Tyrosin (Tyr, Y)
Cystein (Cys. C)
Asparagin (Asn, N)
Glutamin (Gln. Q)
Serin (Ser. S)
Threonin (Thr, T)
Glycin (Gly, G)
Alanin (Ala. A)
Valin (Val, V)
Leucin (Leu. L)
Isoleucin (Ile. I)
Methionin (Met, M)
Prolin (Pro. P)
Phenylalanin (the. F)
Tryptophan (Trp, w)

Beispiel 8: In dem unten dargestellten Beispiel wurden die folgenden Materialien und Verfahren verwendet:

Herstellung von MBP reaktiven T-Zellklonen. Myelin Basisches Protein (MBP) reaktive T-Zellinien und Klone wurden wie vorher beschrieben hergestellt (5). T-Zellklone wurden aus MBP 84-102 reaktiven T-Zellinien durch limitierende Verdünnung (0,3 ZellenNertiefung) in v-Bodenmikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) in der Gegenwart von ug/ml PHA. P (Wellcome Diagnostics, Beckenham, UK) und 105 bestrahlten allogenen PBMC in Medium, welches aus RPMI 1640 bestand (Whittaker, Walkersville, MD), 10% vereinigtem menschlichem AB-Serum (PHS) (Biocell, Carson City, CA), 4mM Glutamin (GIBCO, Grand Island, NY), 10 mM HEPES (Whittaker), 100u/ml Penicillin/Streptomycin (GIBCO), 5% IL-2 (menschliches T Stim. Collaborative Reseach, Bedford, MA) und 1 u/ml rIL-4 (freundlicherweise von Genetics Institute, Cambridge, MA zur Verfügung gestellt) hergestellt. Klone wurden alle 8-12 Tage bei 10º/Vertiefung in Rundbodenmikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar) mit altemierenden Runden von 40 uM 84-102 markierten bestrahlten autologen PBMC und PHA/allogenen PBMC re-stimuliert. Für die hier gezeigten Experimente wurden T-Zell- klone mit Proben aus dem gleichen Einfrierungsvorgang re-stimuliert, um Drift von Langzeitkultur zu verhindern. T-Zellen wurden in 90% FCS/10% DMSO in flüssigem Stickstoff eingefroren.
MBP-PEPTID 84-102. MBP-PEPTID 84-102, Aminosäuresequenz DENPWHFFKNIVTPRTPP wurde durch das Festphaseverfahren (Biosearch Lab. Inc. San Raphael, CA) synthetisiert und auf HPLC, wie vorher berichtet, gereinigt (5).
Zellinien. Früher etablierte EBV-transformierte B-Zellinien 9010 (DR2w2, DQI) und 9009 (DR2w21, DQ1) wurden in 10% FCS vollständigem Medium herangewachsen, dann wie oben beschrieben eingefroren und unmittelbar vor Antigenmarkierung aufgetaut. Maus Fibroblast L-Zellinie, die mit DR2a (Idnd, Gabe von R. Sekaly) transfiziert war, wurde in DMEM (Whittaker), 10% FCS (Whittaker), 1,6 mM Xanthin (Sigma Biochemicals, St. Louis, MO), 110 uM Hypoxanthin (Sigma), 18 uM Mycophenolsäure (GIBCO) Selektionsmedium herangewachsen, wie oben beschrieben eingefroren und unmittelbar vor Antigenbehandlung aufgetaut. HT-2 murine IL-2 abhängige T-Zellinie (ATTC) wurde in 10% FCS vollständigem Medium mit 5% IL-2 herangewachsen und für IL-2 Biotests für zwei Tage nach dem letzten Zusetzen von Nährstoffen benutzt.
MAks. mAks, die in diesen Untersuchungen benutzt wurden, schließen CD3-spezifisches OKT3 und 2AD2, CD2-spezifisches T11&sub2; und T11&sub3; (großzügige Gaben von S. Schlossmann), HLA-DR-spezifisches L243, HLADQ-spezifisches 53/4 (großzügige Gabe von F. Bach), HLA-DP-spezifisches B7/21 (großzügige Gabe von N. Flomenberg), CD28-inaktives 9,3 (großzügige Gabe von J. Ledbetter), CD45RA-inaktives 2H4 (Schlossman), CD45R0-spezifisches UCHL-1 (Dakopatts, Glostrup, Denmark) LFA-3 und LFA-1 (großzügige Gabe von T. Springer) und CD25 Tac (großzügige Gabe von T. Waldmann) ein.
Proliferationstest. T-Zellklon (105/Vertiefung) wurde dreifach ausplattiert und mit geeigneten Stimuli, die in den Figurbeschreibungen angegeben sind, für 72 Stunden bei 37ºC, 90% Feuchtigkeit, 5% CO&sub2; in Flachbodenmikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar) co-kultiviert und mit 2 uCl[³H]TdR (2 Cl/mmole, New England Nuclear Boston, MA) für die letzten 18 Stunden der Kultur radioaktiv markiert. APCs wurden durch Markieren von B-Zellen oder L-Zellen bei 106-Zellen/ml in vollständigem Medium entweder in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 40 uM MBP 84-102 für 2 Stunden bei 37ºC hergestellt, zweimal mit 4ºC Hanks (Whittaker) gewaschen, gefolgt von Bestrahlung mit 5000 Rad. bei 4ºC. Um T-Zellen ohne akzessorische APCs zu stimulieren, wurden 2 uM MBP-Peptid 84-102 oder 10³ u/ml rIL-2 (Hoffman LaRoche, Nutley, NJ) direkt den Zellen für die Dauer der Kultur zugesetzt.
Flußzvtometrische Analyse von T-Zellen. Eine 1/100-Verdünnung des mAk-Aszites in PBS/2% PHS wurde zum Benetzen von T-Zellen bei 10&sup6;/ml für 30 min bei 4ºC benutzt. Zellen wurden zweimal mit 4ºC Markierungsmedium gewaschen, dann mit 1/60 FITC- gekoppeltem Ziegen-anti-Maus Ig (Tago, Burlinganie, CA) für 30 min bei 4ºC gefärbt. Zellen wurden zweimal wie oben gewaschen, dann mit 1% Formaldehyd fixiert (J.T. Baker Chemical Co. Phillipsburg, NJ). Flußzytometrische Analyse wurde auf einem Epics C Flußzytometer (Coulter Electronics, Hialeah, FL) durchgeführt.
B7-Transfektion. 50 ug Kpnl-linearisiertes 87-pCDM8 Konstrukt wurde mit 5 ug an Pvul-linearisiertem POP. F in L-tK-Zellen oder in DR2&spplus;L-tk&supmin;-Zellen (vorher mit DR2 transfiziert) durch Elektroporation unter Verwendung des BRL-Elektroporators bei Einstellungen von 250 V und 1600 mF co-transfiziert. Das POP. F-Plasmid enthält das Herpes simplex Virus Thymidinkinasegen unter der Kontrolle des SV40 Promotors (23). DR2 B7+-Transfektanten wurden durch Wachstum in Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (Sigma) enthaltendem Medium selektioniert und kloniert. DR2&spplus;B7&spplus;-Transfektanten wurden in Xanthin/Hypoxanthin/Mycophenolsäuremedium selektioniert und kloniert, das 150 ug/ml G418 Sulfat (GIBCO) enthielt. Klone, die Zelloberflächen B7 exprimieren, wie durch indirekte Immunfluoreszenz mit anti-B7 mAk getestet, wurden re-kloniert.
Messung von fCa&spplus;²11. Wie vorher beschrieben (22) wurden T-Zellklone (0,2 - 1,0 · 10&sup7;/ml) mit 2 ug/ml Indo-1 (Sigma) in Kulturmedium für 45 min bei 37ºC behandelt (engl. loaded). Indo-behandelte Zellen wurden 1/10 mit Medium verdünnt und bei 4ºC bis 1 min vor der FACS-Analyse gehalten. Stimulator-APCs wurden mit oder ohne 40 uM 84-102 markiert, zweimal gewaschen und in Medium bei 4ºC resuspendiert. Nicht stimulierte lndo-behandelte T-Zellen wurden für 30 Sekunden vor Zusetzen von Stimulus analysiert. Im Fall von zellulären Stimulatoren wurden Stimulator-APCs + behandelte Responder für 30 Sekunden analysiert, dann für 1 Minute bei 1500 UpM zentrifugiert, um Zell-Zellkontakte zu etablieren, dann resuspendiert und auf Reaktion analysiert. Ionomycin (100 ug/ml) (Sigma) wurde als eine Positivkontrolle für Indo-1-Behandlung benutzt.
Detektion von Cytokin mRNA durch Northern Analyse. T-Zellklon Ob.1A12.8 (105lVertiefung in Rundbodenmikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in II-2/IL-4 supplementiertem Medium) wurden in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 2 uM 84-102 für 48 Stunden herangewachsen. Zellen wurden gewaschen und in vollständigem Medium bei 2 · 1 O5/ml in der Anwesenheit oder Abwesenheit von entweder 10 ng/ml PMA und 1 ug/ml Ionomycin, 2 uM 84-102 oder 2 um 84-102 + 10 ng/ml PMA für 4 Stunden bei 37ºC resuspendiert. Geamtzell-RNA wurde unter Verwendung des RNAzoI B-Verfahrens extrahiert (TM Cinna Scientific, Friendswood, TX). 10 ug an Gesamtzell-RNA wurden durch Formaldehydgelelektrophorese unter Verwendung von 1, 2% SeaKem ME-Agarose (FMC Bioproducts, Rockland, ME) und 2, 2 M Formaldehyd fraktioniert.
Nach Fraktionierung wurde RNA auf Nytran-Membranen (Schleicher & Schuell, Keene, NH) mit einer 10xSSC-Lösung durch Kapillartransfer über Nacht geblottet. Membranen wurden in einem Vakuumofen bei 80ºC für 2 Stunden gebacken. Für Hybridisierung von Cytokinsonden wurden Membranen mit 0,5xSSC und 5% SDS bei 65ºC für 2 h vorgewaschen; dann in 50% Formaldehyd, 5xSSC, 0,5% SDS, 1x Denhardt's-Lösung, 10% Dextransulfat und 100 ug/ml Lachsspermien-DNA (Sigma) bei 42ºC für 1-2 h vorhybridisiert. Sonden für IL-2, IL-4 und γIfn (vorher beschrieben in Referenz 24) wurden zu einer spezifischen Aktivität von > 108 cpm/ug durch zufälliges Primermarkierungsverfahren (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) markiert und zu frischem Hybridisationspuffer zugesetzt. Hybridisierungen wurden bei 42ºC für 20 Stunden durchgeführt. Filter wurden in 0,2xSSC/0,1% SDS zweimal für 10 Min bei 24ºC gewaschen, dann zweimal für 30 Min bei 50ºC. Autoradiographie wurde bei -70ºC für 1-5 Tage durchgeführt. Ergebnisse
T-Zellen, die vorher mit Peptidantigen stimuliert wurden, reagieren nicht auf Antigen. Wir haben früher gezeigt, daß MBP reaktive T-Zellklone in Reaktion auf Peptidantigen in der Abwesenheit von herkömmlichen APCs durch Präsentieren von Peptidantigen auf ihren eigenen MHC Klasse II-Molekülen zu autologen T-Zellklonen proliferieren (22). Wir haben dann untersucht, ob T-Zellpräsentation von Antigen verschiedene Signalvorgänge in reagierenden T-Zellklonen involvierte im Vergleich zu herkömmlichen APCs. Wie in Fig. 15 gezeigt, reagierte T-Zellklon Ob.1A12.8 genauso gut auf MBP- Peptid 84-102, welches direkt zu der Kultur zugesetzt worden war wie mit Peptid, das an markierte (engl. pulsed) DR2+ B-Zellinie oder DR2-transfizierte L-Zellen in einem primären Proliferationstest gebunden war (Fig. 15A). Jedoch reagierten T-Zellen, die ursprünglich durch freies MBP 84-102 Peptidantigen stimuliert worden waren, nicht auf Antigenstimulierung in irgendeiner Form, wenn eine Woche später getestet (Fig. 15B, offene Kreise), während T-Zellen, die in primären Kulturen durch Peptidbehandelte B-Zellen oder DR2&spplus;L-Zellen stimuliert worden waren, normal auf die sekundäre Stimulation reagierten (Fig. 15B, geschlossene Symbole). Der Grad an Nichtreaktivität in der zweiten Stimulierung war umgekehrt proportional zu der Antigenkonzentration und der in der primären Stimulierung induzierten Proliferation.
Wir haben gefunden, daß MBP-Peptid in fünf Verschiedenen T-Zellklonen aus zwei verschiedenen Individuen, die gegen zwei verschiedene MBP-Peptidepitope reagierten, Nichtreaktivität induzierte. Nur das spezifische Peptidepitop induziert T-Zell Nichtreaktivität (Daten nicht gezeigt).
Das Zusetzen von co-stimulierenden Zellen kehrt Nichtreaktivität nicht um. Wir nahmen an, daß die Induktion von Anergie eher auf ein negatives Signal zurückzuführen war als auf das Fehlen eines co-stimulierenden Signals auf T-Zell APCs, da L-Zellen (welche wahrscheinlich keine menschlichen co-stimulierenden Moleküle haben) Anergie nicht induzierten. Jedoch wurde kürzlich gefunden, daß L-Zellen murines B7 (G. Freeman, Manuskript in Vorbereitung) exprimieren und es wurde gezeigt, daß murines B7 menschliche T-Zellen co-stimuliert (25). Um den co-stimulierenden Effekt von L-Zellen auf die Induktion von Nichtreaktivität direkt zu testen, setzen wir DR2-transfizierte L-Zellen zu der Kultur des T-Zellklons mit ungebundenem Peptidantigen zu. Um direkt die Rolle von menschlichem B7 als ein Co-stimulatormolekül zu testen, wurde das menschliche B7-Gen in DR2+ und DrZ L-Zellen transfiziert. Wie in Tabelle 5 gezeigt, reagierten T-Zellen, die für eine Woche in 84-102 kultiviert worden waren, nicht auf sekundäre Antigenstimulation, selbst wenn L-Zellen, die menschliches B7 exprimierten oder B7 und DR2 co-exprimierten, der Kultur zugesetzt wurden.
Um zu testen, ob die Nichtreaktivität, die durch Peptidantigen induziert war, durch andere Co-stimulatormoleküle als B7 umkehrbar war, setzten wir bestrahlte B7+B-Zellen, die entweder das geeignete (9010) oder nicht geeignete (9009) HLA-DR für Antigenpräsentation waren, zu der Kultur von T-ZelIklon mit MBP 84-102 zu. Fig. 16 zeigt, daß keine B-Zellinie in der Lage war, die Induktion von Anergie, die von T-Zellen, welche auf freies Peptid reagieren, verursacht wurde, zu verhindern. Wie jedoch in Fig. 15 gezeigt, führte Stimulierung mit MHC angepaßter (engl. matched) B-Zellinie 9010, die vorher mit Peptidantigen behandelt (engl. pulsed) worden war und vor Kultivierung gewaschen worden war, nicht zu der Nichtreaktivität des T-Zellklons. Obwohl der T-Zellklon Antigenreaktivität nach Inkontaktbringen mit Peptidantigen verlor, war die Reaktion auf IL-2 nicht verändert, was anzeigt, daß die Nichtreaktivität nicht auf Zelltod zurückzuführen war.
Kinetik von Aneraie-Induktion. Um die Kinetik von Ariergie-Induktion zu bestimmen, wurde sekundäre T-Zellreaktion auf MBP 84-102 Peptid und IL-2 nach einer primären Stimulierung mit Peptid von 2 bis 168 Stunden getestet. Eine mehr als zehnfache Reduktion in der Reaktion auf Antigen wurde innerhalb von 24 Stunden von MBP 84-102 Peptidkultur induziert, wobei in dieser Zeit die Hintergrundproliferation (allein) auf die von ruhenden Zellen zurückgekehrt war. Diese Nichtreaktivität wurde sogar weiter verstärkt bis > 100fache Reduktion der Reaktion über 4 Tage und wurde für die Dauer des Experimentes, 7 Tage, erhalten (Fig. 17).
Nichtreaktive T-Zellen fahren fort CD3 zu exDrimieren. Die Nichtreaktivität von Peptid-anergisierten T-Zellklonen hätte sekundär zu einem Verlust an CD3/TcR-Zelloberflächenexpression sein können. Die war nicht der Fall, da T-Zellen, die durch Kultur mit Peptidantigen nicht reaktiv gemacht worden waren, eine äquivalente CD3-Oberflächenexpression im Vergleich mit nicht anergisierten T-Zellklonen hatten (Fig. 8).
Reaktion von anercjisiertem T-Zellklon auf nichtanticaene Stimuli. Urn genauer zu definieren, welche Aktivationswege in den anergisierten T-Zellklonen defekt sind, wurden T-Zellen, die durch Peptidkultur anergisiert waren, mit Reagenzien behandelt, die Zelloberflächenantigenstimulierung entweder nachahmten oder umgingen (Fig. 19). Anergisierte T-Zellen versagten in Antwort auf entweder die Kombina#ion von αCD3 und PMA oder die CD2-mitogenen mAks T11&sub2; und T11&sub3; zu proliferieren. Im Gegensatz dazu reagierten anergisierte T-Zellen normal auf die Kombination von PMA und Ionomycin, welche das Bedürfnis für Transmembransignalisierung umgehen (26) und auf rIL-2, welches Proliferation durch einen anderen Weg stimuliert (27).
Anergisierte T-Zellen sind defekt in ihrer Fähigkeit Calcium nach Antigenstimulierung freizusetzen. Wie wir früher gezeigt haben, daß MBP eaktive T-Zeliklone intrazelluläres Calcium [CA&spplus;²]i als Antwort auf Peptid freisetzen; welches von durch Antigen markierten (engt. pulsed) T-Zellen oder B-Zellen (22) präsentiert wird, testeten wir die Fähigkeit von Peptid-anergisierten T-Zellen in diesem Test zu reagieren. Anergisierte T-Zellen haben eine deutliche Reduktion in ihrer Freisetzung von intrazellulärem [Ca&spplus;²]i als Antwort auf entweder TCR-Quervernetzung mit αCD3 oder Peptidantigen, welches durch B-Zellen präsentiert wird (Fig. 20). Im Gegensatz dazu ist die Antwort auf Ionomycin in anergisierten T-Zellklonen äquivalent zu der des nicht anergisierten T-Zellklons. Anergisierte T-Zellen versagen Cytokine in Reaktion auf Antigen herzustellen.
T-Zeliklone, die entweder allein kultiviert wurden oder mit MBP-Peptid 84-10² für 48 Stunden in einer primären Kultur anergisiert wurden, wurden in einer sekundären Kultur mit entweder Peptid, Peptid + PMA oder PMA + Ionomycin stimuliert. mRNA wurde nach 4 Stunden extrahiert und die relative Menge von IL-2, IL-4 und γIFN wurde durch Northern Blotting untersucht. Vor der Induktion von Anergie synthetisierte T-Zellklon Ob.1A12.8 IL-2, IL-4 und γIFN mRNA in Antwort auf MBP 84-102 Peptid oder auf eine Kombination von PMA + Ionomycin oder Peptid + PMA. Im Gegensatz dazu versagte der anergisierte T-Zellklon IL-2, IL4 und γIFN mRNA in Antwort auf das MBP 84-102 Peptid alleine oder auf das Peptid in Kombination mit PMA zu synthetisieren, während er bedeutende Mengen an Cytokin mRNA in Antwort auf PMA + Ionomycinstimulierung synthetisierte (Fig. 21A). Die Ergebnisse der Northem Analyse von IL-2 mRNA wurden durch einen IL-2 Biotest unter Verwendung von HT-2-Zellen bestätigt (Fig. 21 B). Anergisierte T-Zellen, die mit Peptidantigen in einer sekundären Stimulierung aktiviert wurden, sezernierten kein IL-2, wohingegen die nicht anergisierten IL-2 sezernierten, wie durch die Proliferation von HT-2-Zellen gemessen.
Herkömmliche APCs, wie Makrophagen, B-Zellen und dendritische Zellen, exprimieren konstitutiv MHC Klasse II und sind in der Lage Proteinantigen zu prozessieren und CD4&spplus; T-Zellen zu präsentieren (28). Menschliche T-Zellen, die MHC Klasse II nach Aktivierung exprimieren, sind in der Lage, Peptid oder degradiertes Antigen zu präsentieren, jedoch prozessieren sie normalerweise Gesamtantigen, was nahelegt, daß sie als "nicht herkömmliche" APCs agieren (22,29-31). Obwohl T-Zellpräsentation von MBP 84-102 in einem Proliferationstest resultiert, zeigen wir hier, daß T-Zellen, die mit Peptidantigen stimuliert sind, nicht auf sekundäre Stimulierung durch entweder Antigen oder TcR/CD3 Quervernetzung, jedoch kein IL-2 reagieren. Darüber hinaus wurde langanhaltende Antigen-Nichtreaktivität mit nicht gebundenem Peptid induziert, jedoch nicht Peptid markierte B-Zellen oder DR2+L-Zell-Transfektanten, was nahelegt, daß die Nichtreaktivität nicht nur auf eine nicht reagierende refraktorische Zeitspanne nach früherem Stimulus zurückzuführen war, wie als ein Mechanismus von hoher Dosistoleranz nahegelegt worden war (9). Wir beziehen uns auf diese Nichtreakfivität als "Anergie", da die T-Zellen nicht auf Antigenstimulierung reagieren, während sie IL-2 reaktiv verbleiben, was das ursprüngliche Kriterium war, das etabliert wurde, um den Begriff zu definieren (8).
T-Zelltoleranz kann in vitro durch chemisch fixierte APC oder immobilisierte αCD3 mAk induziert werden, wobei ein Signal durch den TcR/CD3-Komplex ohne ein zweites wesentliches Co-stimulatorsignal übertragen wird (6-8). Es ist gezeigt worden, daß das CD28 Molekül auf T-Zellen, welches mit B7 auf B-Zellen und aktivierten Makrophagen interagiert, eine Komponente des co-stimulierenden Signalweges ist, der notwendig für T-Zellaktivierung ist und es ist postuliert worden, daß die Abwesenheit von 87 Co- Stimulierung zu Anergie führen kann (14-16). Jedoch scheint T = Zellanergie, die durch Selbst-T-Zellpräsentation von MBP-Peptid induziert ist, in der Anwesenheit von Co-stimulierung aufzutreten, da das Zusetzen von entweder B7-Tansfektanten oder EBVtransformierten B-Zellen, welche große Mengen an B7 exprimieren, nicht in der Lage war, die Induktion von Nichtreaktivität zu verhindern. Außerdem sind B-Zellen, die den geeigenten MHC haben und als nicht-toleranzinduzierende APCs in der Abwesenheit von freiem Antigen wirken und wahrscheinlich um Präsentation von Peptidantigen mit T-Zellen während der Kultur kompetitieren, nicht in der Lage, die Induktion von Nichtreaktivität zu überwinden. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Induktion von Anergie durch T-Zellpräsentation von Peptidantigen eher in einem negativen Signal als dem Verlust einer positiven Co-stimulierung resultiert. Diese Ergebnisse haben ebenfalls praktische Bedeutungen für das Wachstum von antigenspezifischen T-Zellinien und Klonen, die in der Abwesenheit von freiem Peptidantigen re-stimuliert werden sollten, um den Verlust von Antigenreaktivität zu verhindern.
Der Mechanismus von Anergie, die durch T-Zellpräsentation von Autoantigen induziert wurde, wurde untersucht. Anergisierte T-Zellen haben eine deutliche Verringerung in ihrer Fähigkeit [Ca&spplus;²]i in Antwort auf entweder APCs oder αCD3 mAk Quervernetzung auszuschütten. Zusätzlich stellte Behandlung mit der Kombination von PMA und Ionomycin die Cytokinherstellung und Proliferation von anergisierten T-Zellen vollständig wieder her, was nahelegt, daß die Signalvorgänge, nach PKC-Aktivierung und [Ca&spplus;²]i Freisetzung normal sind. So ist das Stadium an Anergie, wie durch Änderungen in Signalübertragung in unserem System definiert, verschieden zu Studien über in vitro klonale Anergie von Jenkins und Schwartz, wo keine Signaldefekte in Membran-nahen Vorgängen beobachtet wurden (32, 33). Der Mechanismus von T-Zellanergie, die durch T-Zellpräsentation von Antigenen induziert wird, erscheint ähnlich den Studien von transgenen Mäusen, in welchen autoreaktive T-Zellen, die in die Peripherie entweichen, versagen [Ca+Z]i in Antwort auf TcR Signalisieren freizusetzen, jedoch in der Lage sind, in Antwort auf die Kombination von PMA und Ionomycin zu proliferieren (21). Daher erscheint es mindestens zwei verschiedene Stadien an funktionell definierter Anergie zu geben. Ebenso wie Zellfransformation durch die Änderung von ein oder mehreren Molekülen, die einen Signaltransduktionsweg einer Zelle regulieren, auftreten kann, kann das Phänomen von T-Zellanergie durch mehrere verschiedene Mechanismen erreicht werden, welche verschiedene Stadien der T-Zellaktivierung beeinflussen.
O'Hehir und Mitarbeiter haben gezeigt, daß T-Zell-Nichtreaktivität, die durch Peptid oder Superantigen induziert wird, als eine Abnahme in Oberflächenexpression von CD3 zusammen mit einem Anstieg in CD25 16 Stunden nach dem Zusetzen von Peptidantigen charakterisiert werden kann (34, 35). Wir haben ebenfalls eine bescheidene Abnahme in CD3ITCR-Expression und Anstieg in CD25-Expression zu diesem frühen Zeitpunkt beobachtet, wahrscheinlich bedingt durch T-Zellaktivierung (Daten nicht gezeigt). Wir finden jedoch, daß nach 4 Tagen anergisierte T-Zellen äquivalente Zelloberflächendichte an CD3 haben wie nicht-anergisierte T-Zellen (Fig. 18). Dies deutet an, daß Anergie nicht einfach als die Reduktion von Zelloberflächen CDSITcR erklärt werden kann.
Wie wir bei der Mehrheit von menschlichen T-Zellklonen, die aus peripherem Blut (24) abstammen, gesehen haben, scheint T-Zellklon Ob.1A12.8 in seiner Fähigkeit Cytokine von sowohl den TH&sub1; und TH&sub2; Untergruppen in Antwort auf Mitogenstimulierung herzustellen, ein TO-Phänotyp zu sein (36). Anergisierte T-Zellen waren nicht in der Lage IL-2, IL-4 oder γIFN mRNA zu synthetisieren oder meßbares IL-2 in Antwort auf Antigenstimulierung zu sezernieren, egal ob mit oder ohne PMA, während das Zusetzen von sowohl Ionomycin als auch PMA Cytokinsynthese erzeugte. Diese Ergebnisse stimmen überein mit sowohl Proliferation als auch Ca&spplus;² Flux Daten, was nahelegt, daß die Blockierung beim T-Zellsignalisieren ein Vorgang vor Ca&spplus;²-Mobilisierung ist. Das negative Signal, das durch T-Zellen in Antwort auf Peptidantigen erzeugt wird, muß noch bestimmt werden, sowie der tatsächliche biochemische Signalvorgang, der in diesen anergisierten T-Zellen verändert ist.
Eine Hauptfrage der Immunologie bezieht sich darauf, wie aktivierte Autoantigen reaktive T-Zellen während einer Entzündungsantwort reguliert werden. In früheren Arbeiten haben wir gezeigt, daß T-Zellen in der Lage sind, Peptidantigen und teilweise degradiertes natives MBP zu präsentieren, obwohl sie nicht in der Lage sind hochreines MBP zu prozessieren und zu präsentieren (22). Dies führte uns dazu zu spekulieren, daß aktivierte T-Zellen an einer Entzündungsstelle (wie ein De-Myelinisierungsplaque im Gehirn) in der Lage sein können, Fragmente von MBP anderen T-Zellen an der Stelle zu präsentieren. Die Demonstration, daß T-Zellpräsentation von Peptidantigen zu klonaler Nichtreaktivität führt, legt nahe, daß dieser Mechanismus der Toleranz sich entwickelt haben könnte, um autoreaktive T-Zellen an der Entzündungsstelle daran zu hindern, klonal zu expandieren, um Eigengewebe zu beschädigen. Eine hohe extrazelluläre Konzentration an degradiertem Protein wäre charakteristisch für Selbst-Antigen, während Fremdantigen nach der anfängliche in situ Immunantwort in einer geringeren Konzentration vorhanden wäre und in herkömmliche APCs zum Prozessieren und Präsentation internalisiert würde. Auf diesem Wege würde nicht geeignete Antigenpräsentation durch T-Zellen, die das Antigen präsentieren aber nicht prozessieren können, zu Anergie anstatt zur Aktivierung des reagierenden T-Zellklons in einer Entzündungsstelle führen, wo degradiertes Selbstantigen erhältlich ist.
Zusammenfassend präsentieren wir Hinweise für einen Mechanismus, um die anfängliche Beobachtung von Lamb und Feldmann (10,11) zu erklären, daß Vorbehandlung von T-Zellklonen mit Peptidantigen zu Antigen-Nichtreaktivität führt. Anergie steht in bezug zu der Expression von MHC Klasse II durch aktivierte menschliche T-Zellen, welche in der Lage sind, Peptidantigen autologen T-Zellen zu präsentieren. Obwohl diese Interaktion zu einer primären Stimulierung der T-Zellen führt, werden sie nicht reaktiv auf nachfolgende Stimulierung innerhalb von 24 Stunden der Peptidvorbehandlung gemacht. Der Signaldefekt in anergisierten T-Zellen ist nahe der Membran, da Peptidbehandelte T-Zellklone in ihrer Fähigkeit [Ca&spplus;²]i zu entlassen, Cytokine zu produzieren und auf Antigenstimuli zu proliferieren, inhibiert sind, jedoch eine normale Reaktion auf Behandlung mit PMA und Ionomycin zeigen. TABELLE 13
Tabelle 13. Anergie tritt in der Anwesenheit von B7 akzessorischen Zellen auf T-Zellklon Ob.2F3 wurde für 7 Tage in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 5 ug/ml 84-102 mit oder ohne die Zugabe von 104/Vertiefung L-Zellen (bestrahlt bei 5000 Rad) mit Expression von DR2 und/oder B7 transfizierten Molekülen kultiviert. L-Zellinien mit und ohne Expression von DR2 wurden mit B7 transfiziert. Durchschnittliche Fluoreszenzintensität war 77,2 (Maus Ig-PE) und 215,6 (B7-PE) für die DR2&spplus;B7&spplus;-Linie und 56,8 (Maus Ig-PE) und 158,6 (B7-PE) für die DR2-B7+-Linie. Nach der primären Kultur wurden T-Zellen gewaschen und auf Proliferation gegen 84-102 getestet.
Liste an Referenzen, die zur Beschreibung in Beispiel 8 gehören.
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Die vorliegende Erfindung wurde durch Referenz zu spezifischen Beispielen illustriert.

Claims

1. Peptid, das aus dem gesamten Fragment 84-102 von hMBP oder einem Teil davon besteht, wobei das Peptid mindestens Fragment 85-99 von hMBP umfasst, das einen Alaninrest an Position 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 enthält, wobei das Peptid die Eigenschaft hat, in vitro die Proliferation von T-Zellen zu stimulieren, die von MS-Patienten stammen und die das gesamte Fragment 84-102 von hMBP erkennen.

2. Peptid nach Anspruch 1, wobei der Teil aus den Resten 85-99 von hMBP besteht.

3. Peptid nach Anspruch 2, das eine Alanin-Substitution an Position 90 (His), 91 (Phe) oder 93 (Lys) aufweist.

4. Peptid nach Anspruch 2, das eine Alanin-Substitution für das in MBP an Position 93 vorliegende Lysin aufweist.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine oral wirksame Menge eines Peptids nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4 und einen physiologisch verträglichen Träger oder ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel umfasst.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die wirksame Menge im Bereich von etwa 10 mg bis 20 mg liegt.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine parenteral wirksame Menge eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen physiologisch verträglichen Träger oder ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel umfasst.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die wirksame Menge im Bereich von etwa 1 mg bis 200 mg liegt.

9. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Herstellen eines Medikaments zum Verändern der Immunfunktion von CD4T-Zellen, die mit myelin-basischem Protein reaktiv sind, bei einem Säuger, der an multipler Sklerose leidet, wobei das Peptid über die parenterale Route appliziert und in einer Menge verabreicht wird, die bewirkt, dass die Immunfunktion verändert wird.

10. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Herstellen eines Medikaments zum Unterdrücken einer Autoimmunantwort bei einem Säuger, wobei es sich um die Art von Autoimmunantwort handelt, die bei multipler Sklerose festgestellt wird, wobei das Peptid oral verabreicht wird.