DE69505376T2

DE69505376T2 - Alpha b crystallin zur verwendung in diagnose und therapie von autoimmunkrankheiten, besonders multipler skerose

Info

Publication number: DE69505376T2
Application number: DE69505376T
Authority: DE
Inventors: Mustapha El Nl-2288 Gj Rijswijk Ouagmiri; Johannes M. Nl-2288 Gj Rijswijk Van Noort; Arianne C. Nl-2288 Gj Rijswijk Van Sechel
Original assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Current assignee: Delta Crystallon BV
Priority date: 1994-06-09
Filing date: 1995-06-08
Publication date: 1999-04-08
Anticipated expiration: 2015-06-09
Also published as: AU696637B2; DK0764273T3; WO1995033997A1; EP0764273B1; EP0764273A1; US20100291119A9; ES2125618T3; AU2579995A; JPH10501888A; ATE172304T1; CA2192468A1; DE69505376D1; JP3558347B2; US20050013824A1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, insbesondere das Gebiet der Auto-Immunerkrankungen. Ganz besonders betrifft sie die Diagnose und Therapie von Auto-Immunerkrankungen, speziell von Multipler Sklerose. Auto-Immunerkrankungen sind Erkrankungen, bei denen der Abwehrmechanismus des Körpers gegen unerwünschte Materialien, wie Bakterien, Viren usw., die Fähigkeit verliert, zwischen unerwünschtem und Selbst-Material zu unterscheiden, und Teile des eigenen Materials angreift, was zur Zerstörung von essentiellen Geweben und Funktionen führt. Um ein besseres Verständnis der Erfindung zu ermöglichen, wird nachfolgend eine kurze Einführung gegeben, wie dieser Abwehrmechanismus funktioniert.

Das Immunsystem und seine Kontrolle

Das Immunsystem von Mensch und Tier ist ein fein ausbalanciertes System, das darauf ausgelegt ist, Pathogene und Fremdsubstanzen zu überwachen und aus dem lebenden Körper zu entfernen. Jeden Tag wird jedes Individuum mit zahlreichen unterschiedlichen Bakterien, Viren oder anderen Substanzen konfrontiert, die normale Körperfunktionen gefährden können, wenn sie innerhalb von Körpergeweben vorliegen oder sich sogar darin vermehren. Immunologen bezeichnen jedes proteinhaltige Material, das dem Körper selbst fremd ist, als "Antigen". Das Immunsystem umfaßt eine Vielzahl unterschiedlicher Zellen, die auf Antigene aus jeder nur denkbaren Quelle reagieren oder antworten können.
Spezifische Antworten des Immunsystems werden durch einen bestimmten Typ von Zellen kontrolliert, die als T-Helferzellen bezeichnet werden und als überwachende und regulatorische Zellen wirken. Solche T-Helferzellen können zytotoxische T-Zellen (um betroffene Zellen oder Gewebe zu zerstören), B-Zellen (um Antikörper zu produzieren und zu sezernieren) oder Makrophagen (um Material zu ingestieren und Protein-abbauende Enzyme und schädigende oxidative Radikale zu sezernieren) aktivieren. Folglich spielen T-Helferzellen eine zentrale Rolle bei der Bestimmung, wann das Immunsystem in Aktion tritt und gegen genau welche Strukturen es gerichtet sein wird.
Dieses letztgenannte Element, die Ziel- oder Target-Spezifität der Immunantwort, wie sie von T-Helferzellen wahrgenommen wird, wird durch eine strukturelle Probe des Antigens, nämlich davon abgeleitete Proteinfragmente, definiert. Als eine Regel nehmen T-Helferzellen eine Überprüfung oder ein Screening auf die Anwesenheit von Antigen vor, indem Sätze von Proteinfragmenten untersucht werden, die diesen durch sogenannte akzessorische Zellen, häufig Makrophagen, präsentiert werden. Solche akzessorischen Zellen ingestieren Antigen und verdauen das Material teilweise durch Protein-abbauende Enzyme unabhängig von der Natur oder Quelle des Antigens. Als nächstes werden resultierende, von dem Antigen abgeleitete Proteinfragmente abgefangen (nach wie vor innerhalb der akzessorischen Zelle) durch spezielle Proteine, die dazu ausgelegt sind, Proteinfragmente einzufangen und zu präsentieren. Diese Proteine, die in der Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II-Region im Genom kodiert werden, werden als Klasse II-MHC-Proteine bezeichnet. MHC-Proteine, die in einem Komplex mit einem Proteinfragment, das aus den Abbauprozessen innerhalb der akzessorischen Zellen hervorgeht, im Verhältnis 1 : 1 gebunden sind, werden an der Oberfläche exponiert und können an der Zelloberfläche für Tage vorliegen. Folglich werden sie sich vorbeibewegenden T-Helferzellen eine strukturelle Probe von Antigenen in Form der eingefangenen Proteinfragmente präsentieren [1].
Das Immunsystem umfaßt eine Population von T-Helferzellen, von denen jede eine Oberflächenrezeptorstruktur mit ihrer eigenen individuellen Ziel- oder Target-Spezifität aufweist [2]. Gemeinsam jedoch sind die vielen Millionen von unterschiedlichen T- Helferzell-Rezeptoren auf den verschiedenen Zellen in der Lage, praktisch jedes Proteinfragment zu erkennen. Dies ist eine Voraussetzung für die Fähigkeit des Immunsystems, eine endlose Vielzahl von strukturell unterschiedlichen Entitäten zu erken nen. Zugleich wirft dies jedoch ein signifikantes Risiko auf, das Antworten auch gegenüber Strukturen auftreten körnen, die zum Körper selbst gehören. Eine genaue Balance zwischen einem Antworten oder Reagieren auf ein möglicherweise pathogenes Antigen und einer Toleranz gegenüber den körpereigenen Geweben ist für ein gesundes Immunsystem entscheidend [3].
Unglücklicherweise wird die Balance zwischen Aggression und Toleranz nicht immer aufrechterhalten. Insbesondere können gewebespezifische Strukturen innerhalb des Körpers das Ziel von autoreaktiven Immunantworten werden und es kann eine Erkrankung folgen [4]. Im Falle von aberranten Antworten gegenüber Insulin produzierenden Langerhans'-Inseln innerhalb der Bauchspeicheldrüse kann Insulin-abhängiger Diabetes resultieren. Wenn Knorpelstrukturen angegriffen werden, tritt in der Folge rheumatoide Arthritis auf, und wenn etwas innerhalb der weißen Substanz des Gehirns das Immunsystem triggert, kann sich Multiple Sklerose entwickeln. Obwohl diese Erkrankungen zu recht unterschiedlichen Symptomen bei den betroffenen Patienten führen, nehmen Immunologen an, daß diese ähnliche Ursprünge haben: eine unkontrollierte und andauernde Immunantwort gegen ein oder mehrere Antigene innerhalb der körpereigenen Gewebe: Autoimmunität.
In der westlichen Welt leiden ungefähr 3% aller Menschen unter Autoimmunantworten. Ungefähr einer von tausend leidet unter Multipler Sklerose (MS). MS ist gekennzeichnet durch verstreute Entzündungsbereiche (Läsionen) innerhalb der weißen Substanz des Zentralnervensystems, Gehirns und Rückenmarks [5]. Diese weiße Substanz wird hauptsächlich aus einem Material gebildet, das für Gewebe des Zentralnervensystems (ZNS) spezifisch ist, nämlich Myelin, das um Axone in Schichten von isolierenden Membranen herumgewickelt ist. Nervensignale, die jede vorstellbare Körperfunktion steuern, laufen durch Axone von einer Nervenzelle zu einer anderen. Anders als Strom durch einen elektrischen Draht wird jedoch die Signalweiterleitung in dem ZNS durch sogenannte saltatorische Erregungsleitung erzielt. Elektrochemische Poten tiale werden nicht allmählich entlang der gesamten Axonlänge transportiert, sondern springen zwischen kleinen Stellen nackter Axone (Ranvier-Schnürringe), die zwischen den Abschnitten aus Myelin vorliegen.
Durch Springen von Stelle zu Stelle ist die Nervensignalweiterleitung im Zentralnervensystem schnell und effizient. Bei MS verursachen fokale Entzündungsantworten in ZNS den Abbau der Myelinschicht und ihre vollständige Entfernung von Axonen. Entmyelinisierte Axone werden viel weniger effizient bei der Nervensignalweiterleitung, da der saltatorische Weiterleitungsmodus nicht länger möglich ist. Nervensignale benötigen folglich mehr Zeit, um sich über die erforderlichen Entfernungen fortzubewegen, und sie verlieren einen Teil ihres Potentials entlang des Weges. Sogar wenn die Entzündungsantwort vorübergeht, bleibt Schaden bestehen, da eine erneute Myelinisierung von nackten Axonen nur in einem sehr begrenzten Ausmaß stattfindet. Statt dessen entwickelt sich Narbengewebe. Dies ist der Grund dafür, daß sich der Schaden im ZNS als das Ergebnis von MS langsam akkumuliert.
Es wird allgemein angenommen, daß das Ziel-Antigen für die Auto- Immunantwort bei MS im ZNS-Myelin zu finden ist [5, 6]. Myelin besteht aus Plasmamembranen differenzierter Oligod·endrozyten, die zu ungefähr 75% Lipide und zu ungefähr 25% Proteine enthalten [7]. Da T-Helferzellen nur auf Proteinfragmente ansprechen, wird für die verschiedenen Lipidkomponenten von Myelin keine Hauptrolle beim Triggern von Autoimmunantworten erwartet. Die 25% ausmachende Proteinmasse von Myelin weist jedoch eine hochgradig komplexe Zusammensetzung auf. Mehrere Komplexitätsniveaus können unterschieden werden.
Zunächst enthält ZNS-Myelin eine große Anzahl verschiedener Proteine. Es existieren vorherrschende Proteinkomponenten, nämlich basisches Myelinprotein (MBP) und Proteolipidprotein (PLP), die ungefähr 15 bzw. 35% der gesamten Proteinmasse ausmachen.
Zusätzlich wurde jedoch gefunden, daß eine Vielzahl anderer Proteinkompenenten spezifisch mit ZNS-Myelin assoziiert ist. Einige dieser Proteine sind Gegenstand von Untersuchungen infolge der Verfügbarkeit monoklonaler Antikörper gewesen. Diese sind beispielsweise Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG) und Myelin/Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG), die nur sehr geringe Mengen der Proteinmasse in der Größenordnung von weniger als 1 ausmachen. Zahlreiche andere Proteine, einschließlich einer Vielzahl unterschiedlicher Enzyme, sind ebenfalls in Myelin gefunden worden [im Überblick dargestellt in 8].
Zweitens haben molekularbiologische Studien von Myelinproteinen übereinstimmend die Anwesenheit verschiedener Isoformen aufgedeckt [im Überblick dargestellt in 9]. Mehr als Regel als eine Ausnahme können primäre Transkripte von Myelinproteinen differentiell zu unterschiedlichen Isoformen gespleißt werden. Solche Molekülspezies unterscheiden sich voneinander in der Anzahl von Exons, die sie repräsentieren. Beispielsweise ist gegenwärtig bekannt, daß MBP in mindestens sechs verschiedenen Isoformen in der Maus existiert.
Drittens enthält jedes bis heute untersuchte Myelinprotein mindestens einen Typ posttranslationaler Modifikation. Diese Modifikationen umfassen Acetylierungen, Acylierung, Glykosylierung, Methylierung, Phosphorylierung usw. Schließlich können sowohl die Isoformexpression als auch das Ausmaß und die Mustbr posttranslationaler Modifizierungen mit der Zeit variieren gemäß der Entwicklungsstufe oder der Gesundheit. Bei der Entwicklung von Mäusen können konstant unterschiedliche Verhältnisse verschiedener MBP-Isoformen im Gehirn festgestellt werden. Wenn die Tiere Infektionen im ZNS erleiden, können sich solche Muster ändern und es können unterschiedliche Modifizierungen auftreten. Ohne jegliche zusätzliche Information kann nicht angenommen werden, daß irgendein einzelnes Myelinprotein ein antigenes Ziel oder Target von höherer Relevanz darstellt als jedes andere Myelinprotein. Das Vorliegen von z. B. MBP oder PLP in so großer Menge allein impliziert nicht unmittelbar, daß diese Proteine eine höhere Immunogenität als andere Myelinkomponenten aufweisen. Zahlreiche Beispiele existieren, die zeigen, daß T-Helferzellantworten gegenüber Proteinmischungen ebenso gut gegen in sehr geringen Mengen vorliegende Komponenten gerichtet sein können [8]. Trotz dieser Überlegungen ist ein großer Teil der Anstrengungen bei der immunologischen Forschung an MS MBP gewidmet worden. Ohne jeden Zweifel hat die einfache Tatsache, daß MBP ein wasserlösliches und leicht verfügbares Protein für experimentelle Studien ist, eine hauptsächliche Rolle bei dessen Auswahl als in Frage kommendes Autoantigen gespielt.
Jedoch gibt es bislang keinen Nachweis, daß ein bestimmtes der vorstehend erwähnten Proteine ein hauptsächliches Autoantigen bei Auto-Immunerkrankungen, insbesondere MS, darstellt.
Aus den vorstehenden Erläuterungen ist die Notwendigkeit offensichtlich, ein solches Autoantigen zu identifizieren, wenn auch nur, um in der Lage zu sein, MS in einem viel früheren Stadium zu diagnostizieren und vernünftige Interventionsstrategien zu entwickeln. Darüber hinaus kann die Kenntnis des Autoantigens dazu verwendet werden, spezifische Therapien für MS anstelle der unspezifischen Immunmodulation, die gegenwärtig eingesetzt wird, zu entwickeln. Beruhend auf dem Autoantigen wird es möglich sein, Impfstoffe oder Pläne zur Induktion von Toleranz zu entwickeln [10-12]. Die vorliegende Erfindung stellt einen wichtigen Kandidaten für ein hauptsächliches Autoantigen bei der Entwicklung von MS und ein Ziel für Diagnose und therapeutische Intervention bereit.

Ein hochgradig immundominantes ZNS-Myelinprotein: alpha B Cry- stallin

Durch Einsatz einer neuen Strategie für die Untersuchung von Myelin-reaktiven humanen T-Helferzellen ist jetzt ein neues Antigen identifiziert worden, das wahrscheinlich als entscheidendes Autoantigen bei Entzündungsantworten bei MS dient.
In früheren, im Laufe der Jahre dokumentierten Studien bestand die Strategie stets darin, ein individuelles Protein aus ZNS- Myelin zu reinigen und nachfolgend dessen Fähigkeit zum Triggern von T-Helferzell-Antworten beim Menschen oder entmyelinisierenden T-Zell-Antworten bei Labortieren zu untersuchen. Obwohl auf diese Weise relevante Informationen über die Wirkprinzipien von Auto-Immunerkrankungen erhalten werden konnten, betrafdiese Strategie niemals die entscheidende Frage, ob das ausgewählte Antigen tatsächlich immundominant für T-Helferzellen im Kontext aller Myelinproteine zusammen war oder nicht. Bisher ist es sehr wahrscheinlich, daß eine Anregung ("challenge") des Immunsystems mit sämtlichen Myelinproteinen zur gleichen Zeit dem nahe kommt, was bei MS passiert, zumindest bei einer andauernden Erkrankung.
Trotz der Meinung, daß ein verständlicher Vergleich aller jeweiligen Immunogenitäten von Myelinproteinen seit langem sinnvoll sei, hat dessen technische Umsetzung stets ernsthafte Probleme aufgeworfen. Ein Hauptproblem bestand in der Tatsache, daß die meisten der Myelinproteine, die Membranproteine sind, sehr hydrophob und in wäßriger Lösung schlecht löslich sind. Nach wie vor ist die Löslichkeit in wäßriger Umgebung eine strenge Voraussetzung zum Ausführen immunologischer Assays an diesen Proteinen. Wir haben unlängst die mit einer schlechten Löslichkeit verbundenen Probleme umgangen, indem wir eine erschöpfende Protein-Delipidisierung mit einem quantitativen Zwei-Schritt-Transfer sämtlicher ZNS-Myelinproteine von organischen Lösemitteln zu wäßrigen Lösungen ohne Verlust von deren Löslichkeit kombiniert haben [13]. Als Ergebnis sind wir in der Lage gewesen, sämtliche Proteine für immunologische Studien verfügbar zu machen. Ebenfalls konnten delipidisierte Myelinproteine durch Umkehrphasen- HPLC mit einer Auflösung oberhalb jener, von der bislang berichtet worden war, aufgetrennt werden (siehe Fig. 1). Auf diese Weise konnte eine Vergleichsstudie durchgeführt werden, in der T-Helferzell-Antworten in Antwort auf aufgetrennte Myelinproteine nach einer ersten Anregung ("priming") der T-Zellen mit sämtlichen ZNS-Myelinproteinen in einer einzelnen Präparation untersucht wurden.
Darüber hinaus wurde die Untersuchung in parallelen Experimenten unter Verwendung von menschlichen Myelinproteinen aus von MS betroffenen Gehirnen in einem Satz von Untersuchungen und von Myelinpräparationen aus Kontrollgehirnen in einem anderen ausgeführt. Unter Verwendung dieser Sätze von Anregungs ("priming")/ Test-Antigenen wurden T-Zellen des peripheren Bluts von 27 unterschiedlichen Patienten hinsichtlich proliferativer Antworten auf die fraktionierten Myelinproteine untersucht. Diese neue Strategie hat unerwartete und sehr nützliche Daten geliefert. Sie sind in Fig. 2 (beigefügt auf einem separaten Blatt) angegeben.
Zuerst erwiesen sich T-Helferzellen von allen Spendern als reaktiv hauptsächlich gegenüber in geringeren Mengen vorliegenden Myelinproteinen, wohingegen nur sehr schwache Antworten gegenüber jeweils einem der zwei vorherrschenden Komponenten MBP oder PLP detektiert wurden. Diese geringfügige Antwort gegenüber den hauptsächlichen Proteinkomponenten wurde bei T-Zellen gefunden, die sowohl von gesunden als auch von von MS betroffenen Spendern abgeleitet worden waren. Zweitens und am wichtigsten wurde ein überraschender Unterschied bei Antworten gegen aus von MS betroffenem Gehirn isolierten Myelinproteinen beobachtet. Nur wenn dieser Satz von Proteinen als Test-Antigene verwendet wurde, zeigte es sich, daß eine vorherrschende proliferative T-Zell- Antwort gegen eine einzelne HPLC-Proteinfraktion in allen untersuchten Fällen gerichtet war. T-Zell-Proben von gesunden Spendern und von MS-betroffenen Spendern zeigten übereinstimmend die höchste Antwort gegenüber dieser speziellen Proteinfraktion.
Eine genaue Untersuchung dieser Proteinfraktion ergab, daß sie nahezu ausschließlich ein 23 kDa-Protein enthielt, das bei einer Sequenzierung als humanes alpha B Crystallin identifiziert wurde. Obwohl eine direkte Sequenzierung des gereinigten Proteins aufgrund einer N-terminalen Modifizierung unmöglich war, ergaben sechs davon abgeleitete tryptische Peptide übereinstimmend Sequenzen, die mit alpha B Crystallin identisch waren (Tabelle 1). Das Protein enthält 175 Aminosäuren; zwischen der menschlichen und der Rinder-Form des Proteins sind nur vier Aminosäuren unterschiedlich. Die Aminosäuresequenz von humanem alpha B Crystallin ist in Fig. 3 angegeben.

Alpha B Crystallin als Autoantigen bei MS

Bis 1989 wurde angenommen, daß Crystalline, einschließlich alpha B Crystallinen, Proteine seien, die ausschließlich in der Augenlinse lokalisiert sind. Beim Durchmustern unterschiedlicher Gewebe mit Antiseren gegen alpha B Crystallin wurde jedoch dessen Anwesenheit auch in quergestreiftem (Skelett-)Muskel, Niere und ZNS-Gewebe festgestellt [14, Kato et al., J. Biol. Chem. 267 (11), 1992, 7718-7725]. Innerhalb des normalen ZNS wird alpha B Crystallin hauptsächlich in in der weißen Substanz lokalisierten Oligodendrozyten gefunden. Interessanterweise haben frühere Studien über alpha B Crystallin ergeben, daß dessen Sequenz hochgradig homolog zu jener der Familie von kleinen Hitzeschock- Proteinen (oder Streß-Proteinen) ist [15]. Übereinstimmend mit dessen Rolle als Hitzeschock-Protein ist gefunden worden, daß alpha B Crystallin Chaperon-Eigenschaften aufweist [16].
Zusätzlich haben immunhistochemische Studien bestätigt, daß zelluläre Konzentrationen an alpha B Crystallin als Folge von Streß zunehmen. Bei verschiedenen pathologischen Zuständen, einschließlich z. B. Alzheimer'-Krankheit und Alexander-Syndrom, ist festgestellt worden, daß Konzentrationen an alpha B Crystallin im ZNS erhöht sind (17, 18, Iwaki et al., Cell 57 (1), 1989, 71-78]. Bei dem letztgenannten Leiden wird festgestellt, daß beträchtliche Mengen an alpha B Crystallin innerhalb von Astrozyten in Form von Fasern, sogenannten Rosenthal-Fasern, ange häuft sind. Unsere eigenen, durch immunhistochemische Anfärbung von ZNS-Gewebe mit polyklonalen anti-alpha B Crystallin-Antikörpern erhaltenen vorbereitenden Daten zeigen eine verstärkte Expression innerhalb von oder nahe bei MS-Läsionen im Vergleich zu nicht betroffenen Regionen der weißen Substanz. Folglich deuten nicht nur Sequenzhomologien, sondern auch eine tatsächliche Gewebeexpression von alpha B Crystallin auf eine Rolle dieses Proteins als Hitzeschock-Protein hin.
Die Kombination von immundominantem Ziel-Antigen unter allen unterschiedlichen Myelinproteinen und dessen Rolle als Hitzeschock-Protein innerhalb von Gliazellen macht alpha B Crystallin zu einem hochattraktiven potentiellen Autoantigen. Unsere Beobachtung, daß nur bei einer Verwendung von MS-betroffenen Myelinpräparationen eine eindeutige T-Zell-Antwort auf das Protein festgestellt wird, kann gut durch erhöhte Konzentrationen des Proteins in solchen Präparationen im Vergleich zu Kontrollpräparationen erklärt werden. Jedoch können ebenfalls auch spezielle mit der Erkrankung assoziierte Modifikationen des Proteins als relevant in Betracht gezogen werden. Es ist bekannt, daß alpha B Crystallin das Ziel verschiedener Modifikationen, einschließlich z. B. Phosphorylierungen, sein kann. Wenn alpha B Crystallin das Autoantigen bei MS ist, kann dessen Rolle als Hitzeschock-Protein erklären, warum epidemiologische Studien an MS auf eine Rolle viraler Infektionen bei der Entwicklung von MS hingedeutet haben, trotz der Tatsache, daß kein einzelner Virustyp identifiziert worden ist, von dem durchweg gefunden wurde, daß er mit MS assoziiert ist [19].
Virale Infektionen innerhalb des ZNS können, obgleich unterschiedliche Virustypen daran beteiligt sein können, leicht zu einer gemeinsamen Nebenwirkung führen, nämlich einer verstärkten lokalen Expression von alpha B Crystallin als Folge starker Entzündungsmediatoren. Zugleich wird eine lokale Infektion zu einer lokalen Zunahme von Klasse II-MHC-Molekülen z. B. auf infiltrierenden Makrophagen oder auf nicht-wandernden Astrozyten führen [20]. Es ist nicht schwierig, sich vorzustellen, daß die Kombination von verstärkter Expression von Antigen-präsentierenden Klasse II-MHC-Molekülen und erhöhten Konzentrationen an immundominantem alpha B Crystallin zur gleichen Zeit und an demselben Ort dazu führen kann, daß ein Schwellenwert zum Triggern von auf alpha B Crystallin gerichteten T-Helferzell-Antworten überschritten wird. Auch das zeitliche Andauern solcher Antworten wird leicht in entsprechender Weise erklärt. Die Immundominanz von alpha B Crystallin ist bei jedem bislang untersuchten menschlichen HLA-DR-Hintergrund, einschließlich des DR2-Typs, der in Westeuropa mit MS assoziiert ist, beobachtet worden.

Diagnose und Therapie bei MS, beruhend auf alpha B Crystallin als Autoantigen

Die neue und überraschende Feststellung, daß tatsächlich ein einziges immundominantes Myelinprotein für jeden menschlichen Klasse II-MHC-Hintergrund existiert und daß dieses Protein sowohl strukturelle als auch funktionelle Charakteristika eines Hitzeschock-Proteins aufweist, eröffnet eine Reihe von Möglichkeiten für neue Strategien zur Diagnose und Therapie bei mit Autoimmunität in Verbindung stehenden Erkrankungen, insbesondere MS.
Die Diagnostik bei MS ist stets ein Problem gewesen. Nicht nur die intrinsische Vielzahl unterschiedlicher klinischer Symptome, die durch lokale Beschwerden im ZNS verursacht werden können, sondern auch der Zeitverlauf klinischer Befunde, die als charakteristisch für MS angesehen werden, machen eine schnelle Diagnose praktisch unmöglich. Wenn rezidivierende, remittierende Phänomene als von entscheidender Bedeutung beim Erstellen der Diagnose angesehen werden, wird man einfach eine Erkrankung über eine längere Zeitdauer hinweg überwachen müssen. Die unlängst erfolgte Einführung von Kernspinresonanztomographie als diagnostisches Hilfsmittel beim Überwachen lokaler ZNS-Entzündungen hat einen großen Beitrag zur Diagnostik bei MS geleistet, das Zeitproblem jedoch noch nicht vollständig gelöst. Eine langwierige Prozedur für die diagnostische Bestätigung von MS ist nicht wünschenswert, nicht nur für die MS-Patienten selbst, sondern auch bezüglich der möglichen Wirksamkeit therapeutischer Ansätze. Spezifische Immunantworten auf alpha B Crystallin können die Diagnose von MS unterstützen.
Zuerst kann die Bildung von Immunglobulinen, die für alpha B Crystallin spezifisch sind, in Geweben und/oder Körperflüssigkeiten, wie Blut oder Liquor cerebrospinalis bewertet werden, und diese können bei MS spezifisch erhöht sein. Solche verstärkten Antikörperantworten können als diagnostischer Marker für MS bei der Gestaltung von auf Antigen basierenden Kits zur Überwachung von Antikörperantworten eingesetzt werden.
Auf Antigen basierende Kits sollten so verstanden werden, daß sie ELISAs, RIAs, SPIAs und DIAs (die sich zuallererst in der Art der an das spezifische Bindungsreagens für den Antikörper gegen alpha B Crystallin angehefteten Markierung unterscheiden) in jedem beliebigen geeigneten Format, wie Sandwich-, Kompetitions- oder Agglutinationsassays, umfassen, nicht jedoch darauf beschränkt sind.
Ein geeignetes Format ist ein Sandwich-Assay, bei dem alpha B Crystallin an einer festen Phase bereitgestellt wird, wonach eine Probe, von der vermutet wird, daß sie die Antikörper gegen alpha B Crystallin enthält, mit der festen Phase in Kontakt gebracht wird, so daß dieser sich an das Antigen binden kann, wonach die feste Phase mit markiertem Antigen oder mit einem gegen den alpha B Crystallin-Antikörper gerichteten markierten Antikörper in Kontakt gebracht wird. Anstelle ganzer Antigene und/oder Antikörper ist es selbstverständlich sehr gut möglich, spezifisch bindende Teile davon zu verwenden.
Es sind viele Markierungen bekannt und können in erfindungsgemäßen Assays angewendet werden. Solche Markierungen schließen Enzyme ein, die üblicherweise ein Substrat benötigen, um ein Signal zu liefern, Partikelsole, wie Metall (Gold)-Sole, gefärbte Latexteilchen, Farbstoffe, fluoreszierende Materialien und radioaktive Materialien. Der Assay selbst kann im Laborformat oder für eine Verwendung in der Praxis eines Arztes oder sogar für eine Verwendung zu Hause bestimmt sein. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird in der Lage sein, einen auf der Erfindung beruhenden geeigneten Assay herzustellen.
Alternativ können T-Zell-Antworten und insbesondere T-Helferzell-Antworten auf alpha B Crystallin als diagnostischer Marker bei MS dienen. Man kann sich eine Vielzahl von Methoden für die Detektion erhöhter T-Zell-Antworten vorstellen, wie Screening auf Aktivierungsmarker auf alpha B Crystallin-spezifischen T- Zellen in Körperflüssigkeiten, einschließlich Liquor cerebrospinalis, Untersuchen von Häufigkeiten spezifischer T-Zellen oder einer verstärkten Produktion von Zytokinen in Reaktion auf alpha B Crystallin. Folglich können verstärkte Immunantworten gegen alpha B Crystallin, entweder humoral oder zellulär, die spezifisch mit MS assoziiert sein können, eingesetzt werden, um eine Diagnose zu unterstützen.
Für die Entwicklung von Antigen spezifischen therapeutischen Ansätzen bei MS ist bereits eine große Vielzahl von Strategien verfügbar, und andere müssen noch entwickelt werden [in einer Übersicht dargestellt in 21]. Antigen-spezifische Strategien wurden in Tiermodellen für Autoimmunität getestet, und mehrere dieser Verfahren haben sich als wirksam erwiesen, um eine Erkrankung zu verhindern oder zu lindern. Solche spezifischen Therapien können auf eine Intervention bei der produktiven Bildung von trimolekularen Wechselwirkungen zwischen Antigen, T- Zell-Rezeptor und HLA-Molekül, die zu einer Aktivierung der beteiligten T-Zelle führen, abzielen. Alternativ kann Antigen (oder Fragmente davon) so verabreicht werden, daß eine spezifische Toleranz anstelle einer Immunresponsivität getriggert wird. Folglich kann eine spezifische Intervention auf unter schiedlichen Ebenen erzielt werden. Die Verabreichung von Antigen über Toleranzinduzierende Routen kann eingesetzt werden, um eine Toleranz gegenüber einem spezifischen, Autoimmunität induzierenden Antigen zu bewirken. Beispielsweise kann eine orale Verabreichung von Ziel-Antigen zu einem Zustand von Toleranz führen, bei dem Autoimmunität nicht länger induziert werden kann. Das gleiche kann durch häufige Verabreichung entweder sehr geringer oder sehr hoher Dosen von Antigen über eine längere Zeitdauer hinweg erzielt werden. Jede dieser Dosierungen induziert möglicherweise keine Immunität, sondern kann stattdessen schließlich zu einem Zustand von Nicht-Responsivität oder Toleranz gegenüber dem verwendeten Antigen führen. Auch eine Implantation von Antigen in den Thymus kann zu einer spezifischen Toleranz führen, da die Umgebung des Thymus an sich dazu ausgelegt zu sein scheint, Toleranz in T-Zellen zu induzieren, die lokal ihrer Zielstruktur entsprechen. Diese zur Induktion von Toleranz ausgestalteten Verabreichungsrouten oder zukünftige Alternativen dafür können mit vollständigem Antigen oder ausgewählten, davon abgeleiteten Fragmenten entweder als freie Entitäten oder als Teil einer komplexeren Struktur (z. B. verkapselt oder durch Mikroorganismen exprimiert) beschritten werden. Antigen kann auch zusammen mit Mitteln, die mit den co-stimulatorischen Signalen, die für eine T-Zell-Aktivierung essentiell sind, verabreicht werden.
Es ist unlängst klar geworden, daß die Erkennung von Antigen/ HLA-Komplexen durch den T-Zell-Rezeptor allein nicht für eine produktive Aktivierung von T-Zellen ausreicht. Dafür sind zusätzliche Wechselwirkungen zwischen mehreren akzessorischen Molekülen auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen und komplementären Molekülen auf der Oberfläche von T-Zellen erforderlich. Eine Erkennung von Antigen/HLA ohne diese akzessorischen Wechselwirkungen kann nicht nur nicht zu einer Aktivierung der T-Zelle führen, sondern kann sogar zu einem Zustand von Antigen-spezifischer Anergie (Unresponsivität) der T-Zelle führen [22]. Dieses Phänomen kann eingesetzt werden, um bei Mensch oder Tieren spezifische Toleranz zu induzieren [23]. Beispielsweise kann eine Verabreichung von Antigen/HLA-Komplexen (als freie oder membrangebundene Präparationen) die Antigen-spezifischen T-Zellen spezifisch anergisieren, anstatt sie zu aktivieren. Auch kann die Verabreichung von Antigen auf B-Zellen, denen essentielle akzessorische Moleküle für eine Aktivierung naiver (vorab nicht-aktivierter) T-Zellen fehlen, die gleiche Wirkung haben. Schließlich könnten spezifische Antikörperpräparationen (oder andere therapeutische Mittel), die auf akzessorische Moleküle gerichtet sind, wenn sie in Verbindung mit Antigen verabreicht werden, ebenfalls zur Anergie von für das gemeinsam verabreichte Antigen spezifischen T-Zellen führen. Es ist zu erwarten, daß noch weitere Strategien zur Induktion von Antigen-spezifischer Anergie in der Zukunft entwickelt werden, aber diese werden in entscheidender Weise von der Kenntnis des Antigens abhängig bleiben.
Unresponsivität (oder nicht erkrankungsinduzierende Responsivität) kann nicht nur durch eine spezifische Route für die Antigenverabreichung erzielt werden, sondern auch durch Verabreichung ausgewählter Fragmente des Antigens. In Tiermodellen für Autoimmunität ist gezeigt worden, daß Autoimmunität induzierende Antigene Sequenzen enthalten können, die die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen verhindern oder lindern können, wenn sie als separate Entitäten von dem intakten Antigen verabreicht werden. Folglich kann eine Behandlung mit ausgewählten Antigenfragmenten den gegenteiligen Effekt wie eine Behandlung mit dem ganzen Antigen haben. Eine interessante Variante dieses Konzepts besteht in der Verabreichung von geringfügig veränderten Sequenzen des Antigens. Antigenfragmente, die normalerweise an der Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen beteiligt sein können, können in ihrer Sequenz etwas verändert werden, um den gegenteiligen Effekt zu erzielen: spezifische Unresponsivität von Antigen spezifischen T-Zellen. Solche geringfügig veränderten Antigenfragmente (APLs oder "veränderte Peptidliganden" ("altered peptide ligands")) können als Antagonisten oder Modulator peptide wirken. Diese können spezifisch mit TCR mit einer authentischen Spezifität für das Autoantigen auf solche Weise wechselwirken, daß produktive akzessorische Wechselwirkungen, die für eine T-Zell-Aktivierung erforderlich sind, verhindert werden. Der Effekt ist ähnlich zu jenem im Falle einer Verhinderung akzessorischer Signale durch andere Methoden: spezifische Unresponsivität der beteiligten T-Zelle. Obwohl von vornherein nicht vorhergesagt werden kann, welche Veränderungen in der Antigensequenz einen solchen "antagonistischen/Modulator-"Effekt erzeugen können oder nicht, erscheint es wahrscheinlich, daß diese Effekte am stärksten bei Sequenzen sind, die zu den authentischen Antigensequenzen sehr ähnlich sind.
Ein anderes Ziel für eine Antigen-spezifische Intervention bei T-Zell-vermittelter Autoimmunität ist die T-Zelle selbst. Ebenso wie die Struktur eines Antigens einzigartig für seine Identität ist, ist die Struktur des T-Zell-Rezeptors (TCR) einzigartig für die Erkennung von dessen Antigen-Target. Folglich können TCR- S. trukturen identifiziert werden, die für die Erkennung eines gegebenen Antigens spezifisch sind. Diese Strukturen können in den die variable Domäne, die Verbindungs- oder J-Kette oder den Diversitätsbereich kodierenden Bereichen des TCR-Gens für entweder die alpha- oder die beta-Kette gefunden werden. Für die Erkennung eines gegebenen Antigens spezifische Strukturen können als klonotypische oder idiotypische TCR-Strukturen bezeichnet werden. Wieder haben Erfahrungen mit Tiermodellen für Atitoimmunität Möglichkeiten für eine Intervention bei einer Erkrankung aufgezeigt, indem eine Intervention spezifisch auf diese klonotypischen/idiotypischen TCR-Strukturen abzielt. In erster Linie kann dies durch Impfen mit Antigen spezifischen T-Zellen selbst erzielt werden. T-Zellen gegen jedes beliebige Antigen können durch in vitro-Kultivieren ausgewählt werden, und eine Impfung kann mit inaktivierten Populationen solcher vermutlich autoreaktiven T-Zellen ausgeführt werden.
Eine Impfung (Vakzinierung) zielt darauf ab, eine Immunantwort (entweder zellulär oder humoral) in dem erkrankten Individuum zu erzeugen, die für die Antigen spezifischen T-Zellen selbst spezifisch ist, um deren Eliminierung aus dem Körper zu erzielen. Zweitens kann das gleiche durch Impfstrategien erzielt werden, die nicht die vollständige T-Zelle als therapeutisches Mittel, sondern nur relevante Strukturen, wie den TCR allein, oder sogar nur kleine Sequenzen, die klonotypischen oder idiotypischen Determinanten in dem TCR entsprechen, einsetzen. Für solche Strategien können TCR oder davon abgeleitete Sequenzen auch als Teil größerer Strukturen verwendet werden. Obwohl dies noch nicht gezeigt worden ist, können sich Antigen-spezifische (idiotypische) Merkmale von T-Zellen nicht nur in strukturellen Elementen des TCR allein wiederspiegeln, sondern könnten sich prinzipiell auch in alternativen spezifischen Strukturen entweder innerhalb oder auf der Oberfläche von Zellen wiederspiegeln.
Eine Entwicklung von Antigen spezifischen Therapien bei Autoimmunität ist für viele Jahre ein unerreichbares Ziel gewesen. Fortschritte in experimentellen Tiermodellen, wo Trigger-Autoantigene durch vorab erfolgende Selektion bekannt sind, haben eine zunehmende Anzahl von erfolgreichen Ansätzen zur Verhinderung sogar anhaltender Autoimmunität gezeigt [21]. Entweder die Antigenstruktur selbst oder Merkmale der durch sie aktivierten spezifischen T-Zellen können für die rationale Gestaltung einer Therapie eingesetzt werden. Auch bei humaner Autoimmunität ist die Identifizierung sämtlicher idiotypischer und anderer relevanter Merkmale von autoreaktiven T-Zellen, die an Autoimmunität beteiligt sein könnten, vollständig abhängig von der Identifizierung des relevanten Antigens. Mit anderen Worten: die Identifizierung des Antigens ist der Schlüssel zur Selektion und Charakterisierung der respondierenden T-Zellen.
Auch die Beurteilung der genetischen Veranlagung für MS kann durch eine Analyse von alpha B Crystallin-Gensequenzen im menschlichen Genom unterstützt werden. Das mögliche Auftreten von Polymorphismen innerhalb des alpha B Crystallin-Gens oder benachbarter Sequenzen auf dem menschlichen Chromosom 11 kann Hinweise auf eine veränderte (verstärkte) Expression oder modifizierte Proteinstrukturen liefern, von denen beide relevant sein könnten für das Vermögen des Genprodukts, Autoimmunantworten zu triggern und folglich für die Wahrscheinlichkeit, MS zu entwickeln.
Alpha B Crystallin stellt nicht nur einen strukturellen Trigger/ein strukturelles Target oder Ziel für Autoimmunität bei MS, beschränkt auf weiße Substanz im ZNS, dar, sondern kann auch eine Erklärung liefern, wie eine gewebespezifische Autoimmunität gegen ZNS-Myelin einen auf vielen Faktoren beruhenden Beginn haben kann [19]. Da es sich als Hitzeschock- oder Streß-Protein verhält, kann alpha B Crystallin lokal in hohen Konzentrationen in Reaktion auf eine Vielzahl von Stimulantien ("challenges"), wie persistierende neurotrope Infektionen, ischämische Attacken oder physische Verletzungen, exprimiert werden. Zusammen mit seiner Immundominanz für humane T-Zellen kann erwartet werden, daß erhöhte Konzentrationen an alpha B Crystallin gelegentlich über den Schwellenwert für die T-Zell-Aktivierung ansteigen, insbesondere wenn z. B. Infektionen an derselben Stelle eine lokale Klasse II-MHC-Expression von Mikroglia und Astrozyten hervorrufen. Diese Vorstellung kann die Grundlage für noch einen weiteren Ansatz zur Therapie liefern, d. h. einen Ansatz, der auf eine Verringerung von alpha B Crystallin-Konzentrationeh im ZNS abzielt. Molekularbiologische Strategien, die beispielsweise antisense-DNA oder -RNA einbeziehen, können entwickelt werden, um eine Expression von alpha B Crystallin in dem Zielgewebe spezifisch zu blockieren oder zu verringern. Solche Ziele können z. B. durch Gentherapie oder durch Infektion mit veränderten Viren erreicht werden, die antisense-Nukleinsäuren oder sogenannte "Hammerkopf"-Ribozyme ("hammerhead"-Ribozyme) produzieren, die darauf gerichtet sind, den alpha B Crystallin-Messenger zu zerstören oder dessen Konzentrationen zu verringern. Man kann sich vorstellen, daß in der Zukunft auch andere Strategien in entsprechender Weise entwickelt werden können, die auf der Identifizierung von alpha B Crystallin als Ziel-Autoantigen beruhen.
Folglich stellt die Erfindung ein wichtiges Haupt-Autoantigen (alpha B Crystallin) für eine Verwendung bei der Diagnose oder Therapie von mit Autoimmunität in Beziehung stehenden Erkrankungen, insbesondere Multiple Sklerose, bereit. Aus dem Vorangegangenen wird ersichtlich, daß alpha B Crystallin auf viele Weisen gemäß der Erfindung verwendet werden kann. Es ist jedoch ebenfalls wahr, daß es nicht erforderlich sein muß, vollständiges alpha B Crystallin zu verwenden.
In vielen Fällen wird es ebenfalls möglich sein, nur einen Teil des gesamten Proteins oder Derivate des Proteins und dergleichen, die ähnliche Aktivität wie alpha B Crystallin aufweisen, anzuwenden. Dementsprechend sind diese Teile und/oder Derivate ebenfalls Teil der Erfindung.
Es ist vorstehend erläutert worden, wie für eine Diagnose Assays ausgeführt werden können und wie Test-Kits auf der Grundlage von alpha B Crystallin zusammengestellt werden können.
Für therapeutische Zwecke, beispielsweise wenn das Antigen in einer Zusammensetzung zur Induktion von Toleranz verabreicht werden soll, versteht es sich, daß abhängig von der Verabreichungsroute (parenteral, enteral) und dem Patienten die Dosierung variieren kann. Im allgemeinen wird sie zwischen 1 ng/kg Körpergewicht/Tag und 1 mg/kg Körpergewicht/Tag oder bei anderen wirksamen Dosen liegen.
Solche Zusammensetzungen können selbstverständlich geeignete Trägersubstanzen oder Exzipientien umfassen.
Wie das alpha B Crystallin erhalten wird, ist nicht von Bedeutung. Es kann aus Myelinmaterial oder anderen Geweben isoliert werden, oder es kann rekombinant durch geeignete Wirtszellen produziert werden. Fragmente (Peptide) können synthetisch hergestellt werden.
Für eine rekombinante Produktion ist es erforderlich, das für alpha B Crystallin kodierende Gen bereitzustellen, was leicht erfolgen kann, da die Aminosäuresequenz bekannt ist. Beispielsweise werden Techniken, wie PCR, in dieser Hinsicht sehr nützlich sein. Wenn man über das Gen verfügt, stellt dies noch andere nützliche diagnostische und therapeutische Hilfsmittel gemäß der Erfindung bereit.
Es ist klar, daß PCR und NASBA und dergleichen verwendet werden können, um eine verstärkte Expression von alpha B Crystallin zu diagnostizieren. Die Nützlichkeit von antisense-Ansätzen ist bereits vorstehend erwähnt worden. Es ist ebenfalls klar, daß es für diese Ansätze nicht immer erforderlich ist, das vollständige Gen oder ein unverändertes Gen zu verwenden. Fragmente und/oder Derivate können ebenfalls verwendet werden.
Für eine Expression des Gens sind viele Zellen, Vektoren und Expressionsregulatoren, wie Promotoren, Enhancer und dergleichen, bekannt. Wenn posttranslationale Modifizierungen erforderlich sind oder wenn eine Signalsequenz entfernt werden muß, kann es am besten sein, eukaryontische Zellen, wie CHO-Zellen und dergleichen, einzusetzen.
Für den Fachmann auf diesem Gebiet versteht es sich, daß es ebenfalls möglich ist, Derivate von alpha B Crystallin zu erhalten, die als Antagonisten wirken werden und folglich die T- Zell-Antwort auf alpha B Crystallin blockieren. Ein anderer Weg, um zu solchen Antagonisten zu gelangen, besteht darin, anti- Idiotyp-Antikörper bereitzustellen, die eine complementary determining region aufweisen, die nahezu ein internes Bild des durch den T-Zell-Rezeptor erkannten Epitops von alpha B Crystallin ist. Es ist ebenfalls möglich, den verantwortlichen T-Zell- Rezeptor zu identifizieren und Antikörper gegen diesen herzustellen.
Diese und jegliche andere Antikörper können nach jeder beliebigen der wohlbekannten Techniken hergestellt werden. Vorzugsweise werden monoklonale Antikörper hergestellt. Es ist übliche Praxis, Antikörper in Nagetieren herzustellen; wenn diese jedoch in Menschen angewendet werden müssen, werden diese üblicherweise zu einer Immunantwort führen.
Techniken zur Verringerung der Immunogenität dieser Antikörper durch Bereitstellen von Fragmenten oder hybriden menschlichen/ Nagetier-Antikörpern wie auch Techniken zur gentechnologischen Umwandlung dieser Antikörper zu humanisierten Antikörpern ("CDRgrafting"; CDR-Ersetzung) gehören sämtlich zum Stand der Technik.
Wie hier vorstehend angegeben, ist es ebenfalls möglich, Impfstoffe herzustellen, die auf den verantwortlichen autoreaktiven T-Zellen beruhen. Zu diesem Zweck müssen die T-Zellen inaktiviert werden.
Anstelle von vollständigen T-Zellen können deren Rezeptoren (TCRs) oder Teile von Derivaten verwendet werden. Sie können wie die Antigene und die Antikörper auf einer Vielzahl von Wegen erhalten werden, einschließlich Isolierung, Synthese, Gentechnologie, usw.
Jegliche und sämtliche Impfstoffe können die üblichen Trägersubstanzen oder Exzipientien umfassen. Die Erfindung wird jetzt detaillierter in den folgenden Beispielen erläutert.

EXPERIMENTELLER ABSCHNITT

1. Materialien und Methoden

1.1 Herstellung von Myelinproteinen für Immunassays

Proben von weißer Substanz aus menschlichen Gehirnen, die durch rasche Autopsien erhalten worden waren, wurden bis zur Verwendung bei -80ºC gehalten. Proben einschließlich Läsionen in der weißen Substanz wurden von 13 definitiven MS-Patienten und ein weiterer Satz von Proben von 21 Kontrollpersonen erhalten. ZNS- Myelin wurde aus Proben von weißer Substanz gereinigt, wie von Norton und Poduslo beschrieben [24]. Gereinigte Myelin-Präparationen, entweder von MS-Patienten oder Kontrollpersonen, wurden getrennt gepoolt und bis zur Verwendung bei -20ºC lyophilisiert gelagert.
Für die Herstellung von gesamtem Myelinprotein als stimulatorisches Antigen wurde gereinigtes Myelin gemäß von Noort et al. [13] delipidiert oder von Lipiden befreit. Kurz gesagt, wurde Myelin in 80% (Vol./Vol.) Tetrahydrofuran, 20% (Vol./Vol.) Wasser, 0,1% (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure gelöst und über Sephadex LH-60 geleitet, um Proteine von (Glyko)lipiden zu trennen. Protein-enthaltendes Eluat wurde vereinigt, und die Proteine wurden aus der Lösung durch Zugabe von Diethylether präzipitiert. Präzipitierte Proteine wurden durch Zentrifugation niedergeschlagen und lyophilisiert. Delipidierte Myelinproteine wurden nachfolgend in 2-Chlorethanol, enthaltend 0,1 (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure, zu einer Konzentration von ungefähr 4 mg/ml gelöst und gegen viermal ausgewechseltes Wasser in regenerierten Celluloseacetat-Dialysemembranen dialysiert. Die endgültige Proteinkonzentration in der vollständig wäßrigen Lösung wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt. Die wäßrigen Lösungen von gesamten Myelinproteinen wurden bei +4ºC gehalten, da jegliches Einfrieren solcher Präparationen zu einer irreversiblen Präzipitation der hydrophoberen Proteinmoleküle führt.
Eine Fraktionierung sämtlicher Myelinproteine für eine Verwendung als Testantigen in den Assays wurde ausgeführt, wie bereits früher von von Noort et al. [13; siehe Fig. 1] beschrieben, unter Verwendung einer Umkehrphasensäule mit einer C3-Matrix (Beckman Instruments, San Ramon, CA, USA). Nach Sammlung und Lyophilisation von 40 Proteinfraktionen, die durch HPLC erhalten worden waren, wurde der Inhalt jeder Fraktion in 2-Chlorethanol, 0,1% Trifluoressigsäure gelöst und gegen Wasser, wie vorstehend beschrieben, dialysiert. Alle wäßrigen Proteinfraktionen wurden bei +4ºC bis zur Verwendung gelagert. Beruhend auf Analysen der Aminosäurezusammensetzung von Proteinproben wurden gleiche Mengen an Gesamtproteinmasse sowohl aus MS-betroffenen Proben als auch Kontroll-Myelinproben für eine HPLC-Fraktionierung und eine Untersuchung in den Proliferationsassays entnommen.

1.2 Untersuchung von T-Zell-Massenantworten auf Myelinproteine

Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) wurden durch Lymphophorese von 27 HLA-typisierten Spendern, unter welchen sich 5 Patienten mit definitiver MS gemäß den Poser-Kriterien befanden, erhalten. PBMC wurden gemäß Routineverfahren isoliert und bis zur Verwendung bei -196ºC gelagert.
PBMC von jedem Spender wurden bei 37ºC in einem befeuchteten Ofen unter einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden gezüchtet. PBMC wurden zu 2 · 105 Zellen pro 200 ul in RPMI1640-Kulturmedium (Dutch-Modifizierung), supplementiert mit 10 mM HEPES, 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin und 10% (Vol./Vol.) vereinigtem oder gepooltem menschlichen Serum, in Gegenwart von gesamten Myelinproteinen bei einer Endkonzentration von 25 ug/ml ausgesät. Nach 7 Tagen wurden 100 ul des Medium-Überstandes entfernt und die wachsenden T-Zellen erneut stimuliert, indem 100 ul frisches RPMI1640-Kulturmedium, enthaltend 1 · 10&sup5; bestrahlte (30 Gy) autologe PBMC und frisches gesamtes Myelinprotein in einer Konzentration von 50 ug/ml, zugesetzt wurden. Nach 11 Tagen wurde menschliches rekombinantes IL-2 zu einer Endkonzentration von 50 U/ml zugesetzt. Nach 14 Tagen wurden Zellen gesammelt und in Dreifachproben auf eine Proliferation gegenüber HPLC-fraktionierten Proteinen in einem Standard-Proliferationsassay untersucht.
Eine festgelegte Probe des Inhalts jeder HPLC-Fraktion wurde zu Vertiefungen, enthaltend 5 · 10&sup4; kultivierte T-Zellen und 5 · 10&sup4; bestrahlte autologe PBMC in 200 ul Kulturmedium, zugesetzt. Nach 3 Tagen wurde 0,6 uCi [3H]-Thymidin jeder Vertiefung zugesetzt, und nach weiteren 18 h wurden Zellen geerntet und der Thymidin- Einbau unter Verwendung eines Betaplattenzählers bestimmt. Unter Verwendung der vorstehend erläuterten Strategie variierte die Proteinkonzentration in jeder Vertiefung während des Proliferationsassays gemäß den Proteingehalten der entsprechenden HPLC- Fraktion. Für jene Fraktionen, die entweder im MBP oder PLP, die vorherrschenden Proteine von Myelin enthielten, wurde die endgültige Proteinkonzentration in der Vertiefung zu ungefähr 50 ug/ml auf der Grundlage der Aminosäureanalyse einer Probe aus der ursprünglichen HPLC-Fraktion berechnet. Gesamtprotein-Konzentrationen von HPLC-Fraktionen, die in geringerer Menge vorliegende Proteine enthalten, waren ungefähr 5- bis 10fach geringer. Die Wirkungen der Proteinkonzentration auf die qualitativen Aspekte des Ergebnisses wurden untersucht, indem Prohiferationsantworten auf Verdünnungen von HPLC-fraktionierten Proteinen untersucht wurden. Die erhaltenen Ergebnisse stimmten mit den verwendeten Verdünnungen überein und ergaben keine Anomalien (Daten nicht gezeigt).

1.3 Reinigung und Identifizierung von alpha B Crystallin

Die in den Proliferationsassays erhaltenen Ergebnisse ergaben übereinstimmende und starke Proliferationsantworten auf eine bestimmte Proteinfraktion, die von MS-betroffenem Myelin abgeleitet war (siehe nachfolgend unter "Ergebnisse"). Eine Probe dieser Fraktion, die durch aufeinanderfolgende Numerierung als HPLC-Fraktion 8 bezeichnet wurde, wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wie auch zusäLZliche Umkehrphasen-HPLC analysiert. Eine erneute Chromatographie durch HPLC wurde ausgeführt, wobei ein anderer Typ von Umkehrphasen-HPLC-Säule, nämlich eine gemischte C1/C8-Matrix (Pharmacia LKB, Bromma, Schweden) anstelle einer C3-Matrix (Beckman Instruments, San Ramon, CA, USA), und ein anderes Elutionsmittel, nämlich Acetonitril anstelle einer Tetrahydrofuran/Acetonitril-Mischung, verwendet wurden.
Wie unter "Ergebnisse" beschrieben, ergab sowohl die SDS-PAGE- als auch die RP-HPLC-Analyse des Inhalts der hochgradig immunogenen Fraktion 8 die nahezu ausschließliche Anwesenheit eines Proteins mit einer apparenten Masse von ungefähr 23 kDa. Unter Verwendung einer neuen Präparation von MS-betroffenem Myelin als Quelle wurde dieses 23 kDa-Protein bis zur apparenten Homogenität durch aufeinanderfolgende RP-HPLC unter Verwendung einer C3- Matrix und Tetrahydrofuran/Acetonitril als Elutionsmittel in dem ersten Schritt und einer gemischten C1/C8-Matrix und Acetonitril als Elutionsmittel in den zweiten und dritten Schritten gereinigt. Schritt 3 unterschied sich von Schritt 2 in dem eingesetzten Gradienten; es wurde durchgehend 0,1% (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure als Laufmittel verwendet.
Das gereinigte 23 kDa-Protein wurde durch SDS-PAGE untersucht und durch Analyse der Aminosäurezusammensetzung analysiert. Das Protein wurde ebenfalls einer Aminosäuresequenzierung unter Verwendung eines Applied Biosystems 470A-Modells, das online mit einer Applied Biosystems Modell 120A-PTH-Aminosäure-Analysiervorrichtung ausgestattet war, unterworfen. Um Fragmente des 23 kDa-Proteins für eine Sequenzierung zu erzeugen, wurden 100 ug gereinigtes 23 kDa-Protein in 100 ul 50 mM Tris-HCl, pH 7, 8, gelöst und mit 1 ug Trypsin aus Rindermilz versetzt. Nach 24 h bei 37ºC wurde der tryptische Verdau durch RP-HPLC an einer C18-Matrixsäule unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril in 0,1% (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure fraktioniert. Individuelle Fragmente wurden durch zusätzliche RP-HPLC unter Verwendung von 50 mM Ammoniumacetat, pH 5,8, als Lösungsmittel und Acetonitril als Elutionsmittel gereinigt.
Für die Erzeugung eines polyklonalen Antiserums gegen das immunogene 23 kDa-Protein wurde ein Kaninchen zweimal mit 20 ug gereinigtem 23 kDa-Protein, emulgiert in komplettem Freund - Adjuvans (CFA), und ein drittes Mal mit 100 ug Protein in CFA in Abständen von 6 Wochen immunisiert. Unter Verwendung von Western-Blotting gemäß Standardverfahren wurden die erzeugten Antikörper auf eine Erkennung von durch SDS-PAGE auf getrennte Inhaltsstoffe der ursprünglichen HPLC-Fraktion 8, der entsprechenden von Kontroll-Myelin abgeleiteten Fraktion, gegenüber für die Immunisierung verwendetem gereinigtem 23 kDa-Protein, gegenüber gereinigtem MBP und schließlich gegenüber gereinigtem alpha B Crystallin und alpha A Crystallin aus Rinderaugenlinsen untersucht. Sowohl die A- als auch die B-Kette von alpha Crystallin aus Rinderlinsen wurde aus einer kommerziellen Präparation von alpha Crystallin (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0, USA) durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Vor dem Auftragen auf eine Umkehrphasensäule wurde alpha Crystallin in 8 M Harnstoff, 10% Essigsäure gelöst und für 1 h bei 37ºC gehalten, um A- und B- Ketten vollständig zu dissoziieren. Unter Verwendung einer gemischten C1/C8-Umkehrphasenmatrix führt eine Anwendung eines Gradienten aus Acetonitril in 0,1% (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure zu der grundlegenden Auftrennung der A- und B-Ketten.

2. Ergebnisse

2.1 Proliferationsantwort von T-Zellen des peripheren Bluts auf Myelinproteine

Die kurze Zeitspanne von nur 2 Wochen zur Expansion von T-Zellen des peripheren Bluts in Reaktion auf Antigen wurde gewählt, um einen Selektionsdruck auf in vitro wachsende T-Zellen als Ergebnis des experimentellen Protokolls oder des verwendeten Kulturmediumtyps zu minimieren. Wir haben festgestellt, daß 2 Wochen die minimale Zeitspanne ist, die erforderlich ist, um ausreichende Anzahlen von Zellen für eine signifikante Proliferationsantwort der gesamten Population auf Antigen zu expandieren. Auf diese Weise wird die Spezifität der gemessenen Antwort so repräsentativ wie möglich für das vollständige Repertoire an T- Zellen, die eine Reaktion auf Myelinproteine zeigen, gehalten.
Die Ergebnisse zeigen, daß bei einer Verwendung des Repertoirs von T-Zellen aus peripherem Blut als Responderzellen signifikante Variationen zwischen einzelnen Spendern auftreten können. 10 von 27 untersuchten Proben ergaben keine brauchbaren Daten. Entweder wurde überhaupt kein Wachstum gemessen oder die Hintergrund-Proliferation war übermäßig. 17 von 27 Proben von unterschiedlichen HLA-typisierten Spendern lieferten jedoch nützliche Ergebnisse, indem sie eine signifikante Proliferation auf einige HPLC-Fraktionen wie auch auf den vollständigen Satz von Myelinproteinen, die als stimulatorisches Antigen verwendet wurden, zeigten. 3 von 5 PBMC-Proben von MS-Proben bereitstellenden Patienten zeigten eine signifikante Proliferation gegen Myelinproteine. Ein repräsentativer Satz von Daten, welche mit 5 Proben erhaltene Antworten veranschaulichen, ist in Fig. 2 angegeben. Im linken Feld sind Antworten auf aus Kontroll-Myelin isolierte, HPLC-fraktionierte Proteine gezeigt. In dem rechten Feld sind Antworten gegen von MS-betroffenem Myelin abgeleitete Proteine gezeigt.
Die qualitativen Aspekte der gegen Kontroll-Myelinproteine erhaltenen Antwortprofile waren in bemerkenswerter Weise zwischen den unterschiedlichen Spendern ähnlich, unabhängig von der HLA- Typisierung oder ob die Spender unter definitiver MS litten oder nicht. In allen Fällen waren Antworten vorherrschend auf Proteine, die entlang des Gradienten an Positionen eluieren, die zwischen den Fraktionen des hochgradig hydrophilen MBP (Fraktionen 5 und 6) und den Fraktionen des sehr hydrophoben PLP (Fraktionen 22-28) liegen. Antworten auf die in der größten Menge vorliegenden Proteine MBP und PLP waren mäßig, sofern sie über haupt signifikant waren. Diese Ergebnisse stimmen mit unseren früheren Beobachtungen überein [13]. Es bleibt nachzuweisen, ob die apparent vorherrschenden Reaktionen auf die "dazwischenliegenden" Fraktionen 10-15 auf die Gegenwart einer einzelnen immunogenen Komponente hindeuten oder nicht, oder ob sie akkumulierte Antworten auf eine Vielzahl unterschiedlicher, in geringer Menge in diesen Fraktionen vorliegender Proteine vorliegen, widerspiegeln.
Proliferationsantworten auf den Satz von aus MS-betroffenem Myelin isolierten Proteinen sind ähnlich zu jenen gegen Kontrollmaterial, indem sie signifikante Antworten auf die "dazwischenliegenden" Fraktionen 10-15, die viele unterschiedliche, in geringeren Mengen vorliegende Myelinproteine enthalten, zeigen. Jedoch war die stärkste Proliferationsantwort in allen untersuchten Proben übereinstimmend gegen eine einzelne HPLC-Fraktion, nämlich Fraktion 8, gerichtet. Auch bei Zusatz in 5- oder 10facher Verdünnung triggerte der Inhalt von Fraktion 8 die höchste Proliferationsantwort (Daten nicht gezeigt). Die Antworten auf Fraktion 8 waren abhängig von einer Stimulierung ("priming") mit Myelin, da nicht stimulierte ("unprimed") PBMC oder PBMC, die mit einem irrelevanten Antigen (Influenza-Virus) stimuliert waren, keine Antwort zeigten. Reaktionen auf Fraktion 8 hingen jedoch nicht von einer Stimulierung ("priming") mit MSbetroffenem Material ab, da mit Kontroll-Myelin stimulierte PBMC vergleichbare Antworten zeigten.
Es sollte festgehalten werden, daß bislang keine klaren Unterschiede in der Gesamtspezifität von T-Zellen des peripheren Bluts aus entweder gesunden Kontrollen oder MS-Patienten beobachtet wurden. Jedoch liefert die Analyse der Antigen-Spezifität, wie sie hier ausgeführt wurde, keine Daten hinsichtlich Vorläufer-Häufigkeiten, Voraktivierungszustand, Feinspezifität oder Rezeptormerkmalen von T-Zellen im peripheren Blut und auch keine Daten über T-Zellen sonstwo im Körper. Folglich können sich gegen Myelin gerichtete T-Zellantworten in MS-Patienten nach wie vor von Kontrollpersonen in vielen Aspekten unterscheiden, die in der vorliegenden Studie nicht angesprochen wurden.
Ersichtlich enthält MS-betroffenes Myelin ein oder mehrere hochgradig immunogene(s), in einer geringeren Menge vorliegende(s) Myelinantigen(e) für T-Zellen des peripheren Bluts von Spendern unterschiedlichen HLA-Typs, einschließlich gesunden wie auch von MS betroffenen Individuen, welches bzw. welche in HPLC-Fraktion 8 enthalten ist bzw. sind. Erhöhte Mengen an einem oder mehreren derartigen immunogenen Proteinen in dieser Fraktion im Vergleich zu dem von Kontroll-Myelin erhaltenen Material erklärt höchstwahrscheinlich den dramatischen Unterschied, den man zwischen den zwei Assay-Serien, die in Fig. 1 veranschaulicht sind, beobachtet. Nachfolgend wird die Identifizierung dieses immunogenen Proteins beschrieben.

2. 2 Das immunogene Protein in von MS betroffenem Myelin ist alpha B Crystallin

SDS-PAGE-Analyse wie auch zusätzliche Umkehrphasen-HPLC-Analyse des Inhalts der HPLC-Fraktion 8, die MS-betroffenes Myelinprotein enthält, ergaben die nahezu, ausschließliche Anwesenheit eines Proteins mit einer apparenten Masse von 23 kDa. Unter Verwendung einer neuen Präparation von MS-betroffenen Myelinproteinen als Quelle wurde dieses 23 kDa-Protein zusammen mit anderen Proteinen, die bei ungefähr der gleichen Position in dem HPLC-Gradienten co-eluierten, durch zusätzliche RP-HPLC-Schritte subfraktioniert. Wieder waren Proliferationsantworten von mit gesamten Myelinproteinen primär stimulierten ("primed") T-Zellen des peripheren Bluts gegen jene HPLC-Fraktionen gerichtet, die das 23 kDa-Protein enthielten.
Das 23 kDa-Protein wurde bis zur Homogenität durch Umkehrphasen- HPLC gereinigt und einer direkten Aminosäuresequenzierung unterworfen. Jedoch wurden keine eindeutigen Signale bei einer Sequenzierung aufgezeichnet, was die Anwesenheit einer N-termina len Modifizierung des Proteins, die die Sequenzierung behindert, nahelegt. Um eine Sequenzierung interner Proteinabschnitte zu ermöglichen, wurden tryptische Fragmente aus dem 23 kDa-Protein erzeugt. Sechs Peptide wurden bis zur Homogenität gereinigt und einer Sequenzierung unterworfen. Dies führte zu der Identifizierung von drei separaten Sequenzen; bei zwei Peptidpaaren zeigte es sich, daß sie die gleiche N-terminale Sequenz aufwiesen. Alle drei Sequenzen waren identisch mit internen Sequenzen des humanen alpha B Crystallins (Tabelle 1).
Immun-Blotting unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern, die gegen das 23 kDa-Protein erzeugt worden waren, das aus menschlichem, von MS-betroffenem Gehirn gereinigt war, bestätigte die Identifizierung des Proteins als alpha B Crystallin. Western-Blotting des durch SDS-PAGE aufgetrennten Inhalts der HPLC-Fraktion 8 aus von MS betroffenem Myelin führten zu der ausgeprägten Anfärbung nur der vorherrschenden 23 kDa-Proteinbande in dieser Fraktion. Diese Proteinbande kann auch in der entsprechenden HPLC-Fraktion, die Proteine aus Kontroll-Myelin enthält, nachgewiesen werden. Auch die aus einer kommerziellen Präparation von alpha B Crystallin aus Rinderaugenlinsen isolierte B-Kette von alpha Crystallin wurde bei einem Western- Blotting durch die anti-23 kDa-Antikörper erkannt, wohingegen keine Erkennung der A-Kette von alpha Crystallin und auch nicht von gereinigtem MBP aus menschlichem, von MS betroffenem Myelin nachgewiesen werden konnte. Eine Co-Migration bei SDS-PAGE wurde zwischen alpha B Crystallin aus Rinderaugenlinsen und dem gereinigten menschlichen 23 kDa-Myelinprotein aus von MS betroffenem Myelin beobachtet. Auch bei Umkehrphasen-HPLC verhielten sich das gereinigte 23 kDa-Protein und alpha B Crystallin identisch. Tabelle 1. Tryptische Fragmente von gereinigtem menschlichem 23 kDa-Protein enthalten alpha B Crystallin-Se- quenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO (B) STRASSE: Juliana von Stolberglaan 148 (C) ORT: Den Haag (D) BUNDESLAND: Zuid-Holland (E) LAND: Niederlande (F) POSTLEITZAHL (ZIP): 2595 CL
(A) NAME: von Noort, Johannes Maria (B) STRASSE: c/o Lange Kleiweg 139 (C) ORT: Rijswijk (D) BUNDESLAND: Zuid-Holland (E) LAND: Niederlande (F) POSTLEITZAHL (ZIP): 2288 GJ
(A) NAME: von Sechel, Arianne Christine (B) STRASSE: c/o Lange Kleiweg 139 (C) ORT: Rijswijk (D) BUNDESLAND: Zuid-Holland (E) LAND: Niederlande (F) POSTLEITZAHL (ZIP): 2288 GJ
(A) NAME: Oagmiri, Mustapha El (B) STRASSE: c/o Lange Kleiweg 139 (C) ORT: Rijswijk (D) BUNDESLAND: Zuid-Holland (E) LAND: Niederlande (F) POSTLEITZAHL (ZIP): 2288 GJ
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Alpha B Crystallin zur Verwendung bei der Diagnose und Therapie von Auto- Immunerkrankungen, insbesondere von Multipler Sklerose
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG: ANMELDENUMMER: PCT/NL95/00203

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 175 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: unbekannt (D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii)ART DES MOLEKÜLS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: unbekannt (D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0 : 2:

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: unbekannt (D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: unbekannt (D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

Claims

1. Verwendung von alpha B Crystallin oder eines immunogenen Teils oder Derivats desselben oder eines Antikörpers gegen alpha B Crystallin zur Diagnose von Auto-Immunerkrankungen, wobei die Diagnose den Nachweis von alpha B Crystallin oder eines Teils von alpha B Crystallin oder eines Antikörpers gegen alpha B Crystallin in einer Körperflüssigkeit umfaßt.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Auto-Immunerkrankung Multiple Sklerose ist.

3. Alpha B Crystallin oder wenigstens ein spezifischer immunogener Teil oder ein Derivat desselben zur Verwendung als therapeutisches Agens.

4. . Alpha B Crystallin oder wenigstens ein spezifischer immunogener Teil oder ein Derivat desselben zur Verwendung bei der Behandlung von Auto-Immunerkrankungen.

5. Alpha B Crystallin oder wenigstens ein spezifischer immunogener Teil oder ein Derivat desselben zur Verwendung bei der Behandlung von multipler Sklerose.

6. Alpha B Crystallin oder wenigstens ein spezifischer immunogener Teil oder ein Derivat desselben zur Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei es verwendet wird, um gegenüber alpha B Crystallin Toleranz zu induzieren.

7. Verwendung von alpha B Crystallin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Auto-Immunerkrankungen.

8. Verwendung von alpha B Crystallin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von multipler Sklerose.

9. Antagonist von alpha B Crystallin, der Antikörper gegen alpha B Crystallin ist, wobei der Antagonist die Immun-Antwort gegen alpha B Crystallin blockiert.

10. Antagonist nach Anspruch 9, der die Wechselwirkung zwischen alpha B Crystallin und T-Zellen blockiert.

11. Antagonist nach Anspruch 10, wobei die T-Zelle eine T-Helfer-Zelle ist.

12. Auto-reaktive T-Zelle, die für alpha B Crystallin spezifisch ist, zur Verwendung als therapeutisches Agens.

13. Auto-reaktive T-Zelle, die für alpha B Crystallin spezifisch ist, zur Verwendung bei der Behandlung von Multipler Sklerose.

14. Auto-reaktive T-Zelle nach Anspruch 12 oder 13, die für alpha B Crystallin spezifisch ist und die inaktiviert worden ist.

15. Verwendung einer autoreaktiven T-Zelle gegen alpha B Crystallin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Multipler Sklerose.

16. Vakzine zur Verwendung bei der Behandlung von Auto-Immunerkrankungen, die eine gegen alpha B Crystallin gerichtete inaktivierte auto-reaktive T-Zelle umfaßt.

17. T-Zell-Rezeptor oder ein Teil oder ein Derivat desselben, erhältlich von einer T-Zelle nach den Ansprüchen 12 bis 14 zur Verwendung bei der Behandlung einer Auto-Immunerkrankung, insbesondere von Multipler Sklerose.

18. Vakzine zur Verwendung bei der Behandlung einer Auto-Immunerkrankung, insbesondere von Multipler Sklerose, welche einen T-Zell-Rezeptor oder einen Teil oder ein Derivat desselben nach Anspruch 17 umfaßt.