DE69031563T2

DE69031563T2 - Behandlung der autoimmunen uveoretinitis in menschen

Info

Publication number: DE69031563T2
Application number: DE69031563T
Authority: DE
Inventors: David Allen West Newton Ma 02165 Hafler; Robert B. Bethesda Md 20814 Nussenblatt; Alan G. Potomas Md 20854 Palestine; Howard L. Brookline Ma 02146 Weiner
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Autoimmune Inc
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Autoimmune Inc
Priority date: 1989-07-14
Filing date: 1990-07-16
Publication date: 1998-02-12
Anticipated expiration: 2010-07-17
Also published as: AU6058390A; JPH05501866A; US5961977A; BR9007527A; JP2607751B2; ATE158950T1; FI920139A0; EP0482089A1; NO920127L; EP0482089A4; CA2063416A1; WO1991001333A1; AU670024B2; DK0482089T3; NO920127D0; ES2109234T3; HU9200107D0; CA2063416C; DE69031563D1; KR0159046B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Autoantigens, das für Uveoretinitis spezifisch ist oder eines Fragments dieses Autoantigens für die Herstellung eines oral oder enteral verabreichbaren Medikaments für die Behandlung menschlicher Uveoretinitis.
Die wirksame Behandlung von organspezifischen entzündlichen Störungen, die vermutlich einen Autoimmunursprung haben, ist ein ständiges Ziel in der klinischen Medizin. Bis jetzt haben sich klinisch orientierte Ansätze auf die Verabreichung pharmakologischer Substanzen konzentriert, die eine nichtspezifische Wirkung auf die Immunreaktion haben. In der letzten Zeit wurde Cyclosporin, ein Undecapeptid, das die Immunreaktion nicht spezifisch im Hinblick auf das Antigen unterdrückt, das jedoch vor allem einen auf die T-Zellen gerichteten Wirkungsbereich aufweist (Nussenblatt, R. B. und A. G. Palestine, Surv. Ophthalmol. 31:159, 1986) wirkungsvoll für die Behandlung verschiedener Störungen verwendet, von denen man annimmt, daß sie einen Autoimmunursprung haben, einschließlich Uveitis (Nussenblatt, R. B., et al., Am. J. Ophthalmol. 96:275, 1983). Unglücklicherweise weist Cyclosporin ernste Nebenwirkungen auf, was seine Nützlichkeit begrenzt. Außerdem sind die Medikationswirkungen, die mit Cyclosporin assoziiert sind, wie bei allen gegenwärtigen immunosupprimierenden Therapien, nicht spezifisch.
Experimentelle immunotherapeutische Ansätze zur Suppression von Autoimmunerkrankungen, einschließlich Uveitis, haben sich auf die Manipulation der Immunreaktion durch nichtpharmakologische Mittel konzentriert, wie z.B. eine monoklonale Antikörper- Therapie (Hafler, D. A., et al., J. Immunol. 141:131, 1988); eine T-Zell-Impfung (Ben- Nun, A., et al., Nature 292:60, 1981); und die Induktion einer Immuntoleranz durch Verabreichung von Autoantigenen. In letzter Zeit wurde für die Gabe von basischem Myelinprotein (MBP) oder seinen Fragmenten gezeigt, daß es die histologische und klinische Expression von experimenteller Autoimmun-Encephalomyelitis (EAE) verhindert, die als Modell für die menschliche entmyelinierende Krankheit, multiple Sklerose, verwendet wurde (Higgins, P. J. und H. L. Weiner, J. Immunol. 140:440, 1988; Lider et al., J. Immunol. 142:748, 1989; Bitar, D. M. und C. C. Whitacre, Cell Immunol. 112:364, 1988).
Die experimentelle Autoimmun-Uveoretinitis (EAU) kann durch verschiedene Autoantigene induziert werden, die von der Retina abstammen (Gery, I., et al., in N. Osborne und J. Chader (Hrsg.): Progress in Retinal Research. Oxford, Pergamon Press, Band 5, Seiten 75-109, 1986). Bis jetzt ist das am gründlichsten untersuchte Antigen und Modellsystem dasjenige, das durch das retinale S-Antigen induziert wird (S-Ag) (Gery, I., et al., in Progress in Retinal Research, supra). Es wird angenommen, daß das S-Ag an der tatsächlichen Uveoretinitis beim Menschen beteiligt ist, da betroffene Menschen gegen S-Ag sensibilisiert sind. Das S-Ag-Modell zeigt, daß EAU eine T-Zell-vermittelte Störung ist, wobei die Verabreichung von langzeitigen CD4+ T-Zellinien, die für S-Ag spezifisch sind, diese Störung induzieren kann (Caspi, R. R., et al., J. Immunol. 136:928, 1986).
Kozak et al. [Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), Band 129, Seite 73-88 (1978)] offenbart die Inhibition von induzierter Uveoretinitis bei Meerschweinchen durch eine Reihe von Injektionen mit Retinalextrakt. Injektionen der Antigen-Präparation allein oder vermischt mit inkomplettem Freund's Adjuvant erwiesen sich als wirksam entweder bei der Verhinderung des Ausbruchs der Krankheit folgend auf die Induktion (Prophylaxe) oder bei ihrer Behandlung.
Kozak et al. [Eur. J. Immunol., Band 17, Seite 541-547 (1987)] betrifft die Verhinderung experimenteller Autoimmun-Uveoretinitis (EAU) durch Präimmunisierung von Ratten mit monoklonalen anti-S-Antigen-Antikörpern. Diese Druckschrift erwähnt außerdem, daß die Toleranzinduktion gegen das Autoantigen durch Injektion des Autoantigens ohne Adjuvant oder mit inkomplettem Freund's Adjuvant vor Immunisierung mit dem Autoantigen erreicht werden kann.
Das S-Ag EAU-Modell ist aus verschiedenen Gründen von großem Interesse. Zunächst ist bis jetzt das S-Ag das einzige retinale Autoantigen, gegen das eine beträchtliche Anzahl von Patienten mit einer endogenen Intermediat- und Posterior-Uveitis in vitro ständig proliferierende Reaktionen zeigen (Nussenbatt, R. B., et al., Am. J. Ophthalmol. 89:173, 1980; Nussenblatt et al., Am. J. Ophthalmol. 94:147, 1982). Außerdem wurde die gesamte Aminosäuresequenz von S-Ag kürzlich offenbart, wobei zwei Fragmente als N bzw. M bezeichnet wurden, wobei die Uveitogenizität gezeigt wurde (Donoso, L. A., et al., Curr. Eye Res. 8:1151, 1987; Singh, V. K., et al., Cell. Immunol. 115:413, 1988). Außerdem scheint drittens die Immunmanipulation dieses Modells eine ausgezeichnete Vorhersagewirkung für die menschliche Uveoretinitis zu haben, wie durch die klinische Wirksamkeit der Cyclosporin-Verwendung beim Menschen demonstriert wurde (Nussenbatt, R. B., et al., J. Clin. Invest. 67:1228, 1981), die zunächst an dem EAU- Modell getestet wurde.
Ein wichtiges Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines spezifischen fokussierten oder gerichteten Medikaments gegen Uveoretinitis. Ein besonderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Mittels zur Unterdrückung der Symptome der Uveoretinitis durch orale oder enterale Verabreichung von Mitteln, die auf einer Verminderung der Immunreaktion auf Uveoretinitis-spezifische Antigene gerichtet sind.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von oral oder enteral verabreichbaren Uveoretinitis-spezifischen Autoantigenen und deren Fragmente gerichtet, zur Herstellung eines Medikaments für die Unterdrückung der klinischen Manifestation dieser Krankheit. Durch Verabreichung des Medikaments wird die Induktion einer spezifischen Toleranz erreicht.
Die gegenwärtigen Erfinder haben entdeckt, daß Symtome, die mit der Autoimmunerkrankung, Uveoretinitis, assoziiert sind, durch orale Verabreichung an einen Säuger, der eine solche Behandlung benötigt, einer effektiven Menge eines für Uveoretinitis spezifischen Autoantigens oder Fragmenten eines solchen Autoantigens, unterdrückt oder abgeschwächt werden können. Daher schlagen die vorliegenden Erfinder die Verwendung einer effektiven Menge von einem oder mehreren der vorstehenden Uveoretinitis suprimierenden Mitteln zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung vor.
Eine solche Formulierung wird für die therapeutische oder prophylaktische Verabreichung für einen Säuger, der eine solche Behandlung benötigt, geeignet sein.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 stellt den Grad der Entzündung, betrachtet nach histologischer Überprüfung von Lewis-Rattenaugen 14 Tage nach Immunisierung mit S-Ag dar. Sternchen zeigen einen statistisch signifikanten Unterschied bei entzündlichen Erkrankungen (EAU) im Vergleich mit Ratten, die keine orale Verabreichung von S-Ag oder Fragmenten davon erhielten oder mit Ratten, die ein irrelevantes Antigen erhielten (Rinderserum-Albumin, abgekürzt BSA).
Fig. 2 zeigt den Grad der Entzündung, histologisch betrachtet an Augen von Lewis- Ratten, die mit S-Ag oder einem Fragment davon 14 Tage nach Immunisierung entweder mit dem M- oder N-Fragment von S-Ag gefüttert wurden.
Fig. 3A zeigt die Wirkung einer oralen Verabreichung von S-Ag, dem N-Fragment, dem M-Fragement und BSA auf die proliferative Reaktion auf S-Ag, gemessen in Lymphknotenzellen, die für eine Drainage der Stelle der S-Ag Immunisierung verantwortlich sind. Die Ergebnisse stammen von mindestens vier Tieren und werden als Stimulationsindex ±S.E. dargestellt. Das einzelne Sternchen bedeutet einen statistisch signifikanten Unterschied (p=0,018) im Vergleich mit einer oralen Verabreichung von BSA, während das doppelte Sternchen einen p-Wert von 0,005 anzeigt.
Fig. 3B zeigt die Wirkung einer oralen Verabreichung von BSA und S-Ag auf die proliferativen Reaktionen auf unerhebliche Antigene PPD (gereinigtes Proteinderivat von Tuberkulin) und Con A (Concanavalin A), gemessen in Lymphknotenzellen, die für die Drainage der Stelle der S-Ag Immunisierung verantwortlich sind.
Fg. 4A zeigt die Wirkung einer Exposition zu Splenocyten entweder von S-Ag- (TmSAg) oder BSA-(TmBSA) gefütterten Tieren, die in vitro mit S-Ag präinkubiert worden waren, auf die S-antigen-spezifische Indikatorzellinie ThS (ThS-Ag). Eine Unterdrückung der ThSAg-Reaktion auf S-Ag kann bei allen Verhältnissen von ThSAg zu TmSAg festgestellt werden und dieser Suppressionsgrad war statistisch signifikant höher bei Verhältnissen von 1:5 und 1:10 (p=0,04 und 0,002), im Vergleich mit den bei ThSAg und TmBSA Co- Kulturen beobachteten Reaktionen.
Fig. 4B demonstriert die Reaktion von ThSAg auf Con A (ein T-Zell-Mitogen) mit einer Co-Kultur von TmSAg oder TmBSA. Eine Suppression wurde bei einem Verhältnis von einem ThSAg zu zwei Splenocyten nicht bemerkt, während ein identischer Suppressionsgrad für beide bei höheren Verhältnissen festgehalten wurde.
Fig. 4C zeigt die Reaktionen, die durch Co-Kultivierung von ThS-Ag mit Splenocyten von mit KLH, d.h. Schlüsselloch(keyhole)-Napfschnecken-Hämocyanin (wobei solche Splenocyten als TmKLH bezeichnet werden) oder nichts (bezeichnet als Tm-Kontrolle) gefütterten Tieren, die dann in vitro mit S-Ag präinkubiert worden waren, erhalten wurden.
Fig. 5 zeigt die Co-Kultivierung von ThSAg oder ThPPD (eine andere für PPD spezifische Indikatorzellinie) mit TmSAg, das in vitro mit S-Ag präinkubiert worden war. Eine deutliche Suppression der ThSAg-Reaktion auf S-Ag wurde beobachtet, während eine verstärkte ThPPD proliferative Reaktion auf PPD bemerkt wurde.
Fig. 6 zeigt das Muster eines Krankheitsausbruchs (X-Achse) bei Lewis-Ratten über den Ablauf von einer 21-tägigen Zeitspanne. P. O. ist die experimentelle Gruppe, die mit einem mg S-Ag an den Tagen 7, 9, 12 und 15, folgend auf eine Immunisierung mit S-Ag am Tag Null gefüttert wurden.
Fig. 7 zeigt den Grad der Entzündung, histologisch an Augen von Lewis-Ratten beobachtet, die mit S-Ag an den Tagen 7, 9, 12 und 15, folgend auf eine Immunisierung mit S-Ag am Tag Null gefüttert wurden. Die Ergebnisse stammen von mindestens sechs Tieren und sind als Mittel ± Standardabweichung vom Durchschnitt (SEM) dargestellt. Die histologische Feststellung des Krankheitsgrades (grading) ist der Index der Entzündung, basierend auf Kriterien, die von 0 (kein Beweis einer entzündlichen Krankheit) bis 4 (vollständige Zerstörung der Retina-Architektur) reichen.
Fig. 8 ist ein Diagramm, das die Aminosäuresequenz des menschlichen S-Antigen- Polypeptids zeigt sowie die relativen Stellungen der Polypeptide 3, 6, 8, 13, 18, 32, 35 und 36 der vorliegenden Erfindung.
Die experimentelle Autoimmun-Uveitis oder Uveoretinitis (hiernach "EAU") ist eine Autoimmunkrankheit, die klinisch durch eine schwere Entzündung des Uvealtrakts, der Retina und dem vorderen Segment des Auges gekennzeichnet ist. Es besteht eine charakteristische Zerstörung von retinalen Photorezeptor-Zellen. Alle diese Feststellungen können bei menschlichen Uveitis-Fällen beobachtet werden. Gleichzeitig wurde Apinealismus bei niederen Tieren und nichtmenschlichen Primaten mit EAU festgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines für Uveoretinitis spezifischen Autoantigens oder eines Fragments eines solchen Autoantigens zur Herstellung eines oral oder enteral verabreichbaren Medikaments für die Behandlung menschlicher Uveoretinitis bereit.
Wie her verwendet ist "Autoantigen" jede Substanz, die normalerweise bei einem Säuger gefunden wird, die, in einer abnormalen Situation, von den Lymphocyten oder Antikörpern des Säugers nicht länger als Teil des Säugers selbst erkannt wird und daher vom immunoregulatorischen System attakiert wird, als ob es sich um eine Fremdsubstanz handeln würde. Die Bezeichnung umfaßt außerdem Antigen-Substanzen, die Konditionen induzieren, die die Symptome einer Autoimmunkrankheit aufweisen, wenn sie Säugern verabreicht werden. Ein für Uveitis spezifisches Autoantigen ist eine Substanz innerhalb der vorstehenden Definition, die (a) einem Angriff durch das Immunsystem eines Säugers mit Uveitis ausgesetzt ist; und/oder (b) eine Krankheit mit den Symptomen der Uveitis nach parenteraler Verabreichung an einen Säuger induziert.
Außerdem soll die Bezeichnung Autoantigene umfassen, die für Uveitis spezifisch sind, wie auch ihre Fragmente, die die Fähigkeit haben, die Symptome der Uveitis nach oraler oder enteraler Verabreichung zu supprimieren, vorzugsweise ohne die allgemeine Fähigkeit des so behandelten Säugers wesentlich zu beeinflussen, eine Immunreaktion gegen die Antigene zu errichten.
Autoantigene im Umfang der vorliegenden Erfindung umfassen das S-Antigen (hiernach "S-Ag"), das ein lösliches Photorezeptor-Zellprotein mit einem anscheinenden Molekulargewicht von ungefähr 48 Kilodaltons (kDa) ist. S-Ag kann durch Isolation und Reinigung aus Säugeraugen hergestellt werden, z.B. Rinderaugen, unter Verwendung von im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren, wie z.B. dem in Dorey, C., et al., Ophthalmic Res. 14:249-255, 1982, beschriebenen Verfahren. Bis jetzt wurde S-Ag in allen Säugeraugen gefunden, aber Rinderaugen sind die bevorzugte Quelle, da sie leicht erhältlich sind und da ihr S-Ag dem menschlichen S-Ag ähnelt.
Kurz gefaßt kann S-Ag aus Rinderretinas durch Ionen-Austausch-Chromatographie oder isoelektrische Fokussierung isoliert und gereinigt werden. Alternativ kann S-Ag durch Salzausfällung schnell isoliert und gereinigt werden, z.B. unter Verwendung einer ersten 50%igen Ammoniumsulfatausfällung und einer zweiten 50% Ammoniumsulfatausfällung, Gelfiltration, z.B. Sephadex G-200 (Pharmacia Inc., Piscataway, N.J.) Filtration und einer abschließenden Reinigung durch Adsorptions-Chromatographie auf Hydroxylapatitagarose, z.B. HA-Ultrogel (erhältlich von Pharmindustrie Frankreich) Chromatographie, wobei all diese von Dorey et al., supra, beschrieben sind. S-Ag stellt ungefähr 3% der in einem Roh-Retinalgewebeextrakt vorhandenen Proteine dar. Durch Isolierung und Reinigung unter Verwendung der aufeinanderfolgenden Schritte einer Präzipitation, Filtration und Adsorptions-Chromatographie werden ungefähr 40% S-Ag im typischen Fall nach der letzten chromatographischen Auftrennung wiedergewonnen, gemessen z.B. durch den radialen Immunodiffusionstest. Kleinere Verunreingungen können durch Hochdruckflüssig-Chromatographie (HPLC) entfernt werden, wenn dies gewünscht wird. Alternativ kann S-Ag das von Wacker, W. B., et al., J. Immunol. 119:1949-1958 beschriebene Verfahren gereinigt werden. Dorey et al.'s Verfahren scheint die besten Ergebnisse unter allen bis jetzt bekannten Verfahren zu ergeben.
Die vollständige Aminosäuresequenz von Rinder-, menschlichem und Maus-S-Ag wurde in Shinohara, T., et al., S-Antigen: Structure, Function and Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) in Progress in Retinal Research, Osborne und Chader Herausgeber, Pergamon Press, Seiten 51-66, veröffentlicht. Eine Teilsequenz von S-Ag wurde außerdem von Donoso, C., et al., supra veröffentlicht.
Zusätzliche zu "kompletten" oder ganzen Autoantigenen, wie z.B. S-Ag, können außerdem Fragmente, die die Uveitis-Symptome supprimieren können (einschließlich solcher Symptome, die durch das vollständige Autoantigen oder eine Fragment davon induziert werden) und ähnlich aktive Analoge, die davon abgeleitet sind, oral oder enteral (z.B. durch Verfütterung durch einen Schlauch) in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verabreicht werden. Unter den S-Ag-Fragmenten, die so verabreicht werden können, befinden sich N- und M-Antigene. Andere geeignete S-Ag-Fragmente sind die nichtinduzierenden Fragmente, die in Donoso et al., supra, 1987 offenbart sind. Andere Okular-Antigene, wie z.B. das Interphotorezeptor-Retinoid-Bindungsprotein (IRBP) und Rhodopsin können ebenfalls als Uveitis spezifische Autoantigene verwendet werden. IRBP wurde aus der Interphotorezeptormatrix (IPM) von Affen isoliert und im Hinblick auf die isoelektrischen Fokussierungsbandenmuster, die Kohlenhydratanalyse, die Ultrazentrifugal-Konzentrationsverteilung, die Aminosäureanalyse, die Aminoendanalyse, spektrale Eigenschaften, z.B. Tryptophan und Sulfhydrylgehalt und Fluoreszenz-Untersuchungen charakterisiert. (Redmond, T. M., et al., Biochem. 24:787, 1985). Rhodopsin wurde ebenfalls gut beschrieben und von Shields et al., Biochem. Biophys. Acta 147:238, 1967, Wald, Brown, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 36:84, 1950; und Hirtenstein, A., Biochem. J. 199:359, 1970 charakterisiert.
Die Fragmente können unter Verwendung konventioneller chemischer Syntheseverfahren hergestellt werden, z.B. durch Verwendung eines bekannten Merrifield-Peptid- Syntheseverfahrens, das z.B. in Merrifield, R. B., Fed. Proc. Am. Soc. Ex. Biol. 21:412, 1962 und J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963 und Mitchel, A. R., J. Am. Chem. Soc. 98:7357, 1976, beschrieben ist.
Alternativ können S-Ag und supprimierende Fragmente unter Verwendung von DNA Rekombinations-Verfahren gemäß den im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren hergestellt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden natürliche und synthetische Autoantigene, z.B. S-Ag und Fragmente davon, wie auch genetisch hergestellte Autoantigene und/oder Fragmente verwendet.
Es wurde oft berichtet, daß die EAU-Pathogenese T-Zell vermittelt ist. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, glauben die gegenwärtigen Erfinder, daß die orale Verabreichung oder Fütterung von Autoantigen-Proteinen, z.B. dem Autoantigen und Fragmenten oder Analogen davon, das spezifisch für Uveoretinitis ist, die antigen- spezifische Suppression über CD8+ T-Zellen (Suppressor-Zellen) induziert, die durch eine solche Verfütterung hervorgerufen werden. Diese Zellen vermitteln die Suppression (Herab-Regulierung) der Immunreaktion. Diese Herab-Regulierung ermöglicht die Suppression klinischer Symptome (wie z.B. einer Entzündung), die mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert sind, z.B. EAU, die die Symptome einer Uveitis zeigt.
Die vorliegende Beschreibung zeigt, daß die orale oder enterale Verabreichung eines vollständigen S-Antigen-Moleküls zu einer Immuntoleranz und der Verhinderung von S-Ag induzierter EAU führen wird. Außerdem wurde eine antigen-spezifische Suppression der Immunreaktion in vitro gezeigt und die T-Suppressor-Beteiligung wurde durch die Tatsache bestätigt, daß Anti-CD8-Antikörper (die spezifisch gegen den CD8-Suppressor/cytotoxischen Marker auf der Oberfläche von Lymphoid-Zellen gerichtet sind) diese Immunreaktionssuppression blockiert.
Die T-Suppressor-vermittelte Immunsuppression wird im Beispiel 3 unten illustriert, bei dem nichtimmunisierte Säuger, z.B. Ratten, dreimal mit definierten Mengen S-Ag gefüttert werden, wobei die Fütterungen im Abstand von 2 bis 3 Tagen liegen. Danach wurden Milzzellen der Tiere gesammelt und bestrahlt. Eine Responderzelle, z.B. eine CD4+ S-Ag-spezifische T-Helferzellinie (Ths-Ag) oder eine CD4+ PPD-spezifische T-Helferzellinie (ThPPD) wurden in Gegenwart der bestrahlten Milzzellen angezüchtet. Die antigen-getriebene Indikatorzellproliferation wurde dann in Gegenwart oder Abwesenheit der geeigneten Antikörper gemessen, wie z.B. dem OX-8-Antikörper, der CD8 erkennt (ein Glycoprotein, das spezifisch auf der Oberfläche einer Untergruppe von T-Suppressorzellen von Ratten auftritt) und Leu 2a (ein nicht im Zusammenhang stehender Antikörper, der keine bekannte Affinität für T-Zell-Untergruppen von Ratten zeigt). Einer oder mehrere dieser Antikörper wurde zu einigen der oben genannten Kulturen hinzugefügt. Die Ergebnisse der Zellproliferation dieser Kulturen zeigen, daß eine deutliche (und statistisch signifikante) Suppression der T-Helfer ThS-Ag-Zellinie spezifisch durch orale Verfütterung eines Autoantigens, wie z.B. S-Ag, verwendet in Übereinstimmung mit dieser Erfindung, erhalten wurde. Dies bedeutet wiederum, daß die Suppression durch antigen-spezifische (z.B. S-Ag-spezifische) Suppressorzellen vermittelt wird, die in der Milzzellpopulation der S-Ag-gefütterten Ratten vorliegen.
(S-Ag)-induziertes EAU ist ein experimentelles Modell für eine menschliche Uveitis mit einem bemerkenswerten Vorhersagen-Wert für die menschliche Störung. Bei Ratten kann EAU durch direkte Immunisierung mit S-Ag oder durch Übertragung von CD4+ /CD9-T-Lymphocyten-Linien auf native Wirte induziert werden, Gery, I. M., et al., supra; Caspi R. R., et al., supra. Die dominante Rolle der T-Zellen bei dieser Störung wird weiter durch die Beobachtung unterstützt, daß Cyclosporin (das einen vorherrschend gegen die T-Zellen gerichteten Wirkungsbereich hat) effektiv EAU verhindern kann (Nussenblatt, R. B., et al., 1981, supra). Die hier offenbarten Ergebnisse deuten an, daß die oral-induzierte Immuntoleranz eine Anwendbarkeit auf viele organ-spezifische Autoimmunmodelle aufweist, insbesondere diejenigen, die eine vorherrschende T-Zell-Beteiligung aufweisen. Dies soll jedoch nicht bedeuten, daß dieser orale Toleranzansatz blind ausprobiert werden kann oder sollte. Zum Beispiel entsprechen die Wirkungen einer Antigen-Verfütterung, die bei EAU bemerkt wurden, denjenigen, die im EAE/MBP-Modell gefunden wurden, nicht vollständig. Während beide induzierende und nichtinduzierende Fragmente von MBP fähig waren, einen immunotoleranten Zustand gegen EAE auszulösen, waren zwei induzierende Fragmente von S-Ag nicht in der Lage, dies für S-Ag induzierte EAU zu bewirken. Kürzlich wurde über die N- und M-Fragmente des S-Ag-Moleküls berichtet, daß sie uveitogen sind (Donoso, L. A., et al., supra; Singh, V. K., supra). Diese Fragmente (selbst wenn sie zusammen verfüttert wurden) konnten keinen immunotoleranten Zustand gegen vollständiges S-Ag induzieren, obwohl das M-Fragment substantielle Immuntoleranz gegen EAU induzierte, das wiederum mit M- und N-Fragmenten induziert war. Zusätzlich wird angenommen, daß nichtinduzierende Fragmente von S-Ag eine EAU-supprimierende Aktivität aufweisen. Zum Beispiel können Fragmente, die aus den in Donoso, supra, ausgewählt wurden, in Übereinstimmung mit der unten angegebenen Verfahrensweise synthetisiert und auf ihre Fähigkeit zur Induktion einer Toleranz überprüft werden, wobei optional die verabreichten Mengen verändert werden können, wie im Stand der Technik wohl bekannt ist.
Die mit den M- und N-Fragmenten induzierte EAU-Erkrankung war nicht so schwer, wie diejenige, die durch das native Molekül ausgelöst wurde und die molare Menge jedes Fragments, die benötigt wurde, um die Krankheit zu induzieren, war mehrfach höher als die minimale EAU-induzierende Menge von S-Ag von 1 bis 5 µg. Wie oben festgehalten, schützt die orale Verfütterung entweder mit dem M-Fragment (oder vollständigem S-Ag) die Tiere sowohl gegen N- als auch M-induziertes EAU. Auf diese Weise zeigt der oral- induzierte tolerante Zustand eine strikte Antigen-Spezifität, die weiter durch die Beobachtung gestützt wird, daß die Fütterung von S-Ag die Expression der nicht damit in Verbindung stehender Autoimmunstörung EAE nicht verhinderte, die durch das nicht damit in Verbindung stehende Autoantigen MBP induziert wird. Im Hinblick auf diese Feststellungen wirkt der Einbau von diskreten Fragmenten von S-Ag in orale oder enterale pharmazeutische Formulierungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung als nützliches Hilfsmittel (oder Ersatz) für die S-Ag-Therapie.
S-Ag-Fragmente, die T-Suppressor-Zellen hervorrufen, die für S-Ag spezifisch sind, sind eindeutig nützlich und S-Ag-Fragmente, die gegen eine Antigenexposition mit demselben (oder einem unterschiedlichen) S-Ag-Fragment schützen, würden ebenfalls als Hilfsmittel für eine Uveitis-Therapie nützlich sein, da Uveitis-Symptome durch mehr als ein Autoantigen ausgelöst werden können, einschließlich Autoantigenen, die mit Fragmenten von S-Ag identisch oder homolog sind.
Die in vitro-Suppression einer Immunreaktion, die durch eine statistisch signifikante (hiernach manchmal bezeichnet als "wesentliche") Abnahme der proliferativen Reaktion der Lymphknotenzellen von mit S-Ag gefütterten Tieren und insbesondere durch Suppression von Indikator ThS-Ag-Zellen (die für S-Ag aber nicht für T-Helferzellen spezifisch sind) mit Splenocyten von S-Ag-gefütterten Tieren beobachtet wurde, bestätigt, daß die antigen-spezifische Suppression, an der T-Zellen beteiligt sind, durch orale Fütterung induziert wird. Die in Beispiel 3 getroffene Feststellung, daß der OX-8-Antikörper, der CD8 (ein T-Suppressor-spezifisches Glycoprotein auf der Oberfläche einer Untergruppe von T-Suppressor-Zellen von Ratten) erkennt, die Suppression umkehrte, deutet an, daß T-Suppressor-Zellen für die beobachtete Inhibition verantwortlich sind.
Daher ist die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines Autoantigens gerichtet, das für Uveoretinitis spezifisch ist, oder auf ein Fragment des Autoantigens für die Herstellung eines oral oder enteral verabreichbaren Medikaments für die Behandlung menschlicher Uveoretinitis.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist es beabsichtigt, ein Mittel für die Elimination oder zumindest deutliche Abschwächung solcher klinischen Manifestationen und Symptome bereitzustellen. Die Menge des Uveitis-supprimierenden Mittels, wenn es für die Therapie verwendet wird, sollte ausreichen, um eine meßbare und vorzugsweise eine statistisch signifikante Abschwächung von mindestens einem klinischen Symptom zu erreichen, das mit Uveitis assoziiert ist, z.B. einer Entzündung, einer Abnahme der visuellen Schärfe und/oder einem zystoiden Makula-Ödem oder anderen Parametern, deren Veränderung vom Normalwert mit Uveitis assoziiert ist.
Allgemein liegt die wirksame Menge des Uveitis-suppremierenden Mittels zur Suppression oder Abschwächung klinischer Symptome der Uveitis bei Säugern bei ungefähr 0,4 bis ungefähr 15 mg/kg/Tag. Bei Menschen umfaßt eine solche wirksame Menge des die Uveitis-supprimierenden Mittels ungefähr 0,1 bis 15 mg/kg/Tag, vorzugsweise ungefähr 4 bis ungefähr 8,5 mg/kg/Tag. Anders ausgedrückt liegt die effektive Menge für einen Erwachsenen mit 70 kg bei ungefähr 30 bis ungefähr 1000 mg/Tag, vorzugsweise bei ungefähr 300 bis ungefähr 600 mg/Tag.
Natürlich muß der oben angegebene breite Bereich entsprechend Faktoren, wie z.B. dem Alter, dem Geschlecht und physischen Bedingungen des zu behandelnden Subjekts, wie auch der Schwere der Krankheit und der spezifischen supprimierenden Aktivität des oder der zu verabreichenden Mittel eingestellt werden. Jedoch kann eine solche Einstellung geeigneter Dosierungen durch den Fachmann des Gebiets unter Verwendung von Routineexperimentation bestimmt werden. Zum Beispiel kann die optimale Dosierung unter Verwendung in Reihe verdünnter Präparationen der aktiven Mittel der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit einem geeigneten Testverfahren bestimmt werden, wie z.B. demjenigen, das in den unten dargestellten Beispielen beschrieben ist. Alternativ kann eine Matrix von Dosierungen und eine Häufigkeit der Verabreichungen aufgestellt werden und Gruppen experimenteller Subjekte können jedem Punkt auf der Matrix zugeordnet werden, um die optimalen Bedingungen zu bestimmen.
Die wirksamen Mengen des Autoantigens (oder von Fragmenten) können oral oder enteral verabreicht werden.
Das Autoantigen, z.B. S-Ag und seine Fragmente, wird vorzugsweise allein verabreicht oder in einem physiologisch akzeptablen Puffer, wie z.B. Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
Eine solche wirksame Menge kann einem Säuger, der diese Behandlung benötigt, in einer täglichen oralen Dosis oder in zwei oder mehr verteilten täglichen oralen Dosen zugeführt werden. Beim Menschen kann eine solche verteilte tägliche orale Dosis vorzugsweise bei dreimal pro Tag über eine Zeitspanne von ungefähr 90 bis ungefähr 120 Tagen liegen oder sogar länger, um eine ausreichende Aufnahme und Absorption des Autoantigens oder des Fragments sicherzustellen. Die Behandlung kann fortgesetzt oder wieder aufgenommen werden, wenn die Symptome bestehen bleiben oder wieder auftreten.
Pharmazeutische Formulierungen und wirksame Dosierungsformen umfassen eine wirksame Menge für die orale ode enterale Verabreichung eines für Uveoretinitis spezifischen Autoantigens und/oder Uveitis-supprimierender Fragmente davon sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
Die oben definierten Bedingungen sind ebenso auf solche pharmazeutischen Formulierungen anwendbar. So kann z.B. das Autoantigen das S-Antigen (S-Ag) oder biologisch aktive Fragmente davon umfassen.
Die gemäß dieser Erfindung erhaltene pharmazeutische Formulierung kann in fester, halbfester oder flüssiger Form vorliegen und kann weitere pharmazeutische akzeptable Füllstoffe, Träger oder Verdünnungsmittel umfassen sowie andere inerte Zutaten, wie auch Hilfsmittel. Beispiele für solche zusätzlichen Zutaten umfassen: phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), Stärke, Zucker und Bentonit und Siliciumdioxid. Sie kann außerdem mit anderen geeigneten Nahrungsformen vermischt werden, wie auch Geschmacksverstärkern und ähnlichem. Orale Formulierungen können in Form von Kapseln, Tabletten oder Käppchen (caplets) vorliegen, die gegebenenfalls mit einer inerten Beschichtung versehen sind (einschließlich einer Beschichtung, die die Aufnahme erleichtert) oder können in einem oralen oder enteralen Arzneimittel-Zuführsystem enthalten sein, das eine verzögerte Freisetzung zeigt, wie im Stand der Technik bekannt ist.
Beispiele für solche Beschichtungen umfassen Zellulose, Gelatine oder Derivate von einem der beiden. Flüssige Formulierungen, die ebenfalls geeignet sein können, könnten in flüssiger Form oder verkapselt verabreicht werden. Gelformulierungen sind ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen pharmazeutischen Formulierungen sind geeignet zur Behandlung der klinischen Manifestationen von Autoimmunerkrankungen mit den Symptomen von Uveitis beim Menschen.
Die vorliegende Erfindung wird unten in spezifischen Arbeitsbeispielen beschrieben, die die Erfindung darstellen sollen, ohne ihren Umfang zu begrenzen.

Material und Methoden

Tiere. Weibliche Lewis-Ratten, die 180-200 Gramm wogen, wurden von Charles River Laboratories (Raleigh, NC) erhalten und in allen Experimenten verwendet.

Antigene und Immunisierungsschema

Das Retina-Antigen-S-Ag wurde aus Rinderretinas gereinigt. (Dorey, C., et al., Ophthalmic Res. 14:249, 1982). Die zwei uveitogenen S-Ag-Fragmente, N und M (Donoso, L. A., et al., supra; Singh, V. K., supra) wurden verwendet. Die S-Ag-Fragmente wurden synthetisch gemäß den Vorschriften des Herstellers (Gebrauchsanleitung) hergestellt unter Verwendung einer DNA-Synthesevorrichtung Modell 380/381, (Applied Biosystems, Foster City, CA). Alternativ können die Peptide gemäß anderen bekannten Verfahren synthetisiert werden, z. B. wie beschrieben bei Donoso, 1987, supra oder bei Merrifield und/oder Mitchel, ebenfalls oben zitiert. Beide Fragmente hatten eine Länge von 18 Aminosäuren: das M-Peptid hatte eine Aminosäuresequenz DTNLASSTIIKEGIDKTV und das N-Peptid hatte die Sequenz VPLLANNRERRGIALDGKIKHE (wobei: A = Alanin, C = Cystein, D = Asparaginsäure, E = Glutaminsäure, F = Phenylalanin, G = Glycin, H-Histidin, I = Isoleucin, K = Lysin, L = Leucin, M = Methionin, N = Asparagin, P = Prolin, Q = Glutamin, R = Arginin, S = Serin, T = Threonin, V = Valin, W = Tryptophan und Y = Tyrosin bedeutet).
Basisches Myelinprotein (MBP) von Meerschweinchen wurde aus dem Gehirngewebe durch das Verfahren von Diebler et al. gereinigt (Diebler, G. E., et al., Prep. Biochem. 2:139, 1972).
Alle Immunisierungen wurden unter Verwendung von 50 Mikrogramm des Antigens durchgeführt, emulgiert in komplettem Freund's Adjuvant (CFA; Difco, Detroit, MI), das mit dem M. tuberculosis Stamm 37RA verstärkt wurde, der tote Bakterien für das Adjuvant bereitstellt (Difco, Detroit, MI), um eine endgültige Konzentration von 2,5 mg/ml zu erreichen. Den Tieren wurden 0,1 ml der Emulsion in nur einen hinteren Fußballen injiziert. Alle Tiere wurden 14 Tage nach der Immunisierung beobachtet, zu welcher Zeit sie geopfert wurden. Ihre Augen wurden entfernt, in 10% Formaldehyd gelegt und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Objektträger wurden hergestellt. Diese Objektträger wurden histologisch auf eine Entzündung durch einen der Untersucher überprüft, der als maskierter Beobachter diente, unter Verwendung von Kriterien, wie berichtet in Nussenblatt, R. B., et al., Arch. Opthalmol. 103:1559, 1985. Diese Kriterien bedeuten eine Modifikation des Systems zur Feststellung eines Krankheitsgrades, wie beschrieben von Wacker et al. (Wacker, W. B., et al., J. Immunol. 119:1949 (1977), das für Meerschweinchen entwickelt wurde. Kurz gefaßt sind die Einstufungskriterien für die Bestimmung einer Krankheit im hinteren Segment bei der Ratte die folgenden:
0: kein Beweis einer entzündlichen Krankheit; Spuren (0,5+), Architektur der Retina im wesentlichen intakt. Bereiche einer fokalen Zerstörung waren 1+, fokale Bereiche der Zerstörung mit deutlichem Ausfall von Photorezeptoren; 2+: wenig exsudative retinale Ablösung mit größerer Zerstörung, geringe bis gemäßigte Anzahl von Zellen im Glaskörper; 3+: die Retina-Architektur geht langsam verloren, größere exsudative retinale Ablösung, gemäßigte bis große Anzahl von Zellen im Glaskörper, und 4+: vollständige Zerstörung der retinalen Architektur.
Bei denjenigen Tieren, die mit MBP immunisiert wurden, war EAE durch Paralyse der Gliedmaßen charakterisiert und wurde wie folgt eingeteilt: 0: keine Krankheit; 1: verminderte Aktivität, hängender Schwanz; 2: leichte Paralyse, unsicherer Gang; 3: gemäßigte Paraparese, Gliedmaßen gespreizt; und 4: Tetraplegie. Alle anderen verwendeten Materialien sind kommerziell erhältlich.

BEISPIEL 1: Orale Toleranz: Schutz induziert durch orale Fütterung.

Die Ratten wurden dreimal entweder mit 200 Mikrogramm S-Ag (insgesamt 600 Mikrogramm) oder 1 mg (insgesamt 3 mg) S-Ag gefüttert oder mit 1 mg (insgesamt 3 mg) Rinderserumalbumin (BSA) oder 200 Mikrogramm jeweils (insgesamt 600 Mikrogramm) der N- und/oder M-Fragmente, an Tag-7, Tag-5 und Tag-2. Die Immunisierung, wie oben beschrieben, wurde am Tag 0 durchgeführt. Die Tiere, die MBP oral erhielten, wurden mit einem Milligramm des Proteins viermal versorgt, mit einer zusätzlichen Fütterung, die am Tag-9 gegeben wurde. Alle Antigene wurden in einem Milliliter PBS unter Verwendung einer 23-Eichnadel verabreicht, die mit einem Kunststoffschlauch bedeckt war.
Ungefütterte Kontrolltiere, die mit dem uveitogenen Protein (S-Ag) immunisiert worden waren sowie seinen M- und N-Fragmenten, entwickelten eine Krankheit zwischen 11 und 14 Tagen nach der Antigen-Exposition. Wie sich aus den Fig. 1 und 2 ergibt, variierte der Grad der okularen Entzündung, histologisch überprüft durch den maskierten Beobachter, in einem bestimmten Bereich abhängig von dem immunisierenden Antigen, wobei das vollständige S-Ag-Molekül die schwerste Krankheit auslöste. Fig. 1 zeigt die entzündliche Krankheit, die bei der histologischen Überprüfung von Augen vorliegt, die mit S-Ag immunisiert wurden und mit verschiedenen Antigenen gefüttert wurden. Eine schwere entzündliche Reaktion wurde bei den Augen von Tieren festgestellt, die überhaupt keine Fütterung erhielten, wie auch bei Tieren, die insgesamt 3 mg Rinderserumalbumin verfüttert bekamen. Wenn jedoch Tiere mit S-Ag gefüttert wurden, wurde eine statistisch signifikante (wesentliche) Reduktion der entzündlichen Krankheit bemerkt. Selbst wenn Tiere eine Gesamtmenge von 0,6 mg S-Ag in drei verteilten Dosierungen verfüttert bekamen, war die entzündliche Reaktion statistisch signifikant vermindert im Vergleich mit derjenigen, die nach Verfütterung von 0,6 mg BSA beobachtet wurde (Wilcoxon Einstufungs-Summentest (ranked sum test), beschrieben von Colton, T., Little Brown, 1974, Seiten 219-221; p = 0,003). Eine noch dramatischere Abnahme der entzündlichen Krankheit wurde bemerkt, wenn Tieren eine Gesamtmenge von 3 mg S-Ag verfüttert wurde, im Vergleich mit der Verfütterung von 0,6 mg BSA (Wilcoxon Einstufungs-Summentest, p = 0,003), wobei nur 2 von 14 Augen überhaupt eine entzündliche Reaktion bei der histologischen Untersuchung zeigten.
Die N- und M-Fragmente des S-Ag wurden ebenfalls Tieren verfüttert, um ihre Kapazität zur Verhinderung der Krankheit zu bestimmen. Wenn Tieren eine Gesamtmenge von 0,6 mg jeder der N- und M-Fraktionen verfüttert wurde (ein 20facher Überschuß des S-Ag auf molarer Basis, das verfüttert wurde), konnte weder das M- noch das N-Fragment die S-Ag induzierte Krankheit in statistisch signifikanter Weise verringern; die Wirkung war vergleichbar mit einer Verfütterung von BSA. Tatsächlich war die Okular- Krankheit bei Tieren, denen beide Fragmente gleichzeitig verfüttert wurden, wobei sie jeweils eine Gesamtmenge von 0,6 mg erhielten, entsprechend der, die bei der Verfütterung von nicht-okular-Antigen, BSA, beobachtet wurde, oder leicht stärker.
Fig. 2 zeigt die Wirkung der Verfütterung verschiedener Antigene auf experimentelle Uveitis, die durch N- und M-Peptide von S-Ag induziert wurde (autologe Induktion und orale Suppression). Die Verfütterung von vollständigem S-Ag (eine Gesamtmenge von 0,6 mg) konnte eine Uveitis bei Tieren verhindern, die entweder mit dem N-Fragment (7/8 Augen) oder dem M-Fragment (6/8 Augen) immunisiert worden waren. Das N-Fragment (bei einer gesamten oralen Dosis von 0,6 mg) war nicht so wirksam bei der Verhinderung einer N-Fragment-induzierten Krankheit wie das S-Ag, während das M-Fragment, das mit einer entsprechenden oralen Dosierung verabreicht wurde, eine M-Fragment-induzierte Uveitis wirksam verhinderte und außerdem eine N-Fragment-induzierte Krankheit zum Teil verhinderte. Die Verfütterung des N-Fragments an Tiere hatte keine Wirkung auf M-Fragment-induzierte Krankheiten. Diese Ergebnisse legen nahe, daß mindestens das M-Fragment und vermutlich auch das N-Fragment als Begleitmittel für eine orale Therapie auf vollständiger S-Ag-Basis nützlich sein würden.
In einer abgetrennten Experimenten-Reihe, wurde die Verfütterung mit S-Ag überprüft, um die Wirkungen auf die Entwicklung von MBP-induzierter EAE zu bestimmen. Drei Tiere, die mit einer Gesamtmenge von 3 mg S-Ag oral behandelt worden waren und mit MBP immunisiert worden waren, entwickelten schwere EAE (durchschnittliche Punktbewertung 3,66), während keines der Tiere, dem MBP oral vor der Immunisierung mit diesem Antigen gegeben worden war, irgendwelche Zeichen von EAE entwickelte (Daten nicht dargestellt). Daher verleiht die orale (oder enterale) Verabreichung von S-Ag einen spezifischen Schutz und schwächt die Fähigkeit des Empfängers zur Auslösung einer Immunreaktion gegen nicht damit verwandte Autoantigene nicht ab.

BEISPIEL 2: Proliferative Reaktionen in vitro.

14 Tagen nach der Immunisierung wurden die Tiere geopfert und die drainierenden poplietalen Lymphknoten wurden entfernt, zerzupft und für die Kultur gemäß Oppenheim, J. J., et al., 1976 Lymphocyte transformations: Utilization of Automatic Harvesters in In Vitro Methods and Tumor Immunity, Bloom, B. R., et al., Hrsg. Acad. Press, NY, Seiten 573-585 vorbereitet. Kurz gefaßt wurden Zellkulturen mit einer Konzentration von 1,5x10&sup6; Zellen/ml in Mikrotiter-Vertiefungen mit flachem Boden angezüchtet, die 0,2 ml CRPMI enthielten (RPMI 1640 Medium von Gibco, Grand Island, NY), supplementiert mit 100 µg/ml Penicillin, 100 µm/ml Streptomycin, 50 µg/ml Glutamycin, 2mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 5x10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol, wie beschrieben (Caspi, R. R., supra) und enthaltend 1,5% Rattenserum. Alle Kulturen wurden entweder dreifach oder sechsfach durchgeführt. Die Konzentration des S-Ag und der Fragmente N und M betrug 25 Mikrogramm/ml, während Con A mit 10 Mikrogramm/ml verwendet wurde. Die Kulturen wurden bei 37ºC in 5% Kohlenstoffdioxid inkubiert. Pulsieren mit einem MikroCurie/Vertiefung von Tritium behandeltem Thymidin wurde 14 Stunden vor der Beendigung der Kultur durchgeführt (4 Tage nach Beginn) und die Zellen wurden mit einer Mash II Erntevorrichtung (Cambridge Technology, Cambridge, MA) geerntet. Die Ergebnisse sind als Stimulationsindex angegeben, der als Zählungen in den antigen-haltigen Vertiefungen definiert war und werden als Durchschnitt ± als Standardabweichung (SEM) dargestellt. Für diese Gruppe wurde ein Stimulationsindex von 2,5 oder mehr als Beweis einer in vitro "anamnestischen" zellulären Reaktion betrachtet. Ein Stimulationsindex von 2,5 oder mehr ist der gewöhnliche Standard und bedeutet mehr als das Zweifache (2x) der Standardabweichung vom Durchschnitt.
Die Wirkung der Verfütterung verschiedener Antigene auf die proliferative Reaktion auf S-Ag bei Tieren, die mit diesem Antigen immunisiert wurden, kann in Fig. 3A abgelesen werden. Die Kulturen von mindestens vier Tieren sind für jede Spalte dargestellt. Wie sich ergibt, unterscheiden sich die proliferativen Reaktionen auf S-Ag nach Verfütterung entweder des N- oder M-Fragments nicht statistisch von denjenigen, die nach Verfütterung von BSA festgestellt werden (Students-Test, beschrieben in T. Colton, Seiten 129- 131, supra; p = 0,259 bzw. 0,803). Daher wurde bei diesen Tieren ein klinischer Schutz gegen die durch das vollständige Autoantigen induzierte Krankheit durch Verfütterung dieser Fragmente nicht erreicht. Wenn 0,2 mg S-Ag dreimal gegeben wurden, wurde eine Abnahme der proliferativen Reaktion festgestellt, die statistisch signifikant war (im Vergleich mit derjenigen, die bei BSA-Verfütterung festgestellt wurde (p = 0,018)) und die mit dem Teilschutz dieser Tiere vor EAU übereinstimmte. Die beeindruckendste Abnahme (p = 0,005) von in vitro proliferativen Reaktionen wurde jedoch nach Verfütterung von 1 mg S-Ag dreimal vor Immunisierung bemerkt. Dies war die orale Dosierung, die den besten Schutz gegen die klinische Expression einer durch S-Ag-Immunisierung induzierten EAU ergab.
Fig. 4B zeigt die proliferativen Reaktionen auf PPD, einem integralen Bestandteil des kompletten Freund's Adjuvant (Difco, Detroit, MI), das bei der Immunisierung verwendet wurde und gegen das Mitogen Con A (Sigma, St. Louis, MO). Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Tieren, die mit BAS oder S-Ag oral gefüttert wurden, ausgelöst werden.
Die Ergebnisse zeigen, daß der Schutz gegen die klinische Expression der Uveitis- Symptome durch orale Verabreichung von Autoantigenen spezifisch für das oral verabreichte Antigen ist. Außerdem ist ein solcher Schutz T-Zell-vermittelt (mindestens teilweise) und dosisabhängig.

BEISPIEL 3: In vitro-Suppression von proliferativen Reaktionen auf Antigen und Mitogen.

Nichtimmunisierte Ratten wurden entweder mit 1 mg S-Ag, Rinderserumalbumin (BSA) oder dem Adjuvant KLH oder Kochsalzlösung dreimal gefüttert, im Abstand von 2 bis 3 Tagen, wobei Milzzellen 4 Tage nach der letzten Fütterung gesammelt wurden. Die Milzzellen (2x10&sup6; Zellen/ml) wurden dann in CRPMI gelegt, das mit 10% fötalem Rinderserum verstärkt worden war, wurden mit 5 Mikrogramm/ml S-Ag oder 2 Mikrogramm/ml Con A pulsiert und 48 Stunden inkubiert. Die Zellen dieser Kulturen wurden als Modulatorzellen verwendet und als Tm-Kontrolle bezeichnet, wenn sie von Salzlösung-gefütterten Tieren abstammten, als TmKLH, wenn sie von KLH-gefütterten Tieren abstammten, als TmBSA, wenn sie von BAS-gefütterten Tieren abstammten und als TmS-Ag, wenn sie von S-Ag-gefütterten Tieren abstammten.
Eine CD4+, S-Ag-spezifische T-Helferzellinie (ThS-Ag), von der bekannt ist, daß sie EAU bei adoptiver Übertragung induziert (gemäß dem Verfahren von Mokhtarian, Nature, 309:356 (1984)) wurde als Responderzelle bei allen Experimenten verwendet. Bei Parallel-Experimenten wurde eine CD4+/PPD-spezifische T-Helferzellinie (ThPPD) ebenfalls verwendet (Caspi et al., supra). 2x10&sup4; Responderzellen wurden mit 5x10&sup5; bestrahlten (1500 Rad) Lewis-Rattenthymocyten angezüchtet, die als Antigen-präsentierende Zellen dienten (APC). Zu einigen Kulturen wurden unterschiedliche Zahlen bestrahlter (1500 Rad) Tm-Kontroll-, TmBSA-, TmKLH- oder TMS-Ag-Modulatorzellen zugefügt. Alle Kulturen wurden dreifach in CRPMI mit 1,5%igem Rattenserum in Platten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden (Costar) etabliert, wobei einige Vertiefungen mit einem 10 Mikroliter-Aliquot von S-Ag (25 Mikrogramm/ml Endkonzentration) oder Con A (2 Mikrogramm/ml Endkonzentration) oder mit dem Medium allein stimuliert wurden. Die Kulturen wurden 3 Tage inkubiert, mit Pulsierung von 1 MikroCurie/Vertiefung Tritium- behandelten Thymidin, die 14 Stunden vor der Beendigung der Kultur durchgeführt wurde. Die Zellen wurden mit einer Mash II-Erntevorrichtung geerntet.
Zu einigen Vertiefungen, die ThS-Ag, APC und TmS-Ag enthielten, wurden entweder OX8-Antikörper (die spezifisch die Suppressor/cytotoxische Untergruppe von T-Zellen von Ratten erkennen) (Sera Lab, Westbury, NY) oder Leu 2a-Antikörper (von dem keinerlei Affinität zu T-Zell-Untergruppen von Ratten bekannt ist) (Becton Dickinson, Mountain View, CA) beim Start der Kulturen zugefügt.
Nach einer in vitro-Präinkubation, entweder mit S-Ag oder Con A, wurden Co-Kulturen von Splenocyten entweder von S-Ag- oder BSA-gefütterten Tieren und einer S-Ag CD4+ T-Zellinie (ThS-Ag) durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind aus Fig. 4 ersichtlich. Der Grad der Suppression einer Antigen-getriebenen Proliferation der Indikator-ThS-Ag kann festgestellt werden. Fig. 4A zeigt die Suppression, die nach Präinkubation in vitro von TmS-Ag oder Tm-BSA mit S-Ag erhalten wird. Eine deutliche Suppression der ThS-Ag-Reaktion auf S-Ag wurde bei allen Verhältnissen von T-Helfer- zu Splenocyten-Zellkombinationen, die überprüft wurden, erhalten, wobei die Suppression der proliferativen Reaktion sich derjenigen des Hintergrunds bei den Kulturen, die ein ThS-Ag auf fünf oder zehn TmS-Ag enthielten, annäherte. Das bei der Zugabe von Tm-BSA festgestellte Suppressionsmuster unterschied sich davon, wobei keine Suppression bei einem Verhältnis von einem ThS-Ag zu zwei Tm-BSA festgestellt wurde und eine leichte Suppression bei Verhältnissen von einem ThS-Ag zu fünf bis zehn Tm- BSA festgestellt wurde. Bei einem ThS-Ag zu zwei TmS-Ag wurde eine Verringerung des Stimulationsindexes von fast 15 auf 5 beobachtet, während bei diesem Verhältnis keine Suppression der Reaktion bei der Kultur mit Tm-BSA bewirkt wurde. Der Unterschied der Suppression, die durch TmS-Ag bewirkt wird, gegenüber derjenigen durch Tm-BSA, war in allen getesteten Verhältnissen von 1:5 und 1:10 Indikator- zu Supressorzellen (p = 0,04, 0,002) statistisch signifikant. Die Ergebnisse demonstrieren, daß die Autoantigen-induzierte Suppression auf dem T-Zell-Niveau spezifisch ist und daß die Suppression mindestens zum Teil von T-Zellen des Suppressor-Phenotyps vermittelt wird oder von diesen abhängt.
Im Gegensatz zu den in Fig. 4A aufgetretenen Unterschieden zeigt Fig. 4B den Suppressionsgrad, nachdem TmS-Ag oder Tm-BSA mit Con A (2 µg/ml) präinkubiert worden waren. Ein im wesentlichen identisches Muster der Suppression kann sowohl für TmS-Ag als auch für Tm-BSA festgestellt werden. Diese Ergebnisse demonstrieren die Gegenwart einer antigen-spezifischen Suppressorzelle, die in der Milzpopulation von S-Ag-gefütterten Lewis-Ratten gefunden wurde.
Fig. 4C demonstriert die Reaktionen, die durch Co-Kultivierung von ThS-Ag mit TmKLH oder der Tm-Kontrolle erhalten wurden, die 48 Stunden mit 5 µg/ml S-Ag vorinkubiert worden waren (die jedoch entweder nicht sensibilisiert waren oder mit einem nicht in Verbindung stehenden Antigen-KLH sensibilisiert waren). Wie sich daraus ergibt, wurde keine Suppression der ThS-Ag proliferativen Reaktion bei Verhältnissen von einem ThS-Ag zu 5 oder 10 TmKLH oder der Tm-Kontrolle bemerkt.
Fig. 5 demonstriert die antigen-spezifische Suppression, die erhalten wird, wenn TmS-Ag mit S-Ag (5µg/ml) präinkubiert wird und diese dann entweder mit ThS-Ag oder ThPPD co-kultiviert werden. Eine deutliche Suppression der proliferativen Reaktion auf ThS wird bei allen Verhältnissen zugegebener Splenocyten bemerkt. Ein deutlich unterschiedliches Muster wurde bei der proliferativen Reaktion der PPD-Zellinie bemerkt. Keine Suppression, sondern vielmehr ein Anstieg der proliferativen Reaktion, wurde bei allen Verhältnissen von T-Helferzellen zu Splenocyten-Co-Kulturen, die untersucht wurden, festgestellt. Dieses Phänomen ist auf die vermehrte Anzahl von Antigen-präsentierenden Zellen in der Kultur zurückzuführen.
Die Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers, der gegen die T-Suppressor-CD8+ -Untergruppe (OX-8) gerichtet ist die in vitro-Suppression umzukehren (um dadurch die T-Suppressor-Beteiligung zu bestätigten), wurde als nächstes untersucht. Tabelle 1 demonstriert die Ergebnisse eines solchen Experiments. Die in Klammern dargestellten Werte sind Stimutionsindizes. Eine Endkonzentration von 1:100 für jeden Antikörper wurde vewendet und 25 µg/ml S-Ag wurden zugefügt. Eine Konzentration von 1x10&sup5; TmS-Ag wurde während dieses Experiments verwendet. TABELLE 1
* zugegeben in einem Verhältnis von 1:10 (ThS-Ag : TmS-Ag)
Bei einem Verhältnis von einer ThS-Ag- zu 10 TmS-Ag-Zellen wird die proliferative Reaktion in Gegenwart von S-Ag auf ein Niveau reduziert, das sich demjenigen nähert, das bei Vertiefungen gefunden wird, die kein Antigen enthalten.
Jedoch in Gegenwart einer endgültigen 1:100 Verdünnung des OX-8-Antikörpers verstärkt sich die proliferative Reaktion vierfach.
Die Zugabe des Leu 2a-Antikörpers in derselben Verdünnung konnte nicht zu einer Umkehr der Suppression führen.
Unter Verwendung eines Cytofluorographen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) konnte kein Unterschied der Gesamtzahl von OX-8+-Zellen in der Milz von S-Ag-gefütterten Tieren im Vergeich mit BSA-gefütterten Tieren festgestellt werden.
Es wurde durch die vorliegende Erfindung gezeigt, daß die orale Fütterung des vollständigen S-Antigen-Moleküls zu einer Immuntoleranz und Verhinderung von S-Ag-induzierter EAU führt. Weiterhin wurde eine antigen-spezifische Suppression der Immunreaktion in vitro demonstriert. Es wurde ebenso demonstriert, daß der Anti-CD8-Antikörper, der gegen den CD8-Suppressor/cytotoxischen Marker auf der Oberfläche von Lymphoidzellen gerichtet ist, diese Suppression blockieren kann.
S-Ag-induzierte EAU ist ein experimentelles Modell für eine menschliche Uveitis, die bei Ratten durch Transfer von CD4+CD8-Lymphocyten-Zellinien auf native (naive) Wirte induziert werden kann (Caspi, R. R., et al., supra; Gregorson, D. S., et al., S-Antigen specific rat T cell lines mediate EAU and EAP, in Modern Trends in Immunology and Immunopathology of the Eye, Secci, A. G. und I. A. Fregona (Hrsg.), Masson, Milan, Seiten 20-25, 1989). Die dominante Rolle der T-Zellen bei dieser Störung und der Vorhersage-Wert des EAU-Modells für Menschen werden weiter durch die Beobachtung unterstützt, daß Cyclosporin EAU beim Menschen effektiv verhindern kann (Nussenblatt, R. B., et al., 1981, supra).

BEISPIEL 4: Wirkung der Fütterung von retinalem Autoantigen gegen klinische EAU.

In diesem Beispiel wird die Wirkung der Fütterung des retinalen Autoantigens, S-Ag, auf den klinischen Ausbruch von EAU untersucht. Vier Gruppen von sechs weiblichen Lewis-Ratten (n = 24), die 180 bis 200 Gramm wogen, wurden von Charles River (Raleigh, NC) erhalten. Alle Immunisierungen wurden, beginnend am Tag 0, wie beschrieben bei MATERIAL UND METHODEN : Antigene und Immunisierungsschema durchgeführt. Die Fütterung begann am Tag-7 und wurde an den Tagen 7, 9, 12 und 15 fortgesetzt. Für die Gruppe P. O. wurde 1 µg an die Subjekte oral verabreicht, d.h. enteral (Fütterung durch Schlauch). Eine Salzlösung wurde der Kontrollgruppe enteral verabreicht. Der Entzündungsgrad, falls überhaupt feststellbar, wurde histologisch durch das maskierte Beobachterverfahren, wie oben beschrieben, abgelesen. Die Ergebnisse sowohl für die experimentellen (P. O.) als auch die Kontrollgruppen sind in den Fig. 6 und 7 dargestellt.
Wie sich aus Fig. 6 ergibt, entwickelten fünf von sechs Mitgliedern der Kontrollgruppe 11 bis 13 Tage nach der Antigen-Exposition die Krankheit. Für die experimentelle P. O.- Gruppe entwickelte nur eines von sechs Subjekten die Krankheit und in diesem einen Fall waren die Krankheitssymptome sehr schwach im Vergleich mit der Krankheit bei den Kontrollratten.
Fig. 7 ist eine Säulengraphik, die die Ergebnisse der histologischen Krankheitsabstufung zeigt, d.h. den Entzündungsindex der Gruppen (siehe Material und Methoden : Antigen- und Immunisierungsschema zur Diskussion der Abstufungskriterien). Für die Ratten, die keine Behandlung erhielten, lag der durchschnittliche Grad bei ungefähr 2,4, was der Hälfte zwischen 2+ (leichte exsudative retinale Ablösung mit großer Zerstörung, geringe bis mäßige Anzahl von Zellen im Glaskörper) und 3+ (retinale Architektur beginnt sich aufzulösen, große exsudative retinale Ablösung, gemäßigte bis große Anzahl von Zellen im Glaskörper) entspricht. Für die experimentellen P. O.-Subjekte betrug der durchschnittliche Grad ungefähr 0,75, was zwischen 0,5 (Spurennachweise von entzündlichen Krankheiten) und 1+ (fokale Bereiche einer Zerstörung mit deutlichem Ausfall der Photorezeptoren) liegt.
Die vorliegende Erfindung wurde oben im Hinblick auf illustrierende Ausführungsformen beschrieben. Der Fachmann wird jedoch erkennen, daß viele Zusätze, Weglassungen und Modifikationen des oben beschriebenen Gegenstands möglich sind, die alle im Umfang der Erfindung, wie unten beansprucht, liegen.

BEISPIEL 5: Polypeptid-Fragmente des S-Antigens, Polypeptid zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.

Polypeptide mit den unten offenbarten Aminosäuresequenzen können oral oder enteral Säugern zur Behandlung oder Verhinderung der klinischen Manifestation einer Krankheit mit den Symptomen einer Uveoretinitis verabreicht werden.
Die Polypeptide sind Fragmente des S-Antigen-Polypeptids. Diese Polypeptide wurden zur Verwendung bei der Behandlung oder Verhinderung von Uveoretinitis ausgewählt, da es sich herausstellte, daß sie Uveoretinitis induzierten, wenn sie Ratten unter Verwendung des oben auf Seite 15 beschriebenen Verfahrens verabreicht wurden. Außerdem haben vorläufige Experimente gezeigt, daß T-Zellen, die von Ratten, die an Uveoretinitis litten, isoliert wurden (die proliferierte, wenn sie dem vollständigen S-Antigen- Polypeptid ausgesetzt wurde), nicht proliferierten, wenn diese Fragmente solchen Zellen in vitro unter Verwendung des oben auf Seite 18 beschriebenen Systems verabreicht wurden (Daten nicht dargestellt).
Die Aminosäuresequenzen dieser Polypeptide sind unten in Tabelle 2 dargestellt und ihre relativen Positionen in der S-Antigen-Polypeptidsequenz sind in den Fig. 8 und 9 dargestellt. TABELLE 2
Fig. 8 zeigt die humane S-Antigen-Polypeptidsequenz in ihrer Gesamtheit, wie veröffentlicht in Shinohara, T., et al., (Proc. Nat. Acad. Sic. USA 84:6975-6979, 1987). Fig. 9 zeigt die Sequenzen von bovinen, humanen und Mäuse-S-Antigen-Polypeptiden in ihrer Gesamtheit, wie veröffentlicht in Yamaki, K., et al. (FEBS Letters 234:39-43 und 236:5071, 1988), Shinohara, T., et al., (supra) und Yamaki, K., et al., (Biochem. Biophys. Res. Comm. 142:904-910, 1987) und die relativen Positionen der Polypeptide G2, G3 und GM der vorliegenden Erfindung. Die obere Sequenz in Fig. 9 ist das bovine S-Antigen-Polypeptid, die mittlere Sequenz ist das menschliche S-Antigen-Polypeptid und die untere Sequenz ist diejenige des Maus-S-Antigen-Polypeptids. Zusätzlich sind die relativen Positionen der M- und N-Polypeptide, wie oben offenbart, ebenfalls in Fig. 9 dargestellt. Es sollte festgehalten werden, daß das Polypeptid GM von dem Bereich des S-Antigens abstammt, in dem die bovinen, Maus- und menschlichen Sequenzen übereinstimmen und die Polypeptide G2 und G3 sind von bovinem Ursprung. Die Sequenzen der menschlichen Gegenstücke dieser Polypeptide sind oben in Tabelle 2 angegeben. Die menschlichen Gegenstücke der Polypeptide G2 und G3 sind vermutlich ebenfalls nützlich zur Herstellung eines Medikaments und werden bevorzugt, wenn das Medikament zur Behandlung menschlicher Patienten gedacht ist, die an einer Krankheit mit den Symptomen einer Uveoretinitis leiden.
Die in Tabelle 2 dargestellten Peptide können unter Verwendung wohlbekannter Festphasen-Syntheseverfahren hergestellt werden (Merrifield, R.B., Fed. Proc. Am. Soc. Ex. Biol. 21:412, 1962, und J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963 und Mitchel, A.R., J. Am. Chem. Soc. 98:7357, 1976).
Alternativ können die Polypeptide außerdem durch Klonierung der Nukleinsäuresequenzen hergestellt werden, die diese Polypeptide kodieren, in geeigneten eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen, unter Verwendung genetischer Manipulationsverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind.
Die oben offenbarten Polypeptide können einem Säuger, der an den Symptomen einer Krankheit mit den Kennzeichen einer Uveoretinitis leidet, allein oder in Kombination von zwei oder mehreren verabreicht werden. Die Verabreichung der Peptide kann auf dem oralen oder enteralen Weg geschehen.
Die wirksamen Mengen der oben erwähnten Polypeptide zur Behandlung von Uveoretinitis sind dieselben, wie die oben offenbarten.

BEISPIEL 6: Polypeptid-Fragmente des Interphotorezeptor-Retinoid-Bindungsproteins zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.

In der Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können Polypeptide mit den unten offenbarten Aminosäuresequenzen ebenfalls nützlich zur Herstellung eines oral oder enteral verabreichbaren Medikaments zur Behandlung menschlicher Uveoretinitis sein.
Die unten offenbarten Polypeptide sind Fragmente des bovinen Interphotorezeptor- Retinoid-Bindungsproteins (IRBP), wie oben offenbart. Die Polypeptide, die die Sequenzen HVDDTDLYLTIPTARSVGAADGS (alternativ bezeichnet als R4) und PTARSVGAADGSSWEGVGVVPDV (alternativ bezeichnet als R14) aufweisen, sind die Aminosäuresequenz 1158-1180 bzw. 1169-1191 des bovinen IRBP, wie offenbart in Borst, D. E., et al., (J. Biol. Chem. 264:115, 1989).
Diese Polypeptide können wie unten beschrieben und oben in Beispiel 5 hergestellt werden und können oral oder enteral verabreicht werden, allein oder in Kombination von zwei oder mehreren miteinander oder mit den oben in Beispiel 5 offenbarten Polypeptiden in wirksamen Mengen (wie oben offenbart).
Diese Polypeptide wurden ausgewählt, da Lymphocyten, wie unten dargestellt, die aus einer signifikanten Anzahl von Patienten isoliert wurden, die an verschiedenen Augenkrankheiten mit Autoimmun-Äthiologie litten, in Reaktion auf diese Polypeptide proliferierten. Eine Beschreibung der untersuchten Patienten und der Reaktionen der von diesen Patienten isolierten Lymphocyten auf die IRBP-abgeleiteten Polypeptide ist unten dargestellt.
Patienten, die an dieser Studie teilnahmen, wurden in der Uveitis-Klinik des National Eye Institute, Bethesda, USA und der Tokyo University Branch Hospital, Tokyo, Japan untersucht. Alle Patienten gaben eine Zustimmung nach Information, bevor sie an der Studie teilnahmen. Sie waren Teil eines laufenden Protokolls, das von dem Committee on human investigation des jeweiligen Instituts gebilligt wurde. Alle Patienten hatten eine aktive Uveitis, die das hintere Segment involvierte oder zeigten eine Geschichte einer vorherigen aktiven Krankheit, die die Retina oder das Choroid involvierte. Die untersuchten Patienten hatten eine der folgenden Diagnosen: Behcet's Krankheit, Birdshot-Retinochoroidopathie, Pars Planitis, okulares Sarcoid, sympathische Ophthalmie und das Vogt-Koyanagi-Harada-Syndrom. Die Basis für die Diagnose von jedem ist an anderer Stelle aufgeführt (Nussenblatt et al., Uveitis:Fundementals and Clinical Practice, Year Book Medical Publishers, Chicago, II, 1989). Kurz gefaßt entsprachen die Patienten, die als Diagnose die Behcet-Krankheit hatten, mindestens den minimalen Kriterien für eine inkomplette Behcet-Krankheit, wie aufgestellt von dem Behcet's Disease Research Committee von Japan (Behcet's Disease Committee of Japan, Jpn. J. Ophthalmol. Research, 18:291, 1974), wobei alle Patienten eine Augenkrankheit hatten. Patienten mit der Birdshot-Retinochoroidopathie wiesen cremefarbige Läsionen im hinteren Segment auf, wie auch ein Makula-Ödem und retinale vaskuläre Veränderungen.
Diese Patienten waren außerdem HLA-A-29-positiv. Patienten mit sympathischer Ophthalmie wiesen eine Geschichte eines Penetrationstraumas oder mehrfache chirurgische Operationen auf, gefolgt von einer bilateralen granulomatösen Uveitis. Die Patienten mit dem Vogt-Koyanagi-Harada-Syndrom waren entweder japanischer oder amerikanisch-indianischer Abstammung, und zeigten systemische Veränderungen und Veränderungen an den Augen, die mit der Diagnose übereinstimmen. Die Ocular-Sarcoid- Patienten wiesen eine bilaterale granulomatöse Uveitis auf, in den meisten Fällen entweder von einem positiven Gallium-Scan oder einer durch Biopsie nachgewiesenen Krankheit begleitet wurde. Die Patienten wurden unabhängig von ihrer laufenden medizinischen Therapie überprüft (die in der Regel aus Cyclosporin oder Prednison bestand) und unabhängig von ihrem Aktivitätsniveau. Da die untersuchten Antigene aus der Retina stammten, wurde die Entzündung des vorderen Segments nicht als Teil der Definition einer aktiven Krankheit betrachtet. Die Gegenwart von Retina-Infiltraten, Perivasculitis, Schneetreiben (snow banking) oder Glaskörperschleiern wurde als Evidenz der Aktivität betrachtet. Zusätzlich, wurde das cystoide Macula-Ödem, wenn es durch Fluorescein-Angiographie bestätigt wurde, als Zeichen einer aktiven Krankheit betrachtet. Alle diagnostischen Kategorien basierten auf klinischen Kriterien, außer im Fall des Okular- Sarcoids und der Birdshot-Retinochoroidopathie, wo eine Bestätigung durch einen anderen Test nötig war. Die Kontrollsubjekte wurden entweder aus den Angestellten, die nicht in der Forschung beschäftig waren, oder aus klinischen Patienten ausgewählt, die nicht wegen ihrer Uveitis im Krankenhaus waren und für die eine retinale oder choroidale Störung ausgeschlossen worden war.

Herstellung der Antigene:

Die in diesem Versuch verwendeten Antigene umfaßten bovines Interphotorezeptor- Retinoid-Bindungsprotein, gereinigt zur Homogenität, wie beschrieben von Redmond et al., (Biochem. 24:787, 1985) und bovines S-Antigen, gereinigt durch das von Dorey et al., wie oben beschrieben, beschriebene Verfahren. Die von dem Interphotorezeptor- Retinoid-Bindungsprotein abgeleiteten Peptide wurden durch ein kommerzielles Laboratorium (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) unter Verwendung der t-BOC-Chemie auf einer Peptidsynthesevorrichtung (430A, Applied Biosystems Inc.) synthetisiert und gereinigt. Die Peptidsequenzen wurden von der Sequenz des bovinen Interphotorezeptor-Retinoid-Bindungsproteins abgeleitet, wie bestimmt und beschrieben von Borst et al., (supra). Sie bestanden aus der Sequenz 1156-1180 (HVDDTDLYLTIPTARSVGAADGS) für R4 und der Sequenz 1169-1191 (PTARSVGAADGSSWEGVGVVPDV) für R 14. S-Antigen (M und N)-Polypeptide wurden in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Donoso und Mitarbeitern (supra) auf einem Benzhydrylamin-Harz, unter Verwendung einer automatisierten Peptid-Synthesevorrichtung (SAM II; Biosearch, Inc., San Rafael, CA), synthetisiert.

Lymphocyten-Proliferations-Essay:

Die Proliferations-Essays wurden in derselben Weise in Japan und in den Vereinigten Staaten durchgeführt, außer an den angegebenen Stellen. Kurz gefaßt wurden mononukleare Leucocyten von heparinisierten Blutproben auf Isolymphgradienten getrennt (Gallard-Schlesinger, Carle Place, NY) und in RPMI-1640-Medium mit HEPES (GIBCO, Grand Island, NY), supplementiert mit Glutamin (2mM), Penicillin (110 Einheiten/ml), Streptomycin (100 Mikrogramm/ml) und hitze-inaktiviertem menschlichem AB-Serum kultiviert. 20% Serum von einem einzelnen Donor wurde in den Kulturen verwendet, die im National Eye Institute angesetzt wurden, während bei den in Tokyo durchgeführten Essays 10% kommerzielles Serum verwendet wurde (Lot Nr.: 14510, Pel Freez, Brown Deer, WI).
Die Zellen wurden unter Verwendung von zwei Verfahren kultiviet. Kurz gefaßt wurden bei dem ersten Verfahren 2x10&sup5;-Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden 5 Tage inkubiert (wie offenbart in Nussenblatt et al., Am. J. Ophthalmol. 89:173, 1980). Bei einem zweiten Verfahren, von dem man das Gefühl hatte, daß unter bestimmten Bedingungen die Reaktionen durch Verstärkung von Zell zu Zell-Interaktionen vermehrt wurden, wurden 5x10&sup4; Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen und rundem Boden 7 Tage inkubiert (wie offenbart in Hirose, S., et al., Curr. Eye Res. 7:393, 1986). Alle Kulturen lagen in einem Gesamtvolumen von 200 Mikroliter vor und wurden dreifach mit oder ohne Stimulanzien angesetzt. Die Antigen-Konzentration betrug entweder 4, 20, 50 oder 100 Mikrogramm/ml. Die Kufturen wurden für die spezifizierte Zeit bei 37ºC mit 100% Luftfeuchtigkeit und 5% CO&sub2; in der Luft inkubiert, mindestens 16 Stunden mit ³H-Thymidin (³H-TdR, New England Nuclear, Boston, MA; 2 Ci/mMol, 0,5 MikroCi/10 Mikroliter/Vertiefung) pulsiert und auf Glasfaserfiltern unter Verwendung einer MASH II-Erntevorrichtung geerntet. Nach dem Trocknen wurden die Filterstücke in Gefäße mit 3 ml Fluor auf Toluolbasis gestellt und auf einer Beckman L3801 Flüssigscintillations-Vorrichtung gezählt. Verschiedene Peptide wurden gleichzeitig getestet; jedoch konnten nicht alle Peptide an jedem Patienten getestet werden. Zellen aus einer normalen Kontrolle wurden in der Regel gleichzeitig mit Zellen von einem oder mehreren Patienten getestet.

Statistische Analyse:

Der Mittelwert der Dreifachkulturen in den Zählungen pro Minute (CPM) wurde für jede Gruppe replizierter Kulturen kalkuliert. Ein Stimulationsindex (S.I.) wurde durch Division des Mittelwerts jede der antigen-stimulierten Kulturen durch den Mittelwert der Kontrollkulturen, denen kein Antigen zugefügt worden war, abgeleitet. Für jedes Testcenter und für jedes Antigen wurde ein mittlerer Stimulationsindex ± Standardabweichung für die Kontrollsubjekte bestimmt. Eine signifikante Reaktion bei einem Patienten wurde dann als vorhanden angesehen, wenn der Stimulationsindex des Patienten für ein gegebenes Peptid oder einen zu bestimmenden Stoff um zwei Standardabweichungen oberhalb des Mittelwerts für die Kontrolle lag.
Die Stimulationsindizes für jedes getestete Antigen wurden außerdem durch die Krankheitskategorie mit den Kontrollen verglichen, um zu bestimmen, ob irgendein statistisch signifikanter Unterschied auftrat. Die Signifikanz wurde unter Verwendung eines nichtgepaarten Student's 1 Standardtests (non paired Students' 1 test) bestimmt. Die Patienten wurden außerdem im Hinblick auf ihre klinische Aktivität überprüft. Der Test auf die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung von Chi quadriert (Chi squared) durchgeführt. Die in dem Papier ausgedruckten Ergebnisse sind der mittlere Stimutionsindex ± Standardabweichung.

Patienten:

Eine Gesamtzahl von 30 Kontrollen und 82 Patienten wurde untersucht, 47 Patienten stammten aus den Vereinigten Staaten und 35 Patienten aus Japan. Die Eigenschaften der US- und der japanischen Patienten sind in Tabelle 3 unten dargestellt. TABELLE 3
* Durchschnitt. Der Bereich ist in Klammern angegeben.
** Neun Patienten mit Behcet's erhielten außerdem Colchicin.
Wie sich aus Tabelle 3 ergibt, liegt das durchschnittliche Alter der Patienten in beiden Gruppen in einem vergleichbaren Bereich, nämlich bei 41 Jahren (Bereich 10 - 70) für die amerikanischen Patienten und 43 Jahren (Bereich 20 - 70) für die japanischen. Die Dauer der Nachfolge neigte auch dazu, in beiden Gruppen ähnlich zu sein: Vereinigte Staaten 44 Monate (92-108). Japan 57 Monate (2-247). Im Durchschnitt wurden die Patienten mit Uveitis 63 Monate diagnostiziert (2-247). Alle in Japan untersuchten Patienten waren japanischer Abstammung; während in der amerikanischen Gruppe, 41 von 47 kaukasischer Abstammung waren, 5 waren schwarze Amerikaner und 1 Patient stammte aus dem Orient. Die Anzahl der Patienten mit klinisch aktiver Krankheit variierte in verschiedenen Kategorien (Tabelle 3) und zwischen den Ländern. Insgesamt hatte die Hälfte der untersuchten Patienten eine aktive Augenkrankheit. Die größte Diskrepanz wurde unter den Sarcoid-Patienten gefunden, wo eine größere Anzahl der japanischen Patenten aktiv war. Von allen Gruppen zeigten die Birdshot-Retinochoroidopathie-Patienten die geringste Inzidenz einer Akitvität und keine wurde in Japan gefunden, wo diese Krankheit sehr selten ist. Das Verhältnis aktiver Patienten war unter denjenigen am höchsten, die an der Behcet's-Krankheit litten.
Die Reaktionen der Zellen der Patienten auf das S-Antigen-Polypeptid oder IRBP- Polypeptid sind in Tabelle 4 unten dargestellt. TABELLE 4
* Die erste Zahl bezieht sich auf die Anzahl der positiven Responder. Die zweite Zahl bezieht sich auf die Gesamtzahl der untersuchten Patienten.
In den meisten Fällen erwiesen sich 5 Tage-Kulturen mit 20 Mikrogramm/ml Antigen in jeder Vertiefung als optimal, außer wo dies angegeben ist.
t Die Zellen wurden 7 Tage kultiviert.
}} Antigen-Konzentration betrug 100 Mikrogramm/ml.
{ Die Zellen wurden mit 4 Mikrogramm/ml 7 Tage kultiviert.
++ Neun Patienten mit Behcet's erhielten außerdem Colchicin.
Die verschiedenen Krankheitsentitäten reagierten unterschiedlich auf die uveitogenen Antigene, wie dargestellt in Tabelle 4. Jedoch wurde ein ähnliches Reaktionsprofil bei dem S-Antigen-Polypeptid und dem Interphotorezeptor-Retinoid-Bindungsprotein gefunden. Patienten mit Krankheiten, an denen die Retina beteiligt ist, zeigten mit höherer Wahrscheinlichkeit eine signifikante proliferative Reaktion. Bei amerikanischen Patienten lagen die mittlere proliferativen Reaktionen auf das S-Antigen (20 Mikrogramm/ml) im signifikanten Bereich für die Behcet's-Krankheit bei 2,8 ± 1,0 (p = 0,05) und die Birdshot-Retinochoroidopathie bei 2,7 ± 0,2. Für das Interphotorezeptor-Retinoid- Bindungsprotein (20 Mikrogramm/ml) neigten die proliferativen Reaktionen dazu, niedriger zu liegen, mit einem signifikanten Unterschied bei der Behcet's-Krankheit von 1,5 ± 0,4 (p = 0,04), der Birdshot-Retinochoroidopathie 1,4 ± 0,3 (p = 0,04) und Pars Planitis 1,4 ± 0,02 (p = 0,04), im Vergleich mit den Kontrollen (p. 9 ± 0,1). Ein ähnliches Reaktionsmuster lag bei japanischen Patienten vor, wo die höchste Anzahl von Respondern bei der Behcet's-Krankheit gefunden wurde. Die an der okularen Sarcoide leidenden Patienten, die untersucht wurden, gaben sehr wenige positive Reaktionen. Jedoch waren ihre Reaktionen auf Phytohemagglutinin und gereinigtes Proteinderivat stark, was andeutet, daß der Mangel an einer Reaktion nicht auf einem allgemeinen Zustand einer Nichtreaktionsfähigkeit beruhte, sondern vermutlich eine Unfähigkeit zur Erkennung von bovinem S-Antigen oder bovinem Interphotorezeptor-Retinoid-Bindungsprotein andeutete. Die Kultivierung der Zellen über 7 Tage in Vertiefungen mit rundem Boden vermehrt die Anzahl der signifikanten Reaktionen in einigen Gruppen, aber nicht in allen. Es gab einen Anstieg der Sensibilität im wesentlichen bei Patienten mit dem Vogt-Koyanagi-Harada-Syndrom. Es gab einen Anstieg der Anzahl der signifikanten Responder auf das S-Antigen und das in dem Photorezeptor-Retinoid-Bindungsprotein. Die mittlere Reaktion auf das S-Antigen für Lymphocyten von Vogt-Koyanagi- Harada-Patienten in den Vereinigten Staaten betrug 2,8 ± 1,4 im Vergleich mit Kontrollen (1,8 ± 0,1), was ein statistisch signifikanter Unterschied war (p = 0,03).
Zusätzlich zur Überprüfung der in vitro-Reaktionen auf das Interphotorezeptor-Retinoid- Bindungsprotein und das S-Antigen-Polypeptid wurden die Reaktionen der Polypeptid- Fragmente jedes dieser Antigene bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 oben dargestellt.
Wie sich aus der Tabelle 4 ergibt, bestand eine Beziehung zwischen der Intensität der proliferativen Reaktion auf das Interphotorezeptor-Retinoid-Bindungsprotein oder das S-Antigen-Polypeptid und das dem Vorhandensein einer signifikanten proliferativen Reaktion auf ein oder mehrere Polypeptid-Fragmente der vorliegenden Erfindung in 5 Tage-Kulturen. Wenn man nur die statistisch signifikanten Responder auf das S-Antigen- Polypeptid betrachtet, zeigten sieben von neuen amerikanischen Patienten eine signifikante Reaktion auf eins oder beide getesteten Peptidfragmente (Daten nicht dargestellt). In 7 Tage-Kulturen zeigten drei von fünf japanischen Patienten, die auf S-Antigen- Polypeptid reagieren, eine Reaktion auf M- oder N-Peptid oder beide. Bei sechs von neun amerikanischen Patienten, die auf das Interphotorezeptor-Retinoid-Bindungsprotein reagierten, gab es eine Reaktion entweder auf R-4 oder R-14 oder beide. Keine solche Beziehung wurde bei den japanischen Respondern auf das Interphotorezeptor- Retinoid-Bindungsprotein beobachtet.
Die Lymphocyten verschiedener Patienten zeigten eine proliferative Reaktion auf ein Polypeptid-Fragment, erkannten jedoch nicht das Eltern-Antigen. Bei zwölf von zweiundzwanzig amerikanischen Patienten (54%), die auf das eine oder andere S-Antigen- Polypeptidfragment mit 20 oder 100 Mikrogramm/ml in 5 Tage-Kulturen reagierten, gab es keine Kreuzreaktion mit dem gesamten Molekül. Unter ähnlichen Bedingungen ergaben die Reaktionen auf die Interphotorezeptor-Retinoid-Bindungsprotein-Fragmente keine Kreuzreaktionen bei sechzehn von zwanzig (84%) der amerikanischen Patienten. Die japanischen Responder auf die S-Antigen-Polypeptid-Fragmente erkannten, daß S-Antigen-Polypeptid nur in sechs von neunzehn Fällen (Zellen kultiviert für 7 Tage).
Die Patienten mit Behcet's-Krankheit zeigten eine Reaktion auf Fragmente von beiden Antigenen, aber die Reaktionen waren bei den Fragmenten am stärksten oder das S-Antigen-Polypeptid M-Peptid ergab bei 20 Mikrogramm/ml die stärkste Reaktion mit einem mittleren Stimulationsindex von 5,3 ± 1,0 für Patienten und 1,3 ± 0,2 für die Kontrolen (p = 0,0001). Die Reaktion auf das N-Peptid war ebenso signifikant bei Patienten, mit einem mittleren Stimulationsindex, der dreifach höher lag als bei den Kontrollen. Die Patienten mit einer Birdshot-Retinochoroidopathie wiesen ähnliche Reaktionen auf beide Fragmentgruppen auf. Die mittleren Stimulationsindizes bei Patienten waren zweifach so hoch, wie diejenigen von Kontrollen für beide Fragmentgruppen.
Verschiedene Patienten demonstrierten eine Fähigkeit, gleichzeitig eine signifikante proliferative Reaktion auf mindestens einen Determinanten von jedem Antigen zu liefern, jedoch nicht notwendigerweise auf das gesamte Antigen. Eine Gesamtzahl von 32 Patienten von 82 untersuchten Patienten (39%) zeigten solche Reaktionen, wobei 18 davon amerikanische Patienten und 14 japanische Patienten waren. Sie entstammten allen Krankheitskategorien, wurden jedoch bei der Behcet's-Krankheit und den Patienten, die an einer Birdshot-Retinochoroidopathie litten, häufiger gefunden. Eine ähnliche Fallverteilung wurde in den beiden Ländern festgestellt. Elf der amerikanischen Patienten waren zu dem Zeitpunkt aktiv, an dem sie eine Reaktion auf beide Antigene zeigten, im Vergleich mit sechs von achtzehn Nichtrespondern (p = 0,02). Es besteht jedoch nur ein geringer Unterschied bei der Zahl der aktiven Patienten (7/11 Patienten), die nur auf ein Antigen reagierten (p = 0,05). Eine Beziehung zwischen aktiver Krankheit und einer signifikanten lymphoproliferativen Reaktion wurde bei den japanischen Patienten nicht festgestellt.
Bei einem Vergleich des S-Antigen-Polypeptids mit dem Interphotorezeptor-Retinoid- Bindungsprotein erscheint es, daß das S-Antigen-Polypeptid häufiger mit einer aktiven Krankheit (p = 0,003) korreliert ist. Wie jedoch unten in Tabelle 5 gezeigt, war das Profil für jede Krankheit ähnlich für die beiden Antigene. Es wurde ein Versuch unternommen, proliferative Reaktionen mit der Therapie zu korrelieren, aber es war keine Korrelation möglich, wobei Patienten mit einer aktiven Krankheit wahrscheinlicher mit Cyclosporin oder Prednison behandelt wurden. Tabelle 5
* Die erste Zahl bezeichnet diejenigen Patienten mit aktiver Krankheit. Die zweite Zahl bezeichnet alle Patienten mit einer signifikanten proliferativen Reaktion auf das Antigen bei 20 Mikrogramm/ml oder 100 Mikrogramm/ml. Die Daten umfassen alle Responder mit einem Stimulationsindex oberhalb von 2,0 sowohl bei 5 als auch 7 Tage- Kulturen.

Claims

1. Verwendung eines Autoantigens, das spezifisch für Uveoretinitis ist, oder eines Fragments des Autoantigens bei der Herstellung eines oral oder enteral verabreichbaren Medikaments für die Behandlung von humaner Uveoretinitis.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Autoantigens- Antigen, Interphotorezeptor-Bindungsprotein oder Rhodopsin oder mindestens ein Fragment eines der vorstehenden ist.

3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Autoantigen S-Antigen ist.

4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das S-Antigen ein Polypeptid mit einem anscheinenden Molekulargewicht von ungefähr 48 kD enthält.

5. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Autoantigen einen Säugerursprung aufweist, vorzugsweise vom Rind oder vom Menschen.

6. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Autoantigen ein natürliches Protein ist, oder durch Polypeptidsynthese oder rekombinante DNA-Technologie erhältlich ist.

7. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Fragment ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

und Mischungen davon ist.

8. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Formulierung des Medikaments so gewählt ist, daß sie eine Verabreichung von ungefähr 0,1 bis ungefähr 15 mg/kg/Tag, vorzugsweise von ungefähr 4 bis ungefähr 8,5 mg/kg/Tag ermöglicht.

9. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Medikament einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthält.