DE3433339C2

DE3433339C2 - Zellmembran-Proteine enthaltende Arzneimittel zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE3433339C2
Application number: DE3433339A
Authority: DE
Inventors: Irun Robert Cohen; Meir Shinitzky
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1983-09-11
Filing date: 1984-09-11
Publication date: 1994-02-03
Anticipated expiration: 2004-09-12
Also published as: GB2146338A; DE3433339A1; GB8422869D0; US4634590A; FR2553100A1; GB2146338B; IL69686A; JPH0641421B2; ATE83151T1; US4996194A; JPS60155126A; FR2553100B1; IT8422580A0; IT1210493B; IL69686A0; CA1235660A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue Arzneimit tel für Behandlung und Prophylaxe von Autoimmun-Krankheiten, die immunogenes Material aus Membranen bestimmter Autoimmun-Lymphozyten-Zellinien oder Druck-aktivierte Zellen enthalten Anspruch 1-3 und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Die Grundlage der Prophylaxe von Autoimmun-Krankheiten ist die Impfung mit Membranprotein-enthaltenden Präparaten aus Autoimmun-T-Zellinien, die bestimmte T-Zell-Rezeptoren enthalten oder die Verwendung von Druck-aktivierten Zellen. Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines sol chen aktiven Zellmembran-Materials und zur Zellaktivierung bereit sowie Arzneimittel, die diese als Wirkstoff enthalten.

Die Ursache für Autoimmun-Krankheiten sind endogene Lympho zyten, die normale Bestandteile des Organismus angreifen. Die Erfinder hatten besonders Autoimmun-T-Zellinien als Langzeit- Zellinien gezüchtet, die eine Reihe experimenteller Autoimmun- Krankheiten hervorrufen (vgl. Referenzen 1 bis 9).

Durch die so erhaltenen verhältnismäßig reinen Autoimmun- Zellkulturen wurde die Erforschung der Pathogenese erleich tert, der Trägerstatus der Autoimmunität aufgedeckt und es wurden Mittel zur Impfung gegen die Autoimmunität und zur Behandlung derselben bereitgestellt (vgl. Referenzen 5 bis 9).

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Präparate zur Verwendung bei Prophylaxe und Behandlung von Autoimmun-Krank heiten. Als aktiven Wirkstoff enthalten die genannten Präpa rate bestimmte Membrankomponenten spezifischer Autoimmun-T- Lymphozyten oder Druck-aktivierte Zellen. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Gewinnung dieser Membrankomponenten aus den genannten Lymphozyten, auf die Druck-Aktivie rung solcher Lymphozyten und auf die Herstellung von Impf stoffen und Arzneimitteln, die diese Membrankomponenten oder Lymphozyten enthalten.

Ein gemeinsames Merkmal der Autoimmun-Krankheiten ist, daß sie durch einen Angriff des Immun-Systems auf Organismus-eigene Gewebe verursacht werden. Grundsätzlich treten bei allen Auto immun-Krankheiten Autoimmun-Lymphozyten auf, die spezifisch bestimmte Ziel-Antigene des Organismus erkennen. Zu den Auto immun-Krankheiten gehören rheumatische Arthritis, Multiple Sklerose, einige Formen von Diabetes mellitus sowie Thyroidi tis. Bislang gab es keine spezifische Art der Therapie gegen diese Krankheiten.

Es ist möglich geworden, T-Lymphozyten als Langzeit-Zellinien zu züchten, die in Labortieren Autoimmun-Krankheiten verursachen. Zu diesen Krankheiten gehören Encephalomyelitis, Arthritis sowie Thyroiditis.

Es hat sich herausgestellt, daß solche Zellen als Wirkstoffe bei der Impfung gegen die genannten spezifischen Autoimmun- Krankheiten verwendet werden können: Dazu wurden diese Lympho zyten so attenuiert, daß sie keine Autoimmun-Krankheit ver ursachen können und injiziert. Es wurde gefunden, daß solche Impfungen die Tiere immun oder weniger sensitiv (die Krank heit war weniger ernst) gegenüber diesen Krankheiten machen. Außerdem wurde gezeigt, daß kranke Tiere durch die Verabrei chung der genannten Zellen wirkungsvoll behandelt werden können.

Erfindungsgemäß werden Arzneimittel bereitgestellt, die als Wirkstoff Membran-Material spezifischer, bestimmter T-Zell rezeptoren tragender Autoimmun-T-Zellinien enthalten. Außerdem wird durch die Erfindung ein neues Verfahren zur Produktion und Isolierung der genannten Membran-Komponenten bereitgestellt, bei dem die T-Lymphozyten einem hohen hydrostatischen Druck ausgesetzt wurden und dieser Druck allmählich entlastet wur de, wodurch wirkungsvoll das Ausscheiden von biologisch hoch aktiven Membran-Komponenten verursacht wurde. Eine andere Möglichkeit ist die Druck-Aktivierung dieser Zellen. Dabei werden sie einem hydrostatischen Druck unterworfen, der all mählich entlastet wird.

Typische Bedingungen für das Ausscheiden von aktivem Membran material sind Drücke von etwa 500-1500 bar, die allmählich innerhalb von 5 Minuten aufgebaut werden, auf ihrem höchsten Niveau etwa 10 bis 45 Minuten gehalten werden und allmählich innerhalb von 5 bis 15 Minuten wieder entlastet werden.

Die Druckaktivierung von Zellen wird dadurch erreicht, daß diese Zellen einem während 5 Minuten aufgebauten Druck von 500 bis 1000 bar ausgesetzt werden, dieser Druck etwa 5 Minu ten aufrechterhalten wird und danach während etwa 5 Minuten wieder entlastet wird.

Es findet so gut wie kein Ausscheiden von Membran-Komponen ten statt, aber die Zellen werden aktiviert. Dies erfolgt wahrscheinlich durch eine laterale Verschiebung von Membran- Bestandteilen. Sowohl die ausgeschiedenen Komponenten als auch die Druck-aktivierten Zellen können als Wirkstoff für die erfindungsgemäßen Impfstoffe verwendet werden. Bei der Druck-Aktivierung behalten die Zellen ihre vollständige Lebens fähigkeit.

Die so erhaltenen Substanzen enthalten etwa 10⁷ bis 10⁸ akti vierte Zellen oder Material aus einer gleichen An zahl von Zellen. Zur Impfung von Menschen werden Mengen der Größenordnung von etwa 0,01 mg bis 3 mg dieser Substanzen ver wendet (ausgeschiedenes Protein oder aktivierte Zellen). Die Impfung wird in einem Abstand von etwa 2 Wochen zweimal durch geführt.

Derartige Immunisierungen sind bei der Prophylaxe und der Be handlung gewisser Autoimmun-Krankheiten wirksam.

Die Lymphozyten werden in einem geeigneten Puffer suspendiert, in einen Gasphase-freien Druckbehälter eingebracht, in dem mit einer Preßvorrichtung ("French Press") wie vorstehend beschrie ben ein Druck erzeugt wird.

Die entstandene Zellsuspension wird bei etwa 1500 Upm zentri fugiert. Der erhaltene Überstand wird zur Sedimentation der Membran-Fragmente 1 Stunde bei etwa 100 000 g ultrazentrifu giert.

Es wurden spezielle in vitro-Autoimmun-T-Zellinien entwickelt (vgl. Referenzen 1 bis 9). In Tabelle I sind drei experimen telle Autoimmunkrankheiten zusammengefaßt, die mit diesen T-Lymphozyten-Zellinien in Verbindung stehen.

Die experimentelle Autoimmun-Encephalomyelitis (EAE) kann in genetisch susceptiblen Rattenstämmen durch Immunisierung die ser Ratten mit basischem Myelin-Protein (BP) (vgl. Referenz 10) ak tiv induziert werden. Gewöhnlich manifestiert sich EAE als akute Krankheit mit den Symptomen der Paralyse und der zellu lären Infiltration in der weißen Substanz des Zentralen Ner ven-Systems. Unbehandelte Ratten erholen sich gewöhnlich in nerhalb von 2 oder 3 Tagen spontan von akuter EAE und sind dann resistent gegenüber weiteren Versuchen der Induktion ak tiver EAE (vgl. Referenz 2). Chronische oder rückfällige EAE kann ebenso unter bestimmten Bedingungen induziert werden und gleicht dann in vielen Merkmalen der menschlichen Multiplen Sklerose.

Experimentelle Autoimmun-Thyroiditis (EAT) kann in genetisch suszeptiblen H-2-Mäusen durch Immunisierung dieser Mäuse gegen Maus-Thyroglobulin (Tg) in einem Adjuvant induziert werden (vgl. Referenz 11). EAT wirkt sich als chronische Entzündung der Schilddrüse aus. EAT-resistente Mäusestämme können hohe Titer von anti-Tg-auto-Antikörpern bilden. Anscheinend ist EAT ein Modell für die beim Menschen nichht ungewöhnliche Autoimmun- Thyroiditis (Hashimoto′s Thyroiditis).

Die Adjuvant-Arthritis (AA) unterscheidet sich von EAE und EAT dadurch, daß sie in Ratten nicht durch Immunisierung dersel ben gegen ein definiertes Eigen-Antigen sondern gegen Myco bacterium tuberculosis (Tb) in vollständigem Freund′s Adjuvant induziert wird (CFA; vgl. Referenz 12). Etwa 2 Wochen nach der Inokulation entwickeln genetisch suszeptible Ratten eine subakute Polyarthritis mit Merkmalen, die sehr an die mensch liche rheumatische Arthritis erinnern. Es wurde vermutet, daß Typ II-Kollagen das Ziel-Eigen-antigen bei AA ist, denn Arthritis kann durch die Immunisierung gegen dieses Antigen induziert werden (vgl. Referenz 13). Neuere Ergebnisse jedoch weisen darauf hin, daß AA und Typ II-Kollagen-Arthritis ver schiedene Krankheiten sein können (vgl. Referenzen 14 und 15).

Tabelle I veranschaulicht außerdem, daß ähnliche Autoimmun- Krankheiten durch die Inokulation von Antigen-spezifischen Zell inien induziert werden können. Einzelheiten über Wachstum und Erhaltung der Zellinien und die Verursachung der Krankheit sind veröffentlicht worden (vgl. Referenzen 1 bis 5). Das Wesentliche der Methode ist die Behandlung von Tieren mit einem bestimmten Antigen und die Auswahl der spezifisch reagierenden Zellen aus einer Kultur mit dem selektierenden Antigen zusammen mit syngenetischen, bestrahlten Hilfszellen. Die Antigen-präsentie renden Hilfszellen müssen zumindest in einem Teil des Haupt- Histokompatibilitäts-Komplex (MHC) syngenetisch sein, um die proliferative Antwort der Zellinien-Zellen auszulösen (vgl. Referenzen 3 und 4). Die ausgewählten Zellinien-Zellen werden dann in eine Kultur mit konditioniertem Medium, das kein Anti gen und keine Hilfszellen enthält, überführt. Stabile Zell inien, die Autoimmun-Krankheiten übertragen können, sind alle positiv für die üblichen T-Zell-Marker (Thy 1 bei Mäusen oder W3/13) und für die Marker der Helfer-Zellen der verspäteten Form der Hypersensitivität (Lyt-1 oder W3/25) und enthalten einige oder keine für den Lyt-2- oder OX8-Marker der cytotoxischen oder Suppressor-T-Zellen positive Zellen. Keine Zellinien- Zellen sind positiv für Ig-Marker. Zur Übertragung der Krank heit muß die T-Lymphozyten-Zellinie durch Inkubation mit spe zifischem Antigen von T-Zell-Mitogenen aktiviert werden, be vor die Inokulation in die Empfänger-Tiere erfolgt. Eine einzi ge Inokulation von etwa 10⁴ bis 10⁵ anti-BP- oder anti-Tg- Zellen kann in verhältnismäßig kurzer Zeit zu den klinischen und pathologischen Anzeichen deutlicher EAE oder EAT führen. Um AA hervorzurufen, werden höhere Zellinien-Zellzahlen (10⁷) und verhältnismäßig starke Bestrahlung der Empfänger-Tiere (750 R) benötigt. Wenn die Krankheit auftreten soll, müssen die Empfänger in einem Teil des MHC syngenetisch mit den Zell linien-Zellen sein. Die charakteristischen Autoimmun-Verletzun gen gehen einher mit einer immunologisch spezifischen Akkumu lation von Zellinien-Zellen im Zielorgan. Es gibt keine Hinweise für die Mitwirkung von Auto-Antikörpern bei der Krankheit, die von den T-Lymphozyten-Zellinien-Zellen hervorgerufen wird.

Außerdem wurden erfolgreich Encephalomyelitis-oder Arthritis- Zellen cloniert; die anti-BP-Clone waren etwas weniger viru lent als ihre elterlichen Zellinien während ein anti-Tb-Zellclon isoliert wurde, der viel virulenter war als die elterliche Zellinie.

Die Verwendung von Zellinien-Zellen als spezifischem Impfstoff zur Induktion der Resistenz gegen Autoimmun-Krankheiten ist in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Impfung gegen Autoimmun-Krankheiten mit spezifischen Autoimmun-Zellinien-Zellen

Ratten oder Mäusen wurden intravenös aktivierte Zellinien-Zellen inoku liert (anti-BP, 5×10⁶; anti-Tg, 5×10⁶; anti-Tb, 2×10⁷), einige davon waren durch Bestrahlung behandelt worden (1500 R). Kontrolltieren wurden Zellinien-Zellen gegen nicht-interessierende Antigene inokuliert. 2 bis 4 Wochen später wurden die Tiere einem Immunitätstest unterzogen, bei dem versucht wurde, aktive Autoimmun-Krankheiten zu induzieren.

Anti-BP-Zellinien-Zellen konnten infolge von Bestrahlung oder Behandlung mit Mitomycin C nicht mehr EAE hervorrufen. Eine ein zige intravenöse Inokulation von auf diese Weise attenuierten Zellinien-Zellen führte jedoch bei etwa 65% der Ratten, die aktiv durch Immunisierung mit BP/CFA induziert wurden, zur Resistenz. Bei ersten Versuchen waren die Ratten noch suszeptibel für durch passiven Transfer von anti-BP-Zellinien-Zellen her vorgerufene EAE. Daher wurde vermutet, daß der Resistenz mechanismus weniger wirksam gegenüber vorgeformten Wirkungen oder Zellen ist, als gegenüber differenzierenden Zellen (vgl. Referenz 7). Kürzlich wurde jedoch beobachtet, daß sowohl durch positiven Transfer von Zellinien-Zellen verursach te EAE als auch aktive EAE mit Hilfe von Druck-behandel ten Zellen verhindert werden kann. Dagegen verhindert eine einzige intravenöse Inokulation attenuierter anti-Tg-Zell inien-Zellen nicht nur vollständig aktive EAT, die durch Tg/CFA induziert wurde, sondern sie schützt auch vor durch Inokulation aktiver anti-Tg-Zellinien-Zellen vermittelter EAT. Damit ist die Resistenz gegenüber Autoimmun-Krankheiten im allgemeinen nicht auf die frühen Stadien der Differenzierung beschränkt, sondern kann auch die Effektor-Phase der Krankheit umfassen.

Es wurde gefunden, daß Autoimmun-Zellinien-Zellen Wirkstoffe für Prophylaxe und Behandlung experimenteller Autoimmunität sind. Dieser Befund ist hilfreich für den Umfang mit klini schen Autoimmun-Kranheiten, also für Krankheiten, für die es keine spezifische Form der Therapie gibt. Obwohl die klinische Anstrengung eher im Bereich der Behandlung als der Prophylaxe liegen muß, ist dieser Unterschied in der Praxis möglicher weise nicht entscheidend. Ernsthafte Autoimmun-Krankheiten sind häufig progressiv oder mit Rückfall verbunden und schon die Prophylaxe der Ausbildung neuer Wellen von Autoimmun- Lymphozyten kann eine wirkungsvolle Therapie sein.

Fig. 1 veranschaulicht die Linderung von AA durch eine ein zige Inokulation von Zellinien-Zellen. In diesem Experiment wurden Gruppen von Ratten, die an aktiv induzierter AA er krankt waren, mit spezifischen anti-Tb-Zellinien-Zellen oder mit Kontroll-Zellinien-Zellen behandelt. Die mit spezifischen Zellinien-Zellen behandelten Ratten zeigten eine weniger ernste Krankheit und eine beschleunigte Remission.

Eine andere Überlegung ist die Identifizierung und Nutzbar machung von Eigen-Antigenen, gegen die die Autoimmun-Lympho zyten-Zellinien selektiert werden sollen. Häufig sind die Eigen-Antigene unbekannt oder nur sehr begrenzt zugänglich. Dennoch läßt das AA-Modell vermuten, daß es möglich ist, durch Verwendung von Gemischen nur wenig definierter Anti gene, die sogar aus fremden Quellen erhalten sein können, entsprechende Zellinien zu schaffen. Warum oder wie sich spe zifische virulente Autoimmun-Lymphozyten unter solchen Be dingungen entwickeln können ist rätselhaft.

Es kann vorteilhaft sein, die Therapie mit subzellulärem Ma terial aus Zellinien-Zellen oder mit Zellen verstärkter Anti genizität auszuführen und es wurde gefunden, daß Membran proteine wirkungsvoll verwendet werden können. Membran proteine von Zellinien-Zellen wurden mit einer neuen Methode hergestellt, die früher zur Isolierung von Blutgruppen-Anti genen menschlicher Erythrocyten verwendet wurde. Die Me thode beruht auf der Hypothese, daß die Gleichgewichts-Posi tion von Membranproteinen nach Verfestigung des Membran-Lipid- Bilayers zum wäßrigen Bereich verschoben wird und, daß bei hoher Lipid-Zähflüssigkeit Proteine ausgeschieden werden. Im allgemeinen hat jedes in der Membran integrierte Protein eine definierte Lipid-Zähflüssigkeits-Schwelle, bei der es aus der Membran ausgeschieden wird.

Die wirksamste Methode der Hyper-Verfestigung von Membranen ist die Anwendung von hydrostatischen Drücken (500 bis 1500 bar), die durch Vorbehandlung mit Cholesterol unter stützt werden kann. Im allgemeinen überleben Zellen eine solche Behandlung und das ausgeschiedene Material kann durch Zentrifugation größenabhängig fraktioniert werden. Das nach einstündiger Zentrifugation bei 100 000 g im Überstand verbleibende Material kann als isoliertes Protein oder als kleine Aggregate davon betrachtet werden. Das Präzipitat dieser Zentrifugation besteht aus Membran-Fragmenten und großen Protein-Aggregaten. Im allgemeinen behalten lösliche Membran-Proteine, im Gegensatz zu in an sich bekannter Weise durch die Verwendung von Detergentien isolierten Membran- Proteinen, ihre Aktivität.

Die Fähigkeit zur Immunisierung gegen Autoimmun-Krankheiten wurde für die folgenden Fraktionen gefunden:

I. Druck-aktivierte Zellen (vermutlich durch laterale Um lagerungen und vertikale Verschiebungen der spezifischen Antigen-Rezeptoren),
II. ausgeschiedene lösliche Proteine,
III. Membranfragmente.

Tabelle III zeigt, daß Membranfraktionen, die durch die Druck methode isoliert wurden, immunologisch spezifisch die Reak tion von Autoimmun-Zellinien-Zellen mit dem entsprechenden Antigen inhibierten.

Tabelle III

Membranfraktionen inhibieren die proliferative Antwort auf spezifische Zellinien-Zellen

Membranfraktionen aus A2- (Arthritis) und Z1a- (Encephalo lyelitis) Zellinien-Zellen wurden durch die Druckmethode (1000 bar) gewonnen und 50 µg/ml wurden für die prolifera tiven Antworten auf spezifische Antigene der intakten Zell inien-Zellen verwendet. Die Inhibition in Prozent wurde durch Vergleich der Reaktion in Gegenwart der Membranfrak tionen aus den spezifischen Zellinien-Zellen mit der Reaktion in Gegenwart anderer Zellinien-Zellen-Membran-Fraktionen berechnet.

Die mit Druck-aktivierten Zellen ausgeführten Experimente ergaben praktisch identische Resultate.

Beispielsweise inhibierte die aus der anti-BP-Zellinie Z1a gewonnene Membran-Fraktion die Reaktion von intakten Z1a-Zell inien-Zellen auf BP; sie inhibierte nicht die Reaktion von Arthritis-hervorrufenden A2-Zellinien-Zellen auf deren Anti gen. Im Gegensatz dazu inhibierte die Membranfraktion aus Arthritis-hervorrufenden A2-Zellen die Antwort auf intakte A2-Zellinien-Zellen aber nicht auf Z1a-Zellinien-Zellen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Membranfraktionen bio logisch aktive Rezeptoren für Eigen-Antigene enthalten.

Abb. 2 zeigt die Ergebnisse eines Experimentes, bei dem Ratten 2 Dosen von jeweils 0,5 µg Membran-Fraktion aus Z1a-Zellinien in wöchentlichen Abständen verabreicht wurde und bei dem 2 Wochen später aktive EAE in den Ratten indu ziert wurde. Aus der Abbildung kann entnommen werden, daß die Ratten, die mit der Membran-Fraktion behandelt wurden, im Vergleich zu den Kontroll-Ratten nur an einer sehr milden Paralyse litten. Der Verlauf der Krankheit konnte also merklich durch die Verwendung spezifischer Membran-Fraktionen gelindert werden. Tabelle IV zeigt die Resultate der Impfung von Ratten mit Druck-aktivierten anti-BP-Zellinien-Zellen.

Tabelle IV

Impfung gegen EAE mit Druck-aktivierten anti-BP-Zellinien-Zellen

Lewis-Ratten wurden intraperitoneal anti-BP- oder Kontroll- Zellinien-Zellen (5×10⁶ pro Woche, viermal) verabreicht, die durch hydrostatischen Druck aktiviert worden waren (1150 bar, 15 Minuten). Eine Woche später wurden die Tiere einem Immunitäts-Test mit BP/CFA unterworfen, bei dem aktive EAE induziert werden sollte.

Aus Tabelle IV geht hervor, daß die Ratten, die mit den Kontroll-Zellinien-Zellen behandelt wurden suszeptibel für EAE waren, wogegen Ratten, die mit Druck-aktivierten, spezifischen anti-BP-Zellinien-Zellen behandelt waren, vollständig resis tent gegenüber EAE waren. Außerdem waren sie resistent ge genüber durch intakte anti-BP-Zellinien-Zellen vermittelte EAE.

Beispiele von Autoimmun-Krankheiten, die mit Membran-Proteinen aus Autoimmun-Zellinien behandelt werden können:

Die Figuren erläutern die Erfindung.

Fig. 1: Behandlung der Anfangsstadien von Arthritis durch Zellinien-Zellen

In 20 Lewis-Ratten wurde durch Inokulation von CFA die aktive Adjuvants-Arthritis induziert. 5 Tage nach dem Ausbruch der klinischen Arthritis (Pfeil, Tag 16) wurde eine Gruppe von 10 Ratten durch eine einzige intravenöse Inokulation akti vierter anti-Tb-Zellinien-Zellen behandelt (geschlossene Kreise). Eine zweite Gruppe von 10 Ratten wurde mit Zellen einer Kontroll-Zellinie behandelt (offene Kreise). Die mittlere Häufigkeit des Auftretens von Arthritis wurde wie in Referenz 5 beschrieben bestimmt.

Fig. 2: Linderung von EAE durch Verabreichung einer Membran-Fraktion

Im Abstand von 1 Woche wurden Ratten Membran-Fraktionen aus Z1a-Zellinien-Zellen verabreicht (0,5 µg, erhalten durch die Druck-Methode). 2 Wochen später wurden die Tiere einem Immunitätstest mit einer encephalogenen EAE-Dosis unterworfen. Die klinische Trefferquote bei den Testratten wird durch die offenen Kreise angegeben, die bei den Kontrollratten durch geschlossene Kreise. Klinische Trefferquote: 1=mild; 2=mäßig; 3=ernst.

Beispiel Herstellung eines Impfstoffs

Es wurden Zellen einer T-Lymphozyten-Zellinie gegen das basi sche Myelin-Protein verwendet (Z1a-Zellinie). In Ratten indu zieren diese Zellen die experimentelle Autoimmun-Encephalitis (EAE). In eine sterile Druckkammer wurden 6×10⁸ Zellen, sus pendiert in 2,5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2 (PBS)), eingebracht. Zum Ausschluß von Gasblasen wur de der Deckel direkt auf die Oberfläche der Lösung aufge bracht. Mit einer Presse ("French Press") wurde innerhalb von 15 Minuten all mählich ein Druck von 1000 Atmosphären aufgebaut und etwa 45 Minuten lang aufrechterhalten. Der Druck wurde dann lang sam wieder während 15 Minuten auf Atmosphärendruck reduziert. Dann wurden die Zellen in ein Teströhrchen überführt, bei 1500 Upm abzentrifugiert und das Präzipitat wurde abge trennt. Die Zellüberlebensrate wurde mit Trypan-blau- Färbung getestet und betrug mehr als 90%. Danach wurde der Überstand 1 Stunde bei 100 000 g ultrazentrifugiert. Der Überstand (ungefähr 600 µg Protein in 2 ml PBS) wurde gesam melt und bei den in vitro und in vivo-Funktions-Experimen ten wie nachstehend beschrieben, verwendet.

Im in-vitro-Experiment wurden Zellen der Zellinie Z1a durch Zugabe ihres spezifischen Antigens (0,2 µg/ml, basisches Myelin-Protein) zur Proliferation angeregt.

Die Zellproliferations-Rate wurde durch Zählungen der Zerfälle eingebauten, radioaktiven Thymidins pro Minute ge messen. Durch Zugabe von 30 µg/ml der ausgeschiedenen Pro teine (siehe oben) wurde die Zell-Proliferation um 50 bis 60% reduziert. Wenn 30 µg/ml von anderen T-Zellinien-Zellen aus geschiedene Proteine (auch von Arthritis) verwendet wurden, wurde kein Effekt auf die Zell-Proliferation beobachtet. Typische Ergebnisse eines solchen Experimentes sind in Ta belle III gezeigt und weisen darauf hin, daß das Material, das während der Druck-Aktivierung aus der Zelloberfläche ausge schieden wurde, einen spezifischen Rezeptor für das induzie rende Antigen enthält. Dieses Material kann zur Immunisie rung gegen den Rezeptor verwendet werden. Dies führt zur partiellen oder vollständigen Eliminierung der Autoimmun- Krankheit. Ein solches Experiment wird nachstehend beschrie ben.

Ratten wurden zunächst im Abstand von 1 Woche zweimal durch Inokulation von 0,5 µg löslichen Proteinen, die nach der Druckbehandlung aus den Z1a-Zellinien-Zellen ausgeschieden wurden, immunisiert. 2 Wochen später wurden die Ratten einem Immunitätstest mit BP-Antigen in Adjuvants unterworfen. Nach 14 Tagen trat bei allen Ratten der Kontrollgruppe schwere EAE auf, während die vorbehandelten Ratten nur eine leichte EAE zeigten. Typische Profile für den Immunitäts test mit einer encephalitogenen BP-Dosis werden in Fig. 2 gezeigt. Wiederum hatte die Vorbehandlung mit Proteinen, die unter Druck aus einer nicht verwandten Zellinie (Arthri tis) ausgeschieden wurden, keine Auswirkung auf die Ent stehung von EAE.

Referenzen

1. A. Ben-Nun, H. Wekerle, I. R. Cohen, Eur. J. Immun. 11, Seiten 195-199 (1981).
2. A. Ben-Nun, I. R. Cohen, J. Immunol. 128, Seiten 1450- 1457 (1982).
3. A. Ben-Nun, I. R. Cohen, J. Immunol. 129, Seiten 303-308 (1982).
4. A. Ben-Nun, S. Eisenstein, I. R. Cohen, J. Immunol. 129, Seite 918 (1982).
5. J. Holoshitz, Y. Naparstek, A. Ben-Nun, I. R. Cohen, Science 219, Seiten 56-58 (1983).
6. A. Ben-Nun, H. Wekerle, I. R. Cohen, Nature 292, Seiten 60-61 (1981).
7. A. Ben-Nun, I. R. Cohen, Eur. J. Immunol. 11, Seiten 949-952 (1981).
8. R. Maron, R. Zeubavel, A. Friedman, I. R. Cohen, J. Immunol. 131, Seiten 2316-2320 (1983).
9. J. Holoshitz, A. Frenken, A. Ben-Nun, I. R. Cohen, J. Immunol. 131, Seiten 2810-2813 (1983).
10. P. Y. Paterson in. Textbook of Immunopathology (P. Miescher, H. J. Muler-Eberhard, Eds.) Seiten 179-213, Grune & Stratton, N. Y. (1976).
11. N. R. Rose, F. J. Twarog, A. J. Crowle, J. Immunol. 106, Seiten 698-708 (1971).
12. C. M. Pearson, J. Chronic Dis. 16, Seiten 863-874 (1963).
13. D. E. Trentham, W. J. McCunr, P. Susman, J. R. David, J. Clin. Invest. 66, Seiten 1109-1117 (1980).
14. Y. Iizuka, Y. H. Chang, Arthritic Rheum. 25, Seiten 1325-1332 (1982).
15. J. Holoshitz, A. Matitiau, I. R. Cohen, J. Clin Invest. 73, Seiten 211-215 (1984).

Claims

1. Arzneimittel für Prophylaxe und Behandlung einer Autoimmun-Krankheit, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Membran-Proteinen, die aus der Zellmembran von Autoimmun-T-Lymphozyten ausgeschieden wurden, oder einen Gehalt an Druck-aktivierten Autoimmun-T- Lymphozyten als Wirkstoff, sowie an üblichen Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffen.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran-Proteine die Fraktion sind, die man als Überstand erhält, wenn man eine Suspension mit T- Lymphozyten, aus denen Membran-Proteine ausgeschieden wurden, ultrazentrifugiert.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran-Proteine bzw. die Druck-aktivierten Autoimmun-T-Lymphozyten aus Autoimmun- T-Lymphozyten erhalten wurden, die spezifisch sind für Multiple Sklerose, Thyroiditis, Diabetes (Typ I), Ankylotische Spondylitis oder Rheumatische Arthritis.

4. Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Zellmembran-Protein-Präparaten aus Autoimmun-T- Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine aus einem erkrankten Patienten erhaltene spezifische T- Lymphozyten-Zellinie in einem geeigneten Puffer einem hohen hydrostatischen Druck aussetzt, diesen allmählich wieder entlastet, die Zellfragmente abzentrifugiert, den Überstand ultrazentrifugiert und den dabei erhaltenen Überstand entnimmt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Druck von 500 bis 1500 bar in einer geeigneten Vorrichtung erzeugt wird und, daß der Druck allmählich entlastet wird.

6. Verfahren zur Herstellung von Druck-aktivierten Autoimmun-T-Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lymphozyten einem allmählich ansteigenden hydrostatischen Druck von 500 bis 1000 bar aussetzt, den Druck für eine bestimmte Zeitspanne aufrechterhält und allmählich wieder entlastet, wobei diese Bedingungen zur Zellaktivierung ausreichen, aber nicht zur Ausschaltung von Membran-Proteinen führen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Lymphozyten aus einem an einer Autoimmun-Krankheit erkrankten Patienten stammen.