DE68915834T2 - Herstellung von T-Zellen und T-Zellmembranen, verwendbar zur Verhütung und Behandlung von Autoimmunkrankheiten. - Google Patents

Herstellung von T-Zellen und T-Zellmembranen, verwendbar zur Verhütung und Behandlung von Autoimmunkrankheiten.

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DE68915834T2
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Description

    Erfindungsgebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verhütung oder Behandlung von Autoimmunkrankheiten, die als aktiven Bestandteil eine wirksame Menge an aktivierten, für die in Behandlung befindliche Autoimmunkrankheit spezifische T-Zellen, welche einer photoaktivierte Psoralenbehandlung unterzogen wurden, oder den Membranteil solcher behandelter T-Zellen enthalten.
    • Allgemeiner Stand der Technik
  • Die ätiologischen Wirkstoffe der Autoimmunkrankheit sind endogene Lymphozyten, welche normale Bestandteile des Menschen angreifen. Das gemeinsame Merkmal der Autoimmunkrankheiten besteht darin, daß sie durch einen Angriff des Immunsystems auf das Gewebe des Menschen verursacht werden. Den Herd aller Autoimmunkrankheiten bilden die autoimmunen Lymphozyten, die insbesondere die jeweiligen Zielantigene des Menschen erkennen. Die allgemein als solche anerkannten Autoimmunkrankheiten umfassen rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, einige Formen von Diabetes mellitus, Thyreoiditis, Myasthenia gravis und Uveitis anterior.
  • Es hat sich als möglich erwiesen, für die Verursachung von Autoimmunkrankheiten verantwortliche T-Lymphozyten als Langzeit-Zellinien in Labortieren zu züchten. Diese Krankheiten umfassen Enzephalomyelitis, Arthritis und Thyreoiditis. Unter gewissen Bedingungen zeigte sich, daß diese Zellen wirksame Mittel zur Impfung gegen derartige spezielle Autoimmunkrankheiten darstellen. Die Lymphozyten wurden vor der Injektion geschwächt, um nicht die Autoimmunkrankheiten hervorzurufen. Man fand heraus, daß diese Impfungen die Tiere ganz wirksam immun gegen oder weniger anfällig (d.h. die Krankheit war weniger ernst) für eine derartige Krankheit machen. Außerdem wurden diese Krankheiten bei Tieren, die bereits Symptome der Krankheit zeigten und mit diesen Zellen geimpft wurden, ganz wirksam behandelt.
  • Wie von Cohen und Shinitsky, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:4577, 1987, sowie in der EP-261648 beschrieben, können T-Zellen-Impfstoffe gegen Autoimmunkrankheiten durch Behandlung dieser T-Zellen mit chemischen Vernetzern, wie z.B. Glutaraldehyd und Formaldehyd, hergestellt werden. Die mit den Vernetzungsmitteln behandelten Membrane dieser Zellen waren ebenso als aktive Bestandteile der Impfstoffe wirksam. Diese Zusammensetzungen können auch zur Erleichterung von Symptomen dieser Autoimmunkrankheiten eingesetzt werden.
  • Als Gruppe stellen die Psoralene, die als ein Glied 8- MOP umfassen, Verbindungen dar, welche erwiesenermaßen Moleküle wie z.B. Proteine unter dem Einfluß von UV-Licht im allgemeinen mit einer Wellenlänge von 320-400 nm sehr selektiv vernetzen. Diese Verbindungen, auch als Furokumarine bekannt, treten natürlicherweise in mehr als zwei Dutzend Pflanzenarten auf. Zwei der Psoralen-Analogons, nämlich 8-Methoxypsoralen und 4,5'-8-Trimethoxypsoralen, werden klinisch in der Photochemotherapie von Hautkrankheiten wie z.B. Psoriasis, Mykosis fungoides, Vitiligo und Ekzemen eingesetzt. Den Patienten wird das Psoralen typischerweise oral oder lokal verabreicht und daraufhin werden sie einer genau bemessenen Dosis ultravioletter Bestrahlung ausgesetzt.
  • Kürzlich wurde 8-Methoxypsoralen, oder auch 8-MOP genannt, zur Schädigung von im Blut zirkulierenden Tumorzellen eingesetzt, Edelson et al., N. Eng. J. Med., 216:297, 1987. Die Blutzellen wurden in einem extrakorporalen Gerät mit UVA bestrahlt. Die behandelten Blutzellen wurden dem Körper zurückgegeben und führten zu einer Reaktion des Immunsystems auf die Tuinorzellen. Man ging davon aus, daß der Mechanismus der Schädigung der Tumorzellen auf eine Vernetzung von DNS durch 8-MOP zurückzuführen war.
  • Bisher nahm man an, daß die biologischen Wirkungen von Psoralen mit ihrer Fähigkeit zur kovalenten Bindung und Vernetzung von DNS zusammenhängen. Yurkow et al., J. Biol. Chem., 262 (18):8439-8442, 1987, offenbaren jedoch, daß in zytoplasmischen und Plasmamembran-Fraktionen von HeLa- Zellen nach einer Natriumdodezylsulfat-Polyacrylamidgel- Elektrophorese ein Psoralen-Rezeptor gefunden wurde. Dieses Zellprotein hat eine spezielle Affinität für die Psoralenverbindungen und wird durch diese Verbindungen photoalkyliert. Weiterhin offenbaren Yurkow et al, daß Psoralenrezeptoren in HeLa-Zellen ein Protein mit einer Molekülmasse von ca. 22.000 Dalton darstellen. Die Bindung von photoaktiviertem Psoralen an dessen Rezeptor verändert tatsächlich die Proliferations- und Differenzierungszustände verschiedener Zelltypen. Somit dienen die Psoralene nicht als allgemeine chemische Vernetzungsmittel, sondern als ganz spezielle rezeptor-aktivierende Liganden, die den Rezeptor erst nach der Photoaktivierung aktivieren.
  • Einen weiteren Beweis von Psoralenen, welche nicht notwendigerweise direkt mit der DNS zusammenwirken, liefert Laskin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82:6158-6162, 1985. Man hat spezielle, sättigende und mit hoher Affinität bindende Stellen für 8-MOP auf HeLa-Zellen festgestellt und auch für 8-MOP wurde eine spezielle Bindung auf anderen Zellinien gefunden.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, mit einem photoaktivierten Psoralenvernetzer vernetzte T-Zellen oder Membrane solcher T-Zellen zu schaffen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt darin, Zusammensetzungen zu schaffen, die zur Verhütung oder Behandlung von Autoimmunkrankheiten eingesetzt werden können.
  • Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, T-Zellen zu schaffen, die an dem speziellen Rezeptor für Psoralenmoleküle vernetzt sind.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind T-Zellen mit einem photoaktivierbaren Psoralenvernetzer vernetzt. Die vernetzten T-Zellen können in intakter Form verwendet werden oder es können Membranteile der lysierten, vernetzten T-Zellen eingesetzt werden. Ein für diesen Zweck besonders geeigneter, photoaktivierbarer Vernetzer ist 8-Methoxypsoralen, nachfolgend 8-MOP genannt.
  • Die Vernetzung wird dadurch bewirkt, daß die Zellen mit dem Vernetzungsmittel behandelt werden und daraufhin die so behandelten Zellen einem Licht mit geeigneter Wellenlänge ausgesetzt werden, um die Vernetzung herbeizuführen. Sodann werden aus den vernetzten Zellen oder den davon abgetrennten Membranen Impfstoffe hergestellt. Alternativ können pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, die zur Erleichterung der Symptome von Autoimmunkrankheiten geeignet sind.
  • Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Vernetzungsmittel sind photoaktivierbare Psoralen-Vernetzungsreagenzien, die sich als ganz typisch für bestimmte Rezeptoren auf den Zellen herausgestellt haben und die nur an diesen Rezeptoren vernetzen. Diese Rezeptoren stellen das in Zellmembranen gefundene Protein mit 22.000 Dalton dar, wie von Yurkow et al, s.o., beschrieben. Dies steht im Gegensatz zu herkömmlichen Vernetzern wie Glutaraldehyden, die bei der Vernetzung keinen Unterschied machen. Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Psoralene umfassen alle photoaktivierbaren Psoralen-Derivate, die selektiv vernetzen. Von diesen Verbindungen sind zu nennen: Psoralen, 8-Methoxypsoralen, 4,5',8-Trimethylpsoralen, 4',5'-Dihydropsoralen, 3-Karbethoxypsoralen, 4',5'-Dihydro 3-Karbethoxypsoralen, 5-Methoxypsoralen, 4'- (Hydroxymethyl)-4,5',8-Trimethylpsoralen, Aminomethyl-Trioxypsoralen.
  • Die durch diese photoaktivierbaren Vernetzungsmittel vernetzten T-Zellen oder deren Membrane erwiesen sich als brauchbar als Impfstoffe für Autoimmunkrankheiten sowie für die Behandlung derartiger Krankheiten.
    • Kurzbeschreibung der Zeichnung
  • Figur 1 zeigt die Impfung gegen EAE unter Verwendung von mit 8-MOP-UVA behandelten Zellen oder T-Zellmembranen.
  • Figur 2 zeigt die Ergebnisse von mit 8-MOP-UVA behandelten T-Zellen.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung gibt es pharmazeutische Präparate, die als aktiven Bestandteil spezielle, aktivierte, autoimmune T-Lymphozyten, welche mittels eines photoaktivierbaren Psoralen-Vernetzers vernetzt wurden, oder ein von diesen speziellen, vernetzten T-Lymphozyten abgetrenntes Membranmaterial enthalten.
  • Die für den Zweck der vorliegenden Erfindung verwendbaren T-Lymphozytzellen enthalten eine beliebige aktivierte, für eine Autoimmunkrankheit typische T-Zelle. Die erfindungsgemäßen T-Lymphozytzellen können entweder von einer etablierten Zellinie abgeleitet oder den Kreislauf- oder Lymphsystemen eines Lebewesens, z.B. einer Maus, Ratte oder einem Menschen entnommen werden. Außerdem können die T-Lymphozytzellen einem Patienten, bei dem eine spezielle Autoimmunkrankheit behandelt werden soll, direkt entnommen werden. Die Zellen müssen auch "aktiviert" werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "aktivierte T-Lymphozytzelle" eine T-Lymphozytzelle, die einem speziellen Antigen oder Mitogen ausgesetzt worden ist, welches durch die T-Lymphozytzelle eine Immunreaktion auslösen kann. Geeignete Mitogene sind im Stand der Technik bekannt und umfassen Konkanavalin A, Phytohämagglutinin sowie Kermes-Mitogen. Da die T-Zellen sowohl für eine Autoimmunkrankheit typisch als auch aktiviert sein müssen, sollten die nicht spezifischen Aktivierungsmittel, wie z.B. Mitogene, nur bei Zellen verwendet werden, die bereits für eine Autoimmunkrankheit typisch sind, wie z.B. etablierte, für eine Autoimmunkrankheit typische Zellinien oder aus den Kreislauf- oder Lymphsystemen eines bereits von der Krankheit befallenen Lebewesens entnommene Zellen. Die einem solchen Lebewesen entnommenen T-Zellen enthalten für diese Krankheit typische T-Zellen. Wenn unspezifische T- Zellen aktiviert werden sollen, sollte ein spezielles Antigen als Aktivierungsmittel eingesetzt werden, um die T- Zellen für dieses Antigen zu spezifizieren und sie zu aktivieren.
  • Da erfindungsgemäß die Zellmembranrezeptoren den operativen Teil der T-Zellen bilden, ist die spezielle biologische Aktivität der verwendeten T-Zellen nicht von Bedeutung. Somit kann jeder der bekannten T-Zellteile verwendet werden.
  • Gemäß des in der EP-261648 beschriebenen Verfahrens können die T-Zellen wahlweise druckbehandelt werden. Bei einem derartigen Verfahren werden die Zellen einem hydrostatischen Druck ausgesetzt, der dann langsam nachläßt. Die Druckmenge und die Zeit unter Druck werden so ausgewählt, daß im wesentlichen keine Ablösung von Membranproteinen auftritt. Typische Bedingungen für eine derartige Druckaktivierung von Zellen bestehen in einem Druckaufbau über 5 Minuten von ca. 500 bis ca. 1000 atm, einer Aufrechterhaltung des Drucks über ca. 5 Minuten und einem allmählichen Druckabbau über einen Zeitraum von ca. 5 Minuten. Diese Behandlung verursacht eine vertikale Verschiebung der Membranbestandteile in der Art, daß sie wirksam "aufspringen" und die Antigenwirkung der Zellen erhöht wird. Die erfindungsgemäße, photoaktivierte Vernetzungsbehandlung kann vor oder nach einer derartigen Druckbehandlung stattfinden.
  • Wird die photoaktivierte Vernetzungsbehandlung vor der Druckbehandlung durchgeführt, dann kann die Druckbehandlung unter Bedingungen stattfinden, die zu einer wirksamen Ablösung von Membranmaterial führen, das ein hohes Ausmaß an Antigenaktivität behält. Für die Ablösung des aktiven Materials typische Bedingungen sind Drücke im Bereich von 500 bis ca. 1500 atm, wobei der Druckaufbau allmählich über ca. 5 Minuten stattfindet, der Druck ca. 10 bis 45 Minuten lang an der Obergrenze gehalten wird und langsam über einen Zeitraum von 5 bis 15 Minuten wieder abgebaut wird. Die während dieser Druckbehandlung abgelösten Membranteile einschließlich der Membranfragmente und der großen Proteinaggregate sowie der löslichen Membranproteine können erfindungsgemäß eingesetzt werden.
  • Die erfindungsgemäß behandelten Zellen können wahlweise auch mit einem chemischen Standardvernetzer wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd behandelt werden. Dies kann entweder vor oder nach der photoaktivierten Vernetzungsbehandlung und vor oder nach oder auch anstatt der Druckbehandlung geschehen. Vorzugsweise findet die chemische Vernetzungsbehandlung nach der photoaktivierten Vernetzungsbehandlung statt, um nicht die spezielle Rezeptorstelle zu beeinträchtigen, an der die selektive, photoaktivierte Vernetzung auftritt. In ähnlicher Weise können die Zellen auch wahlweise mit einem Spaltmittel behandelt werden, welches die Aufspaltung des Zytoskeletons der Zelle verursacht. Solche Spaltmittel umfassen die Chemikalien Zytochalasin und Kolchizin, obwohl auch andere Spaltmittel im Stand der Technik bekannt sind und ebenfalls eingesetzt werden können. Die Behandlung mit eiinem Spaltmittel kann auch vor, nach oder ohne Druckbehandlung durchgeführt werden (obwohl sie vor der zur Auflösung von Membranteilen beabsichtigten Druckbehandlung stattfinden sollte), vor, nach oder ohne Behandlung mit einem chemischem Vernetzungsmittel und vor oder nach der Behandlung mit einem photoaktiviertem Vernetzungsmittel. Sollen Membranreste von lysierten Zellen verwendet werden, so sollten alle vorgenannten Behandlungen vor der Lysierung stattfinden. Die speziellen Bedingungen usw. für die Druckbehandlung, Behandlung mit chemischem Vernetzer und Behandlung mit Spaltmittel sind in der EP-261648 offenbart.
  • Die T-Zellen werden vorzugsweise in einer Menge von ca. 5-10 x 10&sup6;/ml in einem Gewebekulturmedium vernetzt, indem sie mit einem leichten, photoaktivierbaren Psoralen- Vernetzer, ca. 50 bis ca. 500 ng/ml, inkubiert werden und das behandelte Material einem Licht mit geeigneter Wellenlänge über einen Zeitraum von 5 bis 60 Minuten ausgesetzt wird. Im Fall von 8-MOP handelt es sich bei dem verwendeten Licht um UVA-Strahlung, vorzugsweise mit einer Wellenlänge von 350 nM in einer Dosis von 1-2 Joules. Die vernetzten Stoffe stellen auch nach der Lysierung der Zellen einen wirksamen Impfstoff dar.
  • Vernetzte Membrane erhält man durch Lysieren der vernetzten T-Zellen, wie durch Homogenisierung der Zellen in phosphatgepuf ferter und in destilliertem H&sub2;O verdünnter, physiologischer Kochsalzlösung, Entfernen des Nukleus und der Zellreste durch Zentrifugieren und Ultrazentrifugieren der überstehenden, die Membrane enthaltenden Flüssigkeit und Zurückbehalten des Granulums, das die vernetzten Membrane enthält. Die aus behandelten T-Zellen erhaltenen Membrane waren wirksam bei der Impfung von Ratten entweder gegen EAE oder gegen Adjuvansarthritis.
  • Obwohl man ursprünglich 8-MOP-UVA zur Beeinflussung von Zellen durch die Vernetzung von DNS postulierte, zeigen die vorliegenden Ergebnisse, daß es auf die T-Zellmembran eine Wirkung ausüben kann, womit die Berichte von Yurkow et al und Laskin et al, s.o., bestätigt werden. Anscheinend bringt die spezielle Vernetzung des 22 KD Psoralen- Rezeptors auf den Zelloberflächen die entscheidend verbesserten Ergebnisse gegenüber Zellen, die nicht mit Psoralen behandelt wurden. Somit kann jede beliebige photoakativierbare Psoralenverbindung, die von dem selben Rezeptor, der 8-MOP erkennt, erkannt wird, erfindungsgemäß eingesetzt werden. Dazu gehören Psoralen, 8-Methoxypsoralen, 4,5',8-Trimethylpsoralen, 4',5'-Dihydropsoralen, 3-Karbethoxypsoralen, 4',5'-Dihydro-3-Karbethoxypsoralen, 5-Methoxypsoralen, 4'-(Hydroxymethyl)-4,5',8-Trimethylpsoralen, Aminomethyl-Trioxypsoralen.
  • Da genau diese selektive Vernetzung für die hervorragenden Ergebnisse der vorliegenden Erfindung verantwortlich ist, wäre die Verwendung dieser besonderen Vernetzungsmittel für einen Durchschnittsfachmann, der die Offenbarung der EP-261648 kennt, nicht naheliegend gewesen. Photoaktivierte Psoralene stellen nicht bloß eine weitere Gattung von Vernetzungsmitteln dar. Sie vernetzen nur spezielle Rezeptoren und rufen als solche die Aktivierung bestimmter biologischer Funktionen der Zellen hervor. Genau diese spezielle Rezeptoraktivierungstätigkeit der Psoralene verbessert den Nutzen der Zellen für die Verhütung und Behandlung von Autoimmunkrankheiten ganz erheblich. Dies ist eine völlig andere Funktion im Vergleich zu den allgemeinen chemischen Vernetzern wie Formaldehyd und Glutaraldehyd der EP-261648. Die mit diesem Gebiet vertrauten Fachleute wissen, daß je kleiner die Menge an Vernetzung der Zelloberfläche, desto sicherer sind die behandelten Zellen als Arzneimittel. Somit sind die spezifisch vernetzten Zellen und Membrane der vorliegenden Erfindung den allgemein vernetzten Zellen und Membranen der EP-261648 überlegen und sind nicht naheliegend, auch wenn die Ergebnisse im wesentlichen equivalent sind.
  • Es wurden eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um zu testen, ob Membrane von mit 8-MOP-UVA behandelten T- Zellen als wirksame Impfstoffe gegen Autoimmunkrankheiten eingesetzt werden könnten, die man auch zur Behandlung derartiger Krankheiten verwenden kann.
    • BEISPIEL 1
  • Die Figur 1 zeigt die Impfung gegen EAE unter Verwendung von mit 8-MOP-UVA behandelten T-Zellen oder T-Zellmembranen. Gruppen von fünf Lewis-Ratten wurden intraperitoneal mit 20 x 10&sup6; Zellen der Z1a Antimyelin-Basisprotein- Zellinie geimpft. Die T-Zellen wurden vor der Impfung aktiviert, wie in Ben-Nun et al., J. Immunol., 129:303, 1982, beschrieben. Die aktivierten Zellen (80 x 10&sup6; in 10 ml Medium) wurden daraufhin entweder mit Gamma-Bestrahlung (1500 Rad) wie in Ben-Nun et al., ibidem, beschrieben oder mit 8-MOP behandelt. Die mit 8-MOP behandelten Zellen wurde mit 500 ng/ml 8-MOP inkubiert, indem 6 ml Zuwachs der Zellen in eine 9 cm große Gewebekulturplatte aus Kunststoff gelegt und mit 8-MOP bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang im Dunkeln geschwenkt wurden. Die 8-MOP T-Zellen wurden daraufhin mit UVA von 350 nM in einer Dosis von 2 Joule bestrahlt.
  • Die Membrane wurden folgendermaßen aus den mit 8-MOP- UVA behandelten T-Zellen aufbereitet: Die in phosphatgepufferter, physiologischer Kochsalzlösung befindlichen Zellen wurden im Verhältnis 1:3 in destilliertem Wasser verdünnt und in einem Polytron-Gerät homogenisiert (Einstellung Nr. 7 für zwei Minuten). Kerne und Zellreste wurden durch Zentrifugieren über 10 Minuten bei 2000 U/Min. entfernt. Die überstehende Fraktion mit den Membranen wurde bei 90.000 x g über 90 Minuten zentrifugiert und das Granulum wurde in 1 ml phosphatgepufferter, physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Jede Ratte wurde intraperitoneal mit der sedimentierten, aus einem Equivalent von 60 x 10&sup6; T-Zellen erhaltenen Membranfraktion geimpft.
  • Drei Behandlungen mit Zellen oder Membranen wurden den Ratten in wöchentlichen Abständen verabreicht. Eine Woche nach der letzten Behandlung unterzog man die Ratten einem Immunitätstest mit 50 ug Myelin-Basisprotein in komplettem Freund-Adjuvans, um wie von Ben-Nun, ibidem, beschrieben, EAE zu induzieren. Man stellte klinische Paralyse und Mortalität fest.
  • In Figur 1 bedeuten die Rattengruppen wie folgt: gestreifte Spalte, ungeimpfte Ratten; diagonal gestreifte Spalte, mit bestrahlten Z1a-Zellen geimpfte Ratten; gepünktelte Spalte, mit 8-MOP Z1a-Zellen geimpfte Ratten; schwarze Spalte, mit 8-MOP Z1a-Membranen geimpfte Ratten.
  • Es ist leicht erkennbar, daß die Gamma-bestrahlten Z1a-Zellen keinen Widerstand gegen EAE bewirken konnten (das klinische Ergebnis lag bei 3,6 mit einer Mortalität von 40%). Dagegen bewirkten die mit 8-MOP-UVA behandelten ganzen Z1a-Zellen oder auch die Membrane dieser Zellen einen Widerstand gegen EAE, der sich als bedeutender Rückgang des EAE-Ergebnisses manifestierte (1,9 und 1,8 mit keiner Mortalität).
    • BEISPIEL 2
  • Zur Bestätigung der allgemeinen Wirksamkeit der Membrane von mit 8-MOP-UVA behandelten T-Zellen wurden Ratten mit Membranen des A2b-Zellklons, die mit 8-MOP-UVA behandelt waren, geimpft. Diesen Klon entdeckte man zur Impfung von Ratten gegen Arthritis adjuvans, wenn die A2b Zellen durch Glutaraldehyd oder Formaldehyd vernetzt waren.
  • Gruppen von 10 Lewis-Ratten wurden oder wurden nicht mit gemäß Beispiel 1 erhaltenen Membranen behandelt. Jede Impfkultur umfaßte aus 10&sup8; aktivierten A2b T-Zellen erhaltene Membrane. Nach drei intraperitonealen Impfungen wurden die Ratten einem Immunitätstest mit M. Tuberculosis (H37Ra) wie bei Lider et al., op.cit., beschrieben, unterzogen, um Arthritis adjuvans zu induzieren. Der Grad der klinischen Arthritis wurde beobachtet und verzeichnet.
  • Figur 2 zeigt die Ergebnisse der Impfung gegen Arthritis adjuvans unter Verwendung von Membranen aus mit 8-MOP-UVA behandelten T-Zellen. Die weißen Quadrate mit einem Punkt in der Mitte stellen die Kontrollen dar; die schwarzen Quadrate mit einem weißen Punkt in der Mitte stellen die mit A2bMB (8-MOP) geimpften Gruppen dar.
  • Es ist ersichtlich, daß die Impfung mit Membranen aus mit 8-MOP-UVA behandelten A2b-Zellen die Schwere der Arthritis bedeutend verringerte. Die erfindungsgemäß vorliegenden Zusammensetzungen wurden auch hinsichtlich ihrer Wirksamkeit zur Erleichterung der Symptome von Autoimmunkrankheiten mit ermutigenden Ergebnissen getestet.
    • BEISPIEL 3
  • Die Tabelle 1 zeigt die Wirsamkeit von mit 8-MOP-UVA behandelten T-Zellen bei der Impfung gegen autoimmune Diabetes. Nichtfettleibige Diabetesmäuse (NOD-Mäuse) entwickeln spontan einen autoimmunen insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM), der dem in menschlichen Patienten vorkommenden IDDM ähnelt. Ein Autoimmunangriff auf Pankreasinseln beginnt im Alter von ca. 4 bis 6 Wochen, und bis zu einem Alter von 7 Monaten entwickeln ca. 80 bis 90% der weiblichen NOD-Mäuse und 30 bis 40% der männlichen NOD- Mäuse die Krankheit.
  • In diesem Experiment wurden 4 Monate alten, männlichen oder weiblichen NOD-Mäusen Milzzellen entnommen und die Milzzellen (10&sup8;) wurden mit dem T-Zellen-Mitogen Konkanavalin A (Con A; 1,25 ug/ml) durch in vitro-Kultur über 48 Stunden aktiviert. Es war wahrscheinlich, daß die resultierenden Explosionen der T-Zellen die autoimmunen T- Zellen umfaßten, da diese T-Zellen bekannterweise IDDM auf junge vordiabetische NOD-Mäuse übertragen. Die T-Zellen wurden sodann genau gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 mit 8-MOP-UVA behandelt, mit der Ausnahme, daß die Membrane nicht isoliert wurden; man verwendete die ganzen behandelten Zellen.
  • Gruppen von 10 männlichen NOD-Mäusen und 12 weiblichen NOD-Mäusen wurden im Alter von 5 Wochen (dem Alter des beginnenden Krankheitsverlaufes) entweder mit physiologischer Kochsalzlösung scheingeimpft oder intraperitoneal mit 2 x 10&sup7; behandelten T-Zellen geimpft. Die Impfungen wurden monatlich über 3 Monate wiederholt und die Blutglukose der Mäuse wurde im Alter von 7 Monaten gemessen, um diejenigen zu erfassen, die IDDM entwickelten (die Blutglukose ist bei einer morgentlichen Blutprobe höher als 200 mg%).
  • Daraus ist ersichtlich, daß eine Impfung mit den mit 8-MOP-UVA behandelten T-Zellen bei den meisten MOD-Mäusen IDDM verhütete. TABELLE 1 Impfung von NOD-Mäusen gegen IDDM durch mit 8-MOP-UVA behandelten T-Zellen Mäuse Geschlecht Auftreten von IDDM im Alter von 7 Monaten scheingeimpft geimpft männlich weiblich
  • Aus dem Vorgenannten sowie aus weiteren Experimenten wird deutlich, daß die photoaktivierte Vernetzung eine äußerst wirksame chemische Vernetzungsbehandlung darstellt, die bei der Herstellung von T-Zellen und T-Zellmembranen für die Behandlung menschlicher Autoimmunkrankheiten sowie für Impfstoffe zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegen Autoimmunkrankheiten eingesetzt werden können.
  • Nachfolgend werden Beispiele für Autoimmunkrankheiten genannt, die unter Verwendung von Membranproteinen autoimmuner Zellinien behandelt werden können, wobei diese Beispiele keine Beschränkung darstellen: Menschliche Autoimmunkrankheiten Zur Aktivierung von T-Lymphozyten eingesetztes Antigen Multiple Sklerose Thyreoiditis Diabetes (Typ I) Ankylosierende Spondylitis (spezielle Typen) Arthritis rheumatica Myasthenia gravis Uveitis anterior Myelin Basisproteinextrakt Rohextract des Zentralnervensystem Thyreoglobulin Rohextract der Thyreoidea Extract der Inselzellen bestimmte Klebsiellabakterien Rohextrast aus Gelenken 65 KD Hitzeschock-Protein Acetylcholin-Rezeptor (α-Untereinheit) S-Antigen Rohextract der Retina
  • Impfstoffe gegen Autoimmunkrankheiten werden durch Einlagerung von ganzen, erfindungsgemäß behandelten T-Zellen oder deren Membranfraktionen in einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Adjuvans. Die Impfstoffe werden in Abständen von ca. zwei bis sechs Wochen, vorzugsweise monatlich über einen Zeitraum von bis zu vier Impfungen verabreicht, um ausreichenden Schutz gegen den Ausbruch der Autoimmunkrankheit, vor welcher der Patient geschützt werden soll, zu geben. Jede Impfung umfaßt ungefähr 10&sup7; - 10&sup8; Zellen oder eine equivalente Membranmenge.
  • Zusammensetzungen zur Erleichterung der Symptome von Autoimmunkrankheiten werden durch Einlagerung der wie vorstehend erhaltenen, sedimentierten und aktivierten T-Zellen oder der Membranfraktionen in einen pharmazeutisch annehmbaren Träger hergestellt.
  • Zu den Zusammensetzungen im Bereich der Erfindung gehören solche, in denen der aktive Bestandteil in einer wirksamen Menge enthalten ist, um die Symptome der behandelten Autoimmunkrankheit zu erleichtern. Die wirksamen Mengen können vom Durchschnittsfachmann leicht empirisch bestimmt werden. Im allgemeinen entsprechen die Mengen und Verabreichungsweisen jedoch der vorstehenden Beschreibung für den Impfstoff.
  • Zusätzlich zu den vernetzten T-Zellen oder deren Membranfraktionen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete, pharmazeutisch annehmbare Träger mit Grundsubstanzen und Hilfsstoffen enthalten, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu pharmazeutisch verwendbaren Präparaten erleichtern. Die Präparate, insbesondere solche, die oral verabreicht werden können und die für die bevorzugte Verabreichungsform eingesetzt werden können, wie Tabletten, Dragees und Kapseln, und auch rektal zu verabreichende Präparate wie Suppositorien, sowie geeignete Lösungen zur Verabreichung durch Injektion oder zur oralen Verabreichung enthalten vorzugsweise von ca. 0,1 bis 99 Gewichtsprozent, und vorzugsweise von ca. 25 bis 85 Gewichtsprozent, des aktiven Bestandteils zusammen mit der Grundsubstanz.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate werden in einer an sich bekannten Weise hergestellt, zum Beispiel durch herkömmliche Mischungs-, Granulierungs-, Dragierungs-, Lösungs- oder Lyophilisierungsverfahren. Somit kann man pharmazeutische Präparate für den oralen Gebrauch durch Verbindung der aktiven Mischungen mit festen Grundsubstanzen, wahlweise durch Mahlen einer entstehenden Mischung, und Verarbeiten der Granulatmischung nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, falls gewünscht oder erforderlich, erhalten, um Tabletten oder Drageekerne herzustellen.
  • Geeignete Grundsubstanzen sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, z.B. Laktose, Sukrose, Mannitol oder Sorbitol, Zellulosepräparate und/oder Kalziumphosphate wie Trikalziumphosphat oder Kalziumhydrogenphosphat, sowie Bindemittel wie Stärkepaste unter Verwendung von z.B. Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Gummitragakantha, Methylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Natriumkarboxylmethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon. Wenn gewünscht können Zersetzungsmittel wie die vorgenannten Stärken und deren Derivate sowie Karboxylmethylstärke, vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder deren Salz, wie z.B. Natriumalginat, beigefügt werden. Zu den Hilfsstoffen gehören Fließregulatoren und Schmiermittel wie Kieselerde, Talk, Stearinsäure oder deren Salze, wie z.B. Magnesium- oder Kalziumstearat, und/oder Polyäthylenglykol. Dragéekerne können mit geeigneten Überzügen versehen werden, die auf Wunsch gegen Magensaft resistent sind. Hierzu können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die wahlweise Gummiarabikum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Polyäthylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmischungen enthalten. Zur Herstellung von magensaftresistenten Überzügen werden Lösungen von geeigneten Zellulosepräparaten wie Azetyl-Zellulosephtalat oder Hydroxypropylmethyl-Zellulosephtalat verwendet. Den Tabletten oder Dragéeüberzügen können Farbstoffe oder Pigmente beigefügt werden, z.B. zur Identifizierung oder zur Kennzeichnung verschiedener Kombinationen von Dosierungen der aktiven Verbindungen.
  • Weitere pharmazeutische Präparate zum oralen Gebrauch umfassen druckfeste Kapseln aus Gelatine sowie weiche geschlossene Kapseln aus Gelatine und ein Plastiziermittel wie Glyzerol oder Sorbitol. Die druckfesten Kapseln können die aktiven Verbindungen in Form von Körnchen enthalten, die mit Füllstoffen wie z.B. Laktose, Bindemitteln wie z.B. Stärken und/oder Schmiermitteln wie z.B. Talk oder Magnesiumstearat sowie wahlweise mit Stabilisatoren gemischt werden. In weichen Kapseln sind die aktiven Verbindungen vorzugsweise in geeigneten Flüssigkeiten wie z.B. fetten Ölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyäthylenglykolen aufgelöst oder suspendiert. Zusätzlich können Stabilisatoren beigefügt werden.
  • Zu den rektal zu verabreichenden, pharmazeutischen Präparaten gehören Suppositorien, die aus einer Verbindung der aktiven Mischungen mit einer Suppositorienbasis bestehen. Geeignete Suppositorienbasen stellen z.B. natürliche oder synthetische Triglyzeride, Paraffinkohlenwasserstoffe, Polyäthylenglykole oder höhere Alkanole dar. Außerdem können auch Rektalkapseln aus Gelatine verwendet werden, die aus einer Verbindung der aktiven Mischungen mit einem geeigneten Grundstoff bestehen. Zu den geeigneten Grundstoffen gehören zum Beispiel flüssige Triglyzeride, Polyäthylenglykole und Paraffinkohlenwasserstoffe.
  • Geeignete Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wäßrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen verabreicht werden. Zu den geeigneten, lipophilen Lösungs- oder Bindemitteln gehören Fettöle wie Sesamöl oder synthetische, fette Säureester wie Äthyloleat oder Triglyzeride. Wäßrige Injektionssuspensionen können Stoffe enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie z.B. Natriumkarboxylmethyl-Zellulose, Sorbitol und/oder Dextran. Die Suspension kann fakultativ Stabilisatoren enthalten.

Claims (12)

1. Präparat mit entweder (a) für eine Autoimmunkrankheit spezifischen T-Lymphozytzellen, die behandelt, d.h. aktiviert wurden, indem sie einem für die Autoimmunkrankheit spezifischen Antigen oder einem Mitogen ausgesetzt wurden, das durch die T-Lymphozytzellen eine Immunantwort auslösen kann, oder mit (b) von denselben, behandelten T- Lymphozytzellen getrennten Zellmembranen, dadurch gekennzeichnet, daß die T-Lymphozytzellen weiterbehandelt wurden, indem sie erstens mit photoaktivierbarem, für einen entsprechenden Oberflächenrezeptor auf der Zellmembran selektivem Psoralen in Berührung gebracht wurden, wobei das photoaktivierbare Psoralen außerdem in der Lage ist, bei einer Photoaktivierung eine Vernetzung wahlweise zwischen den Rezeptoren der Zellen hervorzurufen, und indem zweitens das Vernetzungspsoralen photoaktiviert wurde.
2. Präparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das photoaktivierbare Vernetzungspsoralen aus Psoralen, 8-Methoxypsoralen, 4,5',8'-Trimethylpsoralen, 4',5'- Dihydropsoralen, 3-Karbethoxypsoralen, 4',5'-Dihydro-3- Karbethoxypsoralen, 5-Methoxypsoralen, 4'-(Hydroxymethyl)- 4',5',8-Trimethylpsoralen und Aminomethyltrioxypsoralen ausgewählt wird.
3. Präparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem photoaktivierbaren Vernetzungspsoralen um 8-Methoxypsoralen handelt.
4. Präparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus ganzen, behandelten T-Lymphozytzellen besteht.
5. Präparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus den von den behandelten T- Lymphozytzellen getrennten Zellmembranen besteht.
-6. Verfahren zur Herstellung von vernetzten, aktivierten T-Lymphozyten, bei dem in einem Puffer für eine Autoimmunkrankheit spezifische T-Lymphozytzellen suspendiert werden, die dadurch aktiviert wurden, daß sie einem für die Autoimmunkrankheit spezifischen Antigen oder einem Mitogen ausgesetzt wurden, das durch die T-Lymphozytzellen eine Immunantwort auslösen kann, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin den ersten Verfahrensschritt umfaßt, daß die suspendierten Zellen mit photoaktivierbarem, für einen entsprechenden Oberflächenrezeptor auf der Zellmembran selektivein Psoralen in Berührung gebracht werden, wobei das photoaktivierbare Psoralen außerdem in der Lage ist, bei einer Photoaktivierung eine Vernetzung wahlweise zwischen den Rezeptoren der Zellen hervorzurufen, und als zweiten Verfahrensschritt die Photoaktivierung des Vernetzungspsoralen mit Licht umfaßt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das photoaktivierbare Vernetzungspsoralen aus 8- Methoxypsoralen besteht und es sich bei dem photoaktivierenden Licht um UVA handelt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Verfahrensschritt der Suspendierung ca. 5- 10x10&sup6;/ml des photoaktivierbaren Vernetzungspsoralenmittels suspendiert werden und daß bei dem Verfahrensschritt der Photoaktivierung die Zellen einem Licht von geeigneter Wellenlänge ausgesetzt werden, um eine Vernetzung des Psoralen über einen Zeitraum von 5 bis 60 Minuten herbeizuführen.
9. Arzneizusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß diese als Wirkstoff ein Präparat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
10. Arzneizusammensetzung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß diese eine wirksame Menge des Präparates zur Vorbeugung oder Behandlung einer Autoimmunkrankheit enthält, einschließlich einer Autoimmunkrankheit aus der Gruppe von multiple Sklerose, Thyroiditis, Diabetes Typ I, ankylosierende Spondylitis, Arthritis rheumatica, Myasthenia gravis und Uveitis anterior.
11. Arzneizusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Vakzinationszusammensetzung handelt.
12. Arzneizusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine pharmazeutische Zusammensetzung handelt und daß diese einen pharmazeutisch zulässigen Trägerstoff für das Präparat umfaßt.
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