DE19740357A1

DE19740357A1 - Phosphoryliertes Zuckermolekül

Info

Publication number: DE19740357A1
Application number: DE19740357A
Authority: DE
Inventors: Martin Wilhelm; Markus Dr Herderich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-09-13
Filing date: 1997-09-13
Publication date: 1999-03-18

Description

Die Erfindung betrifft ein bisher unbekanntes phos phoryliertes Zuckermolekül, ein Verfahren zu seiner Gewinnung aus Bakterienkulturen sowie seine Verwen dung zur Stimulation von Immunzellen und zur Her stellung eines Arzneimittels.

T-Lymphozyten sind zu den Leukozyten zählende Blut zellen, die in den lymphatischen Organen wie Milz und Lymphknoten, aber auch im Blut und im Gewebe vorkommen und wesentliche Funktionen im Rahmen des Immunsystems von Mensch und Tier besitzen. Insbe sondere die Untergruppe der T-Lymphozyten mit dem gamma/delta T-Zellrezeptor (T_{gamma delta}-Lymphozy ten) spielt eine Rolle bei der Abwehr von Infekti onserregern, beispielsweise von Mycobakterien wie den Erregern von Tuberkolose und Lepra, oder Strep tokokken, aber auch bei Tumorerkrankungen, Leukämie und Aids. T_{gamma delta}-Lympozyten sammeln sich an den Infektionsherden an und sind imstande, die in fizierten oder krebsbefallenen Zellen zu erkennen und abzutöten. Darüberhinaus scheinen sie auch bei Autoimmunerkrankungen wie Rheumatismus oder Mul tipler Sklerose, die auf eine Überreaktion des Im munsystems zurückgeführt werden, beteiligt zu sein.

Im Blut von Erwachsenen gehört die deutliche Mehr heit (ca. 80%) der T_{gamma delta}-Lympozyten zu der Untergruppe T_{gamma9 delta2}, von der bekannt ist, daß sie durch eine bisher unbekannte Substanz, ein Antigen, das bei bestimmten weitverbreiteten Mikro organismen wie den E. coli-Bakterien vorkommt, sti muliert wird. Der Haupteffekt bei dieser Stimula tion ist die Induktion von Zellteilung und damit die Vermehrung der T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten. Dar überhinaus beeinflußt die Stimulierung auch ihre Zytotoxizität, d. h. ihre Fähigkeit, andere Zellen, insbesondere infizierte und Tumorzellen, abzutöten. Hier führt die Stimulierung einerseits zu einer Verbreiterung des Spektrums der angegriffenen Zel len, also zu einer Erhöhung der Anzahl der betrof fenen Zelltypen, andererseits wird auch die Effizi enz beim Abtöten schädlicher Zellen gesteigert. Schließlich regt die Stimulation die T_{gamma9
delta2}-Lympozyten auch zur Ausschüttung von spe ziellen Botenstoffen, den Lymphokinen, an, zu denen beispielsweise das Interferon gamma gehört, daß wiederum die Makrophagen aktiviert, oder auch das Interleukin 2 und 4, die ihrerseits wieder die B- und T-Lymphozyten stimulieren. Insgesamt führt die Stimulation der T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten also zu einer wesentlichen Steigerung der Immunantwort des menschlichen Organismus und damit seiner Fähigkeit eingedrungene Krankheitserreger abzuwehren und Tumor zellen zu bekämpfen. Allerdings kann eine übermä ßige Stimulation der T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten zu einer Anergie führen, d. h. für eine gewisse Zeit spanne besteht Unempfindlichkeit gegenüber Antige nen.

Aufgabe der Erfindung ist die Aufklärung der Struk tur dieses Antigens, dessen Gewinnung sowie Verwen dung.

Diese bisher unbekannte Substanz, die als Antigen T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten stimuliert, konnte aus E. coli-Bakterien isoliert und ihre Struktur aufge klärt werden.

Bei der erfindungsgemäßen Substanz handelt es sich um ein phosphoryliertes Zuckermolekül mit einer Mo lekülstruktur gemäß der Strukturformel, die in An spruch 1 angegeben ist, wobei R₁ und R₂ Restgruppen bezeichnen.

Bei der Restgruppe R₁ des erfindungsgemäßen Molekü les kann es sich insbesondere um eine Carboxy- Gruppe (-COOH) handeln. In diesem Fall ist das er findungsgemäße Molekül eine phosphorylierte Mannuronsäure.

Die Restgruppe R₂ kann insbesondere auch eine Ace tamido-Gruppe (-NH-CO-CH3) sein. In Verbindung mit Anspruch 2 erhält man dadurch ein erfindungsgemäßes Molekül, daß 2-Deoxy-2-Acetamido-Acetylamino-β mannuronsäure-1-phosphat ist.

Zur Gewinnung des erfindungsgemäßen phosphorylier ten Zuckermoleküls schlägt die in der Erfindung an gegebene Lehre das folgende Verfahren vor:
Zunächst muß eine Kultur von E.coli-Bakterien in Bioreaktoren gezüchtet werden. Anschließend wird die Bakterienmasse aus dem Nährmedium abgetrennt und die Zellmembranen der Bakterien aufgebrochen, was auf mechanischem Wege, beispielsweise in einem Mörser oder einer Presse, erfolgen kann. Schließ lich wird das erfindungsgemäße Zuckermolekül mit chromatographischen Methoden isoliert und gerei nigt. Hierfür kommen beispielsweise die Ionenaus tauschchromatographie oder eine chromatographische Trennung nach Molekülgrößen in Frage.

Als vorteilhafte Verwendungsmöglichkeit der erfin dungsgeinäßen phosphorylierten Zuckermoleküle wird die Stimulierung von T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten vorgeschlagen, wie sie durch Zugabe dieser Zucker moleküle zu den Lymphozyten in vitro erfolgen kann. Auf diese Weise kann man einerseits eine drastische Vermehrung der T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten erzielen, man regt sie aber auch zur Produktion von Lymphoki nen wie dem Interferon gamma an, und schließlich lassen sich mit dieser Methode auch T_{gamma9 delta2}-Lympho zyten mit stark erhöhter Zytotoxizität gewin nen.

Als vorteilhafte Verwendungsmöglichkeit der erfin dungsgemäßen phosphorylierten Zuckermoleküle schlägt die Erfindung vor, die Stimulierung der T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten durch diese Moleküle, insbesondere ihre Vermehrung und gesteigerte Zyto toxizität zur Stimulation der Immunabwehr des men schlichen Organismus sowohl prophylaktisch wie auch zu therapeutischen Zwecken auszunutzen und die Zuc kermoleküle und/oder mit diesen stimulierte T_{gamma9
delta2}-Lymphozyten zu einer Arzneiform zu verarbei ten, die beispielsweise für eine parentarale Appli kation, insbesondere für eine Injektion in den Blutkreislauf geeignet ist. Ein bevorzugtes Ein satzgebiet eines derartigen erfindungsgemäßen Arz neimittels liegt auf dem Gebiet der Tumorbekämp fung, wozu die von dem erfindungsgemäßen Zuckermo lekül in vitro, insbesondere aber bei Applikation der Zuckermoleküle selbst invivo stimulierten T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten aufgrund ihrer starken Vermehrung und erhöhten Zytotoxizität hervorragend geeignet sind. Bei der Zerstörung von Lymphomzellen in vitro zeigten die stimulierten T_{gamma9 delta2}-Lympho zyten eine hohe Effiziens.

Ein weiteres mögliches Einsatzgebiet des aus den erfindungsgemäßen Zuckermolekülen und/oder mit die sen stimulierten T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten gewinn baren Arzneimittels liegt in der Stimulation des Immunsystems bei bakteriellen Infektionskrankhei ten, was insbesondere bei durch Mycobakterien aus gelösten Krankheiten wie Tuberkolose oder Lepra, bei deren Bekämpfung durch das Immunsystem T_{gamma
delta}-Lymphozyten bekanntermaßen eine Rolle spie len, einen aussichtsreichen therapeutischen Ansatz darstellt.

Ein anderes Einsatzgebiet ist die gezielte Übersti mulation der T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten des Im munsystems zur Auslösung einer Anergie, also zur gezielten Dämpfung ihrer Reaktionsfähigkeit auf An tigene. Diese Verwendung des erfindungsgemäßen Arz neimittels ist für die Behandlung von Autoimmun krankheiten wie Rheumatismus oder Multipler Skle rose von Interesse, die die Folge einer Überreak tion des Immunsystems sind. Durch eine Dämpfung der Immunreaktionen ist hier eine Besserung der Krank heit zu erwarten.

Schließlich kann ein aus dem erfindungsgemäßen Zuc kermolekül gewonnenes Arzneimittel auch zur Thera pie von Immundefekten, also von Krankheiten wie Ataxia teleangiectatica oder common variable immu nodeficiency, die mit einer Unterfunktion des Im munsystems verbunden sind, eingesetzt werden. Auch hier sind durch eine Stimulation der T_{gamma9 delta2}-Lympho zyten des Immunsystems durch das Arzneimittel signifikante therapeutische Erfolge zu erwarten.

Für alle erfindungsgemäßen Arzeneimittel empfiehlt die Erfindung Arzneiformen, die für eine paren terale Applikation wie beispielsweise die Injektion in den Blutkreislauf geeignet ist. Durch die Umge hung des Verdauungstraktes läßt sich sicherstellen, daß die als Wirkstoff dienenden Zuckermoleküle oder T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten unbeschadet den Blutkreis lauf erreichen.

Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des er findungsgemäßen phosphorylierten Zuckermoleküls sind dem nachfolgenden Beschreibungsteil zu entneh men, in dem sie anhand von Abbildungen näher erläu tert sind. Es zeigen:

Fig. 1 die Resultate einer ¹³C-NMR-spektroskopi schen Untersuchung des erfindungsgemäßen Zuckermo leküls,

Fig. 2 demonstriert die spezifische Stimulation von T_{gamma delta}-Lymphozyten,

Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit der Stimulation von der Konzentration des erfindungsgemäßen Zuckermole küls,

Fig. 4 veranschaulicht den Einfluß der Zugabe von Interleukin 2 zu stimulierten und unstimulierten T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten,

Fig. 5 gibt einen Überblick über die Stimulation von T-Lymphozyten mit und ohne zusätzliche Zugabe von CD5-positiven Lymphom B-Zellen.

Links in Fig. 1 sind linksseitig die Ergebnisse einer ¹³C-NMR-spektroskopischen Untersuchung zur Strukturaufklärung des aus E. coli-Bakterien iso lierten erfindungsgemäßen Zuckermoleküls zu sehen. Als Lösungsmittel für die untersuchte Substanz wurde D₂O verwendet, die Betriebsfrequenz des Spek trometers lag bei 100 MHz. In der rechten Hälfte der Abbildung finden sich entsprechende Ergebnisse für die ¹H-spektroskopische Untersuchung. Für die einzelnen Resonanzfrequenzen ist jeweils die chemi sche Verschiebung in ppm und die Zuordnung zu einem C-Atom bzw. H-Atom des Moleküls angegeben. Durch Vergleich und Anwendung massenspektroskopischer Un tersuchungen ergibt sich die in der Abbildung links unten dargestellte Strukturformel des erfindungsge mäßen Moleküls. Es handelt sich um 2-Deoxy-2-Aceta mido-β-mannuronsäure-1-phosphat, chemisch identisch mit 2-Deoxy-2-N-Acetylamino-β-mannuronsäure-1-phos phat.

In Fig. 2 ist der zeitliche Verlauf der Vermehrung von T_{gamma delta}- und T_{alpha beta}-Lymphozyten mit und ohne Stimulation durch die erfindungsgemäßen Moleküle zu sehen, wobei aus Kostengründen zur Sti mulation die ungereinigte Substanz (aufgebrochene Bakterienmasse) verwendet wurde. Man erkennt einen deutlichen Anstieg der Zellenzahl der mit der er findungsgemäßen Substanz versetzten T_{gamma dela}-Lympho zyten (eine Zellteilung in 24 Stunden, schwarze Quadrate), während die Zellenzahl der un behandelten T_{gamma delta}-Lymphozyten (weiße Qua drate) im gleichen Zeitraum nur leicht zunimmt. Dieser Effekt demonstriert die drastische Wirkung der Stimulation der Untergruppe T_{gamma9 delta2} durch die in der Bakterienmasse enthaltenen erfin dungsgemäßen Zuckermoleküle. Die beiden anderen Kurven (schwarze und weiße Rauten) zeigen das Ver halten von behandelten und unbehandelten T_{alpha
beta}-Lymphozyten, die sich durch die erfindungsge mäße Substanz offenbar nicht stimulieren lassen.

In Fig. 3 ist die aus ihrer Vermehrung bestimmte relative Stimulation der T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten in Abhängigkeit von der Konzentration der erfin dungsgemäßen Zuckermoleküle aufgetragen. Man er kennt, daß bereits bei Konzentrationen von einigen Nanomol pro Liter eine signifikante Stimulation auftritt, die im Konzentrationsbereich von etwa 1 Mikromol pro Liter eine Sättigung erreicht. Die Hälfte der maximalen Stimulation wird bereits bei einer Konzentration von etwa 5 Nanomol pro Liter erreicht.

Im oberen Teil von Abb. 4 ist der prozentuale Anteil von T_{gamma delta} unter den gesamten, im Blut enthaltenen B- und T-Lymphozyten (PBL) mit (schwarze Balken) und ohne (helle Balken) Zusatz von aufgebrochener Bakterienmasse, die das erfin dungsgemäße Zuckermolekül enthält, dargestellt, wo bei von links nach rechts von null beginnend zuneh mende Mengen an Interleukin 2 zugesetzt wurden. Der untere Teil zeigt die absolute Zahl der T_{gamma
delta}-Lymphozyten bei gleichen Untersuchungsbedin gungen. Links in beiden Teilabbildungen ist durch Vergleich von hellen und dunklen Balken wieder die Wirkung der Stimulation durch die in der Bakterien masse enthaltene erfindungsgemäße Substanz zu er kennen. Zusätzlich zeigt der untere Teil der Abbil dung eine deutliche Zunahme der stimulierten T_{gamma
delta}-Lymphozyten mit wachsender Interleukin 2- Zugabe. Der obere Teil von Abb. 4 demon striert, daß die Interleukin 2-Zugabe keinen Ein fluß auf die relativen Anteile der T_{gamma delta}-Lympho zyten besitzt.

Abb. 5 zeigt schließlich in Teil a) reine T-Lymphozyten, in Teil b) mit aufgebrochener Bakteri enmasse stimulierte T-Lymphozyten, in Teil c) mit CD5-positiven B-Lymphozyten versetzte T-Lymphozyten und in Teil d) schließlich T-Lymphozyten, die mit Bakterienmasse stimuliert und zusätzlich mit CD5-positiven B-Lymphozyten versetzt worden sind. In den mittleren Teilen der einzelnen Abbildungen sind jeweils die T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten zu sehen. Man erkennt, daß die Stimulierung mit Bakterien masse, die das erfindungsgemäße Zuckermolekül ent hält, zu einer deutlichen Zunahme der T_{gamma9
delta2}-Lymphozyten führt, und daß die zusätzliche Zugabe von CD5-positiven B-Lymphozyten die Zahl der T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten noch einmal drastisch steigert.

Claims

1. Phosphoryliertes Zuckermolekül, dadurch gekennzeichnet, daß seine Strukturformel
ist, wobei R₁ und R₂ Restgruppen bezeichnen.

2. Zuckermolekül nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß R₁ eine Carboxy-Gruppe ist.

3. Zuckermolekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ eine Acetamido-Gruppe ist.

4. Verfahren zur Gewinnung des Zuckermoleküls nach einem der vorhergehenden Ansprüche aus Bakterien kulturen, dadurch gekennzeichnet, daß

- E. coli-Bakterien in Bioreaktoren gezüchtet wer den,
- die Bakterienmasse abgetrennt wird,
- die Zellmembranen beispielsweise in einem Mörser oder einer Presse mechanisch aufgebrochen werden und
- das Zuckermolekül chromatographisch, zum Beispiel durch Ionenaustauschchromotographie oder chromoto graphische Trennung nach Molekülgrößen isoliert wird.

5. Verwendung des Zuckermoleküls nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung stimulier ter T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten, dadurch gekennzeich net, daß die Zuckermoleküle den T_{gamma9 delta2}-Lym phozyten in vitro zugesetzt werden.

6. Verwendung des Zuckermoleküls nach einem der An sprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Tumoren, beispielsweise Lympho men, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuckermoleküle und/oder mit diesen stimulierte T_{gamma9 delta2}-Lym phozyten zu einer Arzneiform verarbeitet werden.

7. Verwendung des Zuckermoleküls nach einem der An sprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionskrankheiten wie bei spielsweise Tuberkulose oder Lepra, dadurch gekenn zeichnet, daß die Zuckermoleküle und/oder mit die sen stimulierte T_{gamma9 delta2}-Lymphozyten zu einer Arzneiform verarbeitet werden.

8. Verwendung des Zuckermoleküls nach einem der An sprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie Rheu matismus oder Multipler Sklerose, dadurch gekenn zeichnet, daß die Zuckermoleküle zu einer Arznei form verarbeitet werden.

9. Verwendung des Zuckermoleküls nach einem der An sprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Immundefekten wie z. B. Ataxia teleangiectatica oder common variable immunodefi ciency, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuckermole küle zu einer Arzneiform verarbeitet werden.

10. Herstellung eines Arzneimittels nach einer der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Arzneiform zur parenteralen Applikation wie der In jektion in den Blutkreislauf geeignet ist.