DE2639410C2 - Polypeptid VI-7501 mit Antitumorwirkung - Google Patents

Description

(1) fraktionierte Ausfallung ,it Alkohol oder Aceton;

(2) fraktionierte Ausf&'ung mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Natriumchlorid, Zinkchlorid, Zinksulfat;

(3) Adsorption mit Kaolin, Ze iith, Bentonlt, Aluminiumoxid, saurem Ton; (4) Dialyse oder Ultrafiltration mit einer semlpermeablen Membran;

(5) Ausfällung mit Zinkchlorid und Extraktion mit einer wäßrigen Dinatriumhydrogenphosphatlösung;

(6) Gelfiltration durch ein Polyacrylamid-, Dextran-, Agarosegel;

(7) Chromatographie mit einem Ionenaustauscher;

(8) kontinuierliche Papierelektrophorese; (9) Scheibenelektrophorese;

(10) Isoelektrischer Punkt-Elektrophorese;

wobei eine, zwei oder mehrere dieser Methoden angewendet werden können.

Aus den Fermentationsproduktion von Stämmen der Gattungen Streptomycins und Actinomyces sind schon wertvolle Substanzen erhalten worden. So können z. B. Trlchomycln und Soedomycin aus den Fermentatlons-

'" produkten von Streptomyces hachijoensis erhalten werden.

Trlchomycln, das In der JP-AS 2 94 200/1954 beschrieben wird. Ist eine Verbindung, die weder Stickstoff, Schwefel noch Halogen enthält und die In Äther, Äthylacetat und Amylalkohol unlöslich, In Wasser fast unlöslich und bis zu einem gewissen Ausmaß In Butanol, Methanol, Äthanol und Aceton löslich Ist. Gegenüber Nlnhydrin zeigt sie eine negative Reaktion.

>^s Das in der JP-AS 49 42 560/1974 beschriebene Soedomycin kann durch folgendes Verfahren hergestellt werden. Eine Kulturlösung von Streptomyces hachijoensis wird von unlöslichen Produkten, z. B. von Zellkörpern und dgl., befreit. Der erhaltene Überstand wird mit einer Zlnkchlorldlösung behandelt, wodurch ein Niederschlag gebildet wird. Zu dem so erhaltenen Niederschlag wird eine Dlnatrlumhydiogenphosphailösung gegeben, um den pH-Wert der Lösung aus 7,0 bis 9,4 einzustellen und die gewünschte Substanz In die Wasser-

^Wl schicht zu extrahieren. Der Extrakt wird mit Methanol, Äthanol oder Aceton versetzt, um einen Niederschlag zu bilden. Dieser Niederschlag wird In destilliertem Wasser aufgelöst, sterilisiert und gefriergetrocknet, wodurch Soedomycin erhalten wird. Soedomycin hat die folgenden physlkochemlschen Eigenschaften:

Elementaranalyse: C 33.81% H 6,33% O 59,86% μ Molekulargewicht: 1200

IR-Spektrum: 1030, 1655. 2970 und 3450 cm-'. Soedomvc.n wird beim Erhitzen auf 220° C braun und wandelt seine Farbe bei dieser Temperatur unter

ΐ Schrumpfen nach Schwarz. Selbst bei 300° C schmilzt es nicht. Soedomycin zeigt gegenüber Ninhydrin eine

b negative Reaktion.

H Durch die Erfindung wird nun eine neue Substanz zur Verfügung gestellt, die sich von den obengenannten

jj Substanzen unterscheidet.

18 Der Patentanspruch gibt auch an, wie die erfindungsgemäße Substanz herstellbar ist. Dabei wird eine

y bestimmte Kultur der Gattung Streptomyces in einem Nährmedium von 28 bis 29° C 24 bis 60 Stunden lang

hi gezüchtet und sodann die Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1,5 χ 10⁴ bis 3,5 χ 10* durch

ψ Gelfiltration von der Züchtungsflüssigkeit, den Zellwänden und den Zellkörpern abgetrennt (vgl. aber auch die

% anderen. Im Patentanspruch aufgezeigten Möglichkeiten). Die Substanz ist in Wasser leicht löslich und in

fä Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Benzol und Chloroform fast unlöslich. Sie zeigt eine positive Reaktion

β gegenüber Ninhydrin oder Fluorescamin und eine negative Reaktion gegenüber Anthron.

ψ Für die erfindungsgemäße Kultivierung können die allgemeinen, für die Kultivierung von Actinomycetes

fj üblichen Techniken angewendet werden. Als Stickstoffquellen können Peptone, Fleischextrakt, Maisqueliwasser,

κ Ammoniumsulfat und dgl. verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen können Glucose, Stärke, Lactose,

fe Maltose, Melassen und dgl. verwendet werden. Als andere Nährstoffe können anorganische Salze wie Natrium- ^l>

!;; chlorid, Calciumphosphat, Magnesiumchlorid etc. und Hilfsmittel wie Vitamin Bi, Aminosäuren etc. erforderli-

% chenfalls dem Medium zugesetzt werden. Die Fermentationstemperatur wird auf 28 bis 29° C eingestellt werden.

Vi Der Anfangs-pH-Wert des Mediums kann geeigneterweise auf 5 bis 7, vorzugsweise auf neutral, eingestellt

|| werden. Die Fermentation wird in einem flüssigen Medium, das die obengenannten Nährstoffe enthält, als

*i Schüttelfermentation oder als Belüftungs- und Durchbewegungsfermentation durchgeführt. Es ;t vorteilhaft, die

i^. Fermentation durch Belüftung-Durchbewegung vorzunehmen.

$f Der Verlauf der Fermentation eines Stammes der Gattung Streptomyces, der das erfindungsgemäße VI-7501

(S liefert, wurde verfolgt. 24 Stunden nach item Beginn tritt eine Antitumoraktivität auf, die ungefähr nach 48

i| Stunden ihr Maximum erreicht und sodann wieder abnimmt. Wenn die Aktivität das Maximum erreicht, dann

H wird die Fermentation abgebrochen und das erfindungsgemäße VT-7501, das in dem flüssigen Medium und auch

I^ in den Zellkörpern (mit Einschluß der Zellwände) enthalten ist, wird aus den Fermentationsprodukten erhalten.

Jf Es wurde eine Fermentation unter Belüften und Durchbewegen bzw. Rühren durchgeführt, wobei z. B. die

P folgenden Medien verwendet wurden: Medium A, bei dem 10 g Glucose, 5 g Fleischextrakt, 5 g Pepton und 5 g

f> Kaliumchlorid In 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst worden waren; Medium B, bei dem 2&g Glucose, 5 g

; ■: Ammoniumsulfat, 2,5 g Hefeextrakt, 0,2 g Dikaliumhydrogenphosphat, 4 g Kaliumchlorid und 8 g Calciumcar- ^J0

jfi bonat in 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst worden waren; und Medium C, bei dem 10 g Glucose, 5 g PoIy-

H pepton, 3 g Hefeextrakt und 3 g Malzextrakt in 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst worden waren. In jedem

■: Falle erschien 24 Stunden nach Induzierung der Fermentation eine Antitumoraktivität, die nach 48 Stunden

ihren Maximalwert erreichte.

^;.·· Als Stämme der Gattung Streptomyces, die für die erfindungsgemäße Fermentation verwendet werden, sind

zu nennen: Streptomyces griseus DSM 2010, Streptomyces hachljoensis DSM 2011, Streptomyces colllnus DSM 2012, Streptomyces llncolnensls DSM 2013, Streptomyces lavendulae DSM 2014 und Streptomyces xanthochromogenus DSM 2015. Das erfindungsgemäße VI-7501 1st eine Substanz, die in den Fermentationsprodukte.; der oben gerannten Mikroorganismen gefunden wurde. Es hat ein Molekulargewicht von 1,5 χ 10⁴ bis 3,5 χ ΙΟ⁴ und kann aufgrund seiner physikochemischen Eigenschaften als Polypeptid angesehen werden. ⁴⁽⁾

Das VI-7501 kann aus den Fermentationsprodukten isoliert werden. Nach der Entfernung der Zellkörper und der anderen unlöslichen Substanzen aus den Produkten wird die gewünschte Substanz nach den folgenden Methoden gereinigt:

(1) fraktionierte Ausfällung ml! einem organischen Lösungsmittel wie Alkohol, Aceton etc.;

(2) fraktionierte Ausfällung mit einem Ausfällungsmittel wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat. Natriumchlorid, Zinkchlorid, Zinksulfat etc.;

(3) Adsorption mit einem Adsorptionsmittel wie Kaolin, Zeolith, Bentonlt. Aluminiumoxid, saurem Ton etc.;

(4) Dialyse oder Uil'aflltratlon mit einer semipcrmeablen Membran;

(5) Ausfällung mit Zinkchlorid und Extraktion mit einer wäßrigen Dinatriumhydrogenphosphatlösung;

(6) G=Ifiltration durch ein Polyacrylamid-, Dextran-, Agarosegel etc.;

(7) Chromatographie mit einem Ionenaustauscher wie DEAE-Cellulose etc.;

(8) kontinuierliche Papierelektrophorese:

(9) Scheibeneiektrophorese;

(10) isoelcktrlscher Punkt-Elektrophorese. ^

Diese Methoden können selbst dann, wenn sie einzeln angewendet werden, wirksam für den oben angegebenen Zweck eingesetzt werden. Um den Reinigungsgrad zu erhöhen, können vorzugsweise zwei oder mehrere dieser Methoden kombiniert werden.

Um das VI-7501 aus den Zellwänden oder den Zellkörpern herauszunehmen, werden die Zellkörper von dem ^fl" Fermentationsgemisch abgetrennt und mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach dem Waschen werden die Zellkörper zerkleinert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Alle Waschwässer werden kombiniert und durch eine der obengenannten Methoden (1) bis (10) oder eine Kombination davon behandelt. Auf diese Welse kann das auf bzw. In der Zellwand und in dem Zellkörper enthaltene VI-7501 erhalten werden.

Die Mengen von VI-7501, die auf bzw. in den Zellwänden und in den Zellkörpern enthalten sind, sind etwa ''< bis % derjenigen ^ hngen. die In der Fermentationsflüssigkeit vorhanden sind.

Unter den obengenannten Methoden werden zum Erhalt von VI-7501 die folgenden Methoden besonders

(a) Die Fermentatlonsflüsslgkeit oder die Waschwässer werden einer Gelfiltration unterworfen, um eine l-'niktlon mit einem Molekulargewicht von 1.5 χ 10⁴ bis 3,5 χ 10' zu erhallen.

(b) Das obengenannte Ausffillungsmlitel wird zu der Fermentailonsflüsslgkelt oder zu den Waschwüsscrn gegeben. Das so ausgefällte VI-75OI wird In Wasser aufgenommen, und die wäßrige Lösung wird sodann einer

> Gelfiltration unterworfen, um eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 1,5 χ ΙΟ⁴ bis 3,5 χ 10' /u

erhalten.

(c) Nach der Desorption von auf dem obengenannten Adsorptionsmittel adsorbiertem Vl-7501 wird die Vl-7501 enthaltende Lösung einer Gelfiltration unterworfen, um eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 1,5 χ 10' bis 3.5 χ ΙΟ⁴ zu erhalten.

Die Gelflltratlonsmethode Ist einfach einsetzbar, und sie liefert VI-7501 mit konstanten Eigenschaften und in hohen Ausbeuten aus den Fermentationsprodukten.

Das VI-7501 Inhibiert die Aktivität der Bernstelnsäure-Dehydrogenase In der Tumorzelle, wobei diese Inhlblerungsaktlvltät mit seiner Antltumoraktlvltät In Beziehung steht. So wird die Bernstelnsäure-Dehydrogenasci> Inhibierung (nachstehend als BDI abgekürzt) als Anzeichen für die Antltumoraktivltat der erfindungsgemäßen Substanz verwendet.

BDI Ist eine Wirkung, die die Aktivität der Bernstelnsäure-Dehydrogenase In der lebenden Zelle Inhibiert. Die Bernstelnsäure-Dehydrogenase wandelt In einer lebenden Zelle Trlphenylteirazollumchlorld in Formn/an um. BDi kann quantitativ nach einer Methode bestimmt werden, bei der man die obige Umwandlung In Gegen- -' wart von VI-7501 unter Verwendung von Tumorzellen und Messung der gebildeten Formazan-Mengen vornimmt. Diese Methode wird zur Erfassung des Einflusses eines Arzneimittels auf den Stoffwechsel einer Zelle und als Bewertungsmethode für die Antltumoraktlvltät verwendet.

VI-7501 kann unter Verwendung der BDI-Wirkung wie folgt spezifiziert werden. Zu der Fermentatlonsflüsslgkelt eines Stammes der Gattung Streptomyccs wird Ammoniumsulfat gegeben, um einen Niederschlag ausmsal- ^:s zen. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und In einer Dlnatrlumhydrogenphosphatlösung aufgelöst. Diese Lösung wird entsalzt und gefriergetrocknet, wodurch ein leicht braunes Pulver (das nachstehend als VI-7500 bezeichnet wird) erhalten wird. Das so erhaltene VI-75OO wird unter Verwendung von Dextrangel (Sephadex G-100) einer Gelchromatographie unterworfen. In Flg. 1 Ist die Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und der BDI-Aktivität von VI-7500 angegeben. Die Einheit der BDI auf der Ordinate der FIgI wird i" nachstehend erlaub t. In der Flg. 1 sind auch die Adsorptionen bei 280 und 440 ηιμ jeder Fraktion dargestellt.

Nachfolgend werden die Zeichnungen näher erläutert.

Flg. 1 zeigt die Beziehung zwischen der Molekulargewichtsverteilung, der BDI-Aktlvltät und der Absorption von UV-Licht. Fig. 2 zeigt eine Elchkurve, welche das Molekulargewicht durch Gelchromatographie mit Dextrangel anzeigt. Flg. 3 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum von VI-7501. Fig.4 zeigt ein IR-Absorptlons- ^;> Spektrum von Vl-7501. Flg. 5 und 6 zeigen die Tumorzellen schädigende Aktivität von VI-7501. Flg. 7 zeigt die Beziehung zwischen der Tumorzellen schädigenden Aktivität und der Antltumoraktlvität (In vitro) von VI-750!. Fig. S zeigt die Aküviiäi von deaktiviertem Friend Leukämie Virus.

Aus Flg. 1 wird ersichtlich, daß sich Fraktionen mit einer BDI-Aktlvliät nur im Bereich des Molekulargewichts von 1,5 χ 10' bis 3,5 χ 10' verteilen. Das Molekulargewicht einer Fraktion mit einer maximalen BDI ■«> befindet sich bei etwa 2,3 χ 10'.

Das erflndungsgemaße VI-7501 hat daher ein Molekulargewicht von 1,5 χ 10⁴ bis 3,5 χ 10' und zeigt eine BDI-Aktivität. Diese Substanz besitzt auch eine Antltumoraktlvltät, wie aus den später angegebenen Ergebnissen von Tierversuchen und von in-vltro-Tests hervorgeht.

Die Elchkurve des Molekulargewichts für das obige Chromatogramm Ist in Flg. 2 dargestellt. Die Marklerun- ·>> gen 4, 5 und 6 zeigen die graphischen Darstellungen für Albumin (Molekulargewicht 67 000), ar-Chymotrlpsln (Molekulargewicht 22 500) und Lysozym (Molekulargewicht 14 000).

Die oben beschriebene Chromatographie wurde mit einer Säule mit Abmessungen von 26 mm 0 χ 1000 mm und mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/h durchgeführt. Als Lösungsmittel wurde eine wäßrige 0,5 M-NaCl-Lösung verwendet.
Das erfindungsgemäße VI-7501 hat weiterhin die folgenden charakteristischen Eigenschaften bzw. Parameter:

(1) Aussehen und Farbe: weißes oder leicht gelbes Pulver;

(2) UV-Absorptionsspektrum: Fig. 3; die Kurven 7 und 8 zeigen die Absorptionen von VI-7501, wobei dessen Konzentrationen 400μg/ml bzw. 133 μg/mI betragen;

" (3) IR-Absorptionsspektrurr Flg. 4 (KBr-Tablette);

(4) Schmelz- oder Zersetzungspunkt: zersetzt sich bei 220 bis 235° C;

(5) Molekulargewicht: 1,5 χ 10⁴ bis 3,5 χ ΙΟ⁴;

(6) Reaktion der wäßrigen Lösung: neutral;

(7) Permeabilität durch Membranen: durch Cellophan®-Fi!m oder CoHodiummembranen nicht permeabel;

*" (8) Löslichkeit: leicht löslich in Wasser und fast unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat. Benzol

und Chloroform;
(9) Aussalzung: durch Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Natriumchlorid etc. ausgesalzt;

(10) Adsorption und Desorption: adsorbiert auf Aktivkohle, Bentonlt, saurem Ton, Kaolin und Zeolith und teilweise desorbiert von dem Adsorbat auf saurem Ton oder Kaolin mit einer 4%igen Dlnatriumhydrogenphosphaiiösüng;

(11) Stabilität: die gefriergetrocknete Substanz Ist bei gewöhnlicher Temperatur relativ stabil; in der wäßrigen Lösung wird sie durch Erhitzen deaktiviert. In wäßriger Lösung Ist sie gegenüber UV-Strahlen, Wasserstofflonen und Sauerstoff relativ stabil. Sie ist auch relativ stabil gegen einen Elnfrier-Aufschmelz-

Vorgaiu. Die BDi-Wlrkung wird durch Phenol, Formalin, Kupfcrlonen und Quecksllbcrlorien Inhibiert:
(12) Fürbungsreaklioncn:

Rcaktlor mit Nlnhydrln: positiv

Folln-Lowry-Reakllon: positiv

Reaktion mit Fluorescamln: positiv >

Reaktion mit Anthron: negativ

()^1% Elnfärbbarkelt: sie wird mit Amldoschwarz 1OB eingefärbt.

VI-7501 hat zwar eine BDI-Aktivität, zeigt aber nur eine sehr schwache oder fast überhaupt keine antimikrobiell Aktivität. Biologische Methoden mit Bakterien können daher zur Bestimmung der eirflndungsgemäßen Substanz nicht angewendet werden. Ergebnisse von Untersuchungen zur Bestimmung von VI-7501 haben gezeigt, daß die Methode unter Verwendung der BDI-Aktivität von VI-7501 zur quantitativen Bestimmung von VI-7501 geeignet ist, da die BDI-Aktivität von VI-7501 in guter Beziehung zu ihrer Antltutnor-Aktivität steht.

Nachstehend wird die quantitative Bestimmung von VI-7501 beschrieben.

Tumorzellcn werden von Ascites einer Maus gesammelt, die von Sarcoma-180 (nachstehend als S-180 abgekürzt) Infiziert ist. Die Zellen werden in einer 1/15 M-Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7.4 suspendiert, und die Dichte der Zellen in der Suspension wird auf 3 χ ΙΟ⁴ bis 7 χ 10V0,3 ml eingestellt. Portionen cie.r Zcllsusnension mit jeweils 0.3 ml werden In ein kleines Reagenzglas eingebracht und mit 0.2 ml einer Losung der erfindungsgemäßen Substanz versetzt. Das Gemisch wird gut durchgemischt.

Nach lslündlgem Stehenlassen des Gemisches in einem Thermostat bei 37° C werden 0,3 ml einer 0.03%igen Lösung von Trlphenyltetrazoliumchlorld (abgekürzt als TTC) zugegeben, und das Gemisch wird 15 h bei 37° C gehalten. Sodann werden 3 ml einer 0,5%igen Trlchloracctatlösung (0,5 g Trlchloracetat werden In 100 ml Äthylacetat aufgelöst) zugesetzt, und das Gemisch wird stark geschüttelt und durch Zentrifugieren getrennt. Die Absorption der auf diese Welse abgetrennten Äthylacetatschicht wird bei einer Wellenlänge von 480 ΐτ*μ bestimmt. Der Inhibierungslndex (abgekürzt als 1.1.) wird unter Verwendung der gemessenen Werte (Absorption) nach folgendei Gleichung bestimmt:

I.I. = -5^-2- x 100 (%)
a - m

Darin bedeuten

/).· Absorption

a: Absorption einer Lösung, erhalten ohne Zusatz der Lösung der erfindungsgemäßen Substanz
in: Absorption einer Lösung, erhalten ohne Zusatz der Lösung der erfindungsgemäßen Substanz und ohne ^!:i Zusatz von TTC.

Die Aktivität der Standardsubstanz wird auf 1600 Einheiten eingestellt. Dieser Wert wird erhalten, indem man den reziproken Wert des Gewichtes (0,625 mg gemäß der Erfindung), was einem 1.1.-Wert von 50% entspricht, mit 10' multipliziert. '-"

Die Aktivität einer Probe wird anhand der Aktivität der Standardsubstanz bestimmt. Dieser Wert wird errechnet, indem das Gewicht (mg) der Probe, das einem I.I.-Wen von 50% entspricht, mit 1600/0.625 multipliziert wird.

Die Konzentration der Probe, die dem obigen Verfahren unterworfen wird, wird so eingestellt, daß der I.I.Wert zwischen 20 und 80% fällt. Sämtliche oben angegebenen Verfahrensmaßnahmen müssen unter sterilen ⁴" Bedingungen vorgenommen werden.

Die 1/15 M-Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4, die beim obigen Test verwendet wird, wird wie folgt hergestellt. 11,94 g Dlnatriumhydrogenphosphat-dodecahydral und 4,25 g Natriumchlorid werden In destilliertem Wasser zur Injektion aufgelöst, und das Gesamtvolumen der Lösung wird auf 500 ml eingestellt (Lösung 1). 4,54 g Monokaliumdlhydrogenphosphat und 4,25 g Natriumchlorid werden In destilliertem Wasser ·'" aufgelöst, und das Gesamtvolumen wird auf 500 ml eingestellt (Lösung 2). Sodann werden 76 ml der Lösung i und 24 ml der Lösung 2 vermischt. 1/15 M-Phosphatpufferlösung, wie oben beschrieben, werden hergestellt, indem 100 γ Penicillin und 100 γ Streptomycin zu 1 ml der gemischten Lösung gegeben werden.

Die obengenannte TTC-Lösung wird hergestellt. Indem 2,7 g Natriumsucclnat und 30 mg 2,JI,5-Trlphenyltetrazollumchlorld zu 100 ml der obengenannten Phosphatpufferlösung gegeben werden.

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz wird in «Einheiten» gemessen und nach der obigen Methode errechnet. Die Einheiten werden als BDI-Einheiten bezeichnet. Hierin sollen Einheiten immer BDI-Einheiten bezeichnen, wenn nichts anderes angegeben Ist.

Die spezifische Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz Ist die Aktivität pro 1 mg Proteingehalt einer auf Albumin verminderten Probe, bestimmt nach der Folin-Lowry-Methode. ^ω

Nachfolgend wird die Antitumoraktivität von VI-7501 erläutert. In Tabelle I sind die Testergebnisse bei der Behandlung von tierischen Tumoren (in vivo) zusammengestellt. 1 χ 10⁴ Tumorzellen von Ehrlich Ascites Carcinom (nachstehend als EAC abgekürzt) oder S-180 wurden, in eine peritoneale Höhlung einer Maus (dd-Y-System) hlneintransplantiert. Von dem Tag an wurde VI-7501 in die Pertonealhöhlung zur Behandlung bei den folgenden Bedingungen Injiziert: Anzahl der Behandlungen: i bis 20, Dosis: 283 bis 2834 Einheiten.

Wie aus Tabelle I hervorgeht, sind mehr als 2076 Einheiten zur wirksamen Behandlung von EAC nötig, wenn der Tumor nur einmal behandelt wird. Mehr als 531 Einheiten sind notwendig, wenn dies;r 5mal behandelt wird. Im Falle von 283 Einheiten kann der Tumor selbst dann nicht behandelt werden, wi;nn lOmal (S-180)

behandelt wird.

(1) Zur wirksamen Behandlung mit der erflndungsgemäßcn Substanz (VI-7501) sollte die zur einmaligen ':_:· Behandlung verabreichte Menge größer sein als ein vorgewählter Wert. Je größer die Dosiseinheit Ist, desto

> höher Ist Ihr Effekt.

(2) Bei konstanter Dosis Ist der Effekt um so höher, je größer die Anzahl der Behandlungen (Gesamteinheiten)

';' ist.

(3) Wenn -iü zu verabreichenden Gesamteinheiten die gleichen sind, dann Ist eine Behandlung, bei der die erfindungsgemäße Substanz In einer kleinen Menge getrennt über einen langen Zeltraum verabreicht wird,

¹¹¹ weniger wirksam als eine Behandlung, bei der die Substanz In einer großen Menge Innerhalb einer kurzen

Zeltspanne verabreicht wird.

Aus der oben beschriebenen Aniltumor-Aktlvltät von VI-7501 kann gefolgert werden, daß die Aktivität die Beschädigungswirkung der Tumor/eilen stark betrifft. Die Zellbeschädlgungs-Aktlvltäi wird In den Flg. 5 und 6 ¹^ dargestellt.

Die Suspension mit 1 χ 10 Zellen (S-180)/ml (zur Verdünnung wird Phosphatpufferlösung mit einem pH Wen von 7,15 verwendet) wird mit einer Lösung von VI-7501 (die Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert _u_ von 7.15 wird zur Auflösung des VI-7501 verwendet) vermischt. Das Gemisch wird 5 bis 60 min lang in einem

Reagenzglas bei 37° C geschüttelt. Ein Tropfen des Gemisches wird sofort mit 5 Tropfen 0,5%iger Trypanblau- : -" Lösung in physiologischer Kochsalzlösung vermischt. Die blaugefärbten Zellen (beschädigte Zellen) werden

unter dem Mikroskop gezählt, und das Verhältnis der lebenden Zellen wird errechnet. Das Verhältnis der lebenden Zellen (Überlebensrate) wird nach folgender Gleichung errechnet:

■: Anzahl der nichtgefärbten Zellen (lebende Zellen) vm/wo/*

.,. ^ ILMJ ( /ο)

Anzahl der blaugefärbten Zellen + Anzahl der nichtgefärbten Zellen

^;! Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. In Flg. 5 beziehen sich die Kurven 9, 10, 11. 12, 13 und 14 auf

$ 0 Einhelten/ml, 692 Elnhelten/ml, 3460 Einhelten/ml. 13 840 Elnhelten/ml, 32 524 Einhelten/ml bzw. 55 360

Μ ^}" Einheiten/ml der Konzentration von VI-7501.

i,^! Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, daß bei einer Konzentration des VI-7501 von 692 Elnhelten/ml die

f; Anzal der blaugefärbten Zellen sehr gering war, und daß somit nur wenige Zellen beschädigt wurden. Bei einer

41 Konzentration von mehr als 3460 Elnhelten/ml nahm der Anteil der lebenden Zellen entsprechend der Konzen-

\f'i tration von VI-7501 ab.

'jrj ^;>> Das Verhältnis bzw. der Anteil der lebenden Zellen (Schüttelzelt: 60 min) Ist In Fig. 6 gegen die Konzentra-

y\ tion von VI-7501 aufgetragen.

n; Das Gemisch aus Tumcrzeiien und einer Lösung von Vw50i in einem Reagenzglas wurde in die rcriiüiicai-

't. höhlung einer Maus elntrunsplantlert. Es wurde beobachtet, ob die auf diese Welse Implantierte Maus durch die

f\ transplantlerten Tumorzellen getö'.et wird. 1 ml einer Suspension (1 χ 10' Zellen/ml) von S-180 wurde mit 1 ml

'jij ^4U einer Lösung (13 840 Elnhelten/ml) von VI-7501 In einem Reagenzglas vermischt. Zur Verdünnung wurde

Jj Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,15 verwendet. Das Gemisch wurde bei 37° C geschützt. Nach

■rf 5, 20 und 60 min wurden jeweils 0,2 ml des Gemisches In die Perltonealhöhlung einer Maus (10 Mäuse/Gruppe)

g hinelntransplantlert.

Il Die Todesrate durch den Tumor wurde im Verlauf von 60 Tagen beobachtet. Die erhaltenen Ergebnisse sind

Bf -»s in Fig. 7 zusammengestellt.

Aus Flg. 7 wird ersichtlich, daß alle Mäsue dem Tod durch Tumor entkamen, wenn eine Tumorzellsuspenslon mit einer VI-7501-Lösung 60 min geschüttelt wurde. Die Kontrollgruppe, der ein Gemisch aus der Tumorzellensuspension und einer Kochsalzlösung elntransplantlert worden war, wurde vollständig gelötet.

Die Tumorzellen beschädigende Aktivität konnte auch hinsichtlich der Zellen von EAC, der Ascltes-Tumor-5" zellen der Ratte (AH-66) und der Zellen von Yoshlda Sarkom beobachtet werden. Die Ergebnisse sind In Tabelle II zusammengestellt.

Weiterhin kann VI-7501 den Friend Leukämie Virus (als FLV abgekürzt) In vitro deaktivieren. Die hypertrophierte Milz einer Maus, die mit FLV infiziert war, wurde in der 4fachen Gewichtsmenge physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert und 15 min bei 3000 U/mln zentrifugiert. Der abgetrennte Überstand wurde als «20% ^ FLV-Milz-Homogenat» bezeichnet. Dieses Produkt wurde auf das 4fache mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, und die so erhaltene Losung wurde als «5% FLV-Milz-Homogenat« bezeichnet. Eine dieser zwei Arten von Homogenat und die gleiche Menge einer Lösung mit 2076 Einheiten/ml VI-7501 oder einer Lösung mit 20 760 Einheiten/ml wie das Homogenat wurden In ein Reagenzglas eingebracht. Nach öOminütlgem Schütteln des Gemisches wurden jeweils 0,2 ml dieser Gemische In die Peritonealhöhlung einer Maus Injiziert. Im N' Verlauf von 60 Tagen wurden die Todesfälle durch Infektion mit FLV beobachtet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt.

Die Linien 15 und 16 entsprechen den Fällen, bei denen 20%iges and 5%lges FLV-Milz-Homogenat verwendet wurden. Es wird ersichtlich, daß FLV durch VI-7501 deaktiviert werden kann. 60% der Mäuse, denen ein Gemisch aus 20% FLV-Milz-Homogenat und VI-7501 (20?6 Elnheiten/ml) injiziert worden waren, und 100% der ⁶⁵ Mäuse, denen ein Gemisch aus 5Sfe FLV-Milz-Homogenat und VI-750i (2076 Einheiten/mi oder 20 760 Einheiten/mi) injiziert worden waren, entkamen αώτη Tod durch Infektion.

Tabelie I

Effekt »cn VI-7501 auf Tumoren bei Mäusen (in vivo)

Tumor Dosis (Einhcit/Zeit/Körper)	Verfahren	x 1 Tag	Gesamtdosis (Einheit/Körper)	Überlebensrate (%) 30 Tage 60 Tage	30 10
EAC (W 443 Zellen/Körper) ι 328	einmal/Tag		443 1328	40 30	50
2 125			2 125	90	60
2 834		X 5 Tage	2 834	90	30
531	einmal/Tag		2 655	60	30
844			4 220	70	100
1 134			5 670	100	0
physiologische Kcchsaizlcs'jn"		x 1 Tag x 5 Tage	0	20	0 10
S-180 (lü* 283 Zellen/Körper)	einmal/Tag einmal/Tag	x 10 Tage	283 1415	20 20	0
	einmal/Tag	x 1 Tag	2 830	20	10
587	einmal/Tag	x 5 Tage	567	30	30
	einmal/Tag	x 10 Tage	3 335	70	70
	einmal/Tag	x 20 Tage	5 670	80	70
1384	einmal/Tag	X 10 Tage	27 680	100	60
	einmal/Tag	x 20 Tage	13 840	80	0
physiologische Kochsalzlösung	einmal/Tag	0	30

Tabelle II

Tumorzellen schädigende Aktivität von VI-7501

Tumor	Anzahl der Zellen (Zeilen/ml)	Schüttel bedingungen	Konzentralion von VI-7501 (Einheiten/ml)	Verhältnis d. beschädigten Zellen (%)
EAC	107	37° C, 30/min	13 840	59,2
S-180	107	37° C, 30/min	13 040	51,1
AH-66	107	37° C, 30/min	13 840	36,0
Yoshidä Sarkom	107	Λ7° C, 30/min	13 840	55,8

Die akute Toxizität von VI-7501 durch intraperitoneale Verabreichung bei der Maus ist wie folgt: LD₅₀ = 1.5 χ 10^s Einheiten/kg (einmal)

VI-7501, gelöst in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung kann subkutan oder intravenös verabreicht werden.

Untenstehend wird die antimikrobielle Aktivität von VI-7501 gezeigt. Die Mikroorganismen wurden dem Test unterworfen, nachdem sie alle von einer konservierten Schrägkultur zu einem neuen Schrägkulturmedium subkultiviert worden waren. In einer Petrischale wurde ein Agar-Medium hergestellt, in dem ein Mikroorganismus suspendiert war. Nach der Papier-Scheiben-Methode wurde die antimikrobielle Aktivität von VI-7501 bestimmt. Die Scheiben wurden in eine Lösung von VI-7501 mit 19 200, 9600. 4800 bzw. 2400 Einheiten/ml eingetaucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle ΙΠ
Antimikrobielle Aktivität

Nr. Mikroorganismus

Durchmesser d.
Inhibierungsrings (mm) (Konzentration von VI-7501: 2 400-19 200 Einheiten/ml)

1 Staphylococcus aureus (ATCC-6538p) 0

2 Staphylococcus aureus (ATCC-6538DR) 0

3 Bacillus subtilis (ATCC-6633) 0

4 Bacillus cereus (IAM-1190) 0

5 Sarcina lutea (ATCC-9341)' 0

6 Micrococcus flavus (ATCC-10240) 0

7 Escherichia coli (NIHJ) 0

8 KJebsieUa pneumoniae (ATCC-10031) 0

9 Pseudomonas aeruginosa (ΙΛΜ-1001) 0

10 Mycobacterium smegmatis (ATCC-607) 0

11 Candida albicans (YU-1200) 0

12 Saccharomyces cerevisiae (ATCC-9763) 0

13 Penicillium chrysogenum (ATCC-10002) 0

14 Microsporum gypseum (ATCC-14683) 0

Aus den obigen Ergebnissen ergibt sich, daß VI-7501 keine antimikrobielle Aktivität besitzt Das VI-7501 unterscheidet sich von den in Tabelle IV gezeigten Antitumorsubstanzen.

Tabelle IV

Bekannte Antitumor-Polypeptide

Nr. Polypeptid

Charakterstikum Literaturstelle

1 Phenomycin basisches Polypeptid

2 Enomycin

basisches Polypeptid

3 Peptimycin basisches Polypeptid

4 Neocarzinostatin antimikrobiell, MG: 10 700

5 Carzinomycin dunkelgrüne Substanz

6 Carzinocidin antimikrobiell

7 Melanomycin melaninartiges schwarzes

Pulver

8 Marinamycin antimikrobiell

Tanaka & Nakamura, »Koseibusshitsu taiyo«, Tokyo Univ. S. 132

Tanaka & Nakamura, »Koseibusshitsu taiyo«, Tokyo Univ., S. 132

Tanaka & Nakamura, »Koseibusshitsu taiyo«, Tokyo Univ., S. 132

Tanaka & Nakamura, »Koseibusshitsu taiyo«, Tokyo Univ., S. 132 Ota, »Nichii«, Nr. 2601

Sumiki, »Koseibusshitsu« (II), Tokyo Univ., S. 252

Sumiki, »Koseibusshitsu« (II), Tokyo Univ., S. 252

Sumiki, »Koseibusshitsu" (II), Tokyo Univ., S. 252

Sumiki, »Koseibusshitsu« (II). Tokyo Univ.. S. 252

Fortsetzung Nr. Polypeptid Charakterstikum Literaturstelle

9 Actinogan Glicopeptid Tanaka & Nakamura, ⁵

»Koseibusshitsu taiyo«, Tokyo Univ., S. 132

10 A-216 basisches Peptid Sumiki, »Koseibusshitsu«

(II), Tokyo Univ., S. 252 ">

11 A-280 saures Chromopeptid Sumiki, »Koseibusshitsu«

antimikrobiell (II), Tokyo Univ., S. 252

12 Iyomycin schwach antimikrobiell Sumiki, »Koseibusshitsu«

(H), Tokyo Univ., S. 252 ^I5

13 Plurallin Chromopeptid Sumiki, »Koseibusshitsu«

GD, Tokyo Univ., S. 252

14 Calracin basisches Mucoprotein Sumiki, »Koseibusshitsu« 20

(II), Tokyo Univ., S. 252

15 Flammvlin basisches Mucoprotein Sumiki, »Koseibusshitsu«

(II), Tokyo Univ., S. 252

Der technische Fortschritt geht aus den folgenden Untersuchungen hervor.

(1) Vergleich mit Bleomycin:

a) Verwendete Tumorzellen: ^⁰ Ascltes Tumorzellen von Ratten (Ascltes heptoma). AH-13, AH-66, AH-130, AH-44 und AH-41C

b) Versuchstiere:

Donryu-Ratten (pro Gruppe 10 Ratten)

c) Transplantation der Tumorzellen:

Jeweils 1 χ 10^! Ascltes haptoma-Zellen wurden Intravenös den Tieren einer Gruppe transplantlert. ³⁵

d) Behandlung:

(I) 72 Stunden nach Ablauf der Transplantation der Tumorzellen wurden 100 000 Elnhelten/kg des PoIypeptlds VI-7501 intravenös einmal taglich wahrend zehn aufeinanderfolgender Tage verabreicht. Sechzig Tage nach Behandlungsbeginn wurde festgestellt, ob und wieviele Ratten überlebten und das Verhältnis der überlebenden Ratten zu den toten Ratten errechnet. ⁴⁰

(Ii) Polyamid VI-7501 wurde In gleicher Welse wie In (i) verabreicht.

(ill) Bleomycin wurde In gleicher Welse wie bei (I) verabreicht, wobei anstelle von 100 000 Einheiten/kg VI-7501 7,5 mg/kg Bleomycin verabreicht wurden.

(Iv) Bleomycin wurde In gleicher Welse wie In (III) Intraperitoneal verabreicht.

e) Versuchsergebnisse: *5 Diese werden In der folgenden Tabelle V gezeigt.

Tabelle V

Behandlungs- Wirkung (Überlcbensgrad) ⁵⁰

methode _AH._{13 AH}^₆ aH-130 AH-44 AH-41C

VI-7501 i) + ++ + ++ ++

Bleomycin iii) - ++ -

f + Mehr als 4 Rallen pro Gruppe überleblen M>

+ 3 Ratten pro Gruppe übeflebtin - Nur zwei oder weniger Ratten pro Gruppe überleblen

Die bekannten Anti-Tumormlttel weisen alle starke Nebenwirkungen auf. wobei diese starken Nebenwirkun- 65 μοη darin bestehen, daß auch gesunde Zellen durch die Inhibierung von DNA Inhibiert werden. Bekannte Antl-Tumormitlcl mit diesen Nebenwirkungen sind Mitomycin C, Neocarclnostatln, Bleomycin, Daunorublcln, AcH-nomycin. und auch Adriamycin. Über die Nebenwirkungen wird berichtet In »The Journal of the Pharmaceutl-

cal Sciences«, Band 61 (1972), Seite 487, Zeilen 13 bis 18, rechte Spalte, In bezug auf Actinomycin D; Seite 488, 2. Abs., linke Spalte bis Zeile 1 rechte Spalte, In bezug auf Mitomycin C; Seite 490, Zeilen 7 bis 31, rechte Spalte, hinsichtlich Bleomycin; Seite 492, vorletzter Absatz In der rechten Spalte, hinsichtlich Myslamycin; Seile 494, 2. Abs., In der linken Spalte, hinsichtlich Daunorubicin und Seite 495, Zellen 10 bis 15, rechte Spalte, hinsichtlich Adriamycin.

Bei VI-7501 wurden solche Nebenwirkungen nicht festgestellt.

Tumorzellen werden von pathologischen, hlstologlschen oder Immunologischen Gesichtspunkten her unterschieden und die Wirksamkeit eines Arzneimittels ist unterschiedlich je nach der Art des Tumors. Um die Nebenwirkungen von Anti-Tumormltteln zu mindern, wird in der Praxis bei der medizinischen Krebsbehind lung häufig eine Polychemotheraple angewendet. Bei einer solchen Therapie 1st es außerordentlich wichtig, daß die zusammen verabreichten Arzneimittel untereinander abweichende Eigenschaften hinsichtlich Ihres Wirkungsmechanismus aufweisen. Bei der Kombinationsanwendung solcher Anti-Tumormlttel mit unterschiedlichen Eigenschaften wird die synergistische Wirkung der einzelnen Mittel verstärkt, d. h. daß man gleiche Wirkungen mit einer geringeren Menge eines Arzneimittels erzielt als bei alleiniger Verabreichung des Arznei mittels (also nicht In Komb'nationsform).

Die Wirkung bei einer Kombinationsanwendung von VI-7501 wurde mit einer Reihe von Anti-Tumormltteln (wie MMC, Bleomycin, Daunorubicin, Adriamycin und dergleichen), metabolischen Antagonisten (wie 5-FU) und/oder Alfcylierungsmltteln (wie Cyclophosphamid) festgestellt. Für den Fachmann wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Substanz VI-7501 wirksam zur Remission und zur Behandlung von Tumoren oder Leukämien des Menschen verwendet werden kann.

Die erflndkszsgemäße Substanz kann gewöhnlich auf parenteralem Wege, vorzugsweise durch subkutane oder intravenöse Injektion, verabreicht werden. Der erfindungsgemäße Wirkstoff VI-7501 kann für klinische Anwendungszwecke In verschiedenen Arten von Dosiseinheitsformen verwendet werden. Es ist jedoch praktisch und vorzuziehen, eine einzige Dosis der gefriergetrockneten Form zu verwenden, die vorzugsweise auf einem geeig neten Träger getragen wird und In einem geeigneten sterilen Geßß, z. B. einer Ampulle, eingeschlossen Ist. Der Inhalt des Gefäßes wird unter aseptischen Bedingungen In einem geeigneten, physiologisch annehmbaren Lösungsmittel, z. B. physiologisch Kochsalzlösung, unmittelbar vor der Verabreichung aufgelöst, wodurch eine nassige Zubereitung erhalten wird, die für die piirenterale Verabreichung fertig Ist. Eine einzige Dosis (als »Einheit« bezeichnet) der erfindungsgemäßen Substanz kann gewöhnlich im Bereich von etwa 5000 bis 100 000

Μ Einheiten/Erwachsener/1 Verabreichung betragen. Eine einzelne Dosis der erfindungsgemäßen Substanz kann gewohnlich denjenigen Patienten verabreicht werden, die einmal am Tag behandelt werden. Eine Behandlungsperlode umfaßt gewöhnlich eine 30malige Verabreichung. Die Verabreichung sollte sorgfältig je nach Art und Schwere des Tumors ode/ der L: jkämie, der möglichen Nebenwirkungen, der Toxizität und der anderen Faktoren ausgewählt werden.

Die Erfindung wird in den Bels; .elen erläutert. Beispiel 1

Eine Samenkultur von Streptomyces grlseus DSM 2010 wurde zu einem Medium gegeben, das in der Weise hergestellt worden war, daß 5 g Glucose, 5 g Fleischextrakt, 5 g Pepton und 5 g Natriumchlorid In 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst worden waren. Die zugegebene Menge betrug 5% des Gemisches. Das Gemisch wurde unter Belüften bei 28 bis 29° C gerührt. Nach 48 h wurde die Fermentation abgebrochen und unlösliche Materlallen wie Zellen und dergleichen wurden abfiltriert. 500 g Ammoniumsulfat wurden zu 11 Flltrat gegeben. Nach Sstündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden die ausgefällten Produkte durch Zentrifugieren *i gesammelt. Die ausgefällten Produkte wurden In 100 ml einer 4%igen Dlnatrlumhydrogenphosphatiösung aufge löst. Die Lösung wurde In einer Säule mit Sephadex G-100 Chromatographien. Eine Fraktion mit einem MoIe- kulargewlchtsberelch von 1,5 χ 10⁴ bis 3,5 χ 10⁴ wurde gesammelt. Sie zeigte eine BDI-Aktlvltät und sie enthielt die Antltumorsubstanz. Diese Fraktion wurde dlalyslert, entsalzt und gefriergetrocknet, wodurch 200 mg VI-7501 mit einer spezifischen Aktivität von 5,3 χ ΙΟ⁴ Elnheiten/mg Protein (aiii Albumin vermindert) erhalten wurden.

Elementaranalyse: C 3.50% H 5,95% N 6,80% S 1,02% 0 51,19% (durch Differenz) Spezifische optische Drehung:

¹^,. C = +43,14°.

Beispiel 2

Zu dem Medium des Beispiels 1 wurde eine Samenkultur von Streptomyces hachljoensls DSM 2011 in einer Menge von 5%, bezogen auf das Gemisch, gegeben. Das Gemisch wurde unter Belüften bei 28 bis 29° C gerührt. Nach 48 h wurde die Fermentation abgebrochen und unlösliches Material wie Zellen und dergleichen wurde abfiltriert. 500 g Ammoniumsulfat wurde zu 1 I des Flltrats gegeben. Nach 5stündlgem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden die ausgefällten Produkte durch Zentrifugleren gesammelt. Die ausgefällten Produkte wurden In 100 ml einer 4%lgen Dlnatrlumhydrogenphosphatlösung aufgelöst. Die Lösung wurde auf einer Säule mit Sephadex G-100 Chromatographien. Eine Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1,5 χ 10⁴ bis 3,5 χ 10\ die eine BDI und Antitumoraktlvität zeigte, wurde erhalten. Diese Fraktion wurde dlalyslert, entsalzt und gefriergetrocknet, wodurch 250 mg VI-7501 mit einer spezifischen Aktivität von 5,5 χ 10⁴ Elnhelten/mg Protein (auf Albumin vermindert) erhalten wurden. Diese Substanz zeigte die gleichen Eigenschaften oder ahn-

liehe Eigenschaften wie oben beschrieben.

Beispiel 3

Zu einer Brühe (Filtrat), erhalten bei den gleichen Fermentationsbedingungen wie in Beispiel 2, wurden 20 g 5 Zeolith gegeben und das Gemisch wurde ausreichend gerührt. Der Zeolith wurde im Vakuum abfiltriert. Zu
dem abgetrennten Zeolith wurden 100 ml einer 5*igen Dtnatriumhydrogenphosphatlösung gegeben. Nach
einstandigem Rühren wurde der Zeolith durch Filtration Im Vakuum entfernt. Das Filtrai wurde durch eine
Säule mit Sephadex G-100 Chromatographien, wodurch eine Fraktion erhalten wurde, die eine BDI-Aktivität
hatte und ei.'.cn Molekulargewichtsbereich von 1,5 χ 10⁴ bis 3,5 χ 10⁴ aufwies. Die Fraktion wurde dialysiert, um in Dinatriumhydrogenphosphat zu entfernen, und gefriergetrocknet, wodurch 210 mg Vl-7501 mit einer spezifischen Aktivität von 4,4 χ 10⁴ Einheiten/mg Protein (berechnet als Albumin) erhalten wurden. Diese Substanz
zeigve ähniiche oder gleiche Eigenschaften wie oben beschrieben.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

11

Claims (1)

1. Patentanspruch: Polypetid VI-7501 mit Antltumorwirkung und folgenden Eigenschaften:

   - Aussehen und Farbe: weißes oder leicht gelbes Pulver,

   UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 3 bei Konzentrationen von 400 μg/ml bzw. 133 μg/ml;

   IR-Absorptionsspektrum gemäß Flg. 4: (KBr-Tablette), wobei die Fig. 3 und 4 Bestandteil des Patentanspruches sind;

   - Schmelz- bzw. Zersetzungspunkt bei 220 bis 235° C; - Molekulargewicht: 1,5 χ 10* bis 3,5 xlO⁴;

   Reaktion der wäßrigen Losung: neutral;

   Permeabilität durch Membranen: durch Cellophan®-Film oder Collodlummembranen nicht permeabel;

   Löslichkeit: leicht löslich in Wasser und fast unlöslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat,

   Benzol und Chloroform; - Aussalzung: durch Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Natrimchlorid;

   Färbungsreaktionen:

   Reaktion mit Nlnhydrin: positiv

   Folin-Lowry-Reaktion: positiv

   Reaktion mit Fluorescamln: positiv Reaktion mit Anthron: negativ

   Einfärbbarkelt: mit Amidoschwarz 1OB

   Bemsteinsäure-Dehydrogenase-Inhlblerung (BDI-Aktivität) jedoch sehr schwache oder keine antimikroblelle Aktivität;

   erhältlich durch Züchtung von Streptomyces grlseus DSM 2010, Streptomyces hachijoensis DSM 2011, Streptomyces collinus DSM 2012, Streptomyces lincolnensis DSM 2013, Streptomyces lavendulae DSM 2014 oder Stremptomyces xanthochromogenus DSM 2015 in einem üblichen Nährmedium, das Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, während 24 bis 60 Stunden bei 28 bis 29° C, Abtrennung der Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1,5 χ 10' bis 3,5 χ 10⁴ aus der FermentatlonsflOssigkeli, den Zellwänden und den

   •^1(l Zellkörpern durch