DE3329255C2

DE3329255C2 - Verfahren zur Herstellung der Substanz TF-500 mit carcinostatischen und immunostimulierenden Eigenschaften

Info

Publication number: DE3329255C2
Application number: DE3329255A
Authority: DE
Inventors: Takako Toyama Hori; Toyoo Kanazawa Maeda; Hisashi Minami; Shohachi Toyama Murakami; Isamu Saikawa; Hiroshi Takaoka Sakai; Masatoshi Toyama Sugita; Kenzo Kanazawa Tamai; Hisatsugu Toyama Tsuda; Yoshiko Namerikawa Yamamoto; Takashi Yasuda
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Current assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1982-08-17
Filing date: 1983-08-12
Publication date: 1985-06-05
Also published as: AT389525B; NL8302880A; FI79140C; DE3329255A1; ZA836021B; PT77207A; CA1202585A; BE897549A; FI79140B; SE456014B; FR2531863B1; NZ205295A; NO159452B; US4547462A; DK374283A; SE8304435D0; ES8505823A1; KR860001213B1; IT8348851A0; AU1784883A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer TF-500 Substanz mit carcinostatischen und immunostimulierenden Aktivitäten. Bei dem Verfahren werden zur Gattung Fusobacterium gehörende Organismen der Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid unterworfen und die TF-500 Substanz wird aus dem resultierenden Extrakt isoliert.

Description

a) grauweißes-hellbraunes Pulver;

b) die Substanz hat eine carcinostatische und immunostimulierende Aktivität;

c) dte Substanz ist löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Ethylacetat und Diethylether;

d) die Substanz hat keinen klaren Schmelzpunkt und beginnt sich bei etwa 180⁰C zu /ersetzen und /.ersct/l sich bemerkenswert oberhalb 195°C;

e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten nach dem KBr-Verfahren, weist Absorptionsbanden auf in der Nähe von 3500-3200, 2920, 2350, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400. 1380-1360. 1120-1100, 1080-1000, 970 und 840-800 cm"';

f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum ihrer wäßrigen Lösung bei einem pH von 7,0 zeigt eine starke Absorption an der Absorpticnskante und zeigt ein Absorptionsmaxium in der Nähe von 246-280 nm;

g) die Substanz verhält sich positiv bei der Molisch-Reaktion, bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, bei der Anthron-Schwelelsäure-Reaktion, bei der Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und der Lowry-Folin-Reaktion, jedoch negativ bei der Ninhydrin-Reaktion;

h) Elementaranalysen-Werte: C 38-47%, H 5-7%, N 1-4%;

i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach einem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren, beträgt etwa 12 bis 30 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt der Substanz, bestimmt nach dem 1 owry-Folin-Verfahren beträgt etwa 10 Gew.-% oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin, die man gegebenenfalls nach herkömmlichen Verfahren in ein pharmazeutisch akzeptables Salz umwandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Dialkylsulfoxid Dimethylsulfoxid einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als hydrophiles, organisches Lösungsmittel Aceton einsetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Deproteinisierungsbehandlung eine Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als proteolytisches Enzym eine Pronase einsetzt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafiltrationsbehandlung durchgeführt wird mit einem Ultrafilter mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch von 50000

AQ bis 200000.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel unter sauren Bedingungen zu dem resultierenden Extrakt in einer Menge von mehr als dem 5fachen des Extraktes (Vol./Vol.) gibt; das gebildete Präzipitat einer Deproteinisierungsbehandlung mit einer Pronase unterwirft; der behandelten Flüssigkeit einen Alkohol zusetzt unter Schaffung einer Alkoholkonzentration von 30 bis 80 Vol.-¹?..; das gebildete Präzipitat isoliert und der Ultrafiltration unterwirft und nachfolgend

\ durch ein Membranfilter filtriert; und daraufhin eine Gefriertrocknung des Filtrats durchführt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen Substanz TF-500 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes derselben gemäß Patentanspruch 1.

In jüngster Zeit haben als Heilmittel für Patienten, die an verschiedenen Krebstypen leiden, in verstärktem

Maße Mittel Verwendung gefunden, weiche zu einer Steigerung der immunologischen Funktion des Wirts führen und mit denen ein carcinostatischer Effekt unter Mitwirkung der imunologischen Funktion erzielt wird.

Die Erfinder haben die pharmakologische Wirksamkeit von Komponenten untersucht, welche durch die Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid aus Kulturen von Fusobakterium nucieatum ATCC 31467, einem aus der Mundhöhle isoliertem Organismus, erhalten wurden. Dabei wurde festgestellt, daß eine spezielle Komponente des Extrakts eine carcinostatische Wirksamkeit aufweist und daß diese Komponente ferner eine M indirekte carcinostatische Aktivität dadurch entfaltet, daß sie eine Steigerung der wirtsvermittelten Antitumoraktivität oder der Immunität des Wirts unter Nutzung der Assistenz der Immunität herbeiführt. Ferner hat sich gezeigt, daß diese Komponente eine äußerst geringe Toxizität aufweist.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein neues Verfahren zur Herstellung und Isolierung der als TF-500 Substanz bezeichneten carcinostatischen und immunostimulierenden Exlraktkomponcnte von Fusobacterium nucleaturn ATCC 31647 /u schallen.

Diese Aufgabe wird durch das im Hauptanspruch gekennzeichnete Verfahren gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Die bakteriologischen Eigenschaften von Fusobacterium nucieatum ATCC 31647 sind wie folgt:

(I) Form

(1) Form der Zellen: spindelförmig (Fig. 1)

(2) Polymorphismus der Zellen: abwesend

(3) Motilität: abwesend

(4) Sporen: abwesend 5

(5) Gramlarbung: gramnegaUv

(6) Säurebeständigkeit: negativ

(JI) Wuchszustand im Kulturmedium

(1) TF-a Agarplatte und Schrägkulturmedium 10 externe Form: runde Gestalt

Größe etwa 1 mm

Protuberanz: halbkugelförmige Gestalt

Struktur: tautropfenartig

Oberfläche: glatt 15

Kanten: glatt

Farbe: milchig gelblich-weiß

Transparenz; opak

(2) TF-a Flüssigkulturmedium

Wachstumsgrad: heftig 20

Turbidität: Koagulum

Präzipitat: keines

Oberflächenwachstum: keines; kein Wachstum bis zu einer Tiefe von etwa 5 mm

Gas: keines

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Entwicklung von SchwefelwasserstofT: +

(2) Reduktion von Nitraten: -

(3) Produktion von Buttersäure: +

(4) Produktion von Indol: + 30

(5) Urease: -

(6) Catalase: -

(7) Stärkehydrolyse: -

(8) Verhalten gegenüber Sauerstoff: anaerob

(9) Erzeugung von Ammoniak: + 35

(10) Erzeugung von Kohlendioxid: +

(11) Wachstumsbereich: pH 5,0 bis 8_t5; 30° bis 45⁰C

(12) Erzeugung von Gas aus Sacchariden: L-Arabinose (-), D-Xylose (-), D-Glucose (-), D-Mannose (-),
D-Fructose (-), D-Galactose (-), Malzzucker (-), Saccharose (-), Trehalose (-), Sorbit (-), Mannit (-), Inosit (-), Glycerin (-), Stärke (-). ^O

Das Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen Substanz TF-500 wird beispielsweise auflblgende Weise
durchgeführt:

Kultur von Fusobacterium nucleatum ATCC 31647

Filtration

überstehende Flüssigkeit

Organismus

Dialkylsulfoxid

Unlösliches

Extrakt

(saures) hydrophiles organisches
Lösungsmittel

Präzipital

^2:1 Deproteinisierung und/oder Ultrafiltration

carcinostatische Substanz
TF-500

Das oben erwähnte Herstellungsverfahren wird im folgenden näher erläutert.
(I) Kultivierung der Bakterien

Die Kultivierung der Bakterien Fusobacterium nucleatum ATCC 31647 wird auf herkömmliche Weise, wie bei anaeroben Bakterien üblich, durchgeführt. Es wird ein Kulturmedium mit einem Gehalt einer Stickstoffquelle, wie Rinderhirn-Herz-Extrakle, verschiedene Peptone oder dergl., verwendet. Ferner enthält das Medium eine Vitaminquelle, wie Hefeextrakt oder dergl.; anorganische Salze, wie Natriumchlorid oder dergl.; eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Lactose oder dergl.; ein Reduktionsmittel, wie L-Cystin, Natriumsulfit, Natriumthioglykolal oder dergl.; und der pH-Wert wird auf 5 bis 8,5 und vorzugsweise auf6,5 bis 7,5 eingestellt, und zwar mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung. Das Bakterium wird in das Kulturmedium eingeimpft. Danach erfolgt eine Kultivierung im Fließgleichgewicht oder eine Kultivierung unter Rühren, und zwar unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 45°C, vorzugsweise 32 bis 37°C, während 1 bis 5 Tagen, vorzugsweise 1 bis 4 Tagen. Insbesondere erwünscht ist es, das in Tabelle 1 beschriebene Kulturmedium zu verwenden. Dieses wird im folgenden als »TF-Kulturmedium« bezeichnet. Das Hirn-Herz-Infusionsmedium, welches einen Rinder-Hirn-Herz-Extrakt darstellt, ist jedoch nicht immer als Stickstoffquelle erforderlich und kann ersetzt werden durch ein Herzinfusionsmedium, insbesondere einen Rinderherzextrakt, einen Rindfleischextrakt, einen Fischextrakt, Maisquellwasser oder dgl. Unter den verschiedenen Peptonen kommen Proteose-pepton und Phytonpepton in Frage. Sie sind jedoch nicht immer erforderlich. Man kann das Trypticase-pepton auch durch PoIy-

ηςηΤηη CrS€tZCn.

Wenn kein Agar verwendet wird, so wird vorteilhafterweise eine Rührkultur durchgeführt.
" Tabelle 1

Bestandteile des Kulturmediums (g/l) TF-a TF-b TF-c TF-d TF-e TF-f

Trypticase-pepton Phyton-pepton Proteose-pepton Hirn-Herz-Infusion ³ Herz-Infusion

Hefeextrakt Natriumchlorid

17	17	17	17	17	17
3	3	1,5	-	-	-
10	5	5	-	-	-
35	17,5	-	-	-	-
-	-	25	20	10	15
3	3	3	3	3	3
7,5	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5

Fortsetzung

Bestandteile des Kulturmediums (g/l)

TI-"-a TF-b TF-c TF-d TF-c TF-I"

Glucose Lactose L-Cystin Natriumsulfit Natriumthioglykolat

Agar
oder

Dikaliumhydrogenphosphat

6	6	6	12	12	12
5	5	5	10	10	10
0,25	0,5	0,5	-	-	-
0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
0	0	0	0	0	0
0,7	0,7	0,7	0,7	0,7	0,7
	_	2,5	2,5	2,5	2,5

10

(II) Abtrennung der Organismen von der Kultur

Die überstehende Flüssigkeit wird von der oben erhaltenen Kultur en'femt, um die Organismen zu erhalten. Zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit kann ein herkömmliches Verfahren angewendet werden, beispielsweise ein Zentrifugierverfahren oder Filterverfahren. Man kann dabei eine Filtrierhilfe verwenden. Die erhaltenen Organismen werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen und anschließend nach einem herkömmlichen Verfahren getrocknet, beispielsweise durch Gefriertrocknung, oder sie werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen und nachfolgend mit einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, wie Ethanol, Aceton oder dgl., während einer kurzen Zeit gewaschen und anschließend auf herkömmliche Weise, beispielsweise durch Lufttrocknung oder dgl., getrocknet. Ferner werden die getrockneten Organismen erforderlichenfalls pulverisiert.

(III) Extraktionsverfahren

Zu den oben erhaltenen, getrockneten Organismen wird ein Dialkylsulfoxid zugegeben, beispielsweise Dimethylsulfoxid, Diethylsulfoxid oder dgl., vorzugsweise Dimcthylsulfoxid, und zwar in einer Menge von 10 bis 50 ml/g getrocknete Organismen. Die Extraktionsbehandlung wird durchgeführt unter Rühren bei Raumtemperatur bis 80⁰C während 30 Minuten bis mehreren Tagen, vorzugsweise bei etwa 65⁰C während 3 bis 5 Stunden. Danach werden unlösliche Bestandteile mittels eines herkömmlichen Verfahrens, wie Dekantieren, Zentrifugieren, Filtrieren oder dgl., entfernt. Ferner wird dem erhaltenen Extrakt ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zugesetzt, beispielsweise ein Keton, wie Aceton, Diethylketon, Methylethylketon oder dgl., oder ein Alkohol, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol oder dgl., und zwar in einer Menge von mehr als dem 5fachen, bezogen auf die Menge des Extrakts (Volumen/Volumen) bei einer tiefen Temperatur. Vorzugsweise wird das hydrophile, organische Lösungsmittel unter sauren Bedingungen zugesetzt. Beispielsweise wird Aceton zusammen mit Chlorwasserstoffsäure zugesetzt und das resultierende Gemisch mehrere Stunden bis mehrere Tage bei etwa 4°C stehengelassen.

Das Präzipitat wird auf herkömmliche Weise abgetrennt. Anschließend wird das so erhaltene Präzipitat einer Deproteinisierungsbehandlung oder einer Ultrafiltrationsbehandlung unterworfen, und zwar entweder einem dieser Verfahren allein oder einer Kombination von beiden Verfahren.

(IV) Deproteinisierung, Ultrafiltration und Isolierung der angestrebten Substanz

Das auf die oben beschriebene Weise erhaltene Präzipitat wird der Deproteinisierungsbehandlung und nachfolgend der Ultrafiltrationsbehandlung unterworfen oder es wird der Deproteinisierungsbehandlung allein unterworfen oder es wird der Ultrafiltrationsbehandlung allein unterworfen, um die carcinostatische Substanz TF-500 oder ein Salz derselben zu erhalten.

/ur Deproteinisierungsbehandlung können an sich bekannte Verfahren verwendet werden. Fails die Deproteinisierung durchgeführt wird durch eine Behandlung mit einem proteolytischen Enzym, so wird das erhaltene Prä/ipilat in Wasser oder in einer Pufferlösung aufgelöst oder suspendiert, der resultierenden Lösung oder Suspension ein proteolytisches Enzym zugesetzt und die Enzymbehandlung auf eine herkömmliche Weise durchgeführt.

Als proteolytische Hn/ynie kann man beispielsweise Pronase, Papain, Trypsin, Chemotrypsin und dgl., verwenden. Pronase und Trypsin sind bevorzugt. Es ist insbesondere bevorzugt, vor oder während der Enzymbehandliing die wäßrige Lösung auf pH 7 bis 8 einzustellen und zu halten. Zu diesem Zweck kann man Natriumhydroxid. Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Ammoniumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat und dgl. verwenden, /ur Verhinderung einer Putrefraktion des Reaktionsgemisches während der Enzymbehandlung ist es erwünscht, eine geringe Menge eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform. Toluol oder dgl., zuzusetzen. Das Enzym wird gewöhnlich in einer Menge von etwa 1 bis 4 Gew.-",.. bezogen auf das Gewicht des der Fnzymbchandlung /u unterwerfenden Pulvers (Festkörper), zugesetzt.

Die obige Enzymbehandlung erfolgt üblicherweise bei 30 bis 4O⁰C während 1 bis 72 Stunden und vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Sie kann auch durchgeführt werden, indem man zunächst z. B. etwa 1 bis 2 Gew.-⁰,, eines Enzyms zum Pulver (Festkörper) gibt und sodann das Pulver (Festkörper) 1 bis 24 Stunden der Enzymbehand-

20

25

30

40

45

50

60

6 5

lung unterwirft und nachfolgend nochmals etwa 1 bis 2 Gew.-% des Enzyms für eine zusätzliche Enzymbehandlung zusetzt.

Nach der obigen Enzymbehandlung werden erforderlichenfalls unlösliche Bestandteile entfernt, und zwar durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dgl. Sodann wird aus dem auf diese Weise erhaltenen, wasserlöslichen .Anteil die carcinostatische Substanz TF-500 isoliert.

Die Isolierung von TF-500 aus dem wasserlöslichen Anteil kann zunächst durchgeführt werden durch mindestens eine Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH-Wert sowie durch gesonderte Fällung aus einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, durch Fraktionierung mit einem Ionenaustauscher und dgl. und nachfolgend

™ durch Ultrafiltration (die Behandlung kann zweimal wiederholt werden). Genauer gesagt wird die vorliegende,

carcinostatische Substanz TF-500 erhalten durch Einstellen des pH-Wertes des obigen, wasserlöslichen Anteils auf vorzugsweise einen pH von nicht mehr als 2,5 (wobei man erforderlichenfalls Trichloressigsäure zusetzen kann). Dann wird der erhaltene Niederschlag abgetrennt. Nun gibt man zum löslichen Anteil ein hydrophiles, :, organisches Lösungsmittel, wie Ethanol, so daß seine Konzentration 30 bis 80 und vorzugsweise 60 bis 80 Vol.-%

j beträgt. Dann wird der gebildete Niederschlag abgetrennt. Es handelt sich dabei um die Fraktion derangestreb-

ten Verbindung. Nachfolgend kann erforderlichenfalls dieser Niederschlag mit einem Anionenaustauscherharz behandelt werden, z. B. Dowex 1®, Amberüte IRA-400®, DEAE-Sephadex®, DEAE-Cellulose® oder dgl.; diese Behandlung kann mehrmals durchgeführt werden. Man isoliert dabei die nichtadsorbierten Fraktionen, und diese werden erforderlichenfalls einer Ultrafiltration unterworfen (nomineller Molekulargewichtsabbruch: 50000 bis 200000). Hierzu verwendet man entsprechende Ultrafiltrations-Membranen. Sodann werden eine erhaltene, wäßrige Lösung des Präzipitats oder die durch Ultrafiltration erhaltenen Fraktionen weiteren Behandlungen unterzogen, wie einer Einengung, Entsalzung oder Aussalzung oder dgl. Das konzentrierte und entsalzte Produkt wird getrocknet. Eine 0,2%ige wäßrige Lösung dieser TF-500 Substanz (Gew./Vol.) ist transparent.

Die auf diese Weise erhaltene, carcinostatische Substanz TF-500 hat die nachfolgend aufgeführten Eigenschaften. Sie kann in ein pharmazeutisch akzeptables Salz umgewandelt werden, und zwar nach herkömmlichen Verfahren. Diese pharmazeutisch akzeptablen Salze umfassen beispielsweise Alkalimetallsaize, wie Natriumsalze, Kaliumsalze und dgl., und Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumsalze, Calciumsalze und d&i. Die Eigenschaften der carcinostatischen Substanz TF-500 sind wie folgt:

(a) Grauweißes bis hellbraunes Pulver.
(b) Die Substanz hat eine carcinostatische und eine immunostimulierende Wirkung.

(Ο Die Substanz ist in Wasser löslich, jedoch unlöslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Benzol, Chloroform,

Ethylacetat und Diethylether,
(d) Die Substanz hat keinen klaren Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 180⁰C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert oberhalb 195°C.

J5 (e) Ihr Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten nach dem KBr-Verl'ahren, weist Absorptionsbanden auf in der Nähe von 3500-3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000, 970 und 840-800 cm '.

(f) Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum ihrer wäßrigen Lösung bei einem pH-Wert von 7,0 zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und zeigt ein Absorptionsmaximum in der Nähe von 246 bis 280 nra. (g) Die Substanz verhält sich positiv bei der Molish-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstofisäure-Reaktion und Lowry-Folin-Reaktion,jedoch negativ bei der Ninhydrin-Reaktion.

(h) Elementaranalysen-Werte C 38-47%, H 5-7%, N 1-4%.

(i) Der Saccharidgehalt der Substanz, bestimmt mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens, beträgt etwa 12 bis 30 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und ihr Proteingehalt, bestimmt mittels des Lowry-Folin-Verfahrens, beträgt etwa 10 Gew.-"/,, oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin.

Die pharmakologischen Aktivitäten der vorliegenden carcinostatischen Substanz TF-500 sind wie folgt. (I) ElTekt der TF-Substanz auf Zellenlebensfähigkeit (Koloniebildungs-Assay)

Basierend auf dem Verfahren von Kim. J. H. et al. [Cancer Res. 25, 698 (1965)], v/erden HeLa S-3 Ζεϋεη ir. Eagle's MEM, das mit 10% Kalbserum ergänzt ist, kultiviert, und zwar während 3 bis5 Tagen bei 37⁰C. Anschließend wird die Kultur entfernt und eine PBS-Lösung (eine wäßrige Lösung, enthaltend 8,0 g/l Natriumchlorid,

0,2 g/l Kaliumchlorid, 1,15 g/l DinatriumhydrogenphosphatundO,2g/lKaliumdihydrogenphosphat) mit einem »

Gehalt an 0,01 Gew.-¹!,, Ethylendiamintetraessigsäure und 0,1 Gew.-% Trypsin, wird der erhaltenen Zellen- |

schicht zugesetzt, und zwar mittels einer Pipette unter Ausbildung einer Suspension. Die erhaltene Zellensus- |

pension wird verdünnt mit Eagle's MEM, das mit 20% Kalbserum ergänzt ist, und zwar in der Weise, daß sie 300 Zellen/ml enthält. 1 ml dieser Zellensuspension wird 24 h bei 37°C in einem COi-Inkubator kultiviert und zu der resultierenden Kultur wird anschließend die carcinostatische Substanz TF-500, erhalten in dem weiter unten beschriebenen Beispiel 1, zugegeben, und zwar so, daß Konzentrationen von 250,500 und 1000 ug/ml erhalten werden. Es werden zwei Experimente durchgeführt, wobei in einem Fall Serum (20%, Vol./Vol.j der Kultur zugesetzt wird und wobei im anderen Fall kein Serum zugesetzt wird. Nach 24stündiger Behandlung werden die Zellen mit der serum freien Kultur gewaschen und den Zellen wird nachfolgend die Kultur zugesetzt, welcher 20% Kalbserum zugefügt sind Daraufhin werden die Zellen 6 Tage in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Nach der Kultivierung werden die Zellen mittels Ethanol fixiert und mit einer Giemsa-Färbelösung angefärbt. Die resultierenden Kolonien werden gezählt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Dabei wurde die Lebensfähigkeit der Zellen nach der folgenden

Gleichung bestimmt:

Zellenlebensfähigkeit (%) =

_ Anzahl der Kolonien in der behandelten Gruppe

Anzahl der	Kolonien in der ι	mil Serum ver
Tabelle 2		setztes Kultur
Konz. der	jnbehandelten Gruppe	medium
carcinoslatischcn		100
Substanz	Zellenlebenslahigkeit	103,2
(y.g/ml)		98,5
	serumlreies	97,1
0	Kulturmedium
250
500	100
1000	103,8
100,2
55,2

xlOO.

(II) Immunostimulierende Wirkung

Drei Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) werden in jeder Gruppe verwendet. 5 ug, 50 ^g und 510 ;j.g/kg Testsubstanz werden den Mäusen intraperitoneai verabreicht. 24 Stunden nach der Verabreichung werden in den Schwanz der Maus 0,2 ml einer KohlenstofTsuspension intravenös injiziert. Diese wurde hergestellt durch Vermischen von 1 ml Pelikan Zeichentusche Nr. 17 Schwarz mit 2 ml einer physiologischen Salzlösung, enthaltend 3 Gew.-% Gelatine. 1,5,10 und 15 min nach der Injektion werden aus der Orbita 0,02 ml Blut gewonnen, wobei man eine Hämatokrit-Kapillare verwendet, die mit Heparin beschichtet ist. Das Blut wird sofort verdünnt und hämolysiert, und zwar mit 1,6 ml einer 0,lgew.-%igen wäßrigen Natriumcarbonatlösung. Diese Suspension wird einer Colorimetrie bei 675 nm unterzogen. Der Phagocytose-lndex (K-Wert) wird aus der Gleichung von Halpern et al. ermittelt.

Den Mäusen der Blindgruppe werden 0,2 ml physiologische Salzlösung verabreicht.

_K _ log Q - log C

C₀ bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum Zeitpunkt /„; C bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum Zeitpunkt ι. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

Dosis (ig/kg)

Durchschnittlicher K-Wert

5	0,0418 ±0,0089
50	0,0560 ±0,0016
500	0,0561 ±0,027
Vergleich	0,0276 ± 0,0020

Bemerkung:

Es wurde die in Beispiel 1 erhaltene, carcinostatische Substanz

verwendet..

(III) Antitumor-Aktivität gegen Sarcoma-180 Zellen

Sarcoma-180 Zellen werden subkutan transplantiert, und zwar in Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) in die Armbeuge in einer Menge von 1 x 10" Zellen/Maus. Nachfolgend wird eine jede der Testsubstanzen in einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst und 0,2 ml einer jeden der resultierenden Lösungen werden intravenös verabreicht, und zwar jeder Maus einmal pro Tag am 10. und 12. Tag nach der Transplantation der Krebszellen. Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung auf die gleiche, oben beschriebene Weise verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4

Dosis	Mittl. Tumor	Hämorrhagische	7/C⁺³ (%)
(mg/ks)	gewicht ± Stan	Necrose des	(Tag 14)
	dardabweichung	Tumors
	(gl	(Tag 14)

0,5'' 3,4 ±0,7 5/5 53

ί,Ο"¹ 3,6 ±0,7 4/5 56

0,5^τ: 4,1 ± 2,4 3/5 63

1.0-^: 5,0 ± 1,9 3/5 79

Vergleich 6.4 ± 2,7 0/5 ' 100

Bemerkungen:

+1 Es wird üie im Beispiel 1 erhaltene, earcinostatische Substanz verwendet.

+2 Es wird die im Beispiel 2 crnaltt-ne, carcinoslaiische Substanz verwendet.

, _ Mittl. Tumorgewicht der Maust' hei Verabreichung der Testsubstanz

MiUl. Tumorgewichl der Mäuse der Vergleichsgruppe
20

(IV) Akute Toxi/ität

LDs₍i-\Verte werden bei Mäusen (ICR-Stamm, weibiieh, 6 Wochen alt. intravenöse Verabreichung) gemessen. Der LD-io-Wert von TF-500 beträgt mehr als 10 mg/kg.

Man erkennt aus den obigen pharmakologischen Experimenten, daß aie TF-500 Substanz der vorliegenden Erfindung als carcinostatisches Mittel brauchbar ist. Es kann eine Wirksamkeit gegen verschiedenste Krebserkrankungen erwartet werden.

Die TF-500 Substanz oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze gemäß der vorliegenden Erfindung können j zu verschiedensten pharmazeutischen Darreichungsformen verarbeitet werden. Insbesondere können orale

Mittel hergestellt werden oder Injektionsmittel, Suppositorien Gder dgl.

Im Falle oraler Mittel können diese verschiedene Hilfsstofie enthalten und in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern oder Granulaten vorliegen. Im Falle von Injektionsmitteln können diese Pur subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion und intravenöse Injektion vorgesehen sein. Es kann sich dabei um Suspension oder Lösungen handeln oder um Pulver, welche vor Gebrauch in einer physiologischen Salzlösung oder in einer GIucose oder ein Lokalanästhetikum enthaltenden Lösung auigeKv.,·. werden. Die Dosis der erfindungsgemäßen TF-500 Sm, stanz oder ihres pharmazeutisch akzeptablen Salzes kann je nach dem Zustand des Patienten in zweckentsprechender Vvt.se ausgewählt werden. E? ist jedoch im aligemeinen erwünscht, einem Erwachsenen 0,001 bis 0,1 mg/kg einmal am Tag oder mehrmals am Tag zu verabreichen. Was die Verabreichungsmethode anbelangt, so ist die orale Verabreichung, die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder die Injektion in den erkrankten Bereich bevorzugt.

Ausfuhrungsbeispiele

Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen anhand von Beispielen, Präparatbeispielen und Zeichnungen näher erläutert; es zeigt

Fig. 1 eine mikroskopische Photographie der Form des Fusobacteriums nucleatum ATCC 31647, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird;

Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der in dem nachfolgenden Beispiel 1 erhaltenen Substanz TF-500; Fig 3 ein Ultiaviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 4 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der in dem nachfolgenden Beispiel 2 erhaltenen Substanz TF-500; Fig. 5 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 6 ein Infrarci-Absorptionsspektrum der in dem nachfolgenden Beispiel 3 erhaltenen Substanz TF-500; Fig. 7 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 8 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der im folgenden Beispiel 4 erhaltenen Substanz TF-500; und
Fig. 9 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz.

Beispiel 1

(t) In ein 90 ι Fermentationsgelaß gibt man 70 1 eines TF-f Kulturmediums, enthaltend 1190 g Trypticasepepton. 105OgH .zinfusion,210g Hefeextrakt,525gNatriumchlorid,840gGlucose,700gLactose,7gNatriumsulfit, 35 g Natnumthioglykolat und 175 g Dikaliumhydrogenphosphat. Das Kulturmedium wird mit 4 N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7,5 eingestellt. Das Kulturmedium wird 15 min bei I I8°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wird Stickstoflgas während 1 h mit einem Durchsatz von 250 ml/min durchgelcitet. Nun wird das Kulturmedium mit etwa 900 ml einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum ATCC-31647 geimpft, welche zuvor hergestellt wurde durch Kultivierung in einem TF-f Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie oben. Die Zellen werden 4 Tage bei 33°Cunter Ruh: en (90 U/min) kultiviert, wobei Stickstoffgas mit einer Rate von 250 ml/min eingeleitet wird.
(2) Eine 12 1-Portion der so erhaltenen Kultur wird zentrifugiert (4 Χ 10³ U/min; 10 min), um die Organismen

zu sammein. Die Organismen werden mit 1 1 physiologischer Salzlösung gewaschen und nachfolgend entfettet und mit 1 I Ethanol und 1 1 Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen und anschließend getrocknet. Man erhält 14,2 g der Organismen. Die Organismen werden in 300 ml Dimethylsulibxid suspendiert und einer Extraktion unterworfen, und zwar während 4 h unter Rühren und Erhitzen der Suspension auf 65°C. Nachfolgend wird die Suspension unter Absauger, filtriert, um ein Filtrat zu erhalten. Diesem Filtrat werden 21 Aceton und 8 ml konz. Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird anschließend 2 Tage stehengelassen, damit sich das resultierende Prä'zipiiat absetzt und altert. Dieses Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt (4 x 10¹ U/min; 10 min) (748 mg;.

(3) Die auf diese Weise erhaltenen 748 mg des Präzipitats werden in 15 ml Wasser aufgelöst, und die resultierende Lösung wird mit Ammoniumcarbonat auf pH 7,8 bis 8,0 eingestellt. Dieser Lösung werden zwei 7,5-mg-Portionen Pronase E 1 000000 Tyrosineinheiten/g) zugesetzt, und zwar mit einem 30-min-Intervall, und es werden anschließend einige Tropfen Toluol zugegeben. Daraufhin wird das resultierende Gemisch der Enzymbehandlung bei 37°C während 24 h unterworfen. Dem auf diese Weise behandelten Gemisch wird Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, um den pH auf 1 einzustellen. Anschließend wird Ethanol zugegeben, und zwar in der Weise, daß die Ethanolkonzentration 80 VoL-% beträgt. Das resultierende Gemisch wird zentrifugiert (4 x 10³ U/min; 10 min) und das resultierende Präzipitai gesammelt (288,6 mg).

(4) Die 288,6 mg des erhaltenen Präzipitats werden in 50 ml Wasser aufgelöst und die resultierende Lösung wird durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran UK-50 auf 5 ml konzentriert. Der auf diese Weise erhaltenen, konzentrierten Lösung werden 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die so erhaltene, verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung der Ultrafiltrationsmembran UK-50. Diese konzentrierte Lösung wird durch ein Millipore Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2 y.m filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 264 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-500.

Die auf diese Weise erhaltene, carcinostatische Substanz TF-500 hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 2 sowie das Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 3.

Beispiel 2

(1) Aus 70 1 der in Beispiel 1-(1) erhaltenen Kultur werden die Organismen isoliert, und zwar durch Filtration durch Hyflo Super CeI. Das resultierende Gemisch der Organismen mit Hyfio Super CeI wird mit 201 physiologischer Salzlösung gewaschen und anschließend entfettet und mit 3 1 Ethanol und 3 1 Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen. Man erhält 3,2 kg der getrockneten Mischung. Eine 320-g-Portion dieser Mischung wird in 400 ml Dimethyisulfoxid suspendiert und die resultierende Suspension wird einer Extraktion unterworfen, und zwar

unter Rühren während 4 h, während das Ganze auf 65°C erhitzt wird. Nachfolgend wird die Suspension unter |

Absaugen filtriert, um ein Filtrat zu isolieren. 2,5 I Aceton und 10 ml konz. Chlorwasserstoffsäure werden dem 35 %

Filtrat zugesetzt, woraufhin das resultierende Gemisch 2 Tage bei 4°C stehengelassen wird, um das Präzipitat | abzusetzen und zu altern. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt (4 x 10' U/min; 10 min) (94 mg).

(2) In 50 ml Wasser werden die auf diese Weise erhaltenen 94 mg des Präzipitats aufgelöst und die resultie- ft. rende Lösung wird auf 5 ml konzentriert, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltra- " tions-Membran UK-50. Der erhaltenen, konzentrierten Lösung werden 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die

so verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultra- |

filtrations-Membran UK-50. !■

Die so erhaltene, konzentrierte Lösung wird durch ein Millipore Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2 um filtriert und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 62,6 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-500. 45 |

Die auf diese Weise erhaltene, carcinostatische Substanz TF-500 hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarotabsorptionsspektrum gemäß Fig. 4 sowie das Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 5.

Beispiel 3

(1) F.inc 7,2-1-Portion der in Beispiel 1-(1 !erhaltenen Kultur wird zentrifugiert (5 x 10' U/min; 10 min), um die Organismen /u isolieren Diese werden gefriergetrocknet. Eine 3,5-g-Portion der gefriergetrockneten Organismen wird in KK) ml physiologischer Salzlösung suspendiert und die resultierende Suspension wird mit 2 N wäßriger Niitriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt, 3 h gerührt und dann 24 h stehengelassen. Dann wird die Suspension zentrifugiert (5 x 10' U/min; 10 min), um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Dem erhaltencn Prii/ipitat werden 100 ml physiologische Salzlösung zugesetzt und das resultierende Gemisch wird mit 2 N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt. Das Gemisch wird 2 h gerührt und anschließend zentrifugiert (5 x 10¹ U/min; 10 min), um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Nachfolgend wird das erhaltene Präzipitat mit drei 50-ml-Portionen Ethanol, einer 50-ml-Portion Aceton und einer 50-ml-Portion Diethylether in dieser Reihenfolge gewaschen, wobei die Entfernung der Waschflüssigkeiten durch Zentrifugieren erfolgt (5 x 10' U/min; 10 min). Anschließend wird das Präzipitat getrocknet, um trockene Organismen zu erhalten. Die Organismen werden pulverisiert, um ein Pulver derselben zu erhalten. Dem Pulver werden 70 ml DimetJiylsulfoxid zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird extrahiert, und zwar unter Rühren bei 63 bis 65°C während 4 h. Anschließend wird eine Saugfiltration durchgeführt, um ein Filtrat zu isolieren. Dieses Filtrat wird mit 536 ml Aceton und 1 ml konz. ChlorwasserstolTsäure versetzt und das resultierende Gemisch wird 24 h bei 4°C stehengelassen, um ein Absetzen und eine Alterung des Präzipitats zu bewirken. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren isoliert (5 x 10' U/min; 10 min) (269 mg).

(2) Den 2b^l\ mg des auf diese Weise erhaltenen Filtrats werden 2,7 ml Wasser zugesetzt, und das resultierende

Gemisch wird mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt. Dann wird Wasser zugegeben, um das Endvolumen aul"4 ml einzustellen. Dem Gemisch werden 2,7 mg Pronase E (1U00000 Tyrosincinheiten/g) zugesetzt und das resultierende Gemisch wird 1 h bei 37⁰G der Enzymbehandlung unterworfen. Ferner werden 2,7 mg Pronase E und einige Tropfen Toluol zugesetzt und das resultierende Gemisch wird 24 h bei 37°C

der Enzymbehandlung unterworfen. Unlösliche Bestandteile werden aus dem so behandelten Gemisch durch Zentrifugieren abgetrennt (5 x 10' U/min; 10 min) und die erhaltene Lösung wird mit 2 N Chlorwasserstoffsäure versetzt, um den pH derselben auf 1,0 einzustellen. Daraufhin wird Ethanol zugegeben, und zwar in der Weise, daß die Ethanolkonzentration 80 Vol.-% ausmacht. Das dabei erhaltene Präzipitat wird durch Zentrifugieren isoliert (5 x 10³ U/min; 10 min) (78,5 mg).

(3) Den 78,5 mg des so erhaltenen Präzipitats werden 20 ml Wasser zugesetzt und das resultierende Gemisch wird mit 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7 eingestellt. Nachfolgend wird das resultierende Gemisch auf 5 ml konzentriert, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-50. Der so erhaltenen, konzentrierten Lösung 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die so verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafil-

trations-Membran UK-50. Die erhaltene, konzentrierte Lösung wird wiederum mit 45 ml Wasser versetzt und die verdünnte Lösung wiederum auf5 ml konzentriert durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultraiillrations-Membran UK-50. Dieses Konzentrat wird durch ein Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,2 Mtn filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 65 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-500.

Die 50 erhaltene, carcinostatische Substanz TF-500 hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 6 und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 7.

Beispiel 4

(I) Eine 10-I-Portion der in Beispiel l-( 1) erhaltenen Kultur wird zentrifugiert (5 x 10^J U/min; 10 min), um die Organismen zu isolieren. Den Organismen werden 500 ml physiologische Salzlösung zugesetzt, und d-js resultierende Gemisch wird 30 min gerührt. Anschließend wird zentrifugiert (5 x 10^! U/min; 10 min), um das Präzipitat zu isolieren. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt. Dem auf diese Weise erhaltenen Präzipitat werden 500 ml physiologische Salzlösung zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird 30 min gerührt, anschließend mit 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und nachfolgend 30 min gerührt. Dann wird das Gemisch zentrifugiert (5 x 10' U/min; 10 min) und entfettet sowie mit 500 ml physiologischer Salzlösung gewaschen. Daraufhin wird das Gemisch zentrifugiert (5 x 10"' U/min; 10 min), um das Präzipitat zu erhalten. Das erhaltene Präzipitat wird mit einer 500-ml-Portion physiologischer Salzlösung, einer 300-ml-Portion Ethanol und einer 300-ml-Portion Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen, wobei die Entfernung der Waschflüssigkei-

ten durch Zentrifugieren (5 x 10"' U/min; 10 min) erfolgt. Nachfolgend wird getrocknet, um getrocknete Organismen zu erhalten. Die so erhaltenen Organismen werden pulverisiert, um ein Pulver derselben zu erhalten. Dieses Pulver wird mit 160 ml Dimethylsulfoxid versetzt und das resultierende Gemisch anschließend der Extraktion unter Rühren bei 63 bis 65°C während 4 h unterworfen. Anschließend wird das Gemisch unter Absaugen filtriert, um ein Filtrat zu erhalten. Dem Filtrat werden 1,2 1 Aceton und 4,2 ml konz. Chlorwasser-

■40 stoffsäure zugesetzt, woraufhin das resultierende Gemisch 24 h bei 4°C stehengelassen wird, um das Präzipitat abzusetzen und zu altern. Dieses Präzipitat wird abzentrifugiert (5 x 10¹ U/min; 10 min), um das Präzipitat zu sammeln (246 mg).

(2) Den 246 mg des so erhaltenen Präzipitats werden 5 ml Wasser zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird mit 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7,8 eingestellt. Dein Gemisch werden 5 mg Pronase E (1000000 Tyrosin-Einheiten/g) zugesetzt und das Gemisch wird der Enzymbehandlung bei 37°C während 30 min unterworfen. Daraulhin wird dem Gemisch 1 N wäßrige Natriumhydroxidlösung zugesetzt, um den pH auf 7,8 einzustellen. Dann werden wiederum 5 mg Pronase E und einige Tropfen Toluol zugegeben. Das resultierende Gemisch wird der Enzymbehandlung bei 37°C während 24 h unterworfen. Dem behandelten Gemisch wird 1 N Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, um den pH auf 1,0 einzustellen, und das resultierende Gemisch wird 2 h stehengelassen und nachfolgend zentrifugiert (5 x 10' U/min; 10 min), um die überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Der erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit wird Ethanol zugesetzt zur Schaffung einer Ethanolkonzentration von 80 Vol.-%. Das resultierende Gemisch wird 2 h stehengelassen und zentrifugiert (5 x 10¹ U/min; 10 min), um das abgesetzte Präzipitat zu sammeln (98 mg).

(3) Den 98 mg des auf diese Weise erhaltenen Präzipitats werden 20 ml Wasser zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird mit 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7 eingestellt. Anschließend wird das resultierende Gemisch auf 5 ml durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-50 konzentriert. Der erhaltenen, konzentrierten Lösung werden 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die so verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-50. Der erhaltenen, konzentrierten Lösung werden wiederum 45 m! Wasser zugesetzt und die so verdünnte Lösung wird wiederum auf 5 ml konzentriert durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-50. Das erhaltene Konzentrat wird durch ein Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,2 um filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 83 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-500.
Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-500 hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 8 sowie das Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 9.

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Präparat 1

Eine wäßrige Lösung vonrpH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der in Beispiel 1 erhaltenen, carcinostatischen Substanz TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, v/obei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar als 0,5-mg-Einheit oder 1-mg-Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 0,5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die resultierende Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 2

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der in Beispiel 2 erhaltenen, carcinostatischen Substanz TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar als 0,5-mg-Einheit oder 1-mg-Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer ij 0,5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die resultierende Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 3

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der in Beispiel 3 erhaltenen, carcinostatischen Substanz TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar als 0,5-mg-Einheit oder 1-mg-Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 0,5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die resultierende Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 4

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einerr Gehalt der in Beispiel 4 erhaltenen, carcinostatischen Sub- ίο stanz TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar als 0,5-mg-Einheit oder 1-mg-Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 0,5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die resultierende Lösung wird Tür Injektionszwecke verwendet. ^

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch e:

1, Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen Substanz TF-500 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes derselben, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucieatum TF-031 ATCC 31647 der Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid unterzieht, ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel dem resultierenden Extrakt zusetzt, das erhaltene Präzipitat einer Deproteinisierungsbehandlung und/oder einer Ultrafiltrationsbehandlung unterwirft und dann die Substanz TF-500 mit folgenden Eigenschaften isoliert: