DE3032636A1

DE3032636A1 - (beta) -1,3-glucanpolyol, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindung enthaltendes tumorbehandlungsmittel

Info

Publication number: DE3032636A1
Application number: DE19803032636
Authority: DE
Inventors: Mariko Osaka Kakuta; Akira Nishinomiya Hyogo Misaki; Hideki Inazawa Aichi Miyachi; Hideo Kasugai Aichi Nagae; Mineo Hachioji Tokyo Nakayama
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 1979-08-29
Filing date: 1980-08-29
Publication date: 1981-04-09
Also published as: GB2061306B; GB2061306A; JPS5634701A; DE3032636C2; US4398023A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues ß-1,3-Glucanpolyol, welches sich von einem ß-1,3-Glucan ableitet, das durch einen ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia hergestellt worden ist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung und ein Arzneimittel, das das ß-1,3-Glucanpolyol als Wirkstoff enthält. Das ß-1,3-Glucanpolyol hat eine niedrige Toxizität und zeigt eine Antitumor-Aktivität.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein ß-1,3-Glucanpolyol mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften (I) und (II), das sich von einem von einem ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia hergestellten ß-1,3-Glucan ableitet. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung und ein Arzneimittel, das das ß-1,3-Glucanpolyol als Wirkstoff enthält.

Die charakteristischen Eigenschaften des ß-1,3-Glucanpolyols sind wie folgt:

(I) das Glucanpolyol enthält eine Hauptkette mit ß-1,3-Glucopyranose-Einheiten der folgenden Formel

E^ 3) ß-D-Glc (1 -4-*

in der GIc für eine Glucopyranose-Restgruppierung steht, als wiederkehrende Einheiten und daran gebunden entweder Seitenketten der unten angegebenen Formel (B) oder sowohl Seitenketten der unten angegebenen Formel (A) als auch Seitenketten der unten angegebenen Formel (B)

ß-D-Glc _χ 4-

(ß-D-Glc S)_n *· 3) ß-D-Glc ^b(l

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worin η eine Zahl von O bis 1 bedeutet und —{■■>· 3) ß-D-Glc O ■■; für die oben angegebene Hauptkette steht,

(ß-D-Glcf )

—£ 3) ß-

worin η und —& 3) ß-D-Glc (1 --JHh die im Zusammenhang mit der Formel (A) angegebenen Bedeutungen haben und R für eine von ß-D-Glucopyranose abgeleitete Gruppe der Formel

CH₂OH

HOHpC

HOH₂C 0

(manchmal als Polyalkoholrest bezeichnet) steht,

(II) das Glucanpolyol hat eine grundmolare Viskosität [~η] von etwa 1 bis etwa 10.

In dem oben beschriebenen ß-1,3-Glucanpolyol beträgt vorzugsweise die Anzahl der Seitenketten der Formel (B) etwa 25 bis etwa 70 pro 100 ß-1,3-Glucopyranose-Einheiten der Hauptkette --B> 3) -D-GIc (1 und die Anzahl der Seitenketten der Formel (A) beträgt auf der gleichen Basis 0 bis etwa 45·

Erfindungsgemäß kann das ß-1,3-Glucanpolyol dadurch hergestellt werden, daß man ein von einem ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia, z.B. dem Stamm Pestalotia Nr. 815 (FERM-P Nr.5147, DSM 1887), hergestelltes ß-1,3-Glucan einer Oxidationsbehandlung mit Perjodsäure oder ihrem wasserlöslichen Salz unterwirft und sodann einer Reduktionsbehandlung unterwirft, wobei man gewünschtenfalls es

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einer Behandlung zur Verminderung der Viskosität in einer beliebigen Stufe dieses Verfahrens unterwirft.

Das Ausgangs-ß-1,3-Glucan hat keine Seitenkette der Formel (B) und es enthält eine Hauptkette mit als wiederkehrende Einheiten ß-1,3-Glucopyranose-Einheiten der Formel

3) ß-D-Glc (1 -3—>

worin GIc für einen Glucopyranoserest steht,und an die Hauptkette gebunden Seitenketten der folgenden Formel (A)

(ß-IWJlcf )_n (A) —£ ⁶

worin η eine positive Zahl von O bis 1 bedeutet und —1~> 3) ß-D-Glc (1 —3—^ die obengenannte Hauptkette darstellt.

Vorzugsweise beträgt die Anzahl der Seitenketten der Formel (A) in dem ß-1,3-Glucan etwa 55 bis etwa 75/100 ß-1,3-Glucopyranose-Einheiten in der Hauptkette, und die Anzahl der .Seitenketten entsprechend η = 1 ist etwa 2 bis etwa 8/100 der genannten Einheiten.

Es ist bereits bekannt, daß Polysaccharide mit Antitumor-Aktivitäten in Polysacchariden gefunden worden sind, die aus Extrakten von Fruchtkörpern von Basidiomyceten oder von Mycelien oder Kulturbrühen von Basidiomyceten, Hefen und anderen Mikroorganismen, z.B. Glucanen, Mucopolysacchariden und Lipopolysacchariden, erhalten worden sind. Jedoch sind die Antitumor-Aktivitäten für die praktische Verwendung nicht ausreichend oder die Produkte haben ein enges Anti-

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tumor-Spektrum, so daß diese Polysaccharide nur eine begrenzte klinische Anwendung gefunden haben.

In Seikagaku, Band 50, Nr. 9, Seite 762, 1978 (veröffentlicht von der Japanese Biochemical Society am 25. September 1978) wird berichtet, daß saure Polysaccharide und wasserlösliches Glucan und in heißem Alkali unlösliches Glucan aus dem Fruchtkörper von Auricularia auricula-judae erhalten wurden und daß das wasserlösliche Glucan eine starke Hemmwirkung auf in Mäuse transplantiertes Sarcoma 180 zeigte, In dem Artikel werden die Analysenergebnisse dieser Polysaccharide angegeben. Ein ähnlicher Bericht erschien in Seikagaku, Band 51, Nr. 8, Seite 616, 1979 (veröffentlicht von der Japanese Biochemical Society am 25. August 1979).

Vor diesen Berichten haben einige Erfinder der vorliegenden Anmeldung, aufgebaut auf einen Bericht in Agricultural and Biologicyl Chemistry 42(2), 417-425, 1978, eine Patentanmeldung eingereicht, welche ein Verfahren zur Herstellung eines ß-1,3-Glucanpolyols mit einer grundmolaren Viskosität [71] von etwa 15 bis etwa 30 betraf. Bei diesem Verfahren ging man so vor, daß man den Fruchtkörper oder das Mycel eines Stammes der Gattung Auricularia mit einem wäßrigen Medium unter alkalischen Bedingungen extrahiert, den unlöslichen Teil sammelt, diesen einer Oxidationsbehandlung mit Perjodsäure oder ihrem wasserlöslichen Salz unterwirft und das erhaltene Produkt sodann einer Reduktionsbehandlung unterwirft. Diese Patentanmeldung betraf weiterhin das resultierende ß-1,3-Glucanpolyol und ein Tumorbehandlungsmittel, das das resultierende ß-1,3-Glucanpolyol enthielt (JA-OS 97285/78, offengelegt am 23. Februar 1980 mit der Offenlegungsschrift Nr. 25409/80).

Es wurden nun weitere Untersuchungen durchgeführt, um ein Glucanpolyol mit einem breiteren Spektrum der Antitumor-

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Aktivität zu erhalten. Diese Untersuchungen haben zu der Entdeckung geführt, daß ein ß-1,3-Glucanpolyol mit den oben angegebenen Parametern (I) und (II),das bislang noch nicht vorbeschrieben wurde, durch eine ähnliche Technik wie in der genannten älteren Anmeldung aus einem neuen Ausgangs-ß-1,3-Glucan hergestellt werden kann, welches Ausgangs-ß-1,3-Glucan aus einem ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia hergestellt worden ist. Das ß-1,3-Glucanpolyol ist durch eine grundmolare Viskosität [^] von etwa 1 bis etwa 10 charakterisiert, welche erheblich geringer ist als diejenige des in der älteren Anmeldung beschriebenen Polyols.

Von den Erfindern wurde weiterhin festgestellt, daß das ß-1,3-Glucanpolyol mit den oben angegebenen Parametern (I) und (II) ein neues Glucanpolyol ist, welches ein erheblich breiteres Antitumor-Spektrum zeigt als bekannte Polysaccharide mit Antitumor-Aktivitäten, welches eine niedrige Toxizität aufweist, welches den Alkoholrest R in der Formel (B) (welcher in dem nichtbehandelten ß-1,3-Glucan nicht vorhanden ist ) in dem Seitenkettenteil enthält und welches zwei klare Absorptionsbande in der Nachbarschaft von 2900 cm" im Infrarot-Absorptionsspektrum enthält, die in dem Infrarot-Absorptionsspektrum des unbehandelten ß-1,3-Glucans nicht vorhanden sind.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues ß-1,3-Glucanpolyol mit einem erheblich breiteren Antitumor-Spektrum als bekannte Polysaccharide mit Antitumor-Aktiv!täten zu schaffen.

Durch die Erfindung soll weiterhin ein Verfahren zur leichten Herstellung des neuen ß-1,3-Glucanpolyols mit guten Ausbeuten aus dem ß-1,3-Glucan, welches aus einem ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia hergestellt worden ist, zur Verfügung gestellt werden.

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Durch die Erfindung soll schließlich weiterhin ein Tumorbehandlungsmittel zur Verfügung gestellt werden, das das neue ß-1,3-Glucanpolyol als Wirkstoff enthält.

Nachfolgend werden zusammenfassend die Eigenschaften und die Struktur des erfindungsgemäßen ß-1,3-Glucanpolyols angegeben,

Homogenität

Die Substanz zeigt beim Gleichförmigkeitstest, der durch eine Ultrazentrifugenanalyse durchgeführt wird, einen einzigen Peak.

Die Substanz zeigt einen einzigen Flecken bei der Elektrophorese, bei der ein Natriumboratpuffer (pH = 9,3) als Lösungsmittelsystem verwendet wird. Das ß-1,3-Glucan gemäß der Erfindung kann daher als eine homogene Substanz angesehen werden.

Löslichkeit

Löslich bei Raumtemperatur in Wasser, einer wäßrigen 1N Natriumhydroxidlösung, Dimethylsulfoxid etc. (die Substanz bildet häufig eine sol-artige Lösung mit hoher Fließfähigkeit) . Unlöslich oder nur spärlich löslich bei Raumtemperatur in Alkoholen, Aceton, Äthern etc..

Grundmolare Viskosität

Die grundmolare Viskosität des erfindungsgemäßen ß-1,3-GIucanpolyols beträgt gewöhnlich etwa 1 bis etwa 10, obgleich sie geringfügig je nach dem Oxidationsgrad mit Perjodsäure oder ihrem wasserlöslichen Salz beim Herstellungsprozeß und je nach der Durchführung oder Nichtdurchführung einer Viskositätsverminderungsbehandlung und je nach dem Ausmaß dieser Behandlung etc. geringfügig schwanken kann. Die hierin verwendete grundmolare Viskosität [^] wird durch die folgende Gleichung definiert:

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] = lim ?_sp/C

C—» O

worin ^ = ("*! - ^₀)/"¹? _o = /V_o ~ ^ · Darin bedeutet V die Viskosität (bei 25°C in wäßriger Lösung) der Lösung und Tf _o die Viskosität des Lösungsmittels. C ist die Konzentration, ausgedrückt als g/100 ml.

Infrarot-Absorptionsspektrum

Zwei klare Absorptionen liegen in der Nachbarschaft von 29ΟΟ cm" vor. Diese Absorptionen unterscheiden sich von dem breiten Absorptionsspektrum des Ausgangs-ß-1,3-Glucans.

Die Fig. 1 der Zeichnungen zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr-Tablettenmethode) des in Beispiel 1 erhaltenen ß-1,3-Glicanpolyols. Die Fig. 2 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum des Ausgangs-ß-1,3-Glucans.

Zuckerkomponenten

Die durch vollständige Hydrolyse des ß-1_f3-Glucanpolyols mit gewöhnlichen anorganischen oder organischen Säuren erhaltenen Produkte wurden als D-Glucose, Glycerin und Glykolaldehyd in der Papierchromatographie bestimmt [Lösungsmittelsystem: Butanol/Pyridin/Wasser (6:4:3); Sprühreagens: Silbernitratlösung] .

Glucose und Glycerin wurden durch Gaschromatographie als Alditolacetat bestimmt.

Struktur

(A) Wenn das erfindungsgemäße Glucanpolyol vollständig mit 0,05N Perjodsäure oxidiert wird, dann werden 0 bis 0,52 Mol, bezogen auf die Bestandteilszuckerreste, Perjodat verbraucht. Gleichzeitig wird die Bildung von 0 bis 0,26 Mol Ameisensäure festgestellt.

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(B) Wenn das erfindungsgemäße Glucanpolyol mit Natriumborhydrid reduziert und sodann mit einer Säure vollständig hydrolysiert wird, dann werden als Zersetzungsprodukte Glucose allein oder sowohl Glucose als auch geringe Menge Glycerin und Glykolaldehyd gebildet.

(C) Wenn das erfindungsgemäße Glucanpolyol mit Per- ^odsäure oxidiert und hierauf mit Natriumborhydrid reduziert und sodann mit einer Säure bei milden Bedingungen hydrolysiert wird, dann wird ein wasserunlösliches, polymeres Glucan, das nur aus ß-(1 -» 3)-D-Glucosid-Bindungen zusammengesetzt ist, gebildet; in seinem wasserlöslichen Teil wird kein Zersetzungsprodukt festgestellt,oder wenn dies doch der Fall ist, dann wird nur eine geringe Menge von Glycerin festgestellt. In keinem Fall wird Glycerin-D-glucosid festgestellt.

(D) Wenn das unter (C) beschriebene, wasserunlösliche Glucan methyliert und hydrolysiert wird und die Methylzucker in Alditoiacetat umgewandelt werden und wenn eine gaschromatographische Analyse durchgeführt wird, dann werden nur 2,4,6-Tri-O-methyl-1,3,5-tri-O-acetyl-D-glucit und eine Spur von 2,3»4,6-Tetra-O-methyl-1,5-di-O-acetyl-D-glucit gebildet.

(E) Wenn das erfindungsgemäße Glucanpolyol methyliert und hydrolysiert wird und wenn hierauf die Methylzucker in Alditoiacetat umgewandelt werden und wenn eine gaschromatographische Analyse durchgeführt wird, dann werden 2,4,6-Tri-O-methyl-1,^^-tri-o-acetyl-D-glucit und 2,4-Di-O-methyl-1,3,5,6-tetra-O-acetyl-D-glucit und das hoch-fluchtige 1,3-Di-O-methyl-2-O-acetyl-gly.cerin voneinander getrennt und als Hauptkomponenten identifiziert. Geringe Mengen an 2,3,4,6-Tetra-O-methyl-1,5-di-O-acetyl-glucit und 2,3,4-Tri-O-methyl-1,5,6-tri-O-acetyl-D-glucit werden abgetrennt und identifiziert oder sie werden überhaupt nicht gebildet.

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Aus den erhaltenen Ergebnissen wird ersichtlich, daß das erfindungsgemäße neue ß-1,3-Glu.canpolyol ein Polysaccharid ist, das aus Glucose und dem Polyalkoholrest R in Formel (B) zusammengesetzt ist, wobei die Seitenketten der Formel (B) oder sowohl Seitenketten der Formel (B) als auch der Formel (A) an den Glucopyranose-Rest, der die Glucan-Hauptkette der ß-(1 ■* 3)-Bindung bildet, angefügt sind. Es wird ersichtlich, daß, wenn in der Formel (B) η den Wert 1 hat, die ß-D-Glucopyranose mit η auch die durch R angegebene Struktur haben kann. Die Formel (B) soll diesen Fall einschließen. In dem erfindungsgemäßen Glucanpolyol könnte auch ein Rest mit einer niedrigeren Kohlenstoffzahl, der von der Hydrolyse des Polyalkoholrestes mit 5 Kohlenstoffatomen der Formel R herrühren könnte, miteinander vorliegen. Auch dieser Fall soll vom Rahmen dieser Erfindung umfaßt werden.

Der Verhältnisanteil der Seitenketten der Formel (A), bezogen auf die ß-(1 ·> 3)-Glucopyranose-Einheiten der Hauptkette im erfindungsgemäßen ß-1,3-Glucanpolyol kann aus der verbrauchten Menge Perjodsäure im Versuch (A) errechnet werden, welcher oben im Zusammenhang mit der Struktur angegeben wurde. Der Verhältnisanteil der Seitenketten der Formel (B) kann aus den Molverhältnissen von Glycerin und Glucose in dem oben im Zusammenhang mit den Zuckerkomponenten angegebenen Versuch errechnet werden.

Die Verhältnismengen der Seitenketten der Formeln (A) und (B) können auch aus den Verhältnisanteilen von 2,3,4,6-Tetra-O-methyl-1,5-di-Q-acetyl-D-glucit, 2,4,6-Tri-O-methyl-1,3,5-tri-O-acetyl-D-glucit, 2,3,4-Tri-O-methyl-1,5,6-tri-O-acetyl-D-glucit, 2,4-Di-O-methyl-1,3,5,6-tetra-O-acetyl-D-glucit und 1^-Di-O-methyl^-O-acetylglycerin errechnet werden.

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Das ß-1,3-Glucan, das zur Herstellung des erfindungsgemäßen ß-1,3-Glucanpolyols verwendet wird, kann dadurch erhalten werden, daß man einen ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia kultiviert und das Produkt aus der KuI-turbrUhe gewinnt.

Ein Beispiel für einen ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm ist der Stamm Pestalotia Nr. 815 (z.B. der Stamm FERM-P 5147; DSM Nr. 1887). Die mikrobiologischen Eigenschaften von Pestalotia Nr. 815 sind wie folgt.

Kultureigenschaften

Kolonien auf Kartoffel-Glucoseagar. Rasche Bildung. Ausbreitung. Farbe weiß, die später gräulich-braun wird. Luft-Hyphen. Spärlich. Im Zentrum dicht, im Randbereich spärlich. Bei der Reife entwickeln sich Häufchen. Verstreute oder angewachsene Konidien in einer grünlich-schwarzen Masse, wenn sich die Häufchen entwickeln. Rückseite fast farblos.

Mikroskopische Beobachtungen

Lufthyphen; glasig, unregelmäßig verzweigt; Breite 2 bis 3/um. Konidiophoren; längs zylindrische Form; 10 bis 20/um (manchmal 30 /um) lang; Aseptat; Breite 2 bis 3,5/um; annelliert. Konidien; thallisch; vom aleuriokonidisehen Typ, keulenförmig; fusoid; 4-septiert (5 Zellen), mit Hyalin; gepunktete Endzellen; 18 bis 25/um χ 5 bis 6/um. An der Spitze mit Anhängsel versehen; lang; 2 oder 3 an der Zahl; 15 bis 30 /um (manchmal 50 /um) lang; basales Anhängsel; einzeln; geradlinig; 6 bis 10 /um lang. Mittlere 3 Zellen; fahlbraun; an den Scheidewänden angeschnürt; Konidien, erzeugt aus den Konidiophoren, mit Annellierung.

Taxonomisehe Position

Aufgrund der oben angegebenen Kulturcharakteristika und mikroskopischer Beobachtungen wurde dieser Mikroorganismus

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als zugehörig zu der Art Deuteromycotina (Unterabteilung), Coelomycetes (Klasse), Melanconiales (Klasse), Pestalotia (Gattung), entsprechend "Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi", 6. Auflagei Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England (1971), identifiziert.

Das erfindungsgemäß verwendete Ausgangs~ß-1,3-Glucan kann dadurch hergestellt werden, daß man den vorgenannten ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia kultiviert bzw. züchtet, die Mycelien von der Kulturbrühe entfernt, Methanol, Äthanol, Aceton etc. zusetzt, um das rohe Glucan auszufällen, und gewünschtenfalls das rohe Glucan reinigt und hierauf das gereinigte Glucan gewinnt.

Die Kultivierung erfolgt unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das geeignete Kohlenstoffquellen enthält und das vorzugsweise weiterhin geeignete Stickstoffquellen und Mineralien enthält. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Mannose, Fructose, Sorbose, Saccharose, Maltose und Mannit. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind organische Stickstoffquellen, wie Pepton, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit und entfettetes Sojabohnenmehl, und anorganische Stickstoffquellen, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat. In vielen Fällen werden bessere Ergebnisse erhalten, wenn man geringe Mengen von Mineralien, wie Magnesiumsalze und Phosphorsäuresalze, und Vitamine zusetzt.

Die Kultivierung kann in einem flüssigen Kulturmedium oder einem festen Kulturmedium durchgeführt werden, wobei Jedoch die Verwendung eines flüssigen Kulturmediums üblicher ist. Vorzugsweise wird eine Schüttelkolben-Kultivierung oder eine Kultivierung unter Belüften und Rühren in einem flüssigen Kulturmedium durchgeführt. Die Kultivierung kann bei etwa 10 bis etwa 40°C , bevorzugt bei etwa 20 bis etwa 35°C, bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9ι bevorzugt etwa 5

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bis etwa 8, durchgeführt werden. Die KuI ti viertürig kann z.B. über einen Zeitraum von etwa 1 bis etwa 7 Tagen erfolgen.

Nach der Kultivierung wird die flüssige Phase oder das Kultivierungsgemisch in Mycelien und ein Kultivierungsfiltrat durch Filtration oder Zentrifugalabtrennung aufgetrennt. Gewünschtenfalls werden die Mycelien mehrere Male mit Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeiten werden mit dem Kultivierungsfiltrat kombiniert. Wenn ein geeignetes Ausfällungsmittel, z.B. ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Aceton, zu dem kombinierten Gemisch in der etwa 1- bis etwa 4-fachen Volumenmenge, bezogen auf das Gemisch, zugesetzt wird, dann wird das rohe Glucan als Niederschlag erhalten.

Dieses rohe Glucan kann entweder sofort als Ausgangsinaterial oder nach dem Trocknen bei niedriger Temperatur verwendet werden. Gewünschtenfalls kann es vor dem Gebrauch weiterbehandelt werden.

So kann z.B. das rohe Ausgangs-Glucan in der etwa 100- bis 200fachen Menge wäßriger Natriumchloridlösung, z.B. wäßriger Natriumchloridlösung mit einer Konzentration von etwa 0,5 bis 1,096, gewünschtenfalls bei erhöhter Temperatur von etwa 90 bis etwa 95°C, während etwa 30 min bis etwa 1 h gerührt werden. Das behandelte Glucan wird zentrifugiert, um die Flüssigkeitsschicht zu entfernen. Eine wäßrige alkalische Lösung, z.B. eine wäßrige etwa 0,1 bis 1,0N NatriumhydroxidlÖBung, wird zu dem Rückstand in der etwa 100- bis etwa 200fachen Menge gegeben und hierauf wird das Gemisch zentrifugiert. Die Flüssigkeitsschicht wird mit einer Säure, z.B. Salzsäure, neutralisiert und ein Ausfällungsmittel, wie Methanol, Äthanol oder Aceton, wird in der etwa 1- bis etwa 4fachen Menge, bezogen auf Flüssigkeitsschicht, zugesetzt. Der Niederschlag wird sodann abgetrennt und gesam-

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melt. Diese Behandlungsweise wird geeignet oft wiederholt. Sodann werden gewUnschtenfalls Proteine und andere Verunreinigungen durch Gelfiltration, Dialyse, etc. abgetrennt. Der Niederschlag wird in etwa 50- bis lOOfachen Gewichtsmenge destilliertem Wasser suspendiert. Die Suspension wird vollständig gerührt, und das obengenannte Ausfällungsmittel wird zugesetzt, um einen Niederschlag zu bilden, der abgetrennt und gesammelt wird. Er wird sodann, z. B. bei niedriger Temperatur und vermindertem Druck, getrocknet, um das Ausgangs-ß-1,3-Glucan zu liefern.

Das ß-1,3-Glucan wird sodann erfindungsgemäß mit PerJodsäure oder ihrem wasserlöslichen Salz oxidiert. Bei der Durchführung der Oxidationsbehandlung wird 1 Teil Ausgangs-Glucan in etwa 50 oder etwa 500 Teilen einer wäßrigen Lösung, die PerJodsäure oder ihr wasserlösliches Salz (z.B. Natriummetaperjodat oder Kaliummetaperjodat) in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 0,5 M, vorzugsweise etwa 0,05 bis etwa 0,2 M, und erforderlichenfalls einen Puffer, Wie Sn-acetat-Puffer oder Citratpuffer, gewöhnlich mit einem pH-Wert von 3 bis 8, enthält, suspendiert oder aufgelöst. Die Suspension oder Lösung wird gerührt, damit die Bestandteile miteinander reagieren. Der Anteil an PerJodsäure oder ihrem wasserlöslichen Salz, bezogen auf das Ausgangs-Glucan, ist keinen besonderen Beschränkungen unterworfen, doch können gewöhnlich günstige Ergebnisse erhalten werden, wenn etwa 0,1 bis etwa 3 Mol Ausgangs-Glucan, bezogen auf die Einheiten der wasserfreien Glucose, verwendet werden.

Vorzugsweise wird die Reaktion an einem dunklen Ort oder bei einer so niedrig wie möglichen Temperatur, gewöhnlich bei Raumtemperatur oder darunter, vorzugsweise etwa unter 15 C, mehr bevorzugt unterhalb etwa 5⁰C, durchgeführt. Die Reaktionszeit beträgt etwa 2 bis etwa 10 Tage, zweckmäßiger-

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weise etwa 2 bis etwa 5 Tage. In diesem Fall können günstigere Ergebnisse erhalten werden, wenn man in beliebiger Weise von dem Reaktionsgemisch Proben abnimmt, nach der Fleury-Lange-Methode (j.Pharm.Chem.17, 196, 1933) die verbrauchte Menge an PerJodsäure bestimmt, um das Ausmaß der Oxidation und das Auftreten einer Peroxidierungsreaktion als Nebenreaktion zu bestimmen, und die Reaktion in der Weise kontrolliert, daß die gewünschte Oxidation durchgeführt wird.

Die nach der Oxidationsreaktion erfolgende Reduktionsbehandlung kann in der Weise durchgeführt werden, daß man das resultierende Oxidationsprodukt abtrennt, ein wäßriges Medium zusetzt und das Gemisch mit einem Reduktionsmittel reduziert oder daß man direkt das resultierende Oxidationsprodukt mit einem Reduktionsmittel ohne Isolierung aus dem Reaktionssystem reduziert.

Im letzteren Fall kann das Oxidationsprodukt vorbehandelt werden, indem man z.B. die nichtumgesetzte Perjodsäure mit Äthylenglykol zersetzt oder indem man eine Dialyse durchführt, um nichtumgesetzte Perjodsäure und Nebenprodukte abzutrennen. Die Reaktion kann wirksamer durchgeführt werden, indem man den pH-Wert des Oxidations-Reaktionsgemisches in den geringfügiger alkalischen Bereich (pH etwa 8) mit Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat etc. einstellt.

Vorzugsweise ist das Reduktionsmittel wasserlöslich. Beispielsweise kann Palladium-Kohle verwendet werden, doch wird gewöhnlich Natriumborhydrid (NaBH^) eingesetzt. Die Menge des Reduktionsmittels beträgt etwa 1 Mol oder mehr bevorzugt etwa 1,2 bis etwa 2 Mol/Mol Perjodsäure in der Oxidationsreaktion. Die Verwendung einer überschüssigen Menge des Reduktionsmittels beeinflußt die Reduktionsreaktion nicht in nachteiler Weise. Es ist ausreichend, wenn die Re-

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duktionsreaktion gewöhnlich über einen Zeitraum von etwa 1 .bis etwa 2 Tagen durchgeführt wird. Gewünschtenfalls kann die Zeit für die Reduktionsreaktion kürzer oder länger sein.

Nach der Reduktionsreaktion wird überschüssiges NaBH^ durch Zugabe einer Mineralsäure, wie Salzsäure, oder einer organischen Säure, wie Essigsäure, zersetzt,und erforderlichenfalls kann der wasserunlösliche Rückstand in dem Reaktionsgemisch durch bekannte Maßnahmen, wie Zentrifugierung oder Filtration, entfernt werden. Alternativ kann der Überschuß an NaBH^ nach Entfernung des wasserunlöslichen Rückstands zersetzt werden. Das gewünschte Produkt kann aus der resultierenden, wasserlöslichen Fraktion erhalten werden, indem man die Nebenprodukte durch bekannte Maßnahmen, wie Dialyse, entfernt und sodann den Rückstand lyophilisiert oder sprühtrocknet. Das gewünschte Produkt kann auch in der Weise abgetrennt und gewonnen werden, daß man ein mit Wasser mischbares Nicht-Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Aceton, zusetzt. Die Menge des zu diesem Zeitpunkt zugesetzten Nicht-Lösungsmittels kann größer sein als die minimale Menge, die eine Ausfällung des gewünschten Endproduktes induzieren kann. Gewöhnlich ist sie die etwa 1- bis etwa 5fache Volumenmenge der wasserlöslichen Fraktion. Der Niederschlag wird getrocknet und erforderlichenfalls pulverisiert, um das gewünschte ß-1,3-Glucanpolyol zu erhalten. Gewünschtenfalls kann das resultierende ß-1,3-Glucanpolyol durch bekannte Reinigungsmaßnahmen, wie durch eine Wiederausfällung oder Dialyse, gereinigt werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in einer beliebigen Stufe des Herstellungsprozesses für das ß-1,3-Glucanpolyol eine Behandlung zur Verminderung der Viskosität durchgeführt werden. Diese Behandlung kann eine weitere Verminderung der Toxizität des Produktes bewirken, und sie bringt verschiedene Vorteile bei der Arzneimittelformulierung mit sich.

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Die Behandlung zur Verminderung der Viskosität kann z.B. durch Ultraschallbehandlung, Säurehydrolyse, enzymatischen Abbau oder Zugabe eines Wasserstoffbindungen-Spaltüngsmittels geschehen. Die Behandlung kann einmal oder mehrfach durchgeführt werden. Diese Behandlungsmethoden können für sich oder als Kombination aus zwei oder mehreren angewendet werden.

Bei der Durchführung der Ultraschallbehandlung als Behandlung zur Verminderung der Viskosität wird eine wäßrige Lösung oder wäßrige Suspension des zu behandelnden Materials in ein geeignetes Gefäß in einer beliebigen, gewünschten Stufe des Herstellungsprozesses eingegeben und gegebenenfalls unter Rühren der Bestrahlung mit Ultraschallwellen unterworfen. Die Frequenz der Ultraschallwellen ist zwar nicht besonders beschränkt, doch beträgt sie gewöhnlich etwa 10 bis etwa 500 kHz. Die Behandlungstemperatur ist vorzugsweise nicht höher als etwa 50°C. Gewünschtenfalls wird das Behandlungsgemäß abgekühlt, um einen Temperaturanstieg der Behandlungslösung zu verhindern. Die Behandlungszeit kann in geeigneter Weise je nach den Eigenschaften des zu behandelnden Materials und denjenigen des gewünschten Endproduktes ausgewählt werden. Gewöhnlich ist ein Zeitraum, von etwa 300 min oder weniger genügend. Nach der Ultraschallbehandlung kann das Produkt der nachfolgenden Herstellungsoperation entweder als solches oder nach Durchführung einer Trennung unterworfen werden.

Bei der Durchführung der Säurehydrolyse-Behandlung als Behandlung zur Verminderung der Viskosität wird eine Mineralsäure, wie Salz- oder Schwefelsäure, oder eine organische Säure, wie Ameisensäure, zu der wäßrigen Lösung oder wäßrigen Dispersion des zu behandelnden Materials gegeben. Hinsichtlich der Behandlungsbedingungen besteht keine besondere Beschränkung. Venn jedoch diese Behandlung nach Vervoll-

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ständigung der Reduktionsbehandlung durchgeführt wird, dann ist es vom Standpunkt der Ausbeute oder des Antitumoreffekte des Endproduktes zweckmäßig, milde Bedingungen anzuwenden, z.B. etwa 0,1 bis 0,2N Salz- oder Schwefelsäure bei einer so niedrig wie möglichen Temperatur, gewöhnlich bei Raumtemperatur oder darunter, vorzugsweise nicht mehr als etwa 15°C, während etwa 10 bis etwa 24 h anzuwenden. Nach der Behandlung wird das Produkt mit einem Alkali, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Bariumhydroxid oder Natriumcarbonat, neutralisiert und danach wird der nächste Herstellungsschritt durchgeführt. Man kann aber auch so vorgehen, daß man das behandelte Produkt zuerst abtrennt und dann der oben angegebenen Operation unterwirft.

Bei Durchführung der enzymatischen Behandlung als Behandlung zur Verminderung der Viskosität wird ein ß-1,3-Glucan zersetzendes Enzym, z.B. Zymolyase 5000 (eine Art eines ß-1,3-Glucan zersetzenden Enzyms vom endo-Typ) auf das zu behandelnde Material,z.B. in einem wäßrigen Medium, in einer beliebigen, gewünschten Stufe des Herstellungsprozesses einwirken gelassen. Nach dieser Behandlung wird das Enzym in üblicher Weise entfernt und hierauf wird der nächste Herstellungsschritt durchgeführt. Alternativ kann man auch so vorgehen, daß man das behandelte Produkt zuerst abtrennt und dann dem obigen Verfahrensschritt unterwirft.

Wenn man ein Wasserstoffbindungen-Spaltungsmittel als Behandlung zur Verminderung der Viskosität zusetzt, dann wird mindestens eine Verbindung, die die Eigenschaft hat, Wasserstoffbindungen zu spalten, z.B. Harnstoff, Guanidin oder ein Derivat davon, zu einer wäßrigen Lösung oder einer wäßrigen Dispersion des zu behandelnden Materials in einer beliebigen, gewünschten Stufe des Herstellungsprozesses zugesetzt und das Gemisch wird gerührt. So werden z.B. 1 bis 4 Teile Harnstoff zu 1 Teil wäßriger Lösung, die der Reduk-

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tionsbehandlung unterworfen worden ist, zugesetzt und das Gemisch wird 24 h bei etwa 20 bis etwa 1OO°C gerührt. Der Harnstoff wird dann durch Dialyse etc. entfernt, und hierauf wird der Rückstand lyophilisiert oder sprühgetrocknet, wodurch das gewünschte Produkt erhalten wird. Man kann auch so vorgehen, daß man Methanol, Äthanol oder Aceton zugibt, um einen Niederschlag zu bilden, der sodann getrocknet wird, um das gewünschte Produkt zu erhalten.

Das erfindungsgemäße resultierende ß-1,3-Glucanpolyol, das sich von dem Ausgangs-Glucan, das aus einem ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia hergestellt worden ist, ableitet, hat eine grundmolare Viskosität [^] von etwa 1 bis etwa 10 und es besitzt eine Hauptkette mit wiederkehrenden Einheiten von ß-1,3-Glucopyranose-Einheiten,an die Seitenketten der Formel (B) oder der Formel (B) und (A) angefügt sind, wobei die Anzahl der Seitenketten (B) und die Anzahl der Seitenketten (A) etwa 25 bis etwa 70 bzw. etwa 0 bis etwa 45 pro 100 ß-1^-Glucopyranose-Einheiten der Hauptkette beträgt.

Die Verhältnisanteile der Seitenketten und die grundmolare Viskosität [^] kann, wie gewünscht, innerhalb der angegebenen Bereiche variiert werden, indem man den Oxidationsgrad bei der Oxidation des Ausgangs-Glucans mit Perjodsäure oder ihrem wasserlöslichen Salz oder den Grad der Verminderung der Viskosität bei der Behandlung zur Verminderung der Viskosität in geeigneter Weise auswählt.

Die Antitumor-Aktivität des erfindungsgemäßen ß-1,3-Glucanpolyols wird in den folgenden Tierversuchen gezeigt.

(1) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Sarcoma 180 bei ICR-JCL-Mäusen

Ascites Zellen von Sarcoma 180 wurden peritoneal in ICR-JCL-Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g inokuliert.

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1 Woche später, als die Ascites vollständig erhöht waren, wurden 6 Millionen Tumorzellen von Sarcoma 180 in den subkutanen Teil des Rückens der Mäuse durch den rechten Leistenteil transplantiert. Beginnend nach 24 ha nach der Transplantation wurde das erfindungsgemäße Glucanpolyol intraperitoneal einmal täglich über einen Zeitraum von 10 Tagen verabreicht. In der 5· Woche wurde der Tumor herausgekernt und sein Gewicht wurde mit demjenigen der nichtbehandelten Gruppen verglichen. Das Tumor-Hemmverhältnis wurde errechnet und die Anzahl der Tumoren, die sich vollständig zurückgebildet hatten, wurde ermittelt.

Das Tumor-Hemmverhältnis wurde nach folgender Gleichung errechnet :

TT-⁷F Hemmverhältnis = =· χ 100.

Darin bedeuten:

ü das durchschnittliche Tumorgewicht in den nichtbehandelten Gruppen (10 Mäuse/Gruppe)

¥ das durchschnittliche Gewicht des Tumors in den behandelten Gruppen (10 Mäuse/Gruppe).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

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Tabelle 1

Probe Dosis Durchschn.Tumor- Tumor-Hemmverhältnis Vollständige Rückbildung

(mg/kg/Tag) gewicht (g) (%)

0,28 97,5 9/10

0 100 10/10

0,17 98,5 9/10

0,30 97,3 8/10

0,64 94,2 7/10

0,92 91,6 6/10

0,41 96,3 8/10

1,39 87,4 6/10

	Produkt	von	Kontrolle	1
	Beisp.	1		VJl
	η	1		10
	π	1		VJl
	ti	2	5
	η	3	1
	π	4
co			VJl
O	π	4	1
_»	η	VJI	VJl
	"	VJl	5
	H	6
-4			VJl
σ>
cn

0 ₁₀₀ 10/10

11,01 - 0/10

CO K) O)

(2) Antitumor-Aktivitatstest unter Verwendung von Ehrlich Carcinom bei ICR-JCL-Mäusen

3»5 Millionen Ehrlich Carcinomzellen wurden in den· subkutanen Teil des rechten Leistenteils von ICR-JCL-Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g transplantiert. Dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

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Tabelle 2

Probe

Dosis (mg/kg/Tag Durchschn. Tumor- Tumor-Hemmverhältgewicht (g) nis (%)

Vollständige Rückbildung

Produkt von
Beisp. 1

η	2
ti	2
It	3
η	3
π	4
ti	4
η	5
η	5
η	6
π	6
Kontrolle

20 1

5 1

5 1 5

0.31
1.27
0.83
1.15
0.67
1.48
0.97
1.82
1.64
0
0
14.90

100

100
97.9
91.5
94.4
92.3
95.5
90.1
93.5
87.8
89.0

100

10/10

7/10

6/10

7/10

6/10

4/10

5/10

10/10

0/10

U) fs)

(3) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Meth-A bei Balb/c-Mäusen

25 Tausend Meth-A-Tumorzellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von Balb/c-Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g transplantiert, und dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.

130015/0766

Tabelle 3

Probe

Dosis (mg/kg/Tag) Durchschn.Tumor- Tumor-Hemmverhält- Vollständige Rückgewicht (g) nis (%) bildung

Produkt von
Beisp. 1

π	2
π	4
H	4
Π	6
η	6
η	6

Kontrolle

5 20

5 5

20 1

20 7.74 5.57 9.25 6.73 7.99 9.33 5.37 7.45 8.52 13.36

42.1	0/10	I VjJ O
58.3	0/10
30.8	0/10
49.6	0/10
40.2 30.2	0/10 0/10
59.8	0/10	CO O U) ΓΟ <Τ) CO CD
44.2	0/10
36.2	0/10
-	0/10

(4) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Sarcom 180 bei C3H/He-Mäusen

6 Millionen Sarcom 180-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von C3H/He-Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g transplantiert. Danach wurde wie unter (1) beschrieben verfahren.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

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	Probe	1	Dosis (mg/kg/Tag	Tabelle 4	Tumo r-Hemmver- verhältnis (%)	Vollständige bildung	Rück-	I VjJ NJ I
	Produkt von Beisp.	1	1	Durchs chn.Tumor- gewicht (g)	60.2	0/10
	η	1 2	5	5.14	83.4	6/10
	π η	3 4	20 5	2.14	64.2 72.9	1/10 4/10
13001	π η	4	5 1	4.62 3.50	61.7 56.5	2/10 0/10
5/07€	η	6	5	4.94 5.62	61.8	1/10	3032636
	η	6	1	4.93	68.4	3/10
	η		5	4.08	84.1	6/10
	Kontrolle			2.05	-	0/10
				12.91

_ 33 -

(5) Antitumor-Aktivitatstest unter Verwendung von Sarcom 180 bei Balb/c-Mäusen

6 Millionen Sarcom 180-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von Balb/c-Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g transplant!ert. Danach wurde .wie unter (1) beschrieben Verfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5

Probe Dosis	1	Durchschn. Tu-	Tumor-Hemm-	Vollständige
(ms/kg/Tag)	1	morgewicht(g)	verhältn.(%)	Rückbildung
Produkt von	1
Beisp.1	1	0,08	97,8	9/10
η £	5	0,09	97,5	8/10
•ι 3		0,10	97,3	8/10
n 4	0	100	10/10
π 4	0	100	10/10
Kontrolle	3,65		0/10

(6) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Sarcom 180 bei C₅₇BL/6-Mäusen

6 Millionen Sarcom 180-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von CVyBL/ö-Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 20 g transplantiert. Dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 6

Probe	Dosis	Kontrolle	/kg/Ta/	Durchschn.Tu-	Tumor-Hemm-	Vollständige
	(mg		r morgewicht(g)	verhältn.(%)	Rückbildung
Produkt	von	1
Beisp	.1	1	0,15	95,8	8/10
Il	2	1	0,21	94,1	8/10
η	3	1	0,30	91,5	7/10
π	4	5	0,13	96,4	9/10
η	4		0,12	96,6	9/10
3,57		8/10

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(7) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Sarcom 180 bei ddY-Mäusen

6 Millionen Sarcom 180-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von ddY-Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g transplantiert. .Dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt.

Tabelle 7

Probe	(m	Dosis	Kontrolle	g/Tag	Durchschn. Tu-	Tumor-Hemm-	Vollständige
Produkt	g/k		;) morgewicht(g)	verhältn.(%)	Rückbildung
Beisp.	von	1
π	1	1	0,39	96,5	7/10
π	2	1	1,08	90,3	7/10
η	3	1	1,17	89,5	6/10
η	4	5	0,25	97,7	8/10
4		0,54	95,2	8/10
11,10		0/10

(8) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von CCM-Adeno-Carcinom bei ICR-JCL-Mäusen

6 Millionen CCM-Adenocarcinom-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von ICR-JCL-Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g transplantiert. Dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 aufgeführt.

Tabelle 8

Probe	Dosis	Kontrolle	1	Dur chschn. Tu	Tumor-Hemm-	Vollständige
	(mg/kg/Taj?)		1	morgewichtig)	verhältn.(%)	Rückbildung
Produkt	von	1
Beisp,	, 1	1	0,52	95,7	7/10
K	2	5	0,61	95,0	8/10
π	3		0,14	98,9	8/10
η	4	0	100	10/10
η	4	0,23	98,1	8/10
12,23		0/10

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(9) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von NTF-Reticulum-Zellen-Sarcom bei ICR-JCL-Mäusen

6 Millionen NFT-Reticulum-Zellen-Sarcom-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von ICR-JCL-Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g transplantiert. Dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengestellt.

Tabelle 9

Probe	(	Produkt	Dosis	Kontrolle	kg/Ta;	Durchschn. Tu-	Tumor-Hemm-	Vollständige
Beisp.			ί) morgewicht(g)	verhältn.(#)	Rückbildung
π	von	1
η	1	1	0,51	91,1	8/10
η	2	1	0,37	93,6	8/10
η	3	1	0,88	84,7	6/10
4	5	0,67	88,3	8/10
4		0,83	85,6	6/10
5,75		0/10

Aus den Ergebnissen dieser Versuche wird ersichtlich, daß das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucanpolyol das Wachstum von Experimentaltumoren signifikant hemmt und daß diese Verbindung eine ausgeprägte Antitumor-Aktivität in den unter (2) bis (9) beschriebenen Testsystemen zeigt, bei denen bislang allgemein angenommen wurde, daß herkömmliche, bekannte Antitumor-Polysaccharide nicht signifikant wirksam sind. Dies weist auf den großen Vorteil des ß-1,3-Glucanpolyols bei der klinischen Anwendung hin.

Bei den oben beschriebenen Tierversuchen kann davon ausgegangen werden, daß die gleichen Effekte bei anderen Warmblütlern, wie dem Menschen, bei Haustieren, bei Geflügel, bei Hunden, bei Katzen, bei Kaninchen, bei Ratten etc. erzeugt werden.

Die Toxizität des erfindungsgemäßen ß-1,3-Glucanpolyols ist sehr niedrig und die LDcQ-Werte der in den Beispielen 1, 4

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und 5 erhaltenen Produkte bei ICR-JCL-Mäusen sind in Tabelle 10 zusammengestellt.

Tabelle 10

(LD₅₀-Werte in g/kg)

Probe Orale Verabrei- Intraperitoneale Intravenöse chung Verabreichung Verabreichung

Produkt von

Beisp. 1 oberhalb 20 oberhalb 2 oberhalb 0,5

n 4 π 20 " 5 1,5

« 5 " 20 "5 oberhalb 2,0

Es wurde bestätigt, daß durch den Effekt der Ultraschallbehandlung die Produkte der Beispiele 4 und 5 eine niedrigere Toxizität hatten.

Gemäß der Erfindung wird ein Tumorbehandlungsmittel zur Verfügung gestellt, das als Wirkstoff das oben beschriebene ß-1,3-Glucanpolyol enthält. Somit kann ein Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungen der Verdauungsorgane (z.B. von Magenkrebs, ösophaguskrebs, Kolon- und Rektumkrebs), von Lungenkrebs, von Brustkrebs, etc. zur Verfügung gestellt werden, bei dem man einem Tier, das von einer solchen Krankheit befallen ist, ein pharmazeutisches Mittel verabreicht, welches eine pharmazeutisch wirksame Menge an ß-1,3-Glucanpolyol und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder eine pharmazeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Glucanpolyols enthält.

Das erflndungsgemäße Arzneimittel enthält gewöhnlich etwa 1 bis etwa 90 Gew.# des erfindungsgemäßen Glucanpolyols, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels. Der Gehalt an Glucanpolyol kann je nach der Dosierungsform des Mittels variiert werden.

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Das erfindungsgemäße Glucanpolyol kann zu oral verabreichbaren Formen, z.B. Pulver, Granulat, Kapseln, Tabletten, beschichteten Tabletten, Sirups und wäßrigen Zubereitungen, sowie parenteral verabreichbaren Formen, wie Zubereitungen zur Injektion, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel formuliert werden.

Der Träger oder das Verdünnungsmittel kann z.B. einervon verschiedenen flüssigen oder festen Trägern oder Verdünnungsmitteln sein. Beispiele für Träger sind feste Träger oder Verdünnungsmittel, wie Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Glucose, Lactose, Saccharose, Dextrin, Saccharoseester, Stärke, Sorbit, Mannit, kristalline Cellulose, Talk, Kaolin, synthetisches Aluminiumsilikat, Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Celluloseacetat-phthalat, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Gummiarabikum, Tragantgummi, Gelatine, Agarmehl und Schellack; und flüssige Träger oder Verdünnungsmittel, wie Wasser, physiologische Kochsalzlösungen, Äthanol, Propylenglykol, Polyäthylenglykol, Glycerin, Hartman-Flüssigkeit und Ringer-Flüssigkeit.

Das erfindungsgemäße Glucanpolyol-Mittel kann durch allgemeine Verfahrensweisen zur Behandlung von Tumoren verabreicht werden, z.B. durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, durch orale Verabreichung, intrarektale Verabreichung, durch Beschichten als äußeres Arzneimittel und durch Infusion. Das Dosierungs- und Verabreichungsschema des Glucanpolyols kann je nach dem Typ und dem Zustand etc. des Patienten und des Tumors in geeigneter Weise ausgewählt werden.

So beträgt z.B. die Dosierung des erfindungsgemäßen Glucanpolyols bei der oralen Verabreichung gewöhnlich 1 bis 5000 mg/kg Körpergewicht/Tag, vorzugsweise 2 bis 2000 mg/kg/ Tag, und bei der Injektion 0,5 bis 5000 mg/kg Körpergewicht/ Tag, bevorzugt 1 bis 2000 und mehr bevorzugt 2 bis 500 mg/ kg/Tag.

130015/0766 . < .

Das Glucanpolyol kann in Kombination mit anderen Antitumormltteln verwendet werden. Eine Kombination, die eine Erhöhung des immunologischen Effekts mit sich bringt, ist besonders wirksam.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Referenzbeispiel

(Herstellung des Ausgangs-ß-1,3-G	30 g
Glucose	3 g
Polypepton	3 g
Hefeextrakt	1 g
K₂HPO₄	0,5 g
MgSO₄.7H₂O	1 1
Wasser
pH 6,50

100 ml eines flüssigen Kulturmediums mit obiger Zusammensetzung wurden jeweils in 150 Sakaguchi-Kolben mit einer Kapazität von 500 ml eingegeben. Jeder Kolben wurde mit einem Baumwollstöpsel verschlossen. Die Kolben wurden 20 min bei 120⁰C sterilisiert. Ein Pestalotia Nr.815-Stamm, der gesondert in einem Schrägkulturmedium gezüchtet worden war, wurde in die einzelnen Kulturmedien in üblicher Weise einokuliert und 7 Tage bei 28°C unter Schütteln mit einer Rate von 120 Mal/min und mit einer Amplitude von 7 cm kultiviert, wodurch 13,5 1 Kulturbrühe erhalten wurden. Zu der Kulturbrühe wurden 13»5 1 destilliertes Wasser gegeben, und das Gemisch wurde gut gerührt, um es gleichförmig zu machen. Sodann wurde es 30 min bei 10 000 G zentrifugiert, um die Mycelien zu entfernen. Auf diese Weise wurden 21,5 1 überstehende Flüssigkeit erhalten. 60 1 Aceton wurden zu der überstehenden Flüssigkeit unter Rühren zugesetzt, um einen Niederschlag zu bilden. Der Niederschlag wurde herausgenommen, zweimal mit Aceton gewaschen und dann getrocknet, wodurch 52,5 g rohes Glucan erhalten wurden.

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Beispiel

50 g faserartiges Glucan, erhalten im Referenzbeispiel, wurden zu kleinen Stücken zerschnitten und in 16 1 einer 0,5%igen wäßrigen Natriumchloridlösung suspendiert. Das Gemisch wurde 3 h bei etwa 40°C gerührt, pulverisiert und 20 min in einem Homogenisator bei 15 000 U/min homogenisiert. Dann wurden 16 1 destilliertes Wasser zugesetzt und das Gemisch wurde vollständig gerührt und 30 min bei 4000 U/min zentrifugiert, wodurch ein unlösliches Produkt erhalten wurde. 20 1 destilliertes Wasser wurden zu dem resultierenden, wasserunlöslichen Teil zugesetzt, und das Gemisch wurde vollständig gerührt und in ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde zweimal durchgeführt und Natriumhydroxid wurde zu dem resultierenden, wasserunlöslichen Teil so zugesetzt, daß die Endkonzentration 0,5N erreichte. Das Gesamtvolumen des Gemisches wurde auf 15 1 eingestellt, .und es wurde 2 h bei Raumtemperatur zur Bildung einer Lösung gerührt. Die Lösung wurde 30 min bei 4000 U/min zentrifugiert und eine geringe Menge des Rückstand wurde entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 6N Salzsäure neutralisiert, und es wurde ein gleiches Volumen Methanol zugesetzt. Das Gemisch wurde mit einer Geschwindigkeit von 2000 U/min 5 min zentrifugiert, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde. 10 1 Wasser wurden zu dem resultierenden Niederschlag zugesetzt und das Gemisch wurde vollständig gerührt und sodann der gleichen Wieder-Ausfällungsoperation unterworfen. Es wurde lyophilisiert, wodurch 40 g Glucan als Ausgangsmaterial erhalten wurden.

5 g Ausgangs-Glucan wurden in 2 1 einer wäßrigen Lösung suspendiert, die 6,65 g Natriummetaperjodat (NaJO^) enthielt, und die Suspension wurde 7 Tage unter Rühren bei 10⁰C in einem dunklen Raum umgesetzt. 1,5 g Äthylenglykol wurden zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um den Überschuß an Natriummetaperjodat zu zersetzen. Hierauf wurde eine kleine

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Menge Natriumbicarbonat zugefügt, um die Reaktion schwach alkalisch zu machen. Sodann wurden 1,2g Natriumborhydrid zugesetzt, um eine Reduktion bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 2 Tagen unter Rühren durchzuführen. Nach der Reduktion wurde der Überschuß an Natriumborhydrid mit einer geeigneten Menge Essigsäure zersetzt (pH ^ .6). Das resultierende Produkt wurde 2 Tage gegen fließendes Wasser dialysiert. Die Restlösung wurde unter Verwendung eines Filtrationshilfsmittels (Celite) filtriert. Das Filtrat wurde mit dem dreifachen Volumen an Methanol versetzt, wodurch ein Niederschlag erhalten wurde. Zu dem Niederschlag wurde Wasser gegeben und das Gemisch wurde lyophilisiert, wodurch 3,1 g ß-1,3-Glucanpolyol als weiße, faserartige Substanz erhalten wurden.

Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

Ci?] 6,21

Elementaranalyse C 40,32%; H 6,00%

Anteil an Seitenketten (A) 0 Anteil an Seitenketten (B) 69,1

(Die Anteile der Seitenketten (A) und (B) sind auf 100 ß-1^-Glucopyranose-Einheiten der Hauptkette bezogen. Die gleiche Bezugnahme gilt auch für die nachfolgenden Beispiele.)

Beispiel 2

5 g des in Beispiel 1 erhaltenen Ausgangs-Glucans wurden in 1 1 einer wäßrigen Lösung suspendiert, die 4,16 g Natriummetaper jodat enthielt. Die Suspension wurde 5 Tage bei 10⁰C unter Rühren in einem dunklen Raum umgesetzt. Nach der Reaktion wurde die Reaktionslösung gegen fließenden Wasser dialysiert und die restliche Lösung wurde 30 min bei 4000 U/min zentrifugiert. Der resultierende Niederschlag wurde in 1 1 Wasser suspendiert und es wurden 880 mg Natriumborhydrid zugesetzt. Die Reduktion wurde 2 Tage bei Raumtemperatur

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unter Rühren durchgeführt. Nach der Reduktionsreaktion wurde ein Überschuß an Natriumborhydrid zersetzt, indem man eine geeignete Menge Essigsäure (pH<6,0) zusetzte. Das Produkt wurde 30 min bei 4000 U/min zentrifugiert. 2 1 Wasser wurden zu dem Niederschlag gegeben .und nach dem Rühren wurde das Gemisch zentrifugiert. Die resultierende, überstehende Flüssigkeit wurde mit der überstehenden Flüssigkeit kombiniert, die beim vorhergegangenen Zentrifugiervorgang gebildet worden war. Zu der Lösung wurde die 1,5fache Volumenmenge Methanol gegeben. Das Gemisch wurde 5 min bei 2000 ü/min zur Bildung eines Niederschlags zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 1,5 1 Wasser aufgelöst und die gleiche Wieder-Ausfällungsoperation unter Verwendung von Methanol wurde durchgeführt. Der resultierende Niederschlag wurde mit Methanol entwässert und bei vermindertem Druck getrocknet, wodurch 2,8 g ß-1,3-Glucanpolyol als weißes Pulver erhalten wurden.

Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt: ty J 7,25

Elementaranalyse C 40,39%; H 5,9096

Anteil an Seitenketten (A) 27,8 Anteil an Seitenketten (B) 41,7.

Beispiel 3

Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß man 2,8 g Natriummetaperjodat und 590 mg Natriumborhydrid verwendete. Man erhielt so ß-1,3-Glucanpolyol in Form eines weißen Pulvers in einer Menge von 2,5 g. Die Eigenschaften dieses Produktes waren wie folgt:

ty] 7,68

Elementaranalyse C 40,42%; H 5

Anteil an Seitenketten (A) 41,3 Anteil an Seitenketten (B) 28,7.

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Beispiel

5 g Ausgangs-Glucan wurden wie in Beispiel 1 mit Natrlummetaperjodat oxidiert und mit Natriumborhydrid reduziert. Sodann wurde ein Überschuß an Natriumborhydrid zersetzt, indem eine geeignete Menge Essigsäure (pH 6,0) zugesetzt wurde. Das Gemisch wurde gegen fließendes Wasser dialysiert.

Die restliche, nichtdialysierte Lösung wurde mit Wasser so verdünnt, daß die Zuckerkonzentration 0,2596 betrug. Somit wurden etwa 1250 ml Lösung erhalten. Die Lösung wurde auf weniger als 5⁰C abgekühlt und 100 min einer Ultraschallbehandlung mit einer Oszillierungsfrequenz von 20 kHz und einer Abgabe von 60 W unterworfen, während sie kühl gehalten wurde (höchstens 30°C). Die behandelte Lösung wurde unter Verwendung eines Filtrationshilfsmittels (Celite) filtriert. Das Filtrat wurde bei vermindertem Druck konzentriert (auf 500 ml) und die jjfache Volumenmenge Aceton wurde zugesetzt, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde.

Der Niederschlag wurde in Wasser aufgelöst und lyophylisiert, wodurch 2,4 g ß-1,3-Glucanpolyol als weiße, faserartige Substanz erhalten wurden. Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

Ct₂] 3,27

Elementaranalyse C 40,51%; H 6,22%

Anteil an Seitenketten (A) 0

Anteil an Seitenketten (B) 68,3.

Beispiel 5

5 g Ausgangs-Glucan wurden gemäß Beispiel 2 mit Natriummetaper jodat oxidiert und dann mit Natriumborhydrid reduziert. Sodann wurde ein Überschuß an Natriumborhydrid zersetzt, und zwar mit Essigsäure (pH < 6), und das Produkt wurde gegen fließendes Wasser dialysiert. Die restliche Lösung wurde zu einer Zuckerkonzentration von 0,25% bereitet, um 1250 ml einer Lösung zu bilden. Die Lösung wurde 200 min einer Ultraschallbehandlung bei einer Oszillierungsfrequenz von 20 kHz

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und einer Abgabe von 70 W unterworfen, während sie kühl gehalten wurde (höchstens 35°C)., Die behandelte Lösung wurde unter Verwendung eines Filtrationshilfsmittels (Celite) filtriert und unter Druck unter Verwendung eines Millipore-Filters mit einer Porengröße von 0,45/um weiter filtriert. Das Filtrat wurde bei vermindertem Druck (auf etwa 500 ml) konzentriert und lyophilisiert, wodurch 2,9 g ß-1,3-Glucanpolyol erhalten wurden. Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

ty] 1,87

Elementaranalyse C 40,48%; H 5,95%

Anteil an Seitenketten (A) 27,0

Anteil an Seitenketten (B) 40,2.

Beispiel 6

5 g des in Beispiel 1 erhaltenen Ausgangs-Glucans wurden in 2 1 0,05N Acetatpuffer (pH 5) suspendiert, der darin gelöst 5,91 g Kaliummetaperjodat enthielt. Die Suspension wurde 10 Tage bei 10⁰C unter Rühren in einem dunklen Raum umgesetzt. Äthylenglykol (1,5 g) wurde zu der Reaktionslösung gegeben und das Gemisch wurde gegen fließendes Wasser dialysiert. Eine kleine Menge Natriumbicarbonat wurde zu der restlichen Lösung zugesetzt, um sie schwach alkalisch zu machen. Sodann wurden 1,2 g Natriumborhydrid zugesetzt und das Gemisch wurde 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt, um eine Reduktion durchzuführen. Nach der Reduktion wurde der Überschuß an Natriumborhydrid mit einer geeigneten Menge Essigsäure zersetzt und das Produkte wurde gegen fließendes Wasser dialysiert. Die restliche, nichtdialysierte Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch 3,4 g ß-1,3-Glucanpolyol als weiße, faserartige Substanz erhalten wurden. Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

[tj] 9,48

Elementaranalyse C 40,36%; H 5,92%

130015/0766

Anteil an Seitenketten (A) 14,4

Anteil an Seitenketten (B) 55,6.

Beispiel 7

5 g des in Referenzbeispiel erhaltenen, faserartigen Glucans wurden in 2,0 1 Wasser suspendiert, pulverisiert und in einem Homogenisator (15 000 U/min, 20 min) homogenisiert. Sodann wurden 500 ml einer wäßrigen Lösung von 6,65 g Natriummetaperjodat zugefügt und es wurde 7 Tage bei 15°C unter Rühren in einem dunklen Raum umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 reduziert, überschüssiges Natriumborhydrid wurde mit Essigsäure zersetzt und das Produkt wurde gegen fließendes Wasser dialysiert. Nach der Dialyse wurde die restliche Lösung 30 min bei 4000 U/min zentrifugiert. 2 1 Wasser wurden zu dem Niederschlag zugegeben und das Gemisch wurde nach dem Rühren zentrifugiert. Die resultierende, überstehende Flüssigkeit wurde mit der überstehenden Flüssigkeit, die in der vorhergegangenen Zentrifugierungsoperation gebildet worden war, kombiniert. Zu der Lösung wurde die 2fache Volumenmenge an Aceton zur Bildung eines Niederschlags gegeben. 1 1 Wasser wurde zu dem Niederschlag gegeben und Aceton wurde zugesetzt, um eine Wieder-Ausfällung in der gleichen Weise wie oben beschrieben durchzuführen. Der Niederschlag wurde mit Methanol entwässert und bei vermindertem Druck getrocknet, wobei 2,4 g ß-1,3-Glucanpolyol als weißes Pulver erhalten wurden. Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

[η] 8,55

Elementaranalyse · C 40,3896; H 6,0596

Anteil an Seitenketten (A) 1,3

Anteil an Seitenketten (B) 67,8.

Beispiel 8
Herstellung von Arzneimitteln.

130015/0768

- 45 -	Tabletten	Stärke	3032636	Menge (mg)
Glucanpoiyol von Beispiel 2	2000
Lactose	1400
Polyvinylpyrrolidon	400
Talk	500
200

Das Glucanpoiyol wurde mit Lactose vermischt, und das Gemisch wurde durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 60/um getrieben. Hierauf wurde das Gemisch mit alkoholischem Polyvinylpyrrolidon befeuchtet und durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1,67 mm geleitet, um ein Granulat zu bilden, das dann getrocknet wurde. Das getrocknete Granulat wurde durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1,2 mm geleitet und mit Talk und Stärke versetzt. Das Gemisch wurde zu Tabletten tablettiert.

Granulat	Menge (mg)
Glucanpoiyol von Beispiel 2	2000
Methylcellulose	1500
Maisstärke	800
Polyvinylpyrrolidon	200
Aromatisierungsmittel	etwas

Das Glucanpoiyol, Methylcellulose, Aromatisierungsmittel und Maisstärke wurden vermischt und durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 60/um geleitet. Das Gemisch wurde mit alkoholischem Polyvinylpyrrolidon befeuchtet und durch ein Edelstahlsieb mit einem Durchmesser von 0,7 mm granuliert.

Zubereitung für die Injektion Menge (mg)

Glucanpoiyol von Beispiel 4 500

Glucose 2000

destilliertes Wasser mäßige Menge

130015/0766

Das Glucanpolyol und die Glucose wurden in destilliertem Wasser zur Injektion zu einem Volumen von 50 ml aufgelöst und dann in üblicher Weise zu einer Zubereitung für die Injektion verformt.

Ende der Beschreibung.

130015/0766

Leerseite

Claims

ß-1,3-Glucanpolyol, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltendes Tumorbehandlungsmittel

Patentansprüche

ß-1,3-Glucanpolyol, dadurch gekennzeichnet, daß es sich von einem ß-1,3-Glucan ableitet, welches von einem ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia hergestellt worden ist, und daß das Glucanpolyol die folgenden charakteristischen Eigenschaften (I) und (II) aufweist:

(I) das Glucanpolyol enthält eine Hauptkette mit ß-1,3-Glucopyranose-Einheiten der folgenden Formel

fr 3) ß-D-Glc (1 H—>

in der GIc für eine Glucopyranose-Restgruppierung steht, als wiederkehrende Einheiten und daran gebunden entweder Seitenketten der unten angegebenen Formel (B) oder sowohl Seitenketten der unten angegebenen Formel (A) als auch Seitenketten der unten angegebenen Formel (B)

130U1S/Q766

^ (A) —43) ß-D-Glc⁶ (1

worin η eine Zahl von O bis 1 bedeutet und —■£-*■ 3)ß-D-Glc (1 ·}—> für die oben angegebene Hauptkette steht,

R
Φ

J)_n (B)

ß-D-Glc^D(l

worin η und —£-^ 3) ß-D-Glc (1 —j > die im Zusammenhang

mit der Formel (A) angegebenen Bedeutungen haben und R für eine von ß-D-Glucopyranose abgeleitete Gruppe der Formel

CH₂OH

HOPI₉C

HOH₂C ₀

steht,

(II) das Glucanpolyol hat eine grundmolare Viskosität [7£ ] von etwa 1 bis etwa 10.
2. ß-1,3-Glucanpolyol nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß pro 100 ß-1^-Glucopyranose-Einheiten der Hauptkette die Anzahl der Seitenketten der Formel (B) etwa 25 bis etwa 70 und die Anzahl der Seitenketten der Formel (A) etwa O bis etwa 45 beträgt.

130Q15/076S
3. Verfahren zur Herstellung eines 13-1 ,3-Glucanpolyols mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften (I) xuid (II):

(I) das Glucanpolyol enthält eine Hauptkette mit ß-1»3-Glucopyranose-Einheiten der folgenden Formel

—£r> 3) ß-D-Glc (1 -4-»

in der GIc für eine Glucopyranose-Restgruppierung steht, als wiederkehrende Einheiten und daran gebunden entweder Seitenketten der unten angegebenen Formel (B) oder sowohl Seitenketten der unten angegebenen Formel (A) als auch Seitenketten der unten angegebenen Formel (B)

P-D-GIc₁

(ß-D-GlcJ)_n

i
-—£ 3) ß-D-Glc⁶ (1

worin η eine Zahl von O bis 1 bedeutet und —£-> 3) ß-D-Glc (1 -j—> für die oben angegebene Hauptkette steht,

4-

(B)

ß-D-Glc⁶(l-}->

worin η und —£■> 3) ß-D-Glc (1 4—> die im Zusammenhang mit der Formel (A) angegebenen Bedeutungen haben und R für eine von ß-D-Glucopyranose abgeleitete Gruppe der Formel

CHpOH ^T O

HOH₅C ^ 0

130016/0766

steht,

(II) das Glucanpolyol hat eine grundmolare Viskosität [η] von etwa 1 bis etwa 10,

dadurch gekennzeichnet , daß man ein durch einen ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia hergestelltes ß-1,3-Glucan einer Oxidationsbehandlung mit Perjodsäure oder ihrem wasserlöslichen Salz unterwirft und daß man hierauf das Oxidationsprodukt einer Reduktionsbehandlung unterwirft.
4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man ein ■ ß-1,3-Glucan verwendet, welches keine Seitenketten der Formel (B), jedoch Seitenketten der Formel (A) enthält, wobei die Anzahl der Seitenketten der Formel (A) etwa 55 bis etwa 75/100 ß-1^-Glucopyranose-Einheiten der Hauptkette beträgt und wobei die Anzahl der Seitenketten entsprechend η = 1 etwa 2 bis etwa 8/100 der genannten Einheiten beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man in einer beliebigen Stufe des Herstellungsprozesses des ß-1,3-Glucanpolyols das Reaktionsgemisch oder -produkt einer Behandlung zur Verminderung der Viskosität unterwirft.
6. Tumorbehandlungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Antitumor-wirksame Menge eines ß-1,3-Glucanpolyols, abgeleitet von einem ß-1,3-Glucan, das durch einen ß-1,3-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia hergestellt worden ist, welches ß-1,3-Glucanpolyol die folgenden charakteristischen Eigenschaften (I) und (II) aufweist sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel enthält:

(I) das Glucanpolyol enthält eine Hauptkette mit ß-1,3-Glucopyranose-Einheiten der folgenden Formel

130015/0766

3) ß-G-Glc (1

in der GIc für eine Glucopyranose-Restgruppierung steht, als wiederkehrende Einheiten und daran gebunden entweder Seitenketten der unten angegebenen Formel (B) oder sowohl Seitenketten der unten angegebenen Formel (A) als auch Seitenketten der unten angegebenen Formel (B)

P-D-GIc₁

(P-D-GIcJ)_n (A)

Φ $3) ß-D-Glc⁶ (1 -9-*

worin η eine Zahl von O bis 1 bedeutet und —[-> 3) ß-D-Glc (1 —3—^ für die oben angegebene Hauptkette steht,

' I

—f*3) ß-D-Glc⁶ (1

worin η und —|j-> 3) ß-D-Glc (1 ■ die im Zusammenhang mit der Formel (A) angegebenen Bedeutungen haben und R für eine von ß-D-Glucopyranose abgeleitete Gruppe der Formel

HOH₉C

steht,

(II) das Glucanpolyol hat eine grundmolare Viskosität [■>*] von etwa 1 bis.etwa 10.

130015/0766
7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß pro 100 ß-1^-Glucopyranose-Einheiten der Hauptkette die Anzahl der Seitenketten der Formel (B) etwa 25 bis etwa 70 und die Anzahl der Seitenketten der Formel (A) etwa 0 bis etwa 45 beträgt.

13001S/0766