DE2803681A1 - Neue polysaccaride und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue Polysaccharide, insbesondere Polysaccharide mit Antitumor- und anderen wichtigen pharmakologischen Wirkungen, die sich durch eine <\-Bindung der Saccharidkomponente auszeichnet, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus Extrakten, die durch Extraktion von Basidiomyceten der Gattung Coriolu's oder Kulturen davon mit einem wässrigen Lösungsmittel erhalten werden.

In der Literatur der letzten Jahre wurde die Gewinnung von Antitumorstoffen aus verschiedenen Arten von Basidiomyceten berichtet. Diese Stoffe zeigen eine deutliche Antitumorwirkung bei intraperitonealen (i.p.) Anwendungen, erweisen sich jedoch als äusserst gering gegen Tumoren wirksam, wenn sie oral (p.o.) verabreicht werden. Daher haben diese Substanzen, obwohl sie von grossem Interesse für Wissenschaftliehe Zwecke sind, praktisch eine geringe Bedeutung.

Bei der Untersuchung der Extrakte verschiedener Arten von Basidiomyceten und Kulturen davon unter Verwendung eines wässrigen Lösungsmittels wurde nun gefunden, dass die gereinigten Produkte aus den Extrakten, die aus den Pilzen der Basidiomyceten der Art Coriolus der Polyporaceae oder Kulturen davon (einschliesslieh des verwendeten Kulturmediums) erhalten wurden, eine ausgezeichnete Antitumorwirkung nicht nur bei i.p.-Verabreichung, sondern auch bei oraler Verabreichung besitzen.

Ferner-wurde gefunden, dass diese neuen laiirksubstanzen mit der Antitumorwirkung nach dem folgenden Verfahren erfolgreich isoliert werden können: Eine durch Konzentrieren einer gereinigten wässrigen Lösung des Extrakts der Pilze der Art Coriolus oder.Kulturen davon mit einem wässrigen Lösungsmittel erhaltene Lösung wird mit Ammoniumsulfat ge-

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sättigt und der dadurch erzeugte Niederschlag entsalzt und über eine mit einem Ionenaustauscher beschickte Cellulosesäule, beispielsweise eine Diethylaminoethyl (DEAE)-Cellulose» säule, geleitet, so dass die stickstoffhaltige· Komponente absorbiert und entfernt wird, und das Eluat wird, nachdem gegebenenfalls die beschriebenen Arbeitsgänge wiederholt wurden, entsalzt und getrocknet. Ferner konnten die charakteristischen Eigenschaften dieser Wirksubstanzen aufgeklärt werden.

Ziel der vorliegenden Erfindung sind also neue Polysaccharidsubstanzen mit ausgezeichneter Antitumorwirkung nicht nur bei Verabreichungsformen i.p. sondern auch p.o., sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Substanzen.

Weitere Ziele der Erfindung werden aus der folgenden eingehenden Beschreibung ersichtlich.

Die beiliegenden Zeichnungen zeigen die Infrarotabsorptions-(IH)- und Kernresonanz (NMR)-Absorptionsspektren der erfindungsgemässen Polysaccharidsubstanzen, wobei:

Fig. 1 bis 4- die IR-Spektren der aus den Pilzen der Stämme Coriolus versicolor (Fr.) Qu£l. (früher Polystictus versicolor (Fr.) (Fig. 1), Coriolus hirsutus (Fr.) Que*l. (früher Polystictus hirsutus Fr.) (Fig. 2), Coriolus consors (Berk.) Imaz. (früher Irpex consors Berk.) (Fig. 3) bzw. Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. (früher Polystictus pargamenus Fr.) (Fig. 4) gewonnenen Polysaccharidsubstanzen;

die Fig. 5 bis 8 die NMR-Absorptionsspektra der oben genannten Substanzen; sowie

Fig. 9 ein NMR-Absorptionsspektrum einer bekannten PoIysaccharidsubstanz (angegeben als "PS-K"), die durch Filtrieren und Sterilisieren unter Druck, gefolgt von Sprüh-

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AL INSPECTED

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trocknung des Extrakts der Basidiorayceten der Gattung Coriolus erhalten wurde und hier als Kontrolle betrachtet wirdi zeigen.

Die erfindungsgemässen Polysaccharide (im folgenden der Einfachheit halber nur als "vorliegende Substanz" bezeichnet) sind weisse, geschraack- und geruchlose Pulver. Die charakteristischen Eigenschaften der vorliegenden Substanz sind im folgenden nacheinander beschrieben.

(1) PHYSIKALISCHE UND CHEMISCHE EIGENSCHAJ¹TEUi:

Elementaranalyse

Eine Elementaranalyse der vorliegenden Substanz durch einen Analysenapparat CHN-CORDER MT-2 der Yanagimoto Manufacturing Company erbrachte die folgende Zusäiranensetzung der vorliegenden Substanz: 4-3,5 bis 4-5,3 $ C, 5,7 bis 6,7 #'H und der Rest

als 0.

ffarbreaktionen

Die Farbreaktionstests wurden bei den wässrigen Lösungen der vorliegenden Substanz durchgeführt und man erhielt die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse:

Tabelle 1

Farbreaktion	Farbe	Ergebnisse
(χ-Naphthol-Schwefelsäure- reaktion (Molisch-Reaktion)	purpurrot	Saacharide
Indol-Schwefelsäurereaktion (Dische-Reaktion)	braun	Saccharide
Anthron-Schwefelsäurereaktion	grünlich blau	Saccharide
Phenol-Schwefelsäurereaktion	braun	'Saccharide
Tryptophan-Schwefelsäure- reaktion	rötlich braun	Saccharide

Aus den oben angeführten Ergebnissen der Farbreaktionen ist ersichtlich, dass die vorliegende Substanz Saccharide enthält.

pH-Wert

1 g der vorliegenden Substanz wurde in 100 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung eines pH-Meters vom Typ M-5 der Hitachi-Horiba Manufacturing Company bestimmt. Er lag im Bereich von 6,5 bis 7»2.

Spezifische optische Aktivität

Eine 0,25 #ige wässrige Lösung der vorliegenden Substanz wurde hergestellt und ihre optische Aktivität unter Verwendung einer Vorrichtung vom Typ YANACO OR-50 der Yanagimoto Manufacturing Company gemessen und hieraus die spezifische Aktivität ßß-Q bestimmt. Sie lag im Bereich von 70 bis 180.

Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der vorliegenden Substanz lag bei Bestimmung nach einer Ultrazentrifugationsmethode im Bereich von 5000 bis 300 000, das Durchschnittsmolekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 100 000. Die nach anderen Messverfahren, wie etwa fraktionierte Ultrafiltration, erhaltenen Werte deuteten ebenfalls auf den Bereich von 10 000 bis 100 000.hin. Daher kann angenommen werden, dass das Durchschnittsmolekulargewicht der vorliegenden Substanz im Bereich von 10 000 bis 100 000 liegt. Die Messung wurde unter Verwendung einer SPINCO-E Ultrazentifuge ausgeführt.

Löslichkeit

Die vorliegende Substanz ist gut in Wasser löslich, jedoch unlöslich in Pyridin, Chloroform, Benzol und Hexan.

IR-Spektrum

IR-Spektren der vorliegenden Substanz, die in einem Kaliumbromid-Pressling bestimmt wurden, sind in den Pig. 1 bis 4-der beiliegenden Zeichnungen gezeigt. Es war kein

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signifikanter Unterschied zwischen den Proben festzustellen. Das Spektrum zeigte Absorptionen bei 3600 bis 3200 cm * 2920 bis 29ΟΟ cm"¹, 1660 bis 1610 cm"¹, 1460 cm""¹, 1410 cm"¹, 1360 cm~¹, 1230 cm"¹, II50 cm"¹, 1080 cm"¹, 1060 bis 990 cm~¹, 925 cm"¹, 840 cm"¹, 755 cm"¹ und 705 cm"¹. Die breite Absorptionsbande bei'3600 bis 3200 cm , die in den Fig. 1 bis 4 zu sehen ist, muss wohl zu verschiedenen Graden Wasserstoffbrücken-gebundenen OH-Gruppen zugeschrieben werden. Dies kann beispielsweise aufgrund der Tatsache angenommen werden, dass diese breite Absorptionsbende verschwindet, wenn die Hydroxylgruppen im Saccharidteil der Probe O-methyliert werden. Eine weitere breite Absorptions-

—1 bande bei 1200 bis 1000 cm kann der unsymmetrischen

Streckschwingung der C-O-C-Bindung der Pyranoseringe im Saccharidanteil zugeschrieben werden. Die Absorption bei 840 cm kann einer Q(-Bindung der Saccharide zugeschrieben werden. Diese Absorption ist ein Hinweis auf O(-Bindung der Saccharide in der vorliegenden Substanz. Die Messungen wurden unter Verwendung eines Spektralanalysengerätes vom Typ DS-701 von Nippon Bunkosha durchgeführt.

Protonen-NMR-Spektrum

Das NMR-Spektrum (100 MHz) der vorliegenden Substanz wurde unter Verwendung eines Varian A-Spektralanalysators bestimmt. Man verwendete schweres Wasser als Lösungsmittel und wählte Natrium-2,2-dimethyl-2-silanopentan-5-sulfonat (D.S.S.) als internen Standard. Die Ergebnisse sind in den Fig. 5 bis 8 gezeigt.

Die Absorption bei 2,5 bis 6,0 ppi in den Fig. 5 bis 8 kann den Protonen im Saccharidanteil· zugeschrieben werden, während die Absorption bei 5jO PPm einer OC-(1^6)-Bindung, und die bei 5,4 ppm .einer 0Ki*4)-und <X- (1-^3 )-Bindung zugeschrieben werden.können. Zur Kontrolle ist in Fig. 9 ein NMR-Spektrum eines bekannten Produkts gezeigt, das durch Filtrieren und Sterilisieren unter Druck, gefolgt von Sprühtrock-

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nung eines Extrakts von Basidiomyceten der Gattung Goriolus von Polyporaceae gewonnen wurde. Ein solches Produkt wurde unter dem Namen PS-K veröffentlicht und es wird im folgenden so bezeichnet. Der wichtigste Unterschied zwischen
PS-K und der vorliegenden Substanz, wie es sich bei der
vergleichenden Betrachtung der in den Fig. 5 bis 8 und der I¹Ig. 9 gezeigten Absorptionsspektren ergibt, besteht darin, dass im Fall der vorliegenden Substanz, obwohl eine· von
einer W-Bindung herrührenden Absorption bei 4,9 bis 6,0 ppm beobachtet wird, im Bereich von 4,4 bis 4,9 ppm keine
einer ß-Bindung zuzuordnende Absorption sichtbar ist. Dies weist darauf hin, dass die Saccharidkoraponente der vorliegenden Substanz durchweg Q(-gebunden ist. In Hinsicht auf
die quantitative Bestimmung der Bindungsart der Saccharide der vorliegenden Substanz kann .aus einer bei 5,0 ppm
beobachteten 0(-(1-»6)-Bindung und bei 5,4 ppm beobachteten Q£-(1-i*4)- sowie (X-(1^3)-Bindung eine gewisse Annahme getroffen werden, da jedoch <X-(1-»4)- und (X-(1*3)-Bindung bei 5,4 ppm überlappen, ist die exakte quantitative Bestimmung der jeweiligen Bindungen schwierig. Da ferner die vorliegende Substanz eine' verzweigte Struktur-hat, muss die genaue Strukturaufklärung der Substanz der im folgenden beschriebenen Methylierungsmethode vorbehalten bleiben.

(2) STHDEDUEEIGENSCHAFiDEN

Zur Identifikation der Saccharidkoraponente im Saacharidanteil der vorliegenden Substanz wurde eine 10 rag Probe der vorliegenden Substanz zur Methanolyse bei 100 G 16 h mit" 3 # Chlorwasserstoffsäure/Methanol vermischt und nach
Trimethylsfilierung nach üblichen Verfahren einer Gaschromatografischen Analyse unterworfen. Die Ergebnisse zeigten,
dass Glucose überwiegt und andere Saccharide, wie Mannose, Galactose, Xylose und Fucose nur einen geringen Anteil stellen.

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Zur Sicherstellung des vorliegenden optischen Isomeren (D- oder L-iOrra) der Glucose als Hauptsaccharidkomponente im Saacharidanteil der vorliegenden Substanz wurden Glucosekristalle aus den Hydrolysaten der vorliegenden Substanz abgetrennt. Man fand, dass die abgetrennte Glucose einen Schmelzpunkt von 143 bis 145°C hatte und beim Mischen und Schmelzen mit einer Standard-D-Glucose keinen Schmelzpunktabfall zeigte. Damit war die Glucose im Saacharidanteil der vorliegenden Substanz als D-Glucose identifiziert.

Die Position der Glycosidbindung wurde in der folgenden

1 1 Weise bestimmte Die Bindungsmuster für G-* (G -»für Glucosestrukturskelett),-5^G¹-^, -^gI-*, -^g^, -^V* und -»^Gg-* wurden aus der Analyse der Monosaccharide bestätigt, die man nach der Periodatoxidationsmethode oder Smith¹sehen Zersetzungsmethode erhielt, und das Verhältnis der Häufigkeiten dieser Bindungen wurde aus Methylierungsversuchen nach der Haworth-Methode bestimmt. Die durch Hydrolyse der Methylierungsprodukte erhaltenen Saccharide wurden gaschromatografisch eis llditol-acetat und Methylglucosid identifiziert, ferner wurden zur Bestätigung die einzelnen Hydrolysate durch Säulenflüssigchromatografie isoliert und dann kristallisiert oder in kristalline Derivate umgewandelt.

Die molaren Verhältnisse der jeweiligen Bindungen in der vorliegenden Substanz sind in Tabelle 2 gezeigt, wobei das molare Verhältnis der G 4 Bindung als 1 gesetzt ist. Die molaren Verhältnisse in der !Tabelle 2 wurden aus den Flächenverhältnissen der Gaschromatografie von Alditolacetat bestimmt.

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A\

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Tabelle 2

Hydrolysate von methylierten Zuckern

Bindung

molares Verhältnis

2,3,4,6-Tetra-O-methyl-G 2,3,6-Tri-O-methyl-G 2,3-Di-O-methyl-G 2,6-Di-O-methyl-G 2,4,6-Tri-O-methyl-G 2,4-Di-O-methyl-G

3,5 bis 8,5 0,5 bis 2 0,1 bis 2,5 2 oder weniger 0,8 oder weniger

Aus den Ergebnissen der obigen Tabelle kann ersehen werden, dass der Polysaccharidanteil der vorliegenden Substanz hauptsächlich aus (X-(IVO-Bindungen besteht, jedoch auch OC-(I ·*3)-Bindungen und zahlreiche Verzweigungen im Polysaccharidanteil vorkommen. Dies kann als Hinweis genommen werden, dass die vorliegende Substanz eine Struktur aufweist, worin Seitenketten an die Glucanhauptketten mit (X-(1-^)-Bindung gebunden sind, wobei Glucananteile mit W-(¹I-Ϊ5)-Bindung von ähnlicher Struktur darin verstreut vorkommen .

Im folgenden wird das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Polysaccharide beschrieben. Diese Polysaccharide, wie sie oben beschrieben sind, werden aus den Fruchtkörpern oder Mycelen der natürlich oder artifiziell kultivierten Pilze der Basidiomyceten von der Gattung Coriolus von Polyporaceae der Ordnung Aphyllophorales extrahiert.

Zur Identifizierung der in dieser Erfindung verwendeten Pilze verweisen wir auf "COLOURED ILLUSTRATIONS OF FUNGI OF JAPAN" von Rokuya Imazeki und Tsuguo Hongo (Hoikusha

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Press) sowie "FUNGI OE JAPAN" von Seiya Ito (Yokendo Press), Nach diesen Werken handelt es sich beim Ausgangsmaterial für die Extraktion der erfindungsgemässen Polysaacharidsubstanzen, d.h. bei den Pilzen der Basidiomyceten, woraus die Kulturen für die Extraktion gewonnen werden, um die zur Gattung Coriolus gehörigen, wie beispielsweise Coriolus consors (Berk.) Imaz,_? Coriolus versicolor (Fr.) Quäl, Coriolus hirsutus (Fr.) Quel sowie Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. Diese Pilze sind unter den in der folgenden Tabelle angeführten Lagernummern im Fermentation Research Institute (F.R.I.) der Agency of Industrial Science and Technology, einer hierfür eingerichteten Einrichtung der japanischen Regierung, hinterlegt.

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Tabelle 3

Nr. Gattung

Art

Lager-Nr.

1	Coriolus	Coriolus consors (Berk.) Imaz.	CM-166'F.R.I.	CM-104-	. Lag	.Nr.	988
2	Il	Coriolus versicolor (Fr.) Quel. CM-103	CM-105	ti	Nr.	24-14-
3	Il	η	CM-106	It	Nr.	24-15
4-	Il	Il	CM-107	Il	Nr.	24-16
VJl	Il	Il	CM-108	It	Nr.	24-17
6	η	ti	CM-109	Il	Nr.	24-18
7	It	It	CM-110	ti	Nr.	2.4-19
8	ti	Il	CM-111	Il	Nr.	24-2.0
9	Il	Il	CM-112	II	Nr.	24-21
10	II	Il	CM-113	Il	Nr.	24-2.2
11	Il	Il	CM-114-	11	Nr.	24-23
12	Il	It	CM-115	Il	Nr.	24-24-
13	It	ti	CM-151 ■	ti	Nr.	24-25
14-	Il	Il	Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. CM-161	ti	Nr.	24-26
15	ti	Coriolus hirsutus (Fr.) Quel.	Il	Nr.	2711
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Wie oben erwähnt, kann das zur Extraktion der erfindungsgemässen Polysaccharidsubstanzen verwendete Ausgangsmaterial entweder aus natürlich oder künstlich kultivierten Fruchtkörpern oder Mycelen bestehen, und im Fall der künstlichen Kultur unter Verwendung eines flüssigen Mediums ist es möglich, alle Kulturprodukte einschliesslich nicht nur der erzeugten Mycelien, sondern auch der Eluate im flüssigen Kulturmedium, .als Extraktionsmaterial zu verwenden. Vom industriellen Standpunkt her ist es empfehlenswert durch Verwendung eines flüssigen Mediums alle Kulturen einschliesslich der kultivierten Mycele zu verwenden. Das so erhaltene

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Material wird dann dem nächsten Extraktionsschritt unterzogen, kann gegebenenfalls jedoch nach einer geeigneten Trοcknungsbehandlung, wie Lufttrocknung oder Friertrocknung, für den späteren Gebrauch aufbewahrt werden. Es wird bevorzugt, das Material vor dem Extraktionsschritt zu pulverisieren, da eine solche Behandlung den Extraktionseffekt erhöht. Die Extraktion des Materials wird unter Verwendungeines wässrigen Lösungsmittels durchgeführt. Das hier verwendete wässrige Lösungsmittel ist Wasser oder eine wässrige Lösung einer geringen Menge, beispielsweise ca. 10 % oder weniger, eines organischen Lösungsmittels, einer Säure oder Base, die in Wasser löslich sind. Bevorzugte Beispiele für erfindungsgemäss zu verwendende organische Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol und Isopropylalkohol. Die hier verwendete Säure kann Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure oder dergleichen und die Base Ammoniak, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat oder dergleichen sein. Von diesen wässrigen Lösungsmitteln werden V/asser und eine verdünnte Alkalilösung, insbesondere eine wässrige Lösung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid der Konzentration im Bereich von 0,005 bis 2n, bevorzugt. Die Extraktion wird durchgeführt, indem man ein wässriges Lösungsmittel, wie oben erwähnt, in einer Menge vom 5-bis 200-fachen der Menge (auf Trockenbasis) der als Extraktionsmaterial verwendeten Kultur bei einer Temperatur von gewöhnlich 50 bis 100⁰C über einen Zeitraum von 20 min bis 20 h verwendet. Eine Extraktionstemperatur von weniger als 50⁰C führt zu einer schlechten Extraktionsausbeate, so dass es im allgemeinen bevorzugt wird, die Extraktion bei einer Temperatur im Bereich von 80 bis 98⁰C durchzuführen. Die Anzahl der Extraktionsläufe liegt üblicherweise unter 10, vorzugsweise bei 5 bis 8. Um einer Zersetzung von Wirksubstanzen vorzubeugen, ist es vorzuziehen, die gesamte Extraktionszeit auf weniger als 20 h zu begrenzen, unabhängig von der Anzahl der Extraktionsläufe. Andererseits ist es vom Standpunkt der Extraktionsausbeute her vorzuzie-

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hen, die Extraktion über mehr als 1 h durchzuführen. Das zur Extraktion verwendete Lösungsmittel wird aus der oben angeführte Gruppe gewählt, jedoch ist es nicht notwendig, nur eine Lösungsmittelart zu verwenden'; in einigen Fällen werden sogar durch Verwendung von zwei oder mehreren Arten von Lösungsmitteln in Kombination, beispielsweise eine Kombination von Wasser und einer verdünnten Alkalilösung, bessere Ergebnisse erzielt.

Die besonders bevorzugte Extraktionsart dieser Erfindung besteht aus einer mehrstufigen Extraktion unter Verwendung einer verdünnten Alkalilösung oder einer Kombination von Wasser und einer verdünnten Alkalilösung, die durchgeführt wird, indem man allmählich die Konzentration der verdünnten Alkalilösung steigert. Diese Extraktionsmethode hat eine bedeutende Verbesserung der Extraktionsausbeute zum Ergebnis. Obwohl der Grund für diesen hohen Extraktionseffekt nicht genau bekannt ist, nimmt man an, dass bei dieser Extraktionsart nicht nur eine blosse Elution der löslichen Substanzen aus dem Material stattfindet, sondern auch eine milde Zersetzung des Materials, welche die Extraktion der löslichen Wirksubstanzen fördert. Es wird daher angenommen, dass bei einem solcher mehrstufigen Extraktionsverfahren die Zersetzung, die die Extraktion der Wirksubstanz fördert, jedesmal stattfindet, wenn die Alkalikonzentration erhöht wird. Wird die Extraktion unter Verwendung einer von Anfang an hoch-konzentrierten Alkalilösung durchgeführt, so sinkt, obwohl die Extraktion stattfindet, die Ausbeute der gewünschten Substanz in folgenden Extraktionsgängen scharf ab. Dies hat vermutlich den Grund, dass die Fraktion (der gewünschten Substanzen), die durch die Extraktion erhalten werden sollen, aufgrund der harten Bedingungen eine umfangreiche Zersetzung erfahren, was eher zur Bildung der degenerierten oder nieder-molekularen Substanzen als der bevorzugten hoch-molekularen Polysaccharide führt.

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Der nach dem oben genannten Extraktionsverfahren gewonnene flüssige Extrakt wird nach, einem normalen "Verfahren unter Verwendung einer Alkalie im Fall der Säureextraktion und einer Säure im EaIl der Alkaliextraktion neutralisiert und einer Reinigungsbehandlung unterworfen. Die hier durchgeführte Reinigungsbehandlung soll den Extrakt von den darin enthaltenen nieder-molekularen Substanzen (Molekulargewicht kleiner als 5OOO) befreien und kann in Aussalzen, Dialyse, Ultrafiltration, Umkehrosmose, Gelfiltration oder Sedimentation unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels bestehen, wobei diese Techniken entweder für sich oder in Kombination angewendet werden können. Vom technischen Standpunkt wird unter Einsatz der Ultrafiltration, einer Hembranseparationsmethode unter Druck, oder der Umkehrosmose, entweder für sich oder in Kombination bevorzugt, in einigen Fällen jedoch kann diese Reinigungsbehandlung nach einer vorherigen Aussalzbehandlung des Extrakts durchgeführt werden. Die Dialyse als Reinigungsbehandlung wird üblicherweise durch Verwendung einer Gellophanmembran, eines Kollodiondiaphragmas oder einer Cellulosemembran durchgeführt. Das für die Aussalzbehandlung verwendete Aussalzmittel kann Ammoniumsulfat, normales Salz, Kaliumchlorid, Bariumcarbonat oder dergleichen sein, wobei Ammoniumsulfat bevorzugt wird. Wird die Aussalzbehandlung durchgeführt, so wird sie gefolgt von Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, Umkehrosmose oder einer ähnlichen Behandlung. Die Gelfiltration wird unter Verwendung einer mit Dextran oder Polyacrylamidgel beschickten Säule durchgeführt. In diesem Fall wird üblicherweise ein unter der Warenbezeichnung Sephadex Biogel im Handel erhältlicher Säulenfüllstoff verwendet. Ultrafiltration und Umkehrosmose sind beide Fraktionierungsmethoden, die unter Verwendung einer Membran unter Druck durchgeführt v/erden, üblicher-

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v/eise von 0,5 bis 5 kg/cm im ersten und 20 bis 35 kg/cm im letzteren Fall. Im Fall der Sedimentation verwendet man

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im allgemeinen ein organisches. Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol oder Aceton. Gegebenenfalls kann zusammen mit einer oben erwähnten Behandlung auch eine Ionenaustauschbehandlung durchgeführt werden.

Die oben erwähnte Reinigungsbehandlung in dieser Erfindung ist deshalb von wesentlicher Bedeutung, weil die niedermolekulare Fraktion oder die Substanz mit einem Molekular-* gewicht von weniger als 5000, die durch die Behandlung aus dem Extrakt freigesetzt wird, fast keine inhibitorische Wirkung gegen solide Sarcoma-180-Turaoren bei der i.p.-Verabreichung an Mäuse aufweisen und dann diese Fraktion ausserdem etwas bitter ist und einen Geruch aufweist. Daher ist die Gegenwart dieser nieder-molekularen Fraktion bezüglich der pharmazeutischen Potenz der gewünschten Polysaccharidsubstanz dieser Erfindung nicht wünschenswert .

Die durch die oben genannte Reinigungsbehandlung erhaltene Flüssigkeit wird in einer Konzentration von 1 bis 20 #, vorzugsweise 3 bis 10 #,eingestellt und dann mit Ammoniumsulfat gesättigt. Der dabei erhaltene Niederschlag wird gesammelt. Dieser Niederschlag wird dann wieder in Wasser gelöst und der Dialyse, Ultrafiltration oder Umkehrosmose unterworfen. Nach Einstellen der Konzentration auf 3 bis 10 % lässt man diese Lösung über eine DEAE-Cellulosesäule laufen, so dass die stickstoffhaltige Komponente absorbiert und abgetrennt wird, und das erhaltene Eluat v/ird, gegebenenfalls nach Wiederholen dieses Arbeitsgangs, konzentriert und getrocknet. Man erhält so die gewünschte Polysaccharidsubstanz, die weiss, geschmack- und geruchlos ist.

Im folgenden v/ird die Antitumorwirkung der erfindungsgemässen Polysaccharidsubstanz durch Angabe der Ergebnisse verschiedener Tierversuche beschrieben.

akute toxizität

Akute Toxizitätsfür Mäuse und Ratten:

Pur diesen Versuch verwendet wurden 4- bis -5 Wochen alte ICH-JCL-stämmige Mäuse mit einem Gewicht von 21 bis 24- g und 4· bis 5 Wochen alte Donryu-stämmige Ratten mit einem Gewicht von 100 bis 150 g. Die erfindungsgemässe Substanz wurde auf die folgenden vier Arten verabreicht: intravenös (i.V.), subeutan (s.c), intraperitoneal (i.p.) und oral (p.o.). Beobachtet wurden allgemeineSymptome, Tod und Körpergewicht über einen Zeitraum von 7 Tagen nach Verabreichung der Substanz. Nach dem Ende dieser Beobachtungsperiode wurden die Tiere getötet und autoptisch begutachtet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4- aufgeführt. Weder bei Ratten noch bei Mäusen konnte selbst bei Verabreichung der Maxima!dosis der Substanz der Tod herbeigeführt v/erden, und es war praktisch unmöglich, den numerischen Wert der LD₁-Q zu berechnen.

Tabelle 4-

Tierart	Verabreichungsweise	LD50 (mg/kg)	männlich
Maus e	i.v. S · C · i.p. p.o.	weiblich	> 13ΟΟ > 5000 > 5OOO >20 000
Ratten	i.v. s.c. i.p. p.o.	>1500 >5000 >5000 >20 000	> 600 > 5000 > 5OOO > 20 000
> 600 > 5OOO > 5000 > 20 000

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ANTITUMORWIRKÜRG

Der Antitumöreffekt der erfindungsgemassen Substanzen wurde nach einer üblichen, unten ausgeführten Methode bestimmt.

Sarcoma-ieO-Tumor^ellen wurden in die Peritonealhöhlen von Mäusen implantiert und nach dem Zeitraum von 7 Tagen, währenddessen ein hinreichendes Wachstum der Tumorzellen stattfand, wurden IO Zellen unter die Axillarhaut von weiteren 10 Mäusen zur Ausbildung solider Tumoren implantiert. Die pulverisierte erfxndungsgemasse Substanz wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und den Mäusen, beginnend 24- h nach Implantation, verabreicht. Im Fall der Verabreichung i.p. wurde die Substanz in einer Dosis von 10 mg/kg oder 0,2 ml/20 g (Körpergewicht Mäuse) einmal alle 2 Tage insgesamt 10-mal verabreicht, im lall der Verabreichung p.o. in einer Dosis 1000 mg/kg oder 0,2 ml/20 g (Körpergewicht Maus) einmal täglich insgesamt 20-mal. 25 Tage nach Implantation wurden die Tumoren enukleiert und die Tumorwachstums-Hemmrate aus dem Durchschnittsgewicht der Tumoren in der behandelten Gruppe und dem Durchschnittsgewicht der Tumoren der Kontrollgruppe berechnet. Die Ergebnisse sind in der unten angeführten Tabelle 5 gezeigt. Die erhaltenen Testergebnisse aus den oben ausgeführten Messungen zeigen eine ausgezeichnete Antitumorwirkung der vorliegenden Substanz nicht nur bei der i.p.-Verabreichung, sondern auch bei oraler Anwendung. Die im Versuch verwendeten Proben der vorliegenden Substanz wurden aus den Extrakten der Kulturen der in der Tabelle 5 gezeigten Pilzarten hergestellt.

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tabelle Antitumoreffekt in vivo gegen implantierte Tumoren in (ICR-JOL) Mäusen

Pilzart	F.R.I.	Implantations	Anzahl	Zeit	Dosis	Zur Bewer	Tumor
	Dep.Nr.	weg-Verabrei	impl.	bis	(mg/kg χ Anz.	tung der	hemm
		chung	Zellen	Beginn	von Einzel	Wirkung	rate
			pro	d.Verab-	gaben)	notw. Zeit	(#)
			Tier	reichung		(Tage nach
				n.Implant.		Implantation)
Coriolus	Nr. 988	S · C · ·*■ IL · ρ ·	106	24 h	10 χ 10	25	90
consors
(Berk.)		s· c. — p.o.	106	24· h	1000 χ 2.0	25	55
Imaz.
Coriolus	Nr. 24-14-	S # C · ™* .L · [J ·	106	24- h	10 χ 10	25	95
versicolor			CL
(Fr.) Qu el.		S.C. - p.O.	106	24- h	1000 χ 20	25	70
Coriolus	Nr. 2711	S.C. — X.p.	106	24- h	10 χ 10	25	92
hirsutus
(Fr.) Quel.		S.C. — p.O.	106	24- h	1000 χ 20	25	60
Coriolus	Nr. 2.712	s.c. - i.p.	106	24- h	10 x 10	25	90
pargamenus			f.
(Fr.)		S.C. - p.O.	1Ob	24- h	1000 χ 2.0	25	60
Pat.

Wie die obigen Versuchsergebnisse zeigen, kann die vorliegende Substanz sowohl oral als auch intraperitoneal verabreicht werden.

Eine der besonderen Eigenschaften ist, dass sie keine Allergenwirkung hat, da sie keine Proteine enthält, was eine sichere Injektion etc. zur Folge hat. Ausserdem wird die Tatsache, dass die Ergebnisse der Versuche an Säugetierenauf Menschen angewandt werden können,in der Literatur deutlich aufgezeigt (Akio HOSHI und Kazuo KUBEDAHI, Farumashia, 9, 464-468 (1973)). Entsprechend liegt im Fall der oralen Verabreichung bei der Behandlung von Karzinomen des Grastro-intestinal-trak.ts, wie Ösophaguskarzinom, Magenkarzinom, Colonkarzinom und Rektumkarzinom, Karzinomen der Kopf-und Halsgegend, Mammakarzinom, Bronchialkarzinom, malignen Lymphomen und anderen Tumoren bei erwachsenen Patienten die Uormaldosis, obwohl sie in Abhängigkeit von der Zahl von Verabreichungen variiert, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 3 g pro Tag und für die Verwendung als Injektion beträgt die EOrmaldosis vorzugsweise nicht mehr als 500 mg.

Wird die Substanz für die orale Verabreichung in feste Zubereitungsformen gebracht, wie Tabletten, Körnchen, Pulver, Kapseln und dergleichen, so kann die Mischung ein Bindemittel, Einschlussmittel, Formmittel, Gleitmittel, Desintegrator, Netzmittel und andere entsprechende Zusätze enthalten. Die Substanz kann auch in flüssige Zubereitungen zur Verwendung p.o. gebracht werden, wie innerliche, flüssige Arzneimittel, Schüttelmixturen, Suspensionen, Emulsionen, Sirupe und dergleichen, oder sie kann in Form eines trocknen Produkts sein, das vor Verwendung aufgelöst wird. Solche flüssigen Zubereitungen können die normalerweise verwendeten Arten von Zusätzen oder Konservierungsstoffen enthalten.

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Die Zubereitungen zur Injektion können auch einen Zusatz oder Zusätze wie Stabilisator, Puffer, Konservierungsmittel, Isotonisierungsmittel und dergleichen enthalten und sie können in Form von Ampullen geliefert werden, die eine Einheitsdosis der Substanz enthalten oder in Form von Behältern, die Mehrfachdosen der Substanz enthalten. Die Injektionsmischungen können in Form einer wässrigen Lösung, Suspension, Lösung oder Emulsion in einem öligen oder wässrigen Träger hergestellt werden und die Wirksubstanz kann in Form von Pulver geliefert werden, das bei Verwendung in einem geeigneten Träger, wie pyridinfreiem sterilem Wasser, wieder gelöst wird.

Wie oben erwähnt, liefert die erfindungsgemässe Polysaccharidsubstanz einen ausgezeichneten Effekt, wenn sie als Anti— tumormittel zur oralen Verabreichung verwendet wird. Die vorliegende Substanz hat auch immunpotenzierende Wirkung beim Empfänger und ist "zur Verhütung von Nebenwirkungen bei der Chemotherapie und zur Erhöhung der Empfindlichkeit bei der Eadiotherapie wirksam. Ferner ist die vorliegende Substanz für die Verhinderung an Immunsuppression oder Verminderung der physischen Kraft der Patienten sowie zum Schutz des Patienten gegen virale:oder bakterielle Infektionen, für die der Patient aufgrund der herabgesetzten Immunität empfänglich ist, brauchbar. Andere "wichtige Effekte der vorliegenden Substanz bei oraler Verabreichung sind Verbesserung der Leberfunktion, Heilung von intestinalen Beschwerden und Diureseförderung.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ein CM-105-Stamm (F.R.I. Lager-Nr. 24-14) von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. der Gattung Coriolus wurde in einen konischen 200 ml-Kolben mit 30 ml eines aus 5 # Glucose,

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2303681

0,2 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt, 0,1 % KHpPO^ und 0,1 # MgSO^.7HpO bestehenden Mediums inokuliert und einer 10-tägigen stationären Kultur bei 25 bis 27°C unterzogen. Das auf der Oberfläche des Mediums gewachsene Mycel wurde mit physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert und so das Impfmedium hergestellt.

20 1 des aufgeschlämmten Impfmediums wurden in 1600 1 eines aus 10 % Glucose, 1,5 % Hefeextrakt, 0,1 % KH2^P04 ^und MgS0/_j..7Hp0 bestehenden Mediums in einem vertikalen 2 ra Fermenter inokuliert und bei einer Belüftungsrate von 0,5 1 pro min pro Liter Medium, einer Rührgeschwindigkeit von 150 upm,bei einer Temperatur von 26⁰C über 7 Tage kultiviert. Die so erhaltene Brühe wurde in 500 1 Portionen aufgeteilt und jede Portion wurde in einem Doppeltrommel trockner getrocknet, so dass man ungefähr 30 kg Trockenprodukt erhielt. 100 g des Trockenproduktes wurden mit 3 1 Masser in einem 5 1-Kolben mit einem Rührer gegeben und 3 h unter ständigem Rühren bei einer Innentemperatur von 95 +. 2°C geh alten. Dann wurde die Lösung nach Abkühlen in Mycelrückstand und Extraktlösung getrennt. Der Mycelrückstand wurde mit ungefähr 1 1 Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Extraktlösung gemischt, bei einem Volumen von.ca. 3,5 1·

Der Mycelrückstand wurde mit 2 1 0,1n Natriumhydroxidlösung versetzt und in der oben beschriebenen Weise einer 2-stündigen Extraktion bei 95 +. ^⁰C unterworfen, gefolgt von Abkühlen, Neutralisation mit 2n Salzsäure und Auftrennung in Extraktlösung und Mycelrückstand mit Hilfe einer Absaugfiltration. Nach der Abtrennung wurde der Rückstand mit etwa 0,5 1 Wasser gewaschen und mit der Extraktlösung vermischt, so dass man 2,2 1 Extraktlösung erhielt. Die gleiche Behandlung wurde jeweils mit 2 1 0,2n, 0,3n und 0,4-n Natriumhydroxidlösung unter Verwendung von 0,5 1 Waschwasser wiederholt, wobei man ca. 7»2 1 Extraktlösung erhielt.

- 23 -

809833/0765

28Q3SS1

Die so erhaltene Extraktlösung wurde unter Verwendung eines Ultrafilters Amicon 2000 Banktyp (mit einer DM-5 Membran)

unter einem Betriebsdruck von 1,5 kg/cm und bei einer !Temperatur von 10⁰C unter Rühren und Kühlung behandelt, wobei die nieder-molekularen Substanzen und Neutralsalze eliminiert wurden, worauf man 200 ml Flüssigkeit erhielt.

Die so erhaltene Flüssigkeit wurde mit 160 g Ammoniumsulfat versetzt und der erzeugte Niederschlag wurde gesammelt. Dieser Niederschlag wurde dann in Wasser gelöst und unter Verwendung des oben genannten Amicon Ultrafilters entsalzt, wobei man 190 ml Flüssigkeit erhielt. Diese Flüssigkeit liess man über eine DEAE-Cellulose-Säule (0H-Form) von 10 cm Durchmesser und 100 cm Länge zur Adsorption und Entfernung der in der Flüssigkeit enthaltenen stickstoffhaltigen Stoffe laufen und eluierte mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 20 1 Eluat. Die so erhaltene Flüssigkeit wurde auf einem Rotationsverdampfer auf 180 ml eingeengt und dann nochmals über die DEAE-Cellulose-Säule geschickt. Das schliesslich erhaltene Eluat wurde ein weiteres Mal mit dem Rotationsverdampfer konzentriert und gefriergetrocknet, so dass man schliesslich 3₅O g der gewünschten Polysaccharidsubstanz in Pulverform erhielt.

Die Eigenschaften dieser Substanz wurden nach den folgenden Methoden bestimmt, ebenso wurden Tierversuche gemäss der unten angeführten Beschreibung mit dieser Substanz durchgeführt.

(1) BESTIMMUNG DER EIGENSCHAFTEN

IR-Spektrum

Ein IR-Absorptionsspektrum der erhaltenen pulverigen Substanz, bestimmt in einem Kaliumbromidpressling, ist in Fig. gezeigt. Der dabei verwendete Pressling wurde durch Vermischen von 1 g Kaliumbromid und etwa 1/3 bis 1/2. Spatel

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der Probe nach einem üblichen Verfahren hergestellt. Man fand eine Absorption bei 3600 bis 3200 cm , 2920 bis 2900 cm"¹, 1660 bis 1610 cm"¹, 14-60 cm"¹, 14-10 cm""¹, 1360 cm"¹, 1230 cm"¹, 1150 cm"¹, 1080 cm"¹, 1060 bis 990 cm"¹, 925 cm"¹, 84-0 cm"¹, 755 cm"¹ und 705 cm"¹. Die Absorption bei 84-0 cm kann einer Saccharid-O(-Bindung zugeordnet werden. Dies bestätigt.die Tatsache, dass die vorliegende Substanz aus Q(-gebundenen Glucosiden besteht.

Spezifische Aktivität

Optische Aktivität wurde mit der Na^ (589 um)-Linie bei Verwendung einer 0,25 #igen wässrigen Lösung der Probe und einer 5 cm Zelle bestimmt und aus der Drehung 0( die spezifische optische Aktivität /ÜX7j? berechnet.

NMR-Absorptionsspektrum

Das NMR-Spektrum wurde mit DSS als internem Standard unter Verwendung von schwerem Wasser als Lösungsmittel aufgenommen. Die in der Tabelle aufgeführten numerischen Werte sind die Werte nach Korrektur unter der Annahme einer Lorenz-Kurve zur Elimination des Einflusses von Leichtwasserrückständen im schweren Wasser.

Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der vorliegenden Substanz wurde mit der ültrazentrifugationsmethode bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Molekulargewicht aller geprüften Proben im Bereich von 5000 bis 300 000 liegt. Die Messungen wurden mit Anwendung Sedimentationsgleichgewicht und Dichtegradienten unter Verwendung eines optischen Interferenzsystems ausgewertet. Die Versuchsbedingungen waren wie folgt: Probenkonzentration 0,3 %; Lösungsmittel M/1 OM KCl; Temperatur 25°C; Flüssigkeitssäule 1,7 mm; Geschwindigkeit 22 000 upm; Messzeit 5 h.

- 25 809833/0765

IG

2803631

(2) SACCHARIDKOMPONENTE DES GLUCOSIDS

Die Monösaccharidkomponente der vorliegenden Substanz wurde auf folgende Weise analysiert: 3 mg Probe wurde in eine Glasampulle gegeben und man füllte 10 ml 3 #ige HCl/Kethanol für die Methanolyse bei 100 C über 16 h zu. Dann wurde die Chlorwasserstoffsäure mit Silbercarbonat neutralisiert und bei Raumtemperatur filtriert. Das IFiltrat wurde konzentriert und zur Trockne eingedampft und dann in 0,5 ial wasserfreiem Pyridin gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 0,2 ml Hexamethyldisilazan und 0,3 ml Trimethylchlorsilan gemischt und das Gemisch 30 min bei Raumtemperatur zur Trimethylsilierung stehengelassen. Danach wurde das Gemisch in Chloroform gelöst und nach Entfernung des überschüssigen Reagenz durch Waschen mit Wasser wurde die erhaltene Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Tetrachlorkohlenstoff gelöst und gaschromatografisch analysiert. Die Ergebnisse der Analyse zeigten, dass Glucose mehr als 99 % der Saccharidkomponente der vorliegenden Substanz ausmacht und dass andere Saccharide, wie Mannose, Galactose, Xylose, Fucose und dergleichen nur spärlich vorhanden sind.

Um zu erfahren, ob die Glucose als Hauptbestandteil des Saccharidanteils der vorliegenden Substanz in der D- oder L-Form vorliegt, wurde sie vom Hydrolysat der Substanz durch eine Säule abgetrennt und ihr Schmelzpunkt bestimmt. Er lag bei 14-3 bis 14-5°C. Diese Glucose zeigte keinen Schmelzpunktabfall, wenn sie mit einem D-Glucose-Standard gemischt und zum Schmelzen gebracht wurde. Hieraus wurde die Glucose der vorliegenden Substanz als D-Glucose identifiziert.

(3) SACCHARIDBINDUHGSMUSTER

Das Muster der Saccharidbindung in der vorliegenden Substanz wurde nach der Methode von Haworth bestimmt. 2 g Probe wurden in 10 ml 1n NaOH-Lösung gelöst und während das Gemisch im Stickstoffstrom unter heftigem Rühren bei 40 bis 50° C

- 26 809833/07S5

gehalten wurde, wurden 20 ml Dimethylschwefelsäure und 40 ml JO #ige Natriumhydroxidlösung über einen Zeitraum von einigen Stunden zugetropft. Nachdem man das Gemisch über Nacht stehengelassen hatte, wurde es einer ähnlichen Behandlung mit der gleichen Menge von Methylierungsmittel unterworfen. Die Reaktionslösung wurde nach der Neutralisation in fliessendem Wasser dialysiert und das Dialysat unter vermindertem Druck konzentriert und 3-mal der oben beschriebenen Methy— lierungsbehandlung unterworfen. Nach zusätzlicher Neutralisation und Dialyse wurde das Gemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 20 ml eines Chloroform-Methanol (10:1)-Gemisches gelöst und man gab ein Petrolether-Ether-Gemisch (1:1) zur Ausfällung der methylierten Substanz zu. Dann wurden ungefähr 20 mg der methylierten Substanz mit 1n Schwefelsäure bei 100⁰C übei^ 16 h hydrolysiert und das Hydrolysat wurde nach einem üblichen Verfahren zu Alditol-acetat umgesetzt. Aus der Peak-Fläche der gaschromatografischen Kurve wurde das Molverhältnis bestimmt. Zur Unterscheidung zwischen 2,3»6-Tri-0-Me-G und 2,3*4-Tri-0-Me-G wurden 20 mg der methylierten Substanz der Methanolyse bei 100⁰G über 16 h in einem verschlossenen Röhrchen unter Verwendung von 3 % HCl-Methanol der Methanolyse unterworfen. Bei der gaschromatografischen Analyse des Methanolyseprodukts wurde keine 2,3»4--Tri-0-Me-G gefunden. Zur Bestätigung dieses Befundes wurden jeweils die zersetzten Produkte gaschromatografisch unter Verwendung eines Standards identifiziert, während jedes Hydrolysat mit Hilfe einer Saulenflussigchromatografie und jeweils entweder nach Kristallisation oder Umsetzung zu einem kristallinen Derivat isoliert wurde.

Die Eigenschaften, Strukturcharakteristika und Antitumorwirkungen der so erhaltenen Polysaccharidsubstanzen dieser Erfindung sind zusammengefasst in Tabelle 6.

Beispiel 2

Die Impfmedien aus den Stämmen Coriolus consors (Berk.) Imaz. CM-166 (IF.R.I. Lager-Nr. 988), Coriolus pargamenus (Ir.) Pat. CM-161 (I.E.I. Lager-Nr. 2712 und Coriolus hirsutus (Fr.) Quel. CM-I5I (I.E.I. Lager-Kr. 2711) der

Gattung Coriolus aus der Klasse der Basidiomyceten wurden in derselben V/eise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.

Pepton 3 g

Hefeextrakt 5g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,1 g

Kaliumhydrogenphosphat 0,1 g

Magnesiumsulfat (Heptahydrat) 0,05 g

Glucose 20 g

Malzextrakt 10 g

Wasser 1 1

pH 6,0

Jeweils 200 El des oben aufgeführten Mediums wurden in Kulturflaschen ("Volumen 1 1) pipettiert und in jedes Medium wurde 1 ml des Impfmediums inokuliert, gefolgt von einer 25-tägigen Inkubation bei 25 bis 30 C und Trocknung, wobei man 980 g trockenes Mycel von Coriolus consors (Berk.) Imaz. CM-165, 1200 g von Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. CM-161 bzw. 1500 g von Coriolus hirsutus (Fr.) Quel. erhielt.

Dann wurden 100 g der so erhaltenen trockenen Mycelien jedes Stammes und 2 1 0,4-n Natriumhydroxidlösung in einem Extraktionsgefäss mit Heiz- bzw. Kühlmantel und Rührer gegeben und einer 2-stündigen Extraktion unter Rühren und Einstellung der Manteltemperatur auf eine Innentemperatur im Gefäss von 90 bis 95°C gegeben. Der erhaltene Extrakt wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, dann portionsweise mit 2n Salzsäure unter Rühren versetzt und nach Einstellung des pH auf einen Viert von 7 mit einem Zentrifugenseparator in Extraktlösung und Mycelrückstand aufgetrennt.

809833/-033S

IB

280368}

Der Mycelrückstand wurde dann mit 2 1 0,4-n Natriumhydroxidlösung versetzt und einer ähnlichen 2-stündigen Extraktion bei 90 bis 95°C, gefolgt von Abkühlen, Neutralisation und Zentrifugation,unterworfen, so dass man eine Extraktlösung und Mycelriickstand erhielt. Letzterer wurde einem weiteren ähnlichen, 1-stündigen Extraktions Vorgang mit 0,4-n Natriumhydroxidlösung unterworfen, dann abgekühlt, neutralisiert und durch Zentrifugetion in Extraktlösung und Mycellösung aufgetrennt. Letztere wurde nochmals einer Ί-stündigen Extraktion mit 0,4-n Natriumhydroxidlösung unterworfen, gekühlt, neutralisiert und zentrifugiert.

Die insgesamt vier Extraktionsläufe ergaben ca. 8,4 1 Extraktlösung. Diese Extraktlösung wurde auf einem Volumen von 3 1 eingeengt, dann in einen Celluloseschlauch zur Dialyse (Visking-Schlauch der Union Garbide) gegeben und einer 6-tägigen Dialyse mit fliessendem Leitungswasser unterworfen. Die Lösung im Schlauch wurde auf 190 ml Flüssigkeit konzentriert.

Die so erhaltene konzentrierte Flüssigkeit wurde dann mit 16Og Ammoniumsulfat versetzt und der erzeugte Niederschlag wurde gesammelt, in Wasser gelöst und einer weiteren 6-tägigen Dialyse mit dem Visking-Schlauch unterworfen. Die Lösung im Schlauch wurde auf 4-10 ml konzentriert.

Diese konzentrierte Flüssigkeit wurde wie in Beispiel 1 behandelt, d.h. über eine DEAE-Cellulosesäule zur Absorption und Entfernung der in der Flüssigkeit enthaltenen stickstoffhaltigen Komponente geführt und die erhaltene Lösung wurde mit dem Rotationsverdampfer eingeengt und getrocknet, so dass man schliesslich die gewünschten Polysaccharidsubstanzen in trockener Pulverform in einer Menge von 6,0 g aus Goriolus consors (Berk.) Imaz., 6,5 S aus Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. bzw.5»5 g aus Coriolus hirsutus (Fr.)

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Quel. erhielt. Die Eigenschaften der erhaltenen Substanzen, Ergebnisse von Tierversuchen, IR-Absorptionsspektren, NMR-Absorptionsspektren, Molekulargewicht, spezifische optische Aktivität, Saccharidkomponente. und Saccharidbindungsmuster sind zusammen mit denen des Produkts aus Beispiel 1 in
Tabelle 6 aufgeführt.

- 30 809833/0765

Tabelle 6

	Beispiel Nr.	1	2	2	2
	F.R.I. Lager Nr. IERM-P	Nr. 2414	Nr. 988	Nr. 2712	Nr. 2711
	Stamm Nr.	CM-103	CM-166	OM-161	OM-151
	Extraktionsmethode	Heisswas se r-AlkaIi	Alkali	Alkali	Alkali
α>	Molekulargewicht (x10 )	0,7 - 28	0,5 - 26	1 - 20	0,5 - 30
ο CO	Durchschnitts- u Molekulargewicht (xiO )	7,0	9,0	•8,2	9,5
833	Farbreaktion (Saccharid)
ο ^	CX-Naphthol-Schwefelsäure- reaktion	purpur	wie neben stehend -	wie neben stehend'. -	wie neben stehend -:
σ> ι cn

Indol-Schwefelsäurereaktion Anthron-Schwefelsäurereaktion

Phenol-Schwefelsäurereaktion

Tryptophan-Schwefelsäurereaktion

pH-Wert

Spezifische o
Aktivität β]

ische

braun

grünlichblau

braun

rötlichbraun

6,8

170

j».

Il

Il

tt

ti Il

Il It

6,6

150

100

6,9

160

Tabelle_6 XForts.)

Beispiel Nr.

ο» ο co α»

Elementaranalyse

NMR-Absorptionsspektrum Absorption bei (ppm)

0,9 - 2,0 ppm

3,6 - 3,9 ppm

5,0 + 0,1 ppm

5,4 + 0,1 ppm Hauptzuckerbestandteil IR-Absorptionsspektrum

3600 - 3200 cm' 2920 - 2900 cm 1660 - 1610 cm

-1 -1 —1

44	,49	4-31	68	43	,98	4-5	,02
6	,21	.5,	99	6	,39	6	,53
0		0		Ö		0

(gemessen bei 100 MHz, 100⁰C in D

1460,1410,1360,1230 cm 890 cm"¹

840 cm

-1 nicht .nicht
vorhanden vorhanden

nicht vorhanden

nicht vorhanden

vorhanden vorhanden vorhanden vorhanden

Il

It

it

H Il It

D-Glucose D-Glucose D-Glucose

D-Glucose

vorhanden vorhanden vorhanden vorhanden

nicht nicht nicht vorhanden vorhanden vorhanden

nicht vorhanden

vorhanden vorhanden vorhanden vorhanden

CD CvJ

Tabelle 6 (Forts.) Beispiel Nr.

Saccharxdanalyse (Bindungsmuster)

*⁴G¹4 5,5 3,9 6,0 6,8

-»V·* 1,0 1,5 1,9 1,5

0,9 1,2 1,0 1,3

2,1 0,5 1,2 0,4

0,3 0,1 0,3 0,5 ig

1111

< 1300 < 1300 < 1300 <

O	I	3	^]
co	VM
	V)J		η * w
O	I		(4- λ,
		Akute	/|
a%		(Mäuse	G -^
at		i.v.	Toxizität
			, LD50 (mgAs))
		S.C.	männlich
		i.p.	weiblich
		P.O.	männlich
			wexDxxcu männlich
		WC-LuXIbU männlich
		weiblich

Il Il ti It

< 5000 < 5000 < 5000 <

Il It It It

ΐ 5000 < 5000 < 5000 <

Il ti Il It ^T

000 < 20 000 < 20 000 < 20 000 C H

ti 11 11 it

Tabelle 6 (Ports.)

Beispiel

Nr.

1

Antitumorwirkung (Wachstumshemmung, %)

in vivo)

5 mg/kg

Dosis

90

2

2

2

<

(Ratten,

LD50 (mg/kg))

(Mäuse,

Applikationsart

10 mg/kg

95

i.v.

männlich

600 <

i.p.

50 mg/kg

97

s 600 <

^ 600 <

; 600

<

weiblich

It

i.p.

600 mg/kg

60

Il

Il

Il

S.C.

männlich

5000 <

i.p.

1000 mg/kg

70

S 5000 <

^ 5000 <

; 5000

<

weiblich

Il

p.o.

Il

it

It

i.p.

männlich

5000 <

p.o.

C 5000 <

^ 5OOO <

5000

<

OO

weiblich

Il

Il

Il

Il

p.o.

männlich

20 000 <

[ 20 000 <

20 000 <

, 20 000

weiblich

It

Il

ti

Il

^* CD UJ

en -^

95

90

90

90

90

92

90

90

90

50

60

55

55

60

60

Leerse ite

Claims (10)

Neue Polysaccaride und Verfahren zu Ihrer Herstellung PATENTANSPRÜCHE :

1.1 Polysaccarxdsubstanz, dadurch gekennzeichnet, dass sxe ein Molekulargewicht von 5000 bis 300 000, bestimmt durch Ultrazentrifugetion, besitzt und für Saccharide charakteristische Parbreaktionen, nämlich die gf-Kaphthol-Schwefelsäurereaktion, Indol-Schwefelsäurereaktion, Phenol-Schwefelsäurereaktion und Tryptophan-Schwefelsäurereaktion zeigt, dass eine Elementaranalyse 43,5 bis 4-5,3 % Kohlenstoff, 5,7 bis 6,7 % H und als Sest 0 ergibt, die spezifische opti-

""-25
sehe Aktivität -A/-«f_n7fLS^il^Pg^p^^St, sie eine spezifische

* 280368t

IR-Absorption bei 840 cm und. NMR-Absorptionen bei 3,7 + 0,1 ppm, 3,8 + 0,1 ppm, 5,0 £ 0,1 ppm und 5,4 J₁ 0,1 ppm zeigt, dass sie ferner in Wasser löslich, jedoch unlöslich in Pyridin, Chloroform und Hexan ist und dass der Saccharidanteil der Substanz im wesentlichen aus D-Glucose besteht, wobei das Bindungsmuster dieser D-G-lucose in der Substanz eine Oi-Bindung ist.

2. Polysaccharidsubstanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der im wesentlichen aus D-Glucose bestehende Saccharidanteil der Substanz eine Struktur besitzt, worin Λ¹ 3,5 bis 8,5, -*V■» weniger als 2, Λ2-» 0,5 bis 0,2,

7 ^^D

4Gw 0,1 bis 2,5 und -^ ^g-> weniger als 0,8, bezogen auf die nicht-reduzierende Endgruppe (G 4) des Monosaccharids, gemessen im Methylierungshydrolyseversuch nach Haworth, mit dem Index 1, ausmachen«

3. Polysaccharidsubstanz nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, dass das Durchschnittsmolekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 100 000 liegt.

4. Verfahren zur Herstellung der Polysaccharidsubstanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Mycelien und/oder JTruchtkörper von Pilzen der Gattung Coriolus mit einem wässrigen Lösungsmittel extrahiert werden, die erhaltene Extraktlösung durch Zusatz von Ammoniumsulfat nach Entfernung der niedrigen molekularen Substanzen mit Molekulargewichten von weniger als 5000 gesättigt, der erzeugte Niederschlag gesammelt, in Wasser gelöst, die erhaltene Lösung entsalzt, über eine mit Ionenaustauscher beschickte Säule zur Absorption und Entfernung der stickstoffhaltigen Substanz geleitet, die erhaltene Lösung dann konzentriert und getrocknet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Pilze Coriolus versicolor (Fr.) QueL, Coriolus

consors (Berk.) Iraaz., Coriolus hirsutus (Fr.) Quel. und Coriolus Pargamenus (I"r.) Pat· verwendet werden.

6. Verfahren nach .Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, dass als wässrigesLösungsmittel Wasser, verdünnte Säurelösung, verdünnte Baselösung und/oder eine verdünnte organische Lösungsmittellösung verwendet wird.

7- Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösung einer Base eine 0,005 bis 2n wässrige Lösung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion durchgeführt wird, indem man zuerst die Pilze oder deren Kulturen mit Wasser oder verdünnter Alkalilösung extrahiert und dann weiter die Extraktion stufenweise mit den Alkalilösungen von allmählich ansteigender Konzentration durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung der nieder-molekularen Substanzen aus der Extraktlösung durch Ultrafiltration oder Umkehrosmose oder eine Kombination davon durchgeführt wird.

10. Verwendung der Polysaccharxdsubstanz nach Anspruch als Wirksubstanz eines Antitumormittels.

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