DE2604481A1 - Waessrige loesung eines polysaccharids - Google Patents

Description

Priorität : 5. Februar 1975, Nr. 15 788/75, Japan

Wässrige Lösung eines Polysaccharids

Die Erfindung betrifft eine wässrige Lösung, insbesondere eine wässrige Lösung mit Antitumorwirksamkeit, die ein Polysaccharid, insbesondere eine Polysaccharid mit Antitumorwirkung, ein wasserlösliches Hochpolymeres und gegebenenfalls ein Monosaccharid enthält. Diese Lösung eignet sich als Arzneimittelzubereitung, beispielsweise zur intravenösen Injektion.

Die meisten als Antitumormittel wirksamen Polysaccharide haben im allgemeinen wegen ihres hohen Molekulargewichts geringe Löslichkeit in Wasser und neigen dazu, einen unlöslichen Niederschlag zu bilden, wenn sie nach dem Lösen in Wasser stehengelassen werden. Eine derartige wässrige Lösung ist nicht mehr für intravenöse Injektionen, insbesondere in der Humanmedizin, geeignet.

Wie aus der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung 484/1974 hervorgeht, hat Lentinan, ein ß-(l-*3)-Glucan, Antitumorwirksamkeit und hervorragende Wirksamkeit zur Wiederherstellung der Immunantwort, die normalerweise in dem an einem Tumor erkrankten Organismus

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vermindert ist.

Dieses lentinan hat jedoch geringe Löslichkeit in Wasser, wie 38 mg/dl, und die wässrige Lösung von Lentinan neigt gewöhnlich zur Ausbildung eines unlöslichen Niederschlags, wenn sie einen oder zwei Tage oder langer stehengelassen wird. Lentinan kann leicht in einer wässrig alkalischen Lösung gelöst werden; es wird jedoch in der Lösung rasch hydrolysiert und in inaktive Abbauprodukte übergeführt. Es ist im allgemeinen eine gut bekannte Tatsache, daß die physiologische Aktivität selbst vermindert oder beseitigt wird, wenn eine physiologisch aktive Substanz geraeinsam mit anderen Hilfssubstanzen gelöst wird, um die Löslichkeit der aktiven Substanz zu erhöhen. Diese Tatsache konnte- durch die Untersuchungen der Anmelderin vor allem dann bestätigt werden, wenn die physiologische Aktivität von Polysacchariden weitgehend von der Makrostruktur der Polysaccharide in der Lösung abhängt. Wenn ein Polysaccharid mit Antitumorwirkung gemeinsam mit einem anderen Mittel in Wasser gelöst wird, so zeigt sich, daß die physiologische Wirksamkeit vieler Polysaccharide aufgrund einer weitgehenden Veränderung der höheren Strukturen bzw. Makrostrukturen der Polysaccharide in der wässrigen Lösung in Gegenwart der Hilfsstoffe vermindert wird oder verschwindet.

Es wurde gefunden, daß eine wässrige Lösung, die ein physiologisch aktives Polysaccharid, speziell ein Polysaccharid mit Antitumorwirkung, und ein wasserlösliches Hochpolymeres sowie gegebenenfalls ein Monosaccharid enthält, die gewünschte physiologische Aktivität, speziell Antitumoraktivität, nicht verliert und daß diese Aktivität nicht vermindert wird. Eine derartige wässrige Lösung ist weit stabiler und bildet keine Spuren einer Abscheidung und eignet sich daher sehr gut als Injektionslösung zur intravenösen Injektion in der Humanmedizin. Außerdem wird auf diese Weise die Löslichkeit dieser Polysaccharide, insbesondere der Polysaccharide mit Antitumorwirkung, im wässrigen Medium stark erhöht.

Die in den erfindungsgemäßen Lösungen vorliegenden, als Antitumormittel wirksamen Polysaccharide haben geringe Wasserlöslichkeit. So können beispielsweise in Wasser nur weniger als etwa 100 mg eines solchen Polysaccharide pro 100 ml Wasser gelöst werden und

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beim Stehenlassen einer solchen Lösung während 2 bis 3 Monaten bei Raumtemperatur bildet sich ausnahmslos ein deutlicher, beigefarbener unerwünschter Niederschlag.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine stabilisierte wässrige Lösung eines physiologisch aktiven Polysaccharide zur Verfügung zu stellen, in der das Polysaccharid in relativ hoher Konzentration gelöst werden kann, ohne daß es beim Stehenlassen zu unerwünschten Abscheidungen kommt.

Gegenstand der Erfindung ist eine stabilisierte wässrige Lösung, die in Was.yer als Medium

a) eine physiologisch wirksame Verbindung mit einer Glucan-Hauptkette, insbesondere eine Verbindung mit Antitumorwirksamkeit,

b) ein primäres, wasserlösliches, löslich machendes Mittel, welches ein Dextran, Hydroxyäthylstärke, Carboxymethylcellulose oder PoIyäthylenglycol sein kann, in einer Menge, die zur Erhöhung der Löslichkeit der Verbindung a) ausreicht, und

c) ein sekundäres, wasserlösliches, löslich machendes Mittel, das eine Pentose, eine Hexose oder ein Zuckeralkohol mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen sein kann, in einer Menge von O bis 10 g/dl enthält.

Das in den erfindungsgemäßen Lösungen vorliegende physiologisch aktive, speziell tumorhemmende Polysaccharid ist entweder ein Glucan mit Antitumorwirksamkeit oder ein entsprechender PoIysaccharid-Protein-Kpmplex.

Zu solchen Glucanen mit Antitumorwirksamkeit gehören beispielsweise tumorhemmendes ß-(l-»3)-Glucan, ß-(l-*6)-Glucan, ß-(l-*3)(l->6)-Glucan und ß-(l-»4)(l-»6)-Glucan. Das tumorhemmende ß-(l->3)-Glucan ist beispielsweise ein Glucan, das nur durch ß-(l->3)-Glucosidbindungen verknüpft ist, oder ein Glucan, dessen Hauptkette überwiegend aus ß-(l-£5)-Glucosidbindungen besteht, wobei ein geringerer Anteil anderer glucosidischer Bindungen in der Hauptkette oder in den'Seitenketten vorliegen kann, wie ß-(l^2)-, ß-(l-H)- und ß-(l}6)· Glueosidverknüpfungen.

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Außerdem kann das in den erfindungsgemäßen lösungen vorliegende tumorhemmende Polysaccharid beispielsweise ein Glucan sein, das durch bekannte chemische Modifikation eines Polysaccharide, wie Carboxyalkylierung, Hydroxyalkylierung, Mercaptoalkylierung, Oxydation, Reduktion, Hydrolyse oder eine geeignete Kombination dieser Reaktionen gebildet wird, oder ein tumorhemmendes Polysaccharid oder ein Polysaccharid-Protein-Komplex, der aus natürlichen Quellen erhältlich ist, wie durch Extraktion der Fruchtkörper oder des Sklerotium von Basidiomyceten oder durch Isolierung dieser Polysaccharide aus dem Mycel oder der filtrierten Kulturbrühe von Basidiomyceten oder Hefen, oder Skleroglucan aus der Kulturbrühe von Fungi imperfecti. Baispiele für tumorhemmende Polysaccharide sind lentinan, das aus den Fruchtkörpern von Lentinus edodes Sing extrahiert werden kann, ß-Pachyman, das aus Poria cocos Wolf extrahiert werden kann, Pachymaran, das durch chemische Modifizierung von ß-Pachyman gebildet wird, Schizophyllan, das in der filtrierten Kulturbrühe von Schizophyllum commune vorliegt, und Glucane, die durch Extraktion der Fruchtkörper von Flammulina velutipes, pholiota nameko, Pleurotus ostreatus, Tricholoma matsutake, erhalten werden können.

Das in den erfindungsgemäßen Lösungen vorliegende wasserlösliche Hochpolymere ist vorzugsweise ein Polysaccharid, das aus natürlichen Quellen isoliert wird, oder ein Derivat eines solchen Polysaccharide.

Zu geeigneten Beispielen für das wasserlösliche Hochpolymere gehören Polysaccharide, wie Dextran, Hydroxyäthylstärke, Carboxymethylcellulose und deren Salze (nachstehend abgekürzt als CMC bezeichnet) oder Derivate dieser Verbindungen. Das Molekulargewicht dieses Polymeren unterliegt für die Zwecke der Erfindung keiner Beschränkung. Die erfindungsgemäße Lösung enthält vorzugsweise 0,1 bis 1 Gew.-$ dieses wasserlöslichen Hochpolymeren. Im Hinblick auf die stabilisierende Wirkung und die Viskosität der Lösung werden Dextran oder Hydroxyäthylstärke vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 1 Gew.-$ und das Natriumsalz von CMC vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 1 Gew.-j£ verwendet.

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Zu Monosaccharide!], die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, gehören Monosaccharide, wie D-Glucose oder Zuckeralkohole. Um eine isotonische Lösung mit guter Stabilität zu erzielen, enthält die erfindungsgemäße Lösung vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-% dieses Monosaccharide.

Die erfindungsgemäße Lösung kann gebildet werden, indem lediglich das wasserlösliche Polymere zu der Lösung, die das tumorhemmende Polysaccharid enthält, gegeben wird, oder indem das wasserlösliche Polymere und das Monosaccharid zu der Lösung des tumorhemmenden Polysaccharids gegeben werden. Durch Zugabe sowohl des wasserlöslichen "Polymeren als auch des Monosaccharids wird eine bemerkenswerte Verbesserung der Stabilität und Löslichkeit erreicht, die auf eine Wechselwirkung zwischen diesen beiden Materialien zurückzuführen ist.

Beispiel 1

500 g frische Fruchtkörper von Lentinus edodes wurden gewaschen, in einem Viaring-Mischer mit etwa 2 1 Wasser homogen zerkleinert und die so erhaltenen Aufschlämmung wurde unter Rühren 16 Stunden gekocht. Nach dem Entfernen von unlöslichen Materialien durch Zentrifugieren wurde 1 1 einer überstehenden Flüssigkeit erhalten, die auf etwa 1/3 ihres ursprünglichen Volumens im Vakuum eingedampft wurde. Das Konzentrat wurde in etwa 400 ml Äthanol gegossen, wobei sich etwa 50 g eines faserigen Niederschlags bildeten. Der Niederschlag wurde mit einem Sieb entfernt, mit Äthanol gewaschen und durch Homogenisieren in einem Waring-Mischer während 5 Minuten in 2 1 Wasser dispergiert. Durch weiteres Verdünnen mit 20 1 Wasser und Rühren wurde eine klare Lösung erhalten.

Eine 0,2 molare Lösung von Cetyltrimethylammoniumhydroxid wurde tropfenweise zugesetzt, bis kein weiterer farbloser Niederschlag mehr gebildet wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen, in Äthanol gewaschen, 5 Minuten bei Raumtemperatur in 1,2 1 20 $iger Essigsäure gerührt und erneut in Form eines Niederschlags durch Zentrifugieren isoliert. Das Verfahren wurde unter Verwendung von 1,2 1 50 %iger Essigsäure von O⁰C wiederholt. Der

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erhaltene Niederschlag wurde in einer 0,5 η wässrigen Natriumhydroxidlösung gelöst und die so erhaltene Lösung wurde mit Hilfe der Methode nach Sevage entproteinisiert. Aus der entproteinisiei*- ten Lösung wurde reines Lentinan in bekannter Weise ausgefällt, gewaschen und' getrocknet.

Das so erhaltene Lentinan wurde mit Hilfe eines Homogenisators in destilliertem ¥asser dispergiert und die Dispersion wurde erhitzt, wobei eine gesättigte Lösung erhalten wurde, die in 10 Proben unterteilt wurde. Zu verschiedenen Proben wurden die nachstehend angegebenen Zusätze zugefügt und jede Probe wurde mit destilliertem Wasser auf 100 ml mit einem Gehalt an 0,1 g lentinan verdünnt, durch ein Milliporenfilter filtriert und auf 100 Glasfläschchen verteilt, die dann dicht verschlossen und 30 Minuten in Wasserdampf von 110 C sterilisiert wurden. Die Fläschchen, welche die Bildung eines Niederschlags zeigten, wurden sofort verworfen und die anderen Proben wurden 2 Monate bei 40⁰C, 25⁰C bzw. O⁰C aufbewahrt.

Probe Nr. 1 enthielt keine Zusätze. 80 Pläschchen wurden sofort nach dem Sterilisieren verworfen, weil sich ein Niederschlag gebildet hatte. Alle verbliebenen Fläschchen, die bei 40°C aufbewahrt worden waren, zeigten einen Niederschlag, etwa 2/3 der bei 25°C aufbewahrten Fläschchen waren ebenso mangelhaft und gleiches gilt für die Hälfte der bei O⁰C aufbewahrten Fläschchen.

Probe Nr. 2 enthielt zusätzlich zu Lentinan 5 g/dl Glucose. 70 Fläschchen zeigten einen Niederschlag nach dem Sterilisieren und etwa die Hälfte der anfänglich klaren Lösungen bildeten Niederschläge nach der Aufbewahrung bei jeder der drei gewählten Temperaturen.

Probe Nr. 3 enthielt 0,9 g/dl NaCl als einzigen Zusatz, wodurch eine Ausfällung in allen Fläschchen nach der Sterilisation verursacht wurde.

Die Proben Nr. 4-, 5 und 6 enthielten 1 g/dl Dextran 70, 1 g/dl Hydroxyäthylstärke (Molekulargewicht 200 000) bzw. 1 g/dl Natriumsalz der Carboxymethylcellulose als entsprechende primäre löslich-

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machende Mittel. Etwa 10 Fläschchen der Probe Nr. 5 und 20 Eläschchen jeder der Proben Nr. 4 und 6 mußten nach der Sterilisation verworfen werden. In den anderen Fläschchen dieser Gruppe wurde durch die lagerung bei 40°C, 25°C oder O⁰C kein Niederschlag gebildet.

Probe Nr. 7 enthielt zusätzlich zu Lentinan 1 g/dl Dextran 70 und 0,9 g/dl NaCl. 10 Fläschchen mußten nach dem Sterilisieren verworfen werden und 10 bis 20 % der Fläschchen, welche die erste Bewertung passierten, zeigten Niederschläge nach der Aufbewahrung bei den drei angegebenen Temperaturen.

Die Proben Nr. 8 bis 10 unterschieden sich von den Proben Nr. 4 bis 6 durch den Zusatz von 5 g/dl Glucose als sekundäres löslich machendes Mittel. Es zeigte sich, daß kein Fläschchen nach der Sterilisation einen Niederschlag enthielt und es bildete sich kein Niederschlag während zwei Monate langer lagerung bei 40⁰C, 25°C bzw. O⁰C.

Die Antitumorwirkung von frisch sterilisierten Proben von Lentinan und von Proben, die zwei Monate bei 40 C aufbewahrt worden waren, wurden unter Verwendung von Gruppen von im allgemeinen zehn ICR-JCI-Mäusen geprüft. Die Mäuse erhielten subkutane Injektionen von 3x10 Zellen von Sarcoma 180 in 0,05 ml Ascites-Plüssigkeit in die rechte Leistengegend. 24 Stunden nach der Injektion der Tumorzellen und danach täglich während insgesamt zehn Tagen wurden den Mäusen intraperitoneale Injektionen von Lentinanlösungen entsprechend 1 mg Lentinan pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. Nach 5 Wochen wurden die Tumoren herausgeschält und ausgewogen und die durchschnittliche Inhibierungswirkung wurde in Prozent berechnet im Vergleich mit dem Gewicht von Tumoren, die aus einer Gruppe von unbehandelten Kontrolltieren erhalten wurden. Die Anzahl von vollständigen Regressionen der Tumoren wurde eben-.falls festgehalten.

Die Proben Nr. 3 und Nr. 1 konnten nach der Lagerung nicht mehr geprüft werden, weil keine klaren Lösungen mehr vorlagen. Die Ergebnisse der anderen Proben sind in Tabelle 1 gezeigt.

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Tabelle

Probe Nr.	frisch sterilisiert	Regression	2 Monate aufbewahrt	Regression
	Inhibierung	6/10	Inhibierung	• -
1	85,3	7/9	—	5/8
2	89,4 '	7/10	87,9	6/10
4	92,5	7/10	88,5	6/10
5	92,5	7/10	90,1	6/10
6	91,7	8/10	82,3	4/10
7	93,0	8/10	81,1	5/10
8	94,1	8/10	92,9	7/10
9	93,4	8/10	92,9	7/10
10	92,8	83,1

Entsprechende Ergebnisse wurden erhalten, wenn Polyäthylenglycol anstelle von Dextran, Hydroxyäthylstärke oder Carboxymethylcellulose verwendet wurde. Glucose' konnte, ohne daß ein Unterschied in der stabilisierenden Wirkung beobachtet wurde, durch andere Kexosen, Pentosen und Zuckeralkohole mit 5 oder d Kohlenstoffatomen ersetzt werden, wie Xylose, Xylit oder Sorbit. Die Menge der Carboxymethylcellulose konnte auf etwa 0,5 g/dl vermindert werden, ohne daß die Stabilität der Dentinanlösung verschlechtert wurde, während eine so geringe Menge wie 0,1 g/dl der anderen primären löslich machenden Mittel geeignet war. Die Menge des sekundären oder zweiten löslich machenden Mittels wurde so gewählt, daß eine etwa isotonische lösung gebildet wurde; ungefähr gleich stabile Lösungen wurden jedoch innerhalb eines Bereiches von 1 bis 10 g/dl erzielt.

Auch die Stabilität der lösungen von anderen Glucanen und Glucanderivaten wird durch die erfindungsgemäß verwendeten lösliche machenden Mittel in gleicher V/eise verbessert, wie die von Lentinan, wie durch die nachstehenden Beispiele verdeutlicht wirdi

Beispiel 2

Pachyman wurde aus Poria cocos Wolf mit Hilfe einer wässrig-alkalischen Flüssigkeit extrahiert, oxydiert, hydriert und hydroly-

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siert, wobei die von Saishin Igaku Zasshi (Recent Medicine, Japan) 25 (1970), S. 1043 beschriebene Verfahrensweise angewendet wurde, um Pachymaran zu isolieren.

Aus 0,1 g/dl Pachymaran und 1 g/dl Dextran wurde wie in Beispiel 1 Lösung Nr. 11 hergestellt. Lösung Nr. 12 enthielt die gleichen Bestandteile, jedoch zusätzlich noch 5 g/dl Glucose. Diese Lösungen wurden zusammen mit den Nr. 13 bis 36 in der später beschriebenen Weise geprüft.

Beispiel 3

Ein Kulturmedium, das 50 g Glucose, 1 g Ammoniumsulfat und 3 g Hefeextrakt pro Liter destilliertes Wasser enthielt, wurde auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und 50 ml-Anteile des Mediums wurden in 500 ml-Schüttelkolben 15 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Die Anteile wurden mit Impfkulturen von Coriolus hirsutus FERM P-1021, Deadoleopsis PERM P-1023, Phellinus nobustus NRRL 3993, Pomes megregorii PERM P-IO3O, Phlebia strigozo-zonata FSRM P-1027, Polyporus mollis PERM P-1032 und Inonotus cuticoloris NRRL 3991 inokuliert und unter Schütteln während 120 Stunden bei 25 C gehalten. Die durch Züchten jedes der Mikroorganismen erhaltenen verschiedenen Kulturbrühen wurden kombiniert und zentrifugiert, um das Mycel zu entfernen. Dabei wurden 800 ml einer überstehenden Flüssigkeit erhalten, die mit Äthanol bis zu einer Äthanolkonzentration von 40 % verdünnt wurde, so daß ein Niederschlag gebildet wurde, der durch Zentrifugieren gewonnen wurde. Die Substanz wurde 3 mal durch Auflösen in Wasser und Ausfällen mit Äthanol gereinigt. Das so erhaltene rohe Glucan wurde in 200 ml 0,5 η Natriumhydroxidlösung gelöst, mit Äthanol ausgefällt, abzentrifugiert, zweimal mit 80 %igem Äthanol und dann zweimal mit 100 %igem Äthanol gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum wurden aus den sieben genannten Mikroorganismen kristalline Glucane in Mengen von 1,2, 0,7, 0,35, 0,51, 0,15, 0,34 bzw. 0,52 g erhalten.'

Die Lösungen Nr. 13 und 14 wurden aus 0,1 g/dl des Glucans von C. hirsutus mit 1 g/dl Dextran ohne weiteren Zusatz bzw. mit 5 g/dl Glucose wie in Beispiel 2 hergestellt. Die entsprechenden Lösungen Nr. 15 und 16 wurden aus dem Glucan von Deadoleopsis ,

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die lösungen Nr. 17 und 18 aus dem Glucan von P. nobustus, die Lösungen Hr. 19 und 20 aus dem Glucan von F. megregorii, die Lösungen Nr. 21 und 22 aus dem Glucan von P. strigozo-zonata, die Lösungen Fr. 23 und 24 aus dem Glucan von P. mollis und die Lösungen Nr. 25 und 26 aus dem Glucan von I. cuticoloris in gleicher Weise wie die Lösungen Nr. 13 und 14 hergestellt.

Beispiel 4

leuchtkörper von Pholiota nameko wurden mit Hilfe einer wässrig alkalischen Lösung extrahiert und ein Polysaceharid, dessen Hauptkette aus Glucoseeinheiten "bestand, die durch ß-(l-£3)-Bindungen verknüpft waren, wurde durch fraktionierte Fällung mit Äthanol im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 erhalten. Die Lösungen Nr. 27 und 28 wurden durch Lösen des gereinigten Produkts und Dextran in gleicher Weise wie in Beispiel 2 in V/asser hergestellt, wobei die Lösung Nr. 28 zusätzlich Glucose enthielt.

Beispiel 5

60 g ß-Pachyman wurden in einem 3 1-Kolben in 2 1 einer wässrigen 1,2 ^igen NaOH-Lösung gelöst. Die Lösung wurde unter einer Stickstoff-Schutzatmosphäre bei 40⁰C gerührt, während 75 ml (1,5 Mol) Äthylenoxid zugesetzt wurden. Nach 24stündigem Rühren wurde das Gemisch gelatinös. Es wurde mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure bis auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert und der dabei gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert, durch Einrühren in 5 1 70 ^iges Methanol gewaschen und wieder durch Zentrifugieren gewonnen. Der Waschvorgang wurde mit 80 tigern Methanol, 90 ^igem Methanol und schließlich mit absolutem Methanol wiederholt.Das gewaschene Produkt wurde abfiltriert, durch Suspendieren in 2 1 Aceton gewaschen, erneut abfiltriert und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.

Das so erhaltene Glucanderivat war ein weißes Pulver und hatte ein Gewicht von 59,4 g. Es zeigte einen Substitutionsgrad von 0,43. Dieses Produkt wurde zur Herstellung der Lösungen Nr. 29 und 30 in gleicher Weise wie in den vorhergehenden Beispielen verwendet.

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Als die frisch sterilisierten Lösungen 5 Mäusen in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise verabreicht wurden, ergab sich eine vollständige Remission der Tumoren in allen 5 Versuchstieren.

Beispiel 6

3 g Pachymaran, das wie in Beispiel 2 hergestellt worden war, wurden bei Raumtemperatur unter kräftigem Rühren in 80 ml Isopropanol gelöst. Zu der Lösung wurden 8 ml 30 $ige wässrige Natriumhydroxidlösung und danach 3 g feste Monochloressigsäure zugesetzt und die Lösung wurde 3 Stunden auf einem Wasserbad bei 4-0 bis 45⁰C gerührt und danach während des Abkühlens auf Raumtemperatur weiter gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde auf einem Glasfilter abfiltriert, zu 100 ml 70 tigern Methanol, das 5 ml Eisessig enthielt, zugefügt und 10 Minuten gerührt. Er wurde dann gewonnen, mit 3 Anteilen von je 100 ml absolutem Methanol gewaschen und schließlich mit Äther gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum wurden 2,2 g farbloses, pulverförmiges Carboxymethylß-( 1-^3)-glucan erhalten.

1 g Carboxymethyl-ß-(1-^3)-glucan wurde in 10 ml 1 η NaOH-Lösung gelöst und zu der Lösung wurden 50 ml Methanol gegeben. Der dabei gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, nacheinander mit 70 %igem Methanol, 90 $igem Methanol, absolutem Methanol und Aceton gewaschen und danach getrocknet. Dabei wurde 0,8 g des Natriumsalzes von Carboxymethyl-ß-(l-»3)-glucan erhalten, das zur Herstellung der Lösungen Nr. 31 und 32 verwendet wurde.

Beispiel 7

Coriolus hirsutus PERM P-1021 wurde in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise gezüchtet und das Mycel wurde durch Zentrifugieren gewonnen, gewaschen und getrocknet. 10 g des trockenen Mycels wurden in 200 ml 0,2 η Natriumbydroxidlösüng suspendiert und die Suspension wurde 2 Tage bei Raumtemperatur kräftig gerührt und danach zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und danach wurden' 600 ml Äthanol zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und nacheinander mit 70 tigern, 80 tigern

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■und 90 tigern Methanol, absolutem Äthanol, Aceton und Äther gewaschen und schließlich im Vakuum getrocknet. Der so erhaltene Polysaccharid-Protein-Komplex wurde in einer Menge von 810 mg erhalten und wurde in der vorstehend angegebenen Weise zur Herstellung der lösungen Nr. 33 und 34 verwendet.

Beispiel 8

Coriolus versicolor FEIM P-1022 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 3 gezüchtet und das Mycel wurde wie in Beispiel 7 aufgearbeitet, um einen Glucan-Protein-Komplex zu bilden, aus dem die Lösungen Nr. 35 und 36 in gleicher Weise wie in den vorhergehenden Beispielen unter Zugabe von Dextran und von Dextran und Glucose erhalten wurden.

Beispiel 9

Wenn die lösungen Nr. 11 bis 36 sterilisiert wurden, ergaben sich keine Abscheidungen in den geradezahligen Lösungen, die auch Glucose enthielten, und es bildeten sich keine Abscheidungen bei der Lagerung während 2 Monaten bei 40 C. Etwa 10 % der Fläschchen, welche die Lösungen Nr. 11, 15, 19, 23, 27, 29 und 31 enthielten, wurden aufgrund der Bildung eines Niederschlags nach der Sterilisation verworfen und etwa 20 % der Fläschchen mit den Lösungen Nr. 13, 17, 21, 25, 33 und 35 zeigten den gleichen Nachteil. Die Fläschehen, welche die erste Bewertung passierten, wurden zwei Monate bei 4O⁰C gelagert und erneut geprüft. In den Fläschchen, welche die Lösung Nr. 11 enthielten, konnte keine Abscheidung festgestellt werden. Etwa 10 # der aufbewahrten Fläschchen mit den Lösungen Nr. 13, 17, 19, 21, 23, 25 und 31 enthielten Feststoffe und Abscheidungen fanden sich in etwa 20 # der .aufbewahrten Fläschchen mit den Lösungen Nr. 15, 27, 29, 33 und 35.

Die klaren, aufbewahrten Lösungen wurden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise auf ihre Fähigkeit untersucht, das Wachstum von Sarcoma 180 bei Schweizer Albinomäusen zu inhibieren. Die Dosierung des Wirkstoffes betrug bei jeder Injektion 0,25, 0,5 bzw 1,0 mg/kg Körpergewicht, wie aus der nachstehenden Tabelle 2 hervorgeht. In dieser Tabelle Bind außerdem die beobachtete durchschnittliche

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Inhibierung und die Fälle der völligen Tumorremission sowie die Anzahl der Mäuse in der getesteten Gruppe aufgeführt.

Tabelle 2

Lösung Nr.	Dosierung, mg/kg	Inhibierung, %	Remission
11	0,5	93	8/10
12	0,5	94	7/10
13	0,5	92	6/10
14	0,5	93	6/10
15	0,5	95	7/10
16	0,5	94	8/10
17	0,5	100	5/5
18	0,5	99	4/5
19	1,0	92	4/5
20	1,0	91	4/5
21	1,0	94	4/5
22	1,0	92	5/5
23	1,0	93	4/5
24	. ι,ο	93	5/5
25	0,25	92	8/10
26	0,25	92	9/10
27	1,0	90	6/10
28	1,0	92	7/10
29	0,5	98	8/10
30	0,5	96	9/10
31	0,5	92	7/10
32	0,5	93	8/10
33	1,0	92	7/10
34	1,0	91	7/10
35	1,0	90.	8/10
36	ι,ο	90	8/10

Ferner wurde die Toxizität der in Beispielen 1 bis 8 hergestellten Glucane und Glucanderivate gegenüber Mäusen geprüft, wobei die Verbindungen den Mäusen durch intraperitoneale Injektion verabreicht' wurden. Es zeigte sich, daß die DL,-₀-Werte von allen geprüften Verbindungen größer als 4000 mg/kg waren.

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Die erfindungsgemäßen löslich machenden Mittel haben sich in gleicher Yieise v/irksam zur Stabilisation von relativ konzentrierten Lösungen der Antitumormittel erwiesen, die durch Extraktion der Fruchtkörper oder des Sclerotium von anderen Basidiomyceten, aus dem Mycel solcher Basidiomyceten oder Hefen gewonnen werden, welche in den vorstehenden Beispielen nicht speziell angegeben sind, und von Antitumormitteln, die aus den Kulturbrühen anderer Fungi imperfectierhalten werden. Repräsentative Beispiele für diese weiteren Verbindungen, die wirksam zum Inhibieren von Sarcoma 180 bei Mäusen sind und deren Lösungen erfindungsgemäß stabilisiert werden können, sind Schizophyllan, das aus der Kulturbrühe von Schizophyllum commune gewonnen wird, und tumorhemmende Glucane, die aus den Fruchtkörpern von Flammulina velutipes, Pleurotus ostreatus und Tricholoma matsutake extrahiert werden.

Das Molekulargewicht der als Antitumormittel wirksamen Verbindungen ist für die Zwecke der Erfindung irrelevant, abgesehen von den für die Antitumorwirkung erforderlichen Grenzwerten und von den geringen Löslichkeitseigenschaften der Verbindungen.

Die intraperitoneale Injektion ist zwar die praktisch geeignetste Methode zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Lösungen, es können jedoch auch andere Verabreichungswege gewählt werden. Weitere Tests zeigen an, daß diese intraperitonealen Injektionslösungen auch von anderen Warmblütlern als Laboratoriumstieren gut vertragen werden, wenn sie intravenös injiziert v/erden.

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Claims (7)

1. Patent ansprüche

   (T) Stabilisierte lösung, die im wesentlichen aus

   a) V/asser,

   b) einem Polysaceharid mit einer G-lucan-Hauptkette,

   c) einem primären,· wasserlöslichen, löslich machenden Mittel,· das ein Dextran, Hydroxyäthylstärke, Carboxymethylcellulose oder Polyäthylenglycol sein kann, in einer zur Erhöhung der Löslichkeit der Verbindung b)ausreichenden Menge und

   d) einem sekundären, wasserlöslichen, löslich machenden Mittel, das eine Pentose, Hexose oder ein Zuckeralkohol mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen sein kann, in einer Menge von 0 bis 10 g/dl.
2. 2. lösung nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet , daß sie als Verbindung b) ein als Antitumormittel wirksames Polysaceharid mit einer Glucan-Hauptkette enthält.
3. 3. Lösung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie das primäre löslich machende Mittel in einer Menge von 0,1 bis 1,0 g/dl enthält.
4. 4. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß sie das sekundäre löslich machende Mittel in einer Menge von mindestens 1 g/dl enthält.
5. 5. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß sie als sekundäres löslich machendes_i Mittel Glucose, Xylit oder Sorbit enthält.

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6. 6. lösung nach Anspruch 1, 2 oder 5, dadurch g e k en η zeichnet , daß sie als primäres löslich machendes Mittel Carboxymethylcellulose in einer Menge von 0,5 bis 1,0 g/dl enthält.
7. 7. lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß sie als Verbindung b) ein Glucan enthält.

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