DE2845765A1 - Einfaches glukan - Google Patents

Einfaches glukan

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DE2845765A1
DE2845765A1 DE19782845765 DE2845765A DE2845765A1 DE 2845765 A1 DE2845765 A1 DE 2845765A1 DE 19782845765 DE19782845765 DE 19782845765 DE 2845765 A DE2845765 A DE 2845765A DE 2845765 A1 DE2845765 A1 DE 2845765A1
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gel
million
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Kazuaki Hama
Hiroyuki Ohno
Yutaro Sasaki
Mamoru Sugiura
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Description

PATENTANWÄLTE
DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 · TELFX O5-212156 kpatd
TELEGRAMM KRAUSPATENT J
2005 WK/li
1 . MAMORU SUGIURÄ-, K ο η a n (Japan) 2. HITOSHI ITO :, T s u (Japan)
Einfaches Glukan
9817/0923
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein neues Polysaccharid mit Antitumoraktivitat. Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung dieses neuen Polysaccharids und eine Antitumor-Zubereitung, die das genannte Polysaccharid als Wirkstoff enthält.
Es sind schon mehrere antitumoraktive Substanzen aus Basidiomycetes beschrieben worden. So ist schon ein Verfahren
zur Herstellung einer Antitumorsubstanz durch Kultivierung
von Coriolus Versicolor von Basidiomycetes (JA-PA 63263/70), die Isolierung einer Antitumorsubstanz durch enzymatische
Behandlung von Coriolus Versicolor (JA-PA 93039/72) und ein Verfahren zur Herstellung einer Antitumorsubstanz aus dem
Kulturfiltrat von Coriolus Versicolor (JA-PA 77723/72) vorgeschlagen worden.
Es wurde eine neue Substanz mit einer Antitumoraktivitat in dem Heißwasserextrakt von kultivierten bzw. gezüchteten Mycelien von Coriolus Versicolor untersucht und dabei festgestellt, daß eine Polysaccharidfraktion eine hohe Antitumoraktivitat besitzt. Durch Reinigung dieser Fraktion wird ein proteinfreies, neues Glukan erhalten, das aus einer ß-1,3-glucosidischen Bindung als Hauptkette, welche eine verzweigte Kette einer ß-1,6-glucosidischen Bindung hat, besteht.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Polysaccharid mit
Antitumoraktivitat zur Verfügung zu stellen.
Durch die Erfindung soll weiterhin ein wasserlösliches,
nicht-antigenes und parenteral verabreichbares, neues Polysaccharid mit Antitumoraktivitat zur Verfügung gestellt werden.
Es ist schon ein Glycoprotein aus dem Wasserextrakt der Mycelien von Coriolus Versicolor vorgeschlagen worden (JA-PA
71467/68). Dieser Extrakt enthält viele Arten von komplexen
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■f-
Glycoproteinen und er kann nicht als einzige antitumoraktive Substanz identifiziert werden.
Es wurde nun gefunden, daß eine wirksame, antitumoraktive Substanz in gereinigter Form aus dem Heißwasserextrakt erhalten werden kann, wenn man eine Ausfällung mit Äthanol, eine Extraktion mit wässrigem Natriumacetat, eine Ausfällung mit Äthanol, eine Ionenaustauscherbehandlung und eine Fraktionierung mit Äthanol durchführt. Die dabei erhaltene Substanz wurde als neue Substanz identifiziert.
Der zur Herstellung des erfindungsgemäßen Glucans verwendete Mikroorganismus Coriolus Versicolor wurde beim Fermentation Research Institute of Japan unter der Nr. FERM-P 2743 sowie bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nr. DSM 1388 hinterlegt.
Das erfindungsgemäße Polysaccharid (nachstehend manchmal als CVG abgekürzt) ist ein einfaches Glukan, das aus wiederkehrenden, verzweigten Tetrasaccharideinheiten besteht. Diese Einheiten haben eine ß-1,3-glucosidische Bindung als Hauptkette und ein Glucoserest pro drei Glucosereste mit einer ß-1,3-Bindung ist mit jedem anderen in einer ß-1 ,6-glucosidischen Bindung verbunden. Das Polysaccharid hat ein mittleres Molekulargewicht von etwa 2 Millionen.
I. Physikalisch-chemische Eigenschaften:
1. Aussehen: weißes Pulver.
2. Löslichkeit:
Unlöslich: Organische Lösungsmittel, wie Alkohol, Aceton, Chloroform und Pyridin.
Löslich (bis zu einer Konzentration von etwa 0,5%): Kaltes Wasser und physiologische Kochsalzlösung .
Löslich: Heißwasser, alkalische Lösung, Ameisensäure oder Dimethylsulfoxid.
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3. Stabilität: Stabil bei einer 30-min. Dampfsterilisierung
bei 120 C, ohne daß eine Verminderung der Antitumoraktivität auftritt. Beim 24-stünd. Rühren in 0,5N Schwefelsäure von Raumtemperatur stabil, ohne Hydrolyse.
4. Elementaranalyse: H 5,67% C 38,30%.
5. Infrarotspektrum (KBr-Tablette): Gemäß Fig. 1. Eine Ab
sorptionsbande der Glucosidbindung bei 894 cm"1 wird bestätigt.
6. Spezifische Drehung: ίβζΤ = +22° (c=0,2, H2O).
7. Molekulargewicht: Gelfiltrationsmethode
> 1 500 000 (Gelfiltration mit Sephadex G-200 (Warenzeichen der Pharmacia Co., Schweden), Bio-Gel p-300 und Bio-Gel A-1,5m (Warenzeichen, Biorad Laboratory Inc., USA). Die gleichen Elutionsmuster wurden bei der obigen Gelfiltration bei einem Vergleich mit der Standardmarkierungssubstanz "Blue Dextran 2000" (Molekulargewicht etwa 2 Millionen) beobachtet. Daraus wird geschätzt, daß das Molekulargewicht dieser Substanz größer als 1,5 Millionen ist).
etwa 2 000 000 (mittleres Molekulargewicht)
Gelfiltration mit Bio-Gel A-5m (Molekularsieb mit einem Molekulargewicht von unterhalb M.W. 5 Millionen). Die Position der Elution bei der Gelfiltration mit entionisiertem Wasser war eine Fraktion niedriger als diejenige von Blue Dextran).
8. Chemische Struktur:
(1) Zuckerzusammensetzung:
D-Glucose war die einzige feststellbare Zuckerzusammensetzung im Dünnschichtchromatogramm und bei der Gaschrörmatographie nach einer 5-stünd. Hydrolyse mit 2 NH2SO4 bei 1000C. Der Glucosegehalt wurde durch die Phenolschwefelsäuremethode als 98,4 - 99,8% bestimmt.
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Die Analyse dieser Substanz in der Ultrazentrifuge ergab einen einzigen Peak.
(2) Bindungsform der Zuckerzusammensetzung:
Die Substanz wurde üblichen analytischen Methoden der Periodatoxidation, des Smith-Abbaus, der Methylierung, der Acetolyse, des milden Smith-Abbaus und der Methylierungsanalyse unterworfen. Die chemische Struktur dieser Substanz wurde dahingehend aufgeklärt, daß diese Substanz aus den folgenden wiederkehrenden Einheiten besteht:
Das Protonenmagnetresonanz(PMR)spektrum (100 MHz) von vollständig methy1iertem CVG in CDCl3 ist in Fig.2 gezeigt. Das H-1-Signal bei 4,75 ppm bestätigt das Vorhandensein einer ß-Glucosebindung.
II. Biologische Eigenschaften:
1. Toxizität:
(1) Akute Toxizität:
Bei der p.orVerabreichung der maximalen tolerierbaren Menge von CVG an Mäuse und Ratten wurde keine Mortalität festgestellt.
(2) Subakute Toxizität:
Bei der p.o.-Verabreichung von 100 mg/kg an Mäuse wurden keine Veränderung des allgemeinen Aussehens, des Körpergewichts, der Nahrungsmittel-und Wasseraufnahme und der allgemeinen biochemischen Diagnose-
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werte festgestellt. In vielen Fällen wurde eine Zunahme des Gewichts der Thymusdrüse festgestellt.Bei der histopathologischen Untersuchung wurden keine spezifischen Veränderungen festgestellt. Cytotoxizität (in vitro):
Bei einer Konzentration von 1 mg/ml wurde auf einer Raji-Zellenkultur keine Cytotoxizität festgestellt. Antitumoreffekt:
Sarcoma-180 Tumorzellen wurden subkutan in die leichten Achseln von JCL-ICR Mäusen mit einem Alter von 5 Wochen implantiert. Es wurden 3 Gruppen mit jeweils 8 Mäusen in einer Gruppe verwendet. 24 Std. nach der Tumorimplantation wurde das CVG 2 Gruppen intraperetoneal injiziert. Die Kontrollgruppe erhielt Kochsalzlösung. In der Tabelle sind die Ergebnisse 3 Wochen nach der Implantation zusammengestellt .
verabreich
te Menge
(mg/kg)		 Verabrei
chungsweg		 mittleres
Tumorgew.
(g+S.F.)		 Hemmverhält
nis (%)
Kontrolle
0,1
1		 i.p.
i.p.
i.p.		 2,152^0,491
1,400^0,718
0,406^0,211		 34,9
81,1
4. Antitumorspektrum:
Die Wachstumshemmeffekte mit Einschluß des Verschwindens des Tumors wurden beobachtet, als CVG Mäusen verabreicht wurde,die S-180-,Ehrlich Carcinom- und andere Festtumore hatten. Diese Substanz war auch gegenüber durch Methylcholanthren induzierten Lungentumor und spontanen Brusttumor von Mäusen wirksam. Diese Tatsachen zeigen, daß CVG nicht nur gegenüber transplantierbaren Tumoren, sondern auch gegenüber spontanen Tumoren wirksam ist.
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5. Kombinationseffekt mit anderen Antitumorsubstanzen: Schweizer Mäusen, jeweils 10 Mäuse in einer Gruppe, di'e mit Sarcoma-180 Festtumor implantiert worden waren, erhielten peritoneal zweimal wöchentlich Mitomycin C (MMC, 1 mg/kg), Endoxan (Ex, 20 mg/kg) und 5-Fluorouracil (5-FU, 30 mg/kg), entweder allein oder in Kombination mit CVG (1 mg/kg). In Fig. 3 ist das Tumorhemmverhältnis (%) 28 Tage nach der Implantation dargestellt.
6. Kombinationseffekt mit mit Röntgenstrahlen bestrahlten Ehrlich ascites Carcinom:
Eine erhebliche Tumorwachstumshemmwirkung wurde beobachtet, als Mäuse, die mit durch Röntgenstrahlung inaktivierten Zellen von Ehrlich ascites Carcinom immunisiert worden waren, CVG (20 mg/kg/Tag) erhielten, obgleich CVG allein gegen Ehrlich ascites Tumor nicht aktiv ist. In Fig. 4 ist der Effekt der Kombination von inaktivierten Ehrlich ascites Tumorzellen und CVG auf Mäuse (Lebensverlängerungseffekt) dargestellt. Die einzelnen Kurven in Fig. 4 haben folgende Bedeutung:
A: Kontrolle, Ehrlich ascites Carcinom. B: Nur mit Ehrlich ascites Carcinom immunisiert. C: Mit Ehrlich ascites Carcinom + CVG immunisiert. D: Nur mit CVG behandelt.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt.
Mycelien von Coriolus Versicolor werden in einem herkömmlichen Kulturmedium für Basidiomycetes kultiviert. Die Kultivierung kann als Tauchbelüftungskultur oder Festkultur durchgeführt werden. Nach der Kultivierung werden die Mycelien abfiltriert und Std. lang mit heißem Wasser extrahiert, wodurch ein wässriger, löslicher Extrakt erhalten wird. Der Extrakt wird mit 4 Volumina Äthanol versetzt, um rohes Polyaaccharid herzustellen. Dieses Rohmaterial wird mit 0,25 M wässriger Natriumacetatlösung extrahiert und unter Kühlen mit weiterem 1/3 Volumen von Äthanol versetzt, wodurch ein durch Äthanol bewirkter Niederschlag er-
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halten wird. Nach Auflösen des Niederschlags in entionisiertem Wasser wird die Lösung mit einem Ionenaustauscher Duolite A-101 D, Duolite C-20 (Warenzeichen, Chemical Process Inc., USA) bzw.DEAE-Cellulose behandelt. Sodann wird die ionenaustauscherbehandelte Lösung einer 5- bis 20% Äthanolfraktionierung unterworfen, wodurch das gereinigte Produkt CVG erhalten wird.
Das Reinigungsverfahren ist in dem folgenden Schema dargestellt.
Mycelien
1000C, 5 Std., Heißwasserextraktion
Extrakt
Äthanol, 4 Volumina, Zentrifuge
Oberstand
Niederschlag(Ndschlg.,rohes Polysaccharid)
Auflösung in 0,25 M wässriger Natriumacetatlösung Zentrifuge
Überstand Ndschlg.
Zugabe von 1/3 Volumen Äthanol Zentrifuge
Oberstand
Ndschlg.
Duolite A-101 D und Duolite C-20
durchgegangene Lösung
I DEAE-Cellulose
durchgegangene Lösung
i Fraktionierung mit 5-20% Konzentration von Äthanol Zentrifuge Ndschlg. (gereinigtes CVG)
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ΛΑ
Wie vorstehend ausgeführt, ist die als CVG bezeichnete Polysaccharidsubstanz gemäß der Erfindung als Antitumormittel wirksam. Die weitere Eignung dieser Substanz wird als Immunosimulierungseffekt für die Chemotherapie, die Radiotherapie und für die Immunoakt ivitats-Unterdrückung nach Operationen oder Virus- oder Bakterieninfektionen geschätzt.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1
In ein Impfkulturmedium (100 ml in einem Kultivierungskolben), enthaltend 2% Saccharose, 2% Sojasauce, 0,3% Zwiebelextrakt, 0,1% Magnesiumsulfat und 0,5% Kaliumhydrogenphosphat, wurden Mycelien von Coriolus Versicolor Iwade FERM-P Nr. 2743 inokuliert. Es wurde 7 Tage lang bei 30 C eine Schüttelkultivierung durchgeführt. Die Impfkultur wurde in das gleiche Medium (15 1) in einem Becherfermentator überführt und das zweite Impfmaterial wurde 2 Tage lang bei 30 C unter Rühren mit 200 Upm und unter Belüftung 1 v.v.m. kultiviert. Nach 2-tägiger Kultivierung wurde das zweite Impfmaterial in ein Medium (250 1) überführt, das 5% Saccharose, 5% Sojasauce, 0,67% Zwiebelextrakt, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,1% Kaliumhydrogenphosphat und 0,1% Silikon enthielt und das sich in einem Fermentationstank befand. Es wurde unter Rühren mit 200 Upm und unter Belüften mit 0,5 v.v.m. 48 Std. lang bei 30 C kultiviert.
Der pH-Wert des Kulturmediums wurde allmählich von dem AnfangspH-Wert von etwa 5,5 auf ungefähr einen pH-Wert von 3,8 je nach dem Pilzwachstum erniedrigt. Danach wurde der pH-Wert höher.Die Viskosität des Mediums wurde entsprechend dem Wachstum der Mycelien erhöht. Die Kultivierung sollte abgebrochen werden,wenn die Kultur den Wert der spezifischen Viskosität von 3,0, den pH-Wert von 4,0 erreicht und wenn die Mycelienmenge 1000 mg/100 ml beträgt.
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Die Mycelien wurden durch Zentrifugieren gesammelt und mit kochendem Wasser 5 Std. lang unter Rühren extrahiert. Danach wurde der unlösliche Teil durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt, wodurch ein Extrakt eines wasserlöslichen Stoffes erhalten wurde. Der Extrakt wurde bei vermindertem Druck konzentriert und sodann mit 4 Volumina Äthanol allmählich unter Rühren versetzt und über Nacht bei 5°C stehengelassen. Der so gebildete Niederschlag wurde vollständig mit Äthanol und Äther gewaschen und sodann unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch ein rohes PoIysaccharid (127 g) erhalten wurde.
Das rohe Polysaccharid (100 g) wurde in einer 0,25 M wässrigen Natriumacetatlösung (10 1) suspendiert und durch 3-stündiges Rühren bei Umgebungstemperatur aufgelöst. Nach Entfernung der unlöslichen Stoffe in der Zentrifuge (7500 χ g) wurden 1/3 Volumina Äthanol zu dem überstand unter Kühlen gegeben und das ganze wurde über Nacht stehengelassen. Der Niederschlag (14,9 g) wurde in der Zentrifuge gesammelt.
Der Niederschlag (14,9 g) wurde in entionisiertem Wasser (2 1) aufgelöst und mit entionisiertem Wasser durch eine Säule aus Duolite A-101 D (OH-Typ) und anschließend durch eine Säule aus Duolite C-10 geleitet. Hierdurch wurde eine proteinfreie Lösung erhalten. Zu dieser Lösung wurde DEAE-Cellulose (OH-Typ), die mit 0,5 N NaOH behandelt und mit entionisiertem Wasser neutral gewaschen worden war, gegeben und es wurde über Nacht bei 5°C gerührt. Die Lösung wurde durch ein Glasfilter filtriert.
Nach Einstellung der filtrierten Lösung auf eine Konzentration von etwa 0,2% und der Zugabe von Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,25 M wurde kaltes Äthanol bis zu 5% (Vol/Vol) unter Kühlen in Eiswasser zugesetzt. Sodann wurde 3 Std. lang stehengelassen. Das Gemisch wurde hierauf bei 0 C zentrifugiert (15000 χ g, 20 Min.), um den Überstand und den Niederschlag zu trennen. Zu der überstehenden Lösung wurde kaltes Äthanol bis 20%
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(Vol/Vol) gegeben. Nach 3-stündigem Stehenlassen in eiskaltem Wasser wurde die Lösung bei 0 C zentrifugiert, wodurch ein Niederschlag erhalten wurde.
Der Niederschlag wurde gegen entionisiertes Wasser diafysiert und lyophilisiert, wodurch das Produkt (3,52 g) erhalten wurde.
In der Tabelle sind Einzelheiten des Reinigungsverfahrens zusammengestellt.
Ausbeute (g) Zucker (g) Protein (g)
Rohes Polysaccharid 100 60 14
Überstand der Natrium-
acetatelution		 77 57,5 8,1
Äthanolfraktionierung 14,3 12,6 1,2
Duolite A-101 D- und
C-20-Behandlung		 11,8 10,9 0,30
DEAE-CelIulose-Behand
lung		 7,4 7,29 0,056
Äthanolfraktionierung 3,52 3,49
Zur weiteren Erläuterung der Erfindung dienen die beigefügten Zeichnungen. Es zeigen:
Fig. 1 das Infrarotspektrum der erfindungsgemäßen Substanz, Fig. 2 das P.M.R.-Spektrum der methylierten Substanz,
Fig. 3 den Kombinationseffekt der erfindungsgemäßen Substanz mit anderen Antitumorsubstanzen,
Fig. 4 den Kombinationseffekt der erfindungsgemäßen Substanz mit mit Röntgenstrahlen bestrahlten Ehrlich ascites Tumorzellen.
Ende der Beschreibung-9Q9817/0923

Claims (4)

  1. KRAUS & WEISERT
    PATENTANWÄLTE
    DR. WALTER KRAUS DlPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKATE WElSERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 ■ D-8OOO MÜNCHEN 71 ■ TELEFON 089/797077-797078 · TELEX O5-212156 kpatd
    TELEGRAMM KRAUSPATENT
    2005 WK/li
    Patentansprüche
    Einfaches Glukan, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Einheiten mit folgender Struktur!
    besteht, und daß es ein mittleres Molekulargewicht von etwa 2 Millionen (gemessen durch Gelfiltration unter Verwendung von Bio-Gel A-5m) hat.
  2. 2. Polysaccharid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus wiederkehrenden, verzweigten Tetrasaccharideinheiten mit einer ß-1,3-glucosidischen Bindung als Hauptkette, bei der ein GIucoserest pro drei Glucosereste der ß-1,3-glucosidischen Bindung miteinander in einer ß-1,6-glucosidischen Bindung verbunden ist, besteht, und daß es ein mittleres Molekulargewicht von etwa 2 Millionen (gemessen durch Gelfiltration unter Verwendung von Bio-Gel A-5m) oder von mindestens mehr als 1,5 Millionen (gemessen durch Gelfiltration unter Verwendung von Bio-Gel A-1,5m) besteht.
  3. 3. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids, welches aus wiederkehrenden, verzweigten Tetrasaccharideinheiten, die eine ß-1,3-glucosidische Bindung als Hauptkette haben, bei der ein Glucoserest pro drei Glucosereste der ß-1,3-
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    ORIGINAL INSPECTED
    glucosidischen Bindung miteinander in ß-1,6-glucosidischer Bindung verbunden ist, besteht, und das ein mittleres Molekulargewicht von etwa 2 Millionen (gemessen durch Gelfiltration unter Verwendung von Bio-Gel A-5m) oder von mindestens mehr als 1,5 Millionen (gemessen durch Gelfiltration unter Verwendung von Bio-Gel A-1,5m) aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man kultivierte Mycelien von Coriolus Versicolor Iwade FERM-P Nr. 2743 einer Behandlung mit heißem Wasser, Ausfällung mit Äthanol, Elution mit wässrigem Natriumacetat und Ionenaustauscherbehandlung unterwirft.
  4. 4. Antitumorsubstanz-Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie das einfache Glukan gemäß Anspruch 1 als Wirkstoff enthält.
    909817/0923
DE19782845765 1977-10-24 1978-10-20 Einfaches glukan Withdrawn DE2845765A1 (de)

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