DE3241990C2 - Saures Polysaccharid und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Saures Polysaccharid und Verfahren zu seiner Herstellung

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Abstract

Es wird die physiologisch aktive Substanz CH-1 und ein Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben. Die physiologisch aktive Substanz CH-1 besteht mindestens aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff und hat die folgende Elementaranalyse: C: 38,49%, H: 6,07%, N: 1,39%. Die Substanz CH-1 kann durch Extraktion von Chlorella-Zellen der Gattung Chlorella hergestellt werden. Die Substanz besitzt eine interferoninduzierende und Antitumorwirkung.

Description

3) Schmelzpunkt:
4) spezifische Drehung:
5) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
6) I nfrarot-Absorptionsspektrum:
7) Löslichkeit:
positiv: negativ:
8) Farbreaktion:
9) Natur:
10) Farbe:
11) Protein:
12) Monosaccharidanalyse:
13) Zuckergehalt:
14) Ultrazentrifugiermuster gemäß F i g. 3,
impermeabel für eine Ceilophanmembrane und S=6.15 (gemessen in der Ultrazentrifuge),
ungefähr bei 2400C unter Verfärbung, danach bei höherer Temperatur Carbonisierung.
[λ]£ = -9,52 (c= 1.H2O).
Endabsorption in 0.125%iger wäßriger Lösung,
gemäß F ig. 1.
löslich in Wasser, unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Methanol.
Anthron, Molisch und Carbazol-H 2SO4
Folin-Lowry und Ninhydrin,
sauer. Elektrophorese auf Acetatmembrane getniiß Fig. 2.
weißes Pulver.
nicht festgestellt (bestimmt durch Folin-Lowry-Farbreaktion),
Rhamnose,Galactose. Arabinose,Glucose und Glucuronsäure (festgestellt durch Papierchromatographie und Gaschromatographie nach 2stündiger Hydrolyse unter Rückfluß in 7%iger HjSO4).
53% (berechnet als Glucose),
erhältlich durch Isolierung aus gezüchteten Zellen von Chlorella pyrenoidosa.
2. Verfahren zur Herstellung des Polysaccharides nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichne;, dall man Zellen von Chlorella pyrenoidosa mit heißem Wasser extrahiert, durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zu dem Extrakt fraktioniert ausfällt, die wäßrige Lösung des Niederschlags dialysiert und das so erhaltene Dialysat einer Adsorptionschromatographie und Gelfiltration zur Isolierung des sauren Polysaccharides unterwirft.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die fraktionierte Ausfällung mit Methanol unter Anwendung einer Methanolkonzentration von 40 bis 80% durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorbens für die Adsorpiionsehromatographie DEAE-Cellulose und/oder CM-Cellulose einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gelfiltrationsmedium für die Gelfiltration Sephadex® G -75 oder Sephadex® G-100 einsetzt.
b0
br>
Die Erfindung betrifft ein saures Polysaccharid, eine neue physiologisch aktive Substanz, die im folgenden als CH-I bezeichnet wird und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Es sind schon viele Polysaccharide mit einer interferoninduzierbaren Aktivität oder Antitumorakiivitiit bekannt. Solche Antitumormittel, wie PS-K (vgl. GANN 65, 557-558 [1974]), sind auch schon in der Praxis verwendet worden, ledoch ist bislang noch keine Substanz bekannt, die beide Eigenschaften einer Antitumoraktivität und einer klaren interferoninduzierbaren Aktivität besitzt.
Es wurde nun gefunden, daß eine aus Chlorella pyrenoidosa, die zur Gattung Chlorella gehört, extrahierte und isolierte Substanz beide Eigenschaften aufweist.
Die neue physiologisch aktive erfindungsgemäße Substanz ist ein saures Polysaccharid und sie hat eine interferoninduzierbare Aktivität und eine Antitumoraktivität.
Gegenstand der Ei findung ist ein saures Polysaccharid mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
1) mindestens bestehend aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff mit folgender F.lenientiwana
lysc:
C: 38.49%, H: 6,07%, N: 1.39%
2) Molekulargewicht: impermeabel für eine Ceilophanmembrane und S = b.l5.
gemessen in der Ultrazentrifuge bei einer Konzentration von 0,2%, in 0,2 M Phosphatpuffer pH 7.2. Roiomp: RA 60HC.51 200UD1T1.
3) Schmelzpunkt: ungefähr bei 2400C unter Verfärbung, danach bei höherer
Temperatur Carbonisierung,
4) spezifische Drehung: [λ]£ = -9,52 (c = 1,H2O),
5) UV-Spektrum: Enüabsorption in 0,125% wäßriger Lösung, b) IR-Spektrum: ! gemäß Fig. 1, KBr-Tablette, Absorptionsbanden bei
3420, 2930, 1640. 1380. 1125. 10b5. 1040. 990. 915. 835 und 800 cm-',
7) Löslichkeit: löslich in Wasser,
unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol,
8) Farbreaktion: positiv: Anthron, Molisch und Carbazol-H2SO4,
negativ: Folin-Lowry und Ninhydrin,
9) Natur: sauer, Elektrophorese auf Acetatmembrane (elektropho-
retisiert 2U 0,8 cm für ( + ) bei der Bedingung von 0,1 M η Pyridin-Essigsäure, pH 5,0, 200 V (4 raA, 20 min), gemäß Fig. 2,
10) Farbe: weißes Pulver,
11) Protein: nicht festgestellt (bestimmt durch Folin- Lovvry- Farbreak
tion), 2(1
12) Monosaccharidanalyse· Rhamnose, Arabinose, Glucose, Galactose undGlucuron-
säure (festgestellt durch Papierchromatographie und Gaschromatographie nach Hydrolyse in 7%iger HjSO4. Rückflußbehandlung über 2 h),
13) Zuckergehalt: 53% (berechnet als Glucose).
14) Ultrazentrifugiermuster gemäß F i g. 3,
erhältlich durch Isolierung aus gezüchteten Zellen von Chlorella pyrenoidosa. CH-I hat die folgenden biologischen Eigenschaften:
1. lnterferoninduzierende Aktivität
1) Analysenmethode A (in vitro)
Ein Kaninchen (Japanisches Weißkaninchen) wird durch Arteriotoinie verbluten gelassen. Die herausgeichnit- i > tene Milz wird trypsinisiert, um suspendierte Zellen herzustellen (2 bis 5 χ 107 Zellen). Die Milzzellen werden mit CH-I bei 25°C 24 h lang inkubiert, zentrifugiert und das überstehende Produkt wird gesammelt. Der Interferontiter in dem Medium wird bestimmt.
2) Analysenmethode B (in vivo) 4<>
Zu aliquoten Zeiten nach intravenöser Injektion an ddy-Mäuse mit einem Alter von 4 Wochen von 100 mg/kg CH-1 wurden die Mäuse verbluten gelassen, und der lnterferontiter in dem Serum wurde bestimmt.
3) Analysenmethode des lnterferon(IF)titers -r>
Der IF-Titer wird durch die Plättchen-50%-Verminderungsmethode unter Verwendung einer RK13-Kaninchennierenzellinienkultur und von Vescular-Stomatitisvirus als Aggressionsvirus untersucht.
4) Ergebnisse
(1) beider in-vitro-Methode:
Probenkonzentration ^g/ml):
10 1 0,1 0.01
IF-Titer (μ):
49 34 20
(2) beider in-vivo-Methode:
Zeitpunkt des Verblutens:
2 h später 5 h später
IF-Titer (μ): t>< >
240 15
Aus dem obigen ergibt sich, daß die erfindungsgemäüe Verbindung eine interferoninduzierende Aktivität hat.
II. Hemmaktivität auf die Virusinfektion
1) Analysenmethode
CH-I wird intravenös in die Schwanzvene von ddy-Mäusen verabreicht. Nach 2 bis 12 h erfolgt eine Provokation durch intravenöse Verabreichung des Vaccinvirus in die Schwanzvene. Die Anzahl der Pusteln, die auf der Haut des Schwanzes auftreten, wird am 8. Tag nach der Provokation gezählt.
2) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in folgender Aufstellung zusammengestellt.
Hemmaktivität auf die Virusinfektion:
21)
Dosis Behandlungsschema Durchschnittliche
(mg/kg) (Zeit der Verabrei Anzahl der Pusiein
chung von CH-I vor (5 Mäuse)
der Virusinfektion)
Kontrolle _ 58.7
100 2 h davor 1
25 2 h davor 1.6
100 6 hdavor 4
25 6 h davor 26
III. Antitumoraktivität
I) Aktivität gegen Mäuse-Leukämie P-388
CDFi-Mäuse wurden intraperitoneal mit P-388-Zellen, 1 χ 102, inokuliert und vom Tag 1 bis 15 täglich mit CH-I behandelt.
Ergebnisse:
Dosis (mg/kg/Tag)
Kontrolle 50 250
Durchschnittliche Überlebenstage (4 Mause)
Erhöhte Lebensspanne
Erhöhte Lebensspanne (%) =
durchschnittliche Überlebenstage
(behandelt)
durchschnittliche Überlebenstage (Kontrolle)
X 100-100.
50
55
60
2) Aktivität gegen S-180-Festtumor
ICR-Mäuse werden subkutan mit Sarcoma-180(l χ 107)-Zellen am Tag 0 inokuliert. CH-1 wird an den Tagen 1 bis 9 einmal täglich aufeinanderfolgend intraperitoneal verabreicht
Dosis (mg/kg/Tag)
Durchschnittliche Lebensspanne (Tage, 5 Mäuse)
42
50 50
250 61
Erhöhte Lebensspanne
0
19
45
Kinc bislang bekannte antitumoraktive Substanz, die aus der Gattung Chlorella erhalten worden ist. ist ein Antitumormittel, das aus Chlorella regularis isoliert worden ist (JP-OS 52-79 016). Diese Substanz, enthält 3.6% Proteine, während in CH-I kein Protein gefunden wird. Die bekannte Substanz ist weiterhin ein Polysaccharid. das zu 95 ±2% aus Glucose und Spurenmengen von Rhamnose und Galactose, nämlich einem Polysaccharid. bestehend aus Glucose als Hauptkomponente, besteht. Demgegenüber ist das erfindungsgemäße CH-I ein Polysaccharid. das aus kleinen Mengen von Galactose, Arabinose, Glucose und Glucuronsäurc und als Haupt-
komponente aus Rhamnose besteht. Beide Substanzen unterscheiden sich voneinander hinsichtlich ihrer Zuckerkomponenten. CH-I wird daher als neue Substanz bezeichnet.
Durch die Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen sauren Polysaccharids zur Verfugung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Zellen von Chlorella pyrenoidosa mit heißem Wasser extrahiert, durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zu dem Extrakt fraktioniert ausfällt, die wäßrige Lösung des Niederschlags dialysiert und das so erhaltene Dialysat einer Adsorptionschromatographie und Gelfiltration zur Isolierung des sauren Polysaccharids unterwirft.
Chlorella pyrenoidosa wird in einem geeigneten Medium gezüchtet. Es kann ein Nährmedium, das Essigsäure, Kohlendioxid, Calciumsalz, Magnesiumsalz und Kaliumsalz und erforderlichenfalls andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose. Stickstoffquellen, wie Harnstoff, und Vitamine enthält, verwendet werden. Die Kultivierung wird gewöhnlich aseptisch in einem abgeschlossenen Tank unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Sichtbares Licht, z. B. Sonnenlicht oder Fluoreszenzlicht, kann angewendet werden.
CH-I kann durch heißes Wasser aus den gezüchteten Zellen oder sprühgetrockneten Zellen extrahiert werden. Die Extraktion wird 1 h lang bei 80 bis 900C durchgeführt. Der Extrakt oder sein Konzentrat wird mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt, um das Material auszufällen. Bevorzugte 1 > Beispiele für mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel sind niedere Alkohole, wie Methanol oder Ethanol. Die bevorzugte Konzentration kann im Bereich von 40 bis 80% ausgewählt werden.
Das so erhaltene Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammtelt, in Wasser aufgelöst und mittels einer halbpermeablen Membran, wie einem Cellophanröhrchen, dialysiert, um Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen.
Das Dialysat wird durch Adsorptionschromatographie und Gelfiltration behandelt, um das CH-I zu reinigen. So wird beispielsweise das Dialysat in einer Säule von DEAE-Cellulose adsorbiert und mit einer verdünnten alkalischen Lösung eluiert. Das Eluat wird neutralisiert, durch eine Säule von CM-Cellulose geleitet und die aktive Fraktion wird lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in Wasser aufgelöst und auf einer Säule von DEAE-Sephacel® adsorbiert und sodann mit Wasser und 1 M-NaCl/0,01 N-HCl unter Anwendung eines Gradienten Chromatographien. Die Aktivfraktionen werden gesammelt und einer Gelfiltration unterworfen, wobei Sephadex® G-75 verwendet wird. Sie werden lyophilisiert, wodurch CH-I erhalten wird.
Die Erfindung wird in dem Beispiel erläutert.
Beispiei μ
Sprühgetrocknetes Pulver(1 kg) von Chlorella pyrenoidosa wurde mit heißem Wasser (5 I) bei 80 bis 90°C 1 h lang extrahiert. Der Extrakt wurde bei 7000 Upm 20 min lang zentrifugiert. Zu der überstehenden Lösung wurde Methanol bis zu einer Konzentration von 40% gegeben und das Ganze wurde über Nacht bei 5°C stehengelassen. Danach wurde bei 9000 Upm 20 min lang zentrifugiert. Der Niederschlag bzw. das Präzipitat wurde in Wasser aufgelöst, und die wäßrige Lösung wurde in einem Cellophanröhrchen gegen entionisiertes Fließwasser über Nacht dialysiert. Das Dialysat wurde in einer Säule (6,4 χ 39 cm) von DEAE-Cellulose. die mit einem 0,005 M-Phosphatpuffer (pH 6,0) ins Gleichgewicht gebracht worden war, adsorbiert und mit 0,05 N-NaOH eluiert. Jede lOml-Fraktion wurde auf die IF-induzierende Aktivität untersucht. Die gesammelten aktiven Fraktionen wurden mit 1 N-HCI neutralisiert Die Lösung wurde durch eine Säule (4x15 cm) von CM-Cellulose -411 geleitet, das Eluat wurde konzentriert und !yophüisiert. Rohes Pulver, das in einer kleinen Menge Wasser gelöst worden war. wurde auf einer Säule (2,5 χ 50 cm) von DEAE-Sephacel® adsorbiert und unter Anwendung eines Gradienten mit Wasser (500 ml) und 1 M-NaCI/0,01 N-HCl (500 ml) eluiert. Jede 10 mi-Fraktion wurde durch Anthron-HjSC>4 untersucht und die Fraktionen, die eine hohe Konzentration an Saccharid enthielten, wurden gesammelt und mit 0,02 N-NaOH neutralisiert. Sie wurden mit einem Cellophanröhrchen gegen Leitungswasser über Nacht dialysiert. Das Dialysat wurde durch eine Säule (5 χ 70 cm) von Sephadex® G-75 geleitet. Das Eluat wurde lyophilisiert. wodurch ein weißes Pulver von CH-1 (200 mg) erhalten wurde.
Die Erfindung wird weiterhin in den Zeichnungen erläutert. Es zeigt
Fig. 1 das IR-Spektrum vonCH-I,
Fig. 2 das Elektrophoresemuster von CH-I auf Acetatmembrane und r> <>
F i g. 3 das Ultrazentrifugenmuster von CH-I.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Saures Polysaccharid mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
1) mindestens bestehend aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff mit folgender Elementar-
analyse:
C:38.49%, H:6,07%, N: 1.39%
2) Molekulargewicht:
DE3241990A 1981-12-02 1982-11-12 Saures Polysaccharid und Verfahren zu seiner Herstellung Expired DE3241990C2 (de)

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