DE3329255A1 - Neues verfahren zur herstellung einer substanz mit carcinostatischer und immunostimulierender aktivitaet - Google Patents
Neues verfahren zur herstellung einer substanz mit carcinostatischer und immunostimulierender aktivitaetInfo
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Description
1Α-4303
(Α8033-04 Toyama)
(Α8033-04 Toyama)
Anmelder:
TOYAMA CHEMICAL COMPANY, LTD.
Tokyo, Japan
Tokyo, Japan
Titel der Erfindung:
Neues Verfahren zur Herstellung einer Substanz mit
carcinostatischer und immunostimulierender Aktivität
carcinostatischer und immunostimulierender Aktivität
Anwendungsgebiet der Erfindung:
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung einer carcinostatischen Substanz. Genauer gesagt,
betrifft die Erfindung ein neues Verfahren zur Herstel-
lung einer carcinoεtatischen Substanz mit den nachstehend
genannten Eigenschaften oder eines Salzes derselben, bei dem ein zur Gattung Fusοbacterium gehörender
Organismus einer Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid unterworfen wird und eine TF-500-Substanz
oder ein Salz derselben aus dem resultierenden Extrakt erhalten wird.
Charakteristik der bekannten Lösungen:
In jüngster Zeit haben als Heilmittel für Patienten, die an verschiedenen Krebstypen leiden, in verstärktem Maße
Mittel Verwendung gefunden, welche zu einer Steigerung der immunologischen Funktion des Wirts führen und mit
denen ein carcinostatischer Effekt unter Mitwirkung der immunologischen Funktion erzielt wird.
Die Erfinder haben die pharmakologische Wirksamkeit von
Komponenten untersucht, welche durch die Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid aus Organismen erhalten
wurden, welche zur Gattung Fusobacterium gehören und welche aus der Mundhöhle isoliert wurden. Dabei
wurde festgestellt, daß eine spezielle Komponente, welche aus dem Extrakt erhalten wird, eine carcinostatische
Wirksamkeit aufweist, daß diese Komponente eine indirekte carcinostatische Aktivität entfaltet, und
zwar durch Steigerung der wirtsvermittelten Antitumoraktivität
oder der Immunität des Wirts und Nutzung der Assistenz der Immunität; und daß diese Komponente eine
äußerst geringe Toxizität aufweist. Die Erfinder haben ferner Verfahren zur Herstellung dieser Komponente untersucht
und dabei die vorliegende Erfindung gemacht.
Ziel der Erfindung:
Es ist Ziel der Erfindung, ein neues Verfahren zu schaf fen, bei dem Organismen, welche zur Gattung Fusobacteri
um gehören, der Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid
unterworfen werden und eine carcinostatische Substanz aus dem resultierenden Extrakt erhalten
wird.
Andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.
Darlegung des Wesens der Erfindung:
Als Organismen, welche bei der vorliegenden Erfindung
genutzt werden, kommen beliebige,TF-500-Substanzen produzierende Bakterien in Frage, welche zur Gattung
Fusobacterium gehören. Beispielsweise werden solche, welche zu Fusobacterium nucleatum gehören, bevorzugt
verwendet. Speziell wird Fusobacterium nucleatum TF-O31
(FERM 5077; ATCC 31647) verwendet sowie Stämme, welche
gemäß dem allgemeinen Fachwissen der Mikrobiologie dessen Eigenschaften aufweisen, nämlich spontane Mutanten
oder künstlich modifizierte Stämme.
Die bakteriologischen Eigenschaften von Fusobacterium nucleatum TF-031 sind wie folgt:
(I) Form
(1) Form der Zellen: spindelförmig (Fig. 1)
(2) Polymorphismus der Zellen: abwesend
(3) Motilität: abwesend
(4) Sporen: abwesend
(5) Granifärbung: gramnegativ
(6) Säurebeständigkeit: negativ
- ir- ■ • T-
(II) Wuchszustand im Kulturmedium
(1) TF-a Agarplatte und Schrägkulturmedium externe Form: runde Gestalt
Größe: etwa 1 mm Protuberanz: halbkugelförmige Gestalt Struktur: tautropfenartig
Oberfläche: glatt Kanten: glatt Farbe: milchig gelblich-weiß Transparenz: opak
(2) TF-a Flüssigkulturmedium Wachsturnsgrad: heftig
Turbidität: Koagulum Präzipitat: keines Oberflächenwachstum: keines; kein Wachstum bis
zu einer Tiefe von etwa 5 mm Gas: keines
(III) Physiologische Eigenschaften
(1) Entwicklung von Schwefelwasserstoff: +
(2) Reduktion von Nitraten: -
(3) Produktion von Buttersäure: +
(4) Produktion von Indol: +
(5) Urease: -
(6) Catalase: -
(7) Stärkehydrolyse: -
(8) Verhalten gegenüber Sauerstoff: anaerob
(9) Erzeugung von Ammoniak: +
(10) Erzeugung von Kohlendioxid: +
(11) Wachstumsbereich: pH 5,0 bis 8,5; 30° bis 450C
(12) Erzeugung von Gas aus Sacchariden: L-Arabinose (-), D-Xylose (-), D-Glucose (-),
D-Mannose (-), D-Fructose (-), D-Galactose (-), Malzzucker (-), Saccharose (-), Trehalose (-),
Sorbit (-), Mannit (-), Inosit (-), Glycerin (-),
Stärke (-).
Das Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen Substanz TF-5OO wird beispielsweise auf folgende Weise
durchgeführt:
Kultur von Bakterien, welche zu Fusobacterium nucleatum gehören
Filtration
überstehende Flüssigkeit
Organismus
Dialkylsulfoxid
Unlösliches
Extrakt
(saures) hydrophiles organisches .
Lösungsmittel
Lösungsmittel
Präzipitat
Deproteinisierung und/oder Ultrafiltration
carcinostatische Substanz
TF-5OO
Das oben erwähnte Herstellungsverfahren wird im folgenden
näher erläutert.
(I) Kultivierung der Bakterien
Die Kultivierung der Bakterien der Gattung Fusobacterium
wird auf herkömmliche Weise, wie bei anaeroben Bakterien üblich, durchgeführt. Es wird ein Kulturmedium
mit einem Gehalt einer Stickstoffquelle, wie Rinderhirn-Herz-Extrakte,
verschiedene Peptone oder dergl., verwendet. Ferner enthält das Medium eine Vitaminquelle,
wie Hefeextrakt oder dergl.; anorganische-'Salze, wie
Natriumchlorid oder dergl.j eine Kohlenstoffquelle, wie
Glucose, Lactose oder dergl.; ein Reduktionsmittel, wie L-Cystin, Natriumsulfit, Natriumthioglykolat oder
dergl.; und der pH-Wert wird auf 5 bis 8,5 und vorzugsweise auf 6,5 bis 7»5 eingestellt, und zwar mit einer
wäßrxgen Natriumhydroxidlösung. Das Bacterium wird in das Kulturmedium eingeimpft. Danach erfolgt eine Kultivierung
im Fließgleichgewicht oder eine Kultivierung unter Rühren, und zwar unter anaeroben Bedingungen bei
30 bis 450C, vorzugsweise 32 bis 370C, während 1 bis
/ 5 Tagen, vorzugsweise 1 bis 4 Tagen. Insbesondere er
wünscht ist es, das in Tabelle 1 beschriebene Kulturmedium zu verwenden. Dieses wird im folgenden als "TF-Kulturmedium"
bezeichnet. Das Hirn-Herz-Infusionsmedium, welches einen Rinder-Hirn-Herz-Extrakt darstellt,
ist jedoch nicht immer als Stickstoffquelle erforderlich
und kann ersetzt werden durch ein Herzinfusionsmedium, insbesondere einen Rinderherzextrakt,
einen Rindfleischextrakt, einen Fischextrakt, eine. Maisquellflüssigkeit oder dergl. Unter den verschiedenen
Peptonen kommen Proteose-pepton und Phytonpepton in Frage. Sie sind jedoch nicht immer erforderlich.
Man kann das Trypticase-pepton auch durch PoIypepton ersetzen.
-Wenn kein Ajgar verwendet wird, so wird vorteilhafterweise
eine Rührkultur durchgeführt.
TF-a | • /ΙΟ- | 1 | TF-d | TF-e | TF-f | |
17 | Tabelle | TF-c | 17 | 17 | 17 | |
Bestandteile des Kulturmediums(g/l) |
3 | TF-b | 17 | - | - | - |
Trypticase-pepton | 10 | 17 | 1,5 | - | - | - - |
Phyton-pepton | 35 | 3 | 5 | - | - | - |
Proteose-pepton | - | 5 | - | 20 | 10 | 15 |
Hirn-Herζ-Infusiοη | 3 | 17,5 | 25 | 3 | 3 | 3 |
Herz-Infusion | 7,5 | - | 3 | 7,5 | 7,5 | 7,5 |
Hefeextrakt | 6 | 3 | 7,5 | 12 | 12 | 12 |
Natriumchlorid | 5 | 7,5 | 6 | 10 | 10 | 10 |
Glucose | 0,25 | 6 | 5 | - | - | - |
Lactose | 0,1 | 5 | 0,5 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
L-Cystin | 0,5 | 0,5 | 0,1 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Natriumsulfit | 0 0,7 |
0,1 | 0,5 | 0 0,7 |
0 0,7 |
0 0,7 |
Natriumthio- glykolat |
- | 0,5 | 0 0,7 |
2,5 | 2,5 | 2,5 |
Agar oder |
0 0,7 |
2,5 | ||||
Dikaliumhydro gen- phosphat |
- | |||||
(II) Abtrennung der Organismen von der Kultur
Die überstehende Flüssigkeit wird von der oben erhaltenen Kultur entfernt, um die Organismen zu erhalten. Zur
Entfernung der überstehenden Flüssigkeit kann ein herkömmliches Verfahren angewendet werden, beispielsweise
ein Zentrifugierverfahren oder Filterverfahren. Man kann dabei eine Filtrierhilfe, wie CeIite (Warenzeichen von
Johns-Manville, USA), verwenden. Die erhaltenen Organismen
werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen und anschließend nach einem herkömmlichen Verfahren getrocknet,
beispielsweise durch Gefriertrocknung, oder sie werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen und
nachfolgend mit einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, wie Ethanol, Aceton oder dergl., während einer
• AA' .
kurzen Zeit gewaschen und anschließend auf herkömmliche
Weise, beispielsweise durch Lufttrocknung oder dergl., getrocknet, um die getrockneten Organismen zu erhalten.
Ferner werden die getrockneten Organismen erforderlichen falls pulverisiert, um das getrocknete Pulver zu erhalten.
(III) Extraktionsverfahren
Zu den oben erhaltenen, getrockneten Organismen wird ein Dialkylsulfoxid zugegeben, beispielsweise Dirnethylsulfoxid,
Diethylsulfoxid oder dergl., vorzugsweise Dimethylsulfoxid,
und zwar in einer Menge von 10 bis 50 ml/g getrocknete Organismen. Die Extraktionsbehandlung
wird durchgeführt unter Rühren bei Raumtemperatur bis 80°C während 30 Minuten bis mehreren Tagen, vorzugsweise
bei etwa 650C während 3 bis 5 Stunden. Danach
werden unlösliche Bestandteile mittels eines herkömmlichen Verfahrens, wie Dekantieren, Zentrifugieren, Filtrieren
oder dergl., entfernt. Ferner wird dem erhaltenen Extrakt ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel
zugesetzt, beispielsweise ein Keton, wie Aceton, Diethylketon, Methylethylketon oder dergl., oder ein Alkohol,
wie Methanol, Ethanol, Isopropanol oder dergl., und zwar in einer Menge von mehr als dem 5fachen, bezogen
auf die Menge des Extrakts (Volumen/Volumen) bei einer tiefen Temperatur. Vorzugsweise wird das hydrophile,
organische Lösungsmittel unter sauren Bedingungen zugesetzt. Beispielsweise wird Aceton zusammen mit
Chlorwasserstoffsäure zugesetzt und das resultierende Gemisch mehrere Stunden bis mehrere Tage bei etwa 4° C
stehengelassen.
Das Präzipitat wird auf herkömmliche Weise abgetrennt. Anschließend wird das so erhaltene Präzipitat einer
•/a·
Deproteinisierungsbehandlung oder einer Ultrafiltrationsbehandlung
unterworfen, und zwar entweder einem dieser Verfahren allein oder einer Kombination von beiden
Verfahren.
Falls die Organismen mit physiologischer Salzlösung gewaschen werden und anschließend durch Gefriertrocknung
getrocknet werden, kann die Deproteinisierungsbehandlung oder die Ultrafiltrationsbehandlung bei der Isolierung
einer carcinostatischen Substanz TF-5OO oder eines Salzes derselben weggelassen werden.
(IV) Deproteinisierung, Ultrafiltration und Isolierung der angestrebten Substanz
Das auf die oben beschriebene Weise erhaltene Präzipitat wird der Deproteinisierungsbehandlung und nachfolgend
der Ultrafiltrationbehandlung unterworfen oder es wird
der Deproteinisierungsbehandlung allein unterworfen oder es wird der Ultrafiltrationsbehandlung allein unterworfen,
um eine carcinostatische Substanz TF-5OO
oder ein Salz derselben zu erhalten.
Zur Deproteinisierungsbehandlung können an sich bekannte Verfahren verwendet werden. Falls die Deproteinisierung
durchgeführt wird durch eine Behandlung mit einem proteoIytischen Enzym, so wird das erhaltene Präzipitat
in Wasser oder in einer Pufferlösung aufgelöst oder suspendiert, der resultierenden Lösung oder Suspension
ein proteolytisches Enzym zugesetzt und die Enzymbehandlung auf eine herkömmliche Weise durchgeführt.
Als proteolytische Enzyme kann man beispielsweise
Pronase, Papain, Trypsin, Chemotrypsin und dergl. verwenden. Pronase und Trypsin sind bevorzugt. Es ist ins-
besondere bevorzugt, vor oder während der Enzymbehandlung
die wäßrige Lösung auf pH 7 bis 8 einzustellen und zu halten. Zu diesem Zweck kann man Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Ammoniumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat und dergl. verwenden. Zur Verhinderung
einer Putrefraktion des Reaktionsgemisches während der Enzymbehandlung ist es erwünscht, eine geringe
Menge eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, Toluol oder dergl., zuzusetzen. Das Enzym wird gewöhnlich
in einer Menge von etwa 1 bis 4 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des der Enzymbehandlung zu unterwerfenden
Pulvers (Festkörper), zugesetzt.
Die obige Enzymbehandlung erfolgt üblicherweise bei 30
bis 400C während 1 bis 72 Stunden und vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Sie kann auch durchgeführt werden, indem
man zunächst z.B. etwa 1 bis 2 Gew.% eines Enzyms zum Pulver (Festkörper) gibt und sodann das Pulver (Festkörper)
1 bis 24 Stunden der Enzymbehandlung unterwirft und nachfolgend nochmals etwa 1 bis 2 Gew.% des Enzyms
für eine zusätzliche Enzymbehandlung zusetzt.
Nach der obigen Enzymbehandlung werden erforderlichenfalls unlösliche Bestandteile entfernt, und zwar durch
Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl.. Sodann wird aus dem auf diese Weise erhaltenen, wasserlöslichen Anteil
eine carcinostatische Substanz TF-500 isoliert.
Die Isolierung von TF-500 aus dem wasserlöslichen Anteil kann zunächst durchgeführt werden durch mindestens
eine Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH-Wert sowie durch gesonderte Fällung aus einem hydrophilen, organischen
Lösungsmittel, durch Fraktionierung mit einem Ionenaustauscher und dergl. und nachfolgend durch Ultra-
-/rf - • /lit-
filtration (die Behandlung kann zweimal wiederholt werden) . Genauer gesagt wird die vorliegende, carcinostatische
Substanz TF-500 erhalten durch Einstellen des pH-Wertes des obigen, wasserlöslichen Anteils auf vorzugsweise
einen pH von nicht mehr als 2,5 (wobei man erforderlichenfalls Trichloressigsäure zusetzen kann).
Dann wird der erhaltene Niederschlag abgetrennt. Nun gibt man zum löslichen Anteil ein hydrophiles, organisches
Lösungsmittel, wie Ethanol, so daß seine Konzentration 30 bis 80 und vorzugsweise 60 bis 80 Vol-96
beträgt. Dann wird der gebildete Niederschlag abgetrennt. Es handelt sich dabei um die Fraktion der angestrebten
Verbindung. Nachfolgend kann erforderlichenfalls dieser Niederschlag mit einem Anionenaustauscherharz
behandelt werden, z.B. Dowex 1V , Amberlite
^\ DEAE-Sephadex^R\ DEAE-Cellulose^ oder
dergl.; diese Behandlung kann mehrmals durchgeführt
werden. Man isoliert dabei die nichtadsorbierten Fraktionen, und diese werden erforderlichenfalls einer Ultrafiltration
unterworfen (nomineller Molekulargewichtsabbruch: 50 000 bis 200 000). Hierzu verwendet man beispielsweise
eine Ultrafiltrations-Membran UK-50 mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch von 50 000,
eine Ultrafiltrations-Membran UK-200 mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch von 200 000 oder dergl.
(Ultrafiltrations-Membran UK-50 und UK-200 sind Warenbezeichnungen für Ultrafiltrations-Membranen von Toyo
Roshi Kabushiki Kaisha). Sodann werden eine erhaltene, wäßrige Lösung des Präzipitats oder die durch Ultrafiltration
erhaltenen Fraktionen weiteren Behandlungen unterzogen, wie einer Einengung, Entsalzung oder Aussalzung
oder dergl.. Das konzentrierte und entsalzte Produkt wird getrocknet. Eine 0,2%ige wäßrige Lösung dieser
TF-500 Substanz (Gew./Vol.) ist transparent.
- yi-
• AS-
Wie oben erwähnt, kann anstelle der Deproteinisierungsbehandlung und der nachfolgenden Ultrafiltrationsbehandlung
die oben erläuterte Deproteinisierungsbehandlung oder Ultrafiltrationsbehandlung jeweils für sich
allein durchgeführt werden.
Die auf diese Weise erhaltene, carcinostatische Substanz
TF-5OO hat die nachfolgend aufgeführten Eigenschaften.
Sie kann in ein pharmazeutisch akzeptables Salz umgewandelt werden, und zwar nach herkömmlichen
Verfahren. Diese pharmazeutisch akzeptablen Salze umfassen
speziell beispielsweise Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze, Kaliumsalze und dergl., und Erdalkalimetallsalze,
wie Magnesiumsalze, Calciumsalze und dergl..
Die Eigenschaften der carcinostatischen Substanz TF-5OO
sind wie folgt:
(a) Grauweißes bis hellbraunes Pulver.
(b) Die Substanz hat eine carcinostatische und eine immunostimulierende Wirkung.
(c) Die Substanz ist in Wasser löslich, jedoch unlöslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Benzol, Chloroform,
Ethylacetat und Diethylether.
(d) Die Substanz hat keinen klaren Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 1800C zu zersetzen und
zersetzt sich bemerkenswert oberhalb 195°C
(e) Ihr Infrarot-AbsorptionsSpektrum, erhalten
nach dem KBr-Verfahren, weist Absorptionsbanden auf in der Nähe von 3500 - 3200, 2920, 2850, 1660-1600,
1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000,
970 und 840-800 cm"1.
(f) Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum ihrer wäßrigen Lösung bei einem pH-Wert von 7,0 zeigt eine
starke Absorption an der Aborptionskante und zeigt
ein Absorptionsmaximum in der Nähe von 246 bis 280 nm.
(g) Die Substanz verhält sich positiv bei der Molish-Reaktion, Phenol-SchwefeIs äure-Reaktion $ Anthron-Schwefelsäure-Reaktion,
Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin-Reaktion, jedoch negativ bei
der Ninhydrin-Reaktion.
(h) Elementaranalysen-Werte C 38-47% H 5-7% N 1-4%.
(i) Der Saccharidgehalt der Substanz, bestimmt mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens, beträgt
etwa 12 bis 30 Gew.%, ausgedrückt als Glucose, und ihr Proteingehalt, bestimmt mittels des Lowry-Folin-Verfahrens,
beträgt etwa 10 Gew.% oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin.
Die pharmakologischen Aktivitäten der vorliegenden
carcinostatischen Substanz TF-50Q sind wie folgt.
(I) Effekt der TF-Substanz auf Zellenlebensfähigkeit
(Koloniebildungs-Assay)
Basierend auf dem Verfahren von Kim.J.H. et al. [Cancer
Res. 25_, 698 (1965)], werden HeLa S-3 Zellen in Eagle's
MEM, das mit 10% Kalbserum ergänzt ist, kultiviert, und zwar während 3 bis 5 Tagen bei 370C. Anschließend
wird die Kultur entfernt und eine PBS(-)-Lösung (eine wäßrige Lösung, enthaltend 8,0 g/l Natriumchlorid,
0,2 g/l Kaliumchlorid, 1,15 g/l Dinatriumhydrogenphosphat und 0,2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat) mit einem
Gehalt an 0,01 Gew.% Ethylendiamin-tetraessigsäure und 0,1 Gew.% Trypsin, wird der erhaltenen Zellenschicht
zugesetzt, und zwar mittels einer Pipette unter Ausbildung einer Suspension. Die erhaltene Zellensuspension
wird verdünnt mit Eagle's MEM, das mit 20% Kalbserum ergänzt ist, und zwar in der Weise, daß sie 300 ZeI-
len/ml enthält. 1 ml dieser Zellensuspension wird 24 h
bei 37°C in einem CC^-Inkubator kultiviert und zu der
resultierenden Kultur wird anschließend die carcinostatische Substanz TF-5OO, erhalten in dem weiter unten
beschriebenen Beispiel 1, zugegeben, und zwar so, daß Konzentrationen von 250, 500 und 1000 /ug/ml erhalten
werden. Es werden zwei Experimente durchgeführt, wobei
in einem Fall Serum (20%, Vol/Vol) der Kultur zugesetzt
wird und wobei im anderen Fall kein Serum zugesetzt wird. Nach 24stündiger Behandlung werden die Zellen mit
der serumfreien Kultur gewaschen und den Zellen wird nachfolgend die Kultur zugesetzt, welcher 20% Kalbserum
zugefügt sind. Daraufhin werden die Zellen 6 Tage in einem COp-Inkubator inkubiert. Nach der Kultivierung
werden die Zellen mittels Ethanol fixiert und mit einer Giemsa-Färbelösung angefärbt. Die resultierenden Kolonien
werden gezählt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle
2 zusammengestellt. Dabei wurde die Lebensfähigkeit der Zellen nach der folgenden Gleichung bestimmt:
Anzahl der Kolonien in
Zellenlebens- der behandelten Gruppe inn
fähigkeit (%) = Alizahl der Kolonien in
d.unbehandelten Gruppe
Konz.der carcino- Zellenlebensfähigkeit (fo)
statischen Substanz serumfreies KuI- mit Serum versetz-(/ug/ml)
turmedium tes Kulturmedium
0 ■ 100 100
250 103,8 103,2
500 100,2 98,5
1000 55,2 97,1
(II) Immunostimulierende Wirkung
Drei Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) werden
in jeder Gruppe verwendet. 5/ug, 50/ug und 500 /Ug/kg
Testsubstanz werden den Mäusen intraperitoneal verabreicht. 24 Stunden nach der Verabreichung werden in den
Schwanz der Maus 0,2 ml einer Kohlenstoffsuspension intravenös
injiziert. Diese wurde hergestellt durch Vermischen von 1 ml Pelikan Zeichentusche Nr. 17 Schwarz
(Günther Wagner GmbH) mit 2 ml einer physiologischen Salzlösung, enthaltend 3 Gew.% Gelatine. 1, 5f 10 und
15 min nach der Injektion werden aus der Orbita 0,02 ml Blut gewonnen, wobei man eine Hämatokrit-Kapillare
verwendet, die mit Heparin beschichtet ist. Das Blut wird sofort verdünnt und hämolysiert, und
zwar mit 1,6 ml einer 0,1 gew.%igen wäßrigen Natriumcarbonatlösung.
Diese Suspension wird einer Colorimetrie bei 675 nm unterzogen. Der Phagocytose-Index
(K-Wert) wird aus der Gleichung von Halpern et al. ermittelt.
Den Mäusen der Blindgruppe werden 0,2 ml physiologische Salzlösung verabreicht.
log Cn - log C
K =
K =
C0 bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum
Zeitpunkt tQ; C bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum Zeitpunkt t. Die Ergebnisse sind in Tabelle
3 aufgeführt.
Tabelle 3
Dosis (/ug/kg) Durchschnittlicher K-Wert
Dosis (/ug/kg) Durchschnittlicher K-Wert
5 0,0418 + 0,0089
50 0,0560 + 0,0016
500 0,0561 + 0,027
Vergleich 0,0276 + 0,0020
Bemerkung: Es wurde die in Beispiel 1 erhaltene, carcinostatische Substanz verwendet.
(III) Antitumor-Aktivität gegen Sarcoma-180 Zellen
Sarcoma-180 Zellen werden subkutan transplantiert, und
zwar in Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt)
•γ
in die Armbeuge in einer Menge von 1 χ 10 Zellen/Maus.
Nachfolgend wird eine jede der Testsubstanzen in einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst und 0,2 ml einer
C'eden der resultierenden Lösungen werden intravenös verabreicht,
und zwar ^eder Maus einmal pro Tag am 10. und 12. Tag nach der Transplantation der Krebszellen. Der
Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer 5%igen wäßrigen
Glucoselösung auf die gleiche, oben beschriebene Weise verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Dosis Mittl.Tumorgewicht | Standardabweichung | Hämo rrha gi s ehe | T/C+3 {%) | 53 |
(mg/kg) + | (ß) | Necrose des Tu-(Tag 14) | 56 | |
3,4 z 0,7 | mors (Tag 14) | 63 | ||
0,5+1 | 3,6 + 0,7 | 5/5 | 79 | |
1,O+1 | 4,1 + 2,4 | 4/5 | 100 | |
O,5+2 | 5,0 + 1,9 | 3/5 | ||
1,O+2 | 6,4 + 2,7 | 3/5 | ||
Vergleich | 0/5 | |||
Bemerkungen:
+1 Es wird die in Beispiel 1 erhaltene, carci· nostatische Substanz verwendet.
-/Tf -
. 30-
+2 Es wird die in Beispiel 2 erhaltene, carcinostatische
Substanz verwendet.
+3 T/C (90 =
+3 T/C (90 =
Mittl.Tumorgewicht der Mäuse bei
Verabreichunp; der Testsubstanz 10Q
Mittl.Tumorgewicht der Mäuse der
Vergleichsgruppe
(IV) Akute Toxizität
LD1-Q-Werte werden bei Mäusen (ICR-Stamm, weiblich,
6 Wochen alt, intravenöse Verabreichung) gemessen. Der von TF-500 beträgt mehr als 10 mg/kg.
Man erkennt aus den obigen pharmakologiscnen Experimenten, daß die TF-500 Substanz der vorliegenden Erfindung
als carcinostatisches Mittel brauchbar ist. Es kann eine Wirksamkeit gegen verschiedenste Krebserkrankungen
erwartet werden.
Die TF-500 Substanz oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze gemäß der vorliegenden Erfindung können zu verschiedensten
pharmazeutischen Darreichungsformen verarbeitet werden. Insbesondere können orale Mittel hergestellt
werden oder Injektionsmittel, Suppositorien oder dergl..
Im Falle oraler Mittel können diese verschiedene Hilfsstoffe
enthalten und in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern oder Granulaten vorliegen. Im Falle von Injektionsmitteln
können diese für subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion und intravenöse Injektion
vorgesehen sein. Es kann sich dabei um Suspension oder Lösungen handeln oder um Pulver, welche vor Gebrauch in
einer physiologischen Salzlösung oder in einer Glucose oder ein Lokalanäthetikum enthaltenden Lösung aufgelöst
werden. Die Dosis der erfindungsgemäßen TF-500 Substanz oder ihres pharmazeutisch akzeptablen Salzes kann je
nach dem Zustand des Patienten in zweckentsprechender Weise ausgewählt werden. Es ist jedoch im allgemeinen
erwünscht, einem Erwachsenen 0,001 bis 0,1 mg/kg einmal am Tag oder mehrmals am Tag zu verabreichen. Was die
Verabreichungsmethode anbelangt, so ist die orale Verabreichung, die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse
Injektion oder die Injektion in den erkrankten Bereich bevorzugt.
Ausführungsbeispiele:
Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen anhand von Beispielen, Präparatbeispielen und Zeichnungen
näher erläutert; es zeigen:
Fig. 1 eine mikroskopische Photographie der Form des Fusobacteriums nucleatum TF-031, das bei der
vorliegenden Erfindung verwendet wird;
Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der in dem nachfolgenden Beispiel 1 erhaltenen Substanz
TF-500;
Fig. 3 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 4 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der in dem nachfolgenden Beispiel 2 erhaltenen Substanz TF-500;
Fig. 5 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum
dieser Substanz;
Fig. 6 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der in dem nachfolgenden Beispiel 3 erhaltenen Substanz TF-500;
Fig. 7 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 8 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der im folgenden Beispiel 4 erhaltenen Substanz TF-500; und
Fig. 9 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum
dieser Substanz.
.a.2,"
eispiel 1
(1) In ein 90 1 Femientationsgefäß (MSJ-U-Typ, hergestellt
von Marubishi Rika Kenkyusho) gibt man 70 1
eines TF-f Kulturmediums, enthaltend 1190 g Trypticasepepton. 1050 g Herzinfusion, 210 g Hefeextrakt, 525 g
Natriumchlorid, 840 g Glucose, 700 g Lactose, 7 g Natriumsulfit, 35 g Natriumthioglykolat und 175 g Dikaliumhydrogenphosphat.
Das Kulturmedium wird mit 4N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7,5 eingestellt. Das Kulturmedium
wird 15 min bei 1180C sterilisiert. Nach dem Abkühlen
des Kulturmediums wird Stickstoffgas während 1 h
mit einem Durchsatz von 250 ml/min durchgeleitet. Nun wird das Kulturmedium mit etwa 900 ml einer Vorkulturlösung
von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077,
ATCC-31647) geimpft, welche zuvor hergestellt wurde durch
Kultivierung in einem TF-f Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie oben. Die Zellen werden 4 Tage bei
330C unter Rühren (90 U/min) kultiviert, wobei Stickstoff
gas mit einer Rate von 250 ml/min eingeleitet wird.
(2) Eine 12 1-Portion der so erhaltenen Kultur wird zentrifugiert (4 χ 10·5 U/min; 10 min), um die Organismen
zu sammeln. Die Organismen werden mit 1 1 physiologischer Salzlösung gewaschen und nachfolgend entfettet
und mit 1 1 Ethanol und 1 1 Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen und anschließend getrocknet. Man erhält
14,2 g der Organismen. Die Organismen werden in 300 ml
Dimethylsulfoxid suspendiert und einer Extraktion unterworfen, und zwar während 4 h unter Rühren und Erhitzen
der Suspension auf 650C Nachfolgend wird die Suspension
unter Absaugen filtriert, um ein Filtrat zu erhalten. Diesem Filtrat werden Z 1 Aceton und 8 ml konz.
Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, und das resultierende
Gemisch wird anschließend 2 Tage stehengelassen, damit
COPY BAD ORIGINAL
sich das resultierende Präzipitat absetzt und altert. Dieses Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt
(4 χ 103 U/min; 10 min) (748 mg).
(3) Die auf diese Weise erhaltenen 748 mg des Präzipita ts werden in 15 ml Wasser aufgelöst, und die resultierende
Lösung wird mit Ammoniumcarbonat auf pH 7,8 bis 8,0 eingestellt. Dieser Lösung werden zwei 7,5-mg-Portionen
Pronase E (Warenname von Kaken Kagaku; 1 000 000 Tyrosineinheiten/g) zugesetzt, und zwar mit einem 30 min- !
Intervall, und es werden anschließend einige Tropfen Toluol zugegeben. Daraufhin wird das resultierende
Gemisch der Enzymbehandlung bei 370C während 24 h un- ;
terworfen. Dem auf diese Weise behandelten Gemisch wird Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, um den pH auf 1
einzustellen. Anschließend wird Ethanol zugegeben, und zwar in der Weise, daß die Ethanolkonzentration
80 Vol-$ beträgt. Das resultierende Gemisch wird zentrifugiert
(4 χ 10-5 U/min; 10 min) und das resultierende
Präzipitat gesammelt (288,6 mg).
(4) Die 288,6 m9 des erhaltenen Präzipitats werden
in 50 ml Wasser aufgelöst und die resultierende Lösung wird durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran
UK-50 auf 5 ml konzentriert. "Der auf diese Weise erhaltenen, konzentrierten Lösung werden
45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die so erhaltene, verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird,
und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung der Ultrafiltrationsmembran UK-50. Diese konzentrierte Lösung
wird durch ein Millipore Filter (Warenname für ein Membranfilter von Japan Millipore Limited) mit einem
Porendurchinesser von 0,2 /um filtriert und dann gefriergetrocknet.
Man erhält 264 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-500. COPY
BAD ORIGINAL.
Die auf diese Weise erhaltene, carcinostatische Substanz
TF-5OO hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 2 sowie das
Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 3.
Beispiel .2
(1) Aus 70 1 der in Beispiel 1-(1) erhaltenen Kultur
werden die Organismen isoliert, und zwar durch Filtration durch Hyflo Super CeI (Warenname von Johns-Manville,
USA). Das resultierende Gemisch der Organismen mit Hyflo Super CeI wird mit 20 1 physiologischer Salzlösung
gewaschen und anschließend entfettet und mit 3 1 Ethanol und 3 1 Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen. Man
erhält 3,2 kg der getrockneten Mischung. Eine 320 g-Fortion dieser Miechung wird in 400 ml Dimethylsulfoxid
suspendiert und die resultierende Suspension wird einer Extraktion unterworfen, und zwar unter Rühren während
4 h, während das Ganze auf 65°C erhitzt wird. Nachfolgend wird die Suspension unter Absaugen filtriert, um
ein Filtrat zu isolieren. 2,5 1 Aceton und 10 ml konz. Chlorwasserstoffsäure werden dem Filtrat zugesetzt,
woraufhin das resultierende Gemisch 2 Tage bei 40C stehengelassen wird, um das Präzipitat abzusetzen und
zu altern. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt (4 χ 10* U/min; 10 min) (94 mg).
(2) In 50 ml Wasser werden die auf diese Weise erhaltenen 94 mg des Präzipitats aufgelöst und die resultierende
Lösung wird auf 5 ml konzentriert, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran
UK-50. Der erhaltenen, konzentrierten Lösung werden 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die
so verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran
UK-50.
- 22 - .
Die so erhaltene, konzentrierte Lösung wird durch ein Millipore Filter mit einem Porendurchmesser von
0,2 /um filtriert und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 62,6 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen
Substanz TF-500.
Die auf diese Weise erhaltene, carcinostatische Substanz
TF-50Ö hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarotabsorptionsspektrum gemäß Fig. 4 sowie das Ultra
violett-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 5.
(1) Eine 7,2 1-Portion der in Beispiel 1-(1) erhaltenen
Kultur wird zentrifugiert (5 x 10 U/min; 10 min),
um die Organismen zu isolieren. Diese werden gefriergetrocknet. Eine 3»5 g-Portion der gefriergetrockneten
Organismen wird in 100 ml physiologischer Salzlösung suspendiert und die resultierende Suspension wird mit
2N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt, 3 h gerührt und dann 24 h stehengelassen. Dann
wird die Suspension zentrifugiert (5 x 1Cr U/min; 10 min), um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen.
Dem erhaltenen Präzipitat werden 100 ml physiologische Salzlösung zugesetzt und das resultierende Gemisch
wird mit 2N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt. Das Gemisch wird 2 h gerührt und anschließend
zentrifugiert (5 χ 10^ U/min; 10 min), um
die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Nachfolgend wird das erhaltene Präzipitat mit drei 50 ml-Portionen
Ethanol, einer 50 ml-Portion Aceton und einer 50 ml-Portion
Diethylether in dieser Reihenfolge gewaschen, wobei die Entfernung der Waschflüssigkeiten durch
Zentrifugieren erfolgt (5 x 10^ U/min; 10 min). Anschließend
wird das Präzipitat getrocknet, um trockene
. Ab ·
Organismen zu erhalten. Die Organismen werden pulverisiert, um ein Pulver derselben zu erhalten. Dem Pulver
werden 70 ml DimethyIsulfoxid zugesetzt, und das resultierende
Gemisch wird extrahiert, und zwar unter Rühren bei 63 bis 650C während 4 h. Anschließend wird
eine Saugfiltration durchgeführt, um ein Filtrat zu isolieren. Dieses Filtrat wird mit 536 ml Aceton und
1 ml konz.Chlorwasserstoffsäure versetzt und das resultierende
Gemisch wird 24 h bei 40C stehengelassen, um ein Absetzen und eine Alterung des Präzipitats zu
bewirken. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren isoliert (5 x 103 U/min; 10 min) (269 mg).
(2) Den 269 mg des auf diese Weise erhaltenen FiI-trats
werden 2,7 ml Wasser zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung
auf pH 8,0 eingestellt. Dann wird Wasser zugegeben, um das Endvolumen auf 4 ml einzustellen. Dem
Gemisch werden 2,7 mg Pronase E (1 000 000" Tyrosineinheiten/g)
zugesetzt und das resultierende Gemisch wird 1 h bei 37°C der Enzymbehandlung unterworfen. Ferner werden
2,7 mg Pronase E und einige Tropfen Toluol zugesetzt und das resultierende Gemisch wird 24 h bei 370C der
Enzymbehandlung unterworfen. Unlösliche Bestandteile werden aus dem so behandelten Gemisch durch Zentrifugieren
abgetrennt (5 x 10^ U/min; 10 min) und die erhaltene
Lösung wird mit 2N Chlorwasserstoffsäure versetzt, um
den pH derselben auf 1,0 einzustellen. Daraufhin wird Ethanol zugegeben, und zwar in der Weise, daß die
Ethano!konzentration 80 Vol-% ausmacht. Das dabei erhaltene
Präzipitat wird durch Zentrifugieren isoliert (5 χ 103 U/min; 10 min) (78,5 mg).
. StT-.
(3) Den 78,5 mg des so erhaltenen Präzipitats werden
20 ml Wasser zugesetzt und das resultierende Gemisch wird mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7
eingestellt. Nachfolgend wird das resultierende Gemisch auf 5 ml konzentriert, und zwar durch Ultrafiltration
unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-50.
Der so erhaltenen, konzentrierten Lösung werden 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die so verdünnte Lösung
wiederum auf 5 ml konzentriert wird, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran
UK-50. Die erhaltene, konzentrierte Lösung wird wiederum mit 45 ml Wasser versetzt und die verdünnte
Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert durch Ultrafiltration
unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran
UK-50. Dieses Konzentrat wird durch ein Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,2/um (Toyo Roshi
Kabushiki Kaisha TM-4) filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 65 mg der gefriergetrockneten,
carcinostatischen Substanz TF-500.
Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-500 hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarot-Absorptionsspektrum
gemäß Fig. 6 und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum
gemäß Fig. 7.
Beispiel 4
(1) Eine 10 1-Portion der in Beispiel 1-(1) erhaltenen
Kultur wird zentrifugiert (5 x 10^ U/min; 10 min),
um die Organismen zu isolieren. Den Organismen werden 500 ml physiologische Salzlösung zugesetzt, und das resultierende
Gemisch wird 30 min gerührt. Anschließend wird zentrifugiert (5 x 105 U/min; 10 min), um das
Präzipitat zu isolieren. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt. Dem auf diese Weise erhaltenen Präzipitat
- 25 -
werden 500 ml physiologische Salzlösung zugesetzt, und
das resultierende Gemisch wird 30 min gerührt, anschließend mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf
pH 8,0 eingestellt und nachfolgend 30 min gerührt. Dann
wird das Gemisch zentrifugiert (5 x 10 U/min; 10 min)
und entfettet sowie mit 500 ml physiologischer Salzlösung gewaschen. Daraufhin wird das Gemisch zentrifugiert
(5 x 10^ U/min; 10 min), um das Präzipitat zu erhalten.
Das erhaltene Präzipitat wird mit einer 500 ml-Portion physiologischer Salzlösung, einer 300 ml-Portion
Ethanol und einer 300 ml-Portion Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen, wobei die Entfernung der Waschflüssigkeiten
durch Zentrifugieren (5 χ 10 U/min; 10 min) erfolgt. Nachfolgend wird getrocknet, um getrocknete
Organismen zu erhalten. Die so erhaltenen Organismen werden pulverisiert, um ein Pulver derselben
zu erhalten. Dieses Pulver wird mit 160 ml Dimethylsulfoxid
versetzt und das resultierende Gemisch anschließend der Extraktion unter Rühren bei 63 bis 65°C
während 4 h unterworfen. Anschließend wird das Gemisch unter Absaugen filtriert, um ein Filtrat zu erhalten.
Dem Filtrat werden 1,2 1 Aceton und 4,2 ml konz.Chlorwasserstoff
säure zugesetzt, woraufhin das resultierende Gemisch 24 h bei 40C stehengelassen wird, um das Präzipitat
abzusetzen und zu altern. Dieses Präzipitat wird abzentrifugiert (5 x 10^ U/min; 10 min), um das Präzipitat
zu sammeln (246 mg).
(2) Den 246 mg des so erhaltenen Präzipitats werden 5 ml Wasser zugesetzt, und das resultierende Gemisch
wird mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7,8
eingestellt. Dem Gemisch werden 5 mg Pronase E (1 000 000 Tyrosin-Einheiten/g) zugesetzt und das Gemisch
wird der Enzymbehandlung bei 370C während 30 min
- 26 -
unterworfen. Daraufhin wird dem Gemisch 1N wäßrige
Natriumhydroxidlösung zugesetzt, um den pH auf 7,8 einzustellen. Dann werden wiederum 5 mg Pronase E und
einige Tropfen Toluol zugegeben. Das resultierende Gemisch wird der Enzymbehandlung bei 37°C während 24 h
unterworfen. Dem behandelten Gemisch wird 1N Chlorwasserstoff
säure zugesetzt, um den pH auf 1,0 einzustellen, und das resultierende Gemisch wird 2 h stehengelassen
und nachfolgend zentrifugiert (5 x 1Cr U/min; 10 min), um die überstehende Flüssigkeit zu erhalten.
Der erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit wird Ethanol zugesetzt zur Schaffung einer Ethanolkonzentration von
80 Vol-%. Das resultierende Gemisch wird 2 h stehengelassen
und zentrifugiert (5 x 1CK U/min; 10 min), um
das abgesetzte Präzipitat zu sammeln (98 mg).
(3) Den 98 mg des auf diese Weise erhaltenen Präzipitats werden 20 ml Wasser zugesetzt, und das resultierende
Gemisch wird mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7 eingestellt. Anschließend wird das resultierende
Gemisch auf 5 ml durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-5.0
konzentriert. Der erhaltenen, konzentrierten Lösung werden 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die so verdünnte
Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran
UK-50. Der erhaltenen, konzentrierten Lösung werden wiederum 45 ml Wasser zugesetzt und die so verdünnte
Lösung wird wiederum auf 5 ml konzentriert durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations
Membran UK-50. Das erhaltene Konzentrat wird durch ein Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,2 /um
(Toyo Roshi Kabushiki Kaisha TM-4) filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 83 mg der gefriergetrockneten,
carcinostatischen Substanz TF-500.
Die so erhaltene, careinostatische Substanz TF-500 hat
die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig. δ sowie das Ultraviolett-Absorptionsspektrum
gemäß Fig. 9.
Präparat 1
Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der in Beispiel 1 erhaltenen, carcinostatischen Substanz
TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat
der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar als 0,5 mg-Einheit oder 1 mg-Einheit. Vor Gebrauch wird ·
das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 0,5%igen
wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die resultierende
Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.
Präparat 2
Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt
der in Beispiel 2 erhaltenen, carcinostatischen Substanz TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet,
wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar
als 0,5 mg-Einheit oder 1 mg-Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen
Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 0,5%igen
wäßrigen Glucoselösung oder dergl.aufgelöst. Die resultierende
Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.
Präparat 5
■Μ-
Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der in Beispiel 3 erhaltenen, carcinostatischen Substanz
TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet,
wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar
als 0,5 mg-Einheit oder 1 mg-Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen
Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 0,5%igen
wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die resultierende Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.
Präparat 4
Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der in Beispiel 4 erhaltenen, carcinostatischen Substanz
TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat
der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar als 0,5 mg-Einheit oder 1 mg-Einheit. Vor Gebrauch wird
das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,59&Lgen Lidocainlösung, einer 0,5%igen
wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die resultierende Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.
Leerseite
Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung einer carcinostatischen
Substanz TF-5OO mit den folgenden Eigenschaften
oder eines Salzes derselben, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gattung Fusοbacterium gehörende Organismen
einer Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid
unterwirft und die Substanz aus dem Extrakt isoliert:
(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) die Substanz hat eine carcinostatische und immunostimulierende Aktivität;
(c) die Substanz ist löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Benzol, Chloroform,
Ethylacetat und Diethylether;
(d) die Substanz hat keinen klaren Schmelzpunkt und beginnt sich bei etwa 1800C zu zersetzen und zersetzt
sich bemerkenswert oberhalb 1950C;
(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten nach dem KBr-Verfahren, weist Absorptionsbanden auf
in der Nähe von 3500-3200, 2920, 2850, 1660-1600,
1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000, 970 und 840-800 cm"1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum ihrer
wäßrigen Lösung bei einem pH von 7,0 zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und zeigt ein Absorptionsmaximum
in der Nähe von 246-280 nm;
(g) die Substanz verhält sich positiv bei der Molisch-Reaktion, bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion,
bei der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, bei der Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und der Lowry-Folin-Reaktion,
jedoch negativ bei der Ninhydrin-Reaktion;
(h) Elementaranalysen-Werte: C 38-47% H 5-7% N 1-4%;
.a·
(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach einem
Phenol-Schwefelsäure-Verfahren, beträgt etwa 12 bis 30 Gew.%,ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt
der Substanz, bestimmt nach dem Lowry-Folin-Verfahren beträgt etwa 10 Gew.% oder weniger, ausgedrückt
als Rinderserumalbumin.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gattung Fusobacterium gehörende Organismen der
Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoyid unterworfen werden, ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel
dem resultierenden Extrakt zugesetzt wird, das erhalten Präzipitat einer Deproteinisierungsbehandlung
und nachfolgend einer Ultrafiltrationsbehandlung unterworfen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Dialkylsulfoxid Dimethylsulfoxid ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3>
dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile, organische Lösungsmittel Aceton ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Deproteinisierungsbehandlung
eine Enzymbehandlung mit einem proteoIytisehen
Enzym ist.
.6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das proteolytisehe Enzym eine Pronase ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Gattung Fusobacterium gehörenden Organismen
der Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid unterworfen werden, dem resultierenden Extrakt ein hydro-
philes, organisches Lösungsmittel zugesetzt wird und das erhaltene Präzipitat ultrafiltriert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Dialkylsulfoxid Dirnethylsulfoxid ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile, organische Lösungsmittel
Aceton ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die Ultrafiltrationsbehandlung durchgeführt wird mit einem Ultrafilter mit einem nominellen
Molekulargewichtsabbruch von 50 000 bis 200 000.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zur Gattung
Fusobacterium gehörenden Organismen um Fusobacterium nucleatum handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu Fusobacterium nucleatum gehörende Organismen
der Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid unterwirft; ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel unter
sauren Bedingungen zu dem resultierenden Extrakt in einer Menge von mehr als dem 5fachen des Extrakts (Vol./
Vol.) gibt; das gebildete Präzipitat der Deproteinisierungsbehandlung
mit einer Pronase unterwirft; der behandelten Flüssigkeit einen Alkohol zusetzt unter Schaffung
einer Alkoholkonzentration von 30 bis 80 Vo 1-96; das gebildete
Präzipitat isoliert und der Ultrafiltration unterwirft und nachfolgend durch ein Membranfilter filtriert;
und daraufhin eine Gefriertrocknung des Filtrats durchführt, um die carcinostatische Substanz zu erhalten.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57142439A JPS5931715A (ja) | 1982-08-17 | 1982-08-17 | 制癌性物質tf−500の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3329255A1 true DE3329255A1 (de) | 1984-02-23 |
DE3329255C2 DE3329255C2 (de) | 1985-06-05 |
Family
ID=15315335
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3329255A Expired DE3329255C2 (de) | 1982-08-17 | 1983-08-12 | Verfahren zur Herstellung der Substanz TF-500 mit carcinostatischen und immunostimulierenden Eigenschaften |
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US (1) | US4547462A (de) |
JP (1) | JPS5931715A (de) |
KR (1) | KR860001213B1 (de) |
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ES (1) | ES524977A0 (de) |
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GB (1) | GB2126893B (de) |
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