DE3301997A1 - Verfahren zur herstellung von disaccharid-tripeptiden und disaccharid-tetrapeptiden - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Disaccharid-Tripeptiden und Disaccharid-Tetrapeptiden mit immunstimulierender Wirkung und die nichtspezifische Resistenz gegen bakterielle Infektionen verstärkender Wirkung.
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Peptidoglycane, die Strukturkomponenten der Zellwand von Bakterien darstellen, weisen eine immunstimulierende Wirkung auf; vgl. Experientia Bd. 32 (1976), S. 677-683. Deshalb wurden bereits zahlreiche Versuche unternommen, wasserlösliche Peptidoglycane mit immunstimulierender Wirkung aus dem Bakterienzellwand-Verdauungsprodukt von Xyseenzymen zu gewinnen. Die in solchen Verfahren erhaltenen wasserlöslichen Peptidoglycane stellen aber gewöhnlich ein Gemisch aus verschiedenen Peptidoglycanen mit unterschiedlichem Molekulargewicht dar und haben deshalb unterschiedliche Zusammensetzung und zeigen einen unterschiedlichen Grad an Aktivität in jeder zubereiteten Charge.

In der ÜS-PS 4- 186 W sind Verbindungen der nachstehenden Formeln beschrieben

N-AcGlc-N-Acyl-Mur N-AcGlc-N-Acyl-Mur

I !

L-AIa L-AIa

ι I

30 D-GIu D-GIu

I oder I

meso-DAP meso-DAP

I
D-AIa

in der N-AcGIc die N-Acetylglucosaminylgruppe, N-Acyl-Mur die N-Acylmuramylgruppe, L-AIa die L-Alanylgruppe, D-GIu die D-Glutamylgruppe, meso-DAP die Meso^je-diaminopimelylgruppe oder den Meso-2,6-diaminopimelinsäurerest und D-AIa die D-Alaningruppe bedeuten, mit der Maßgabe, daß die Carboxylgruppe in der D-Glutaminsäure und/oder dem Meso-2,6-diaminopimelinsäurerest entweder in freiem oder amidiertem Zustand vorliegen kann. Die Verbindungen der vorstehenden Formeln sind zusammen mit anderen Peptidoglycanen mit niedrigem Molekulargewicht beschrieben, wobei festgestellt wird, daß die betreffende Verbindung der vorstehenden Formeln als einzelne Verbindung, d.h. nicht als Gemisch davon, erhalten wird und daß sie immunostimulierende Wirkung aufweist.

Bei dem in der US-PS beschriebenen Verfahren wird ein Lyseenzym zur Hydrolyse der Zellwand von Mycobacteria, Nocardiae oder Escherichia coli verwendet. Dabei wird aber nur eine Verbindung der vorstehenden Formeln erhalten^ / Acyl die Glycolyl— gruppe bedeutet und die Carboxylgruppe des Glutamyl- und Meso-2,6-diaminopimelylrestes amidiert ist. Dies gelang durch Hydrolyse von delipidierten Zellwänden durch katalytische Einwirkung von Lysozym und Muramyl—L-alanin-amidase von Myxobacter AL^. Es werden drei Fraktionen von Peptidoglycanen erhalten, von denen die Fraktion mit dem niedrig- sten Molekulargewicht der preparativen Elektrophorese unterzogen wird. Auch in einem Beispiel, in dem aus der Zellwand von E. coli gewonnene unlösliche Peptidoglycane mit Lysozym hydrolysiert werden, umfaßt die Fraktion mit dem niedrigsten Molekulargewicht der drei Peptidoglycan-Fraktionen ein Gemisch von Disaccharid-Tetrapeptiden und Disaccharid-Tripeptiden. Die Verbindungen konnten somit bisher nicht isoliert, d.h. als einzelne Verbindungen erhalten werden.

Streptomyces sp. L-3 kann das Enzym D-Alanyl-meso-2,6-di— aminopimelinsäure-endopeptidase (nachstehend als "Endopeptidase" bezeichnet) erzeugen, welches spezifisch die

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_Λ A m · ' · Ι»ΑΛ·

D-Alanyl-meso-2,6~diaminopimelinsäure-Bindungen zwischen Peptid-Untereinheiten in den Peptidoglycanen der Bakterienzellwand spaltet; vgl. Biken Journal, Bd. 19, (1976), S. 75-91'. Im nachstehenden Bezugsbeispiel 1 wird jedoch gezeigt, daß dieser Stamm eine extrem niedrige Endopeptidase-Produktivität besitzt und Endopeptidase nicht in einer für den praktischen Gebrauch erforderlichen Menge erzeugen kann.

In Agr. Bioi. Chem., Bd. 39 0975), S. 1533-154-3 wird die Gewinnung einer als M-1 Enzym bezeichneten Endo-N-acetylmuramidase aus Mutanolysin beschrieben, welches aus der Kulturbrühe von Sfrreptomyces globisporus B-1829 partiell gereinigt wird. Dieses Enzym hydrolysiert die Glycosid-Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglucosamin, wobei Fragmente mit N-Acetylmuraminsäureresten am reduzierenden Ende freigesetzt werden.

Im Rahmen umfangreicher Untersuchungen nach einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von Endopeptidase in ausreichender Menge für einen praktischen Gebrauch als Lyseenzym wurde gefunden, daß der erwähnte Stamm Streptomyces sp. L-3 in einen Stamm Streptomyces nitrosporeus SK transformiert werden kann, der eine hervorragende Produktivität der gewünschten Endopeptidase aufweist. Ferner wurde gefunden, daß eine neue Endopeptidase mit hoher Aktivität aus einer Kulturbrühe von Streptomyces globisporus in hoher Ausbeute erhalten werden kann. Schließlich wurde auch festgestellt, daß bei der Verwendung sowohl von Endopeptidase aus der Mutante Streptomyces nitrosporeus SK oder Streptomyces filobisporus als auch von Endo-N-acetylmuramidase aus Streptomyces p;lobisporus zur Hydrolyse bestimmter Bakterienzellwände Disaccharid-Tripeptide und Disaccharid-Tetrapeptide inform von diskreten, einzelnen Verbindungen, d.h.

nicht als Gemische davon, erhalten werden können. 35

L J

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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Disaccharid-Tripeptiden und Disaccharid-Tetrapeptiden mit immunstimulierender Aktivität und die nichtspezifische Resistenz gegen bakterielle Infektionen verstärkender Aktivität in Form von einzelnen Verbindungen zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch den überraschenden Befund gelöst, daß die genannten Stoffe als diskrete, einzelne Verbindungen erhalten werden können, wenn man eine Endopeptidase und Endo-N-acetylmuramidase, die von bestimmten Mikroorganismen gewonnen wurden, zur Hydrolyse der Bakterienzellwände einsetzt.

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Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von Disacchardid-Tripeptiden und Disaccharid-Tetrapeptiden der allgemeinen Formel I

20 25 30 35

CH₂OH

CH₀OR,

H₀NCH (CH₀) -,CHCOR₀

NHCOCH-

OH.H

(D

in der R_-* ein Wasserst off atom oder eine,Acetylgruppe und R^ eine Hydroxylgruppe oder den Rest -NH^HCOOH darstellen und die Symbole (D) und (L) die Konfi- ^CH3 guration bezeichnen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Zellwände von Bakterien, die eine Muraminsäure-Einheit mit acetylierter Aminogruppe, Isoglutamin und Meso-2,6-diaminopimelinsäure mit einer amidierten Carboxylgruppe als Bestaridteile von Zellwand-Peptidoglycan enthalten, mit einer Endp-N-acetylmuramidase aus Streptomyces Klobisporus und einer D-Alanyl-meso-2,6-diaminopimelinsäure-endopeptidase aus Streptomyces nitrosporeus SK (FERM BP-216) oder Streptomyces p-loMsporus hydrolysiert und, falls ein Produkt der allgemeinen Formel I erhalten wird, in der R,, eine Acetylgruppe darstellt, dieses Produkt gegebenenfalls hy-

¹⁵ drolysiert.

Im Verfahren der Erfindung werden die wasserlöslichen Peptidoglycane der Formel I erhalten, die hohe physiologische Aktivitäten mit geringer Toxizität verbinden. Das Produkt wird in Form von einzelnen Verbindungen in höher Ausbeute erhalten; ihre . chemische Struktur ist bestimmt.

Unter die Formel I fallen die Verbindungen: ß-N-Acetyl- glucosaminyl-(1—l· 4) -N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-meso-2,6-diaminopimelinsäure-(D)-amid (nachstehend als "GMP-,-A" bezeichnet), ß-N-Acetylglucosaminyl-O—4 4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-meso-2,6-diaminopimelinsäüre-(D)-amid-(L)-D-alanin (nachstehend als "GMP^-A" bezeichnet), ß-N-Acetylglucosaminyl-ii—r 4)-N,6-0-diacetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-mes0-2,6-diaminopimelinsäure-(D)-amid (nachstehend als "GMP^-B" bezeichnet) und ß-N-Acetylglucosaminyl-(1—> 4)-N,6-0-diacetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-meso-2,6-diaminopimelinsäure-(D)-

amid-(L)-D-alanin (nachstehend als "GMP^-B" bezeichnet). 35 ^

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Spezielle Beispiele für Bakterien, die sich als Ausgangsmaterial für die Zellwände eignen, sind Lactobacillus plantarum und Corynebacterium diphtheriae. Dabei ist das erstgenannte Bakterium im Hinblick auf fehlende pathogene Eigenschaften bevorzugt. Gegen Arzneimittel resistente Mutanten oder Mutanten dieser Bakterien, denen bestimmte Strukturen fehlen, können von den Elternstämmen unter Verwendung von Mutagen abgeleitet werden, um den Gehalt an Peptidoglycanen in der Zellwand zu erhöhen. Die Ausgangszellwände können durch Kultur dieser Bakterien in üblicher Weise, Abtrennen der Zellen von der Kulturbrühe, mechanisches Aufbrechen der Zellen, Differentialzentrifugieren der aufgebrochenen Zellen, Behandeln der erhaltenen rohen Zellwände mit einer Kochsalzlösung hoher Konzentration zur Entfernung der intrazellulären Proteine und Behandeln der Zellwände mit Trypsin zur Entfernung anderer Proteine gewonnen werden. Die so erhaltenen Zellwände können ferner mit einer 0,05 bis 0,5 N, vorzugsweise 0,1 bis 0,2 N wäßrigen Alkalilösung zur Herstellung alkalisch behandelter Zellwände behandelt werden, die ebenso als Ausgangs-Zeilwände eingesetzt werden können. Die alkalibehandelten Zellwände können in einer anderen Ausführungsform auch dadurch hergestellt werden, daß zunächst die ganzen Zellen mit einer 0,05 bis 0,5 N, vorzugsweise . 0,1 bis 0,2 N wäßrigen Alkalilösung behandelt und dann die ganzen Zellen dem vorstehend beschriebenen Verfahren unterzogen werden. Die Behandlung mit der wäßrigen Alkalilösung wird gewöhnlich bei Raumtemperatur 30 Minuten bis 4 Stunden durchgeführt. Beispiele für geeignete alkalische Verbindungen sind Alkalimetallhydroxide, wie Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, und Alkalimetallcarbonate, wie Natriumcarbonat oder Kaliumcarbonat.

Die derart erhaltenen Zellwände werden mit zwei Enzymen behandelt, nämlich Endo-N-acetylmuramidase und Endopeptidase. Dabei werden die Zellwände lysiert. In diesem Fall ist es bevorzugt, zunächst die Behandlung mit der Endo-N-

L J

acetylmuramidase und dann die Behandlung mit der Endopepti— dase oder eine gleichzeitige Behandlung mit beiden Enzymen durchzuführen. Um unerwünschte Spaltungen des Produktes zu vermeiden, sollen die Enzyme soweit wie möglich gereinigt

5 sein.

Die Endo-N-äcetylmuramidase ist vorzugsweise ein von Streptomyces ^lobisporus B-1829 erzeugtes Enzym, das nachstehend als "I^-Acetylmuramidase^ezeichnet wird. Der Stamm Strepto myces Klobisporus Β-Ί829 ist bei The Fermentation Research Institute, Agency of Industrieal Science and Technology, Japan, unter der Nr. FERM-P 596 und bei The American Type Culture Collection, USA unter der Nr. ATCC 21553 hinterlegt. Die morphologischen, kultur- und physiologischen Eigenschaften und das Kulturverfahren dieses Stammes sowie das Verfahren zur Reinigung des Enzyms aus der Kulturbrühe sind in der US-PS 3 929 579 sowie in Agr. Bio!-. Chem., Bd. 39 (1975), S. 1533-154-3 beschrieben.

Die Endopeptidase ist ein von Streptomyces nitrosporeus SK oder Streptomyces globisporus B-1829 erzeugtes Enzym. Der Stamm Streptomyces nitrosporeus SK ist eine Mutante mit hoher Endopeptidase-Produktivität, die von dem in Biken Journal, Bd. 19 (1976), S. 75-91 beschriebenen Stamm Streptomyc.es sp, L-3 abgeleitet ist. Der Stamm ist bei The Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Nr. FERM BP-216 hinterlegt. Das Ableitungs- (Mutations-) Verfahren, das Kultivierungsverfahren und die morphologischen, kultur- und physiologischen Eigenschaften des Stamms und das Verfahren zur Reinigung der Endopeptidase (nachstehend als "SK-Endopeptidase" bezeichnet) aus der Kulturbrühe sind im nachstehenden Bezugsbeispiel beschrieben. Die Isolierung und Reinigung der Endopeptidase aus Streptomyces globisporus B-1829 (diese Endopeptidase wird nachstehend als "AM^-Endopeptidase" bezeichnet) wird durch Kultivieren des Stammes und Gewinnung

L J

eines Rohenzyms aus der Kulturbrühe in der in der US-PS 5 929 579 beschriebenen Weise durchgeführt. Das Rohenzym wird dann in der im nachstehenden Bezugsbeispiel beschriebenen Art gereinigt. ΑΜ-,-Endopeptidase unterscheidet sich in den physikochemischen Eigenschaften deutlich von SK-Endopeptidase und zeigt ferner eine andere Substratsspezifität als von Streptomyces albus G erzeugte DD-Carboxypeptidase; vgl. Biochemistry Bd. 9 (1970), S. 2955, 2961. Dieses Enzym ist somit eine neue Endopeptidase.

.

Die Lysebehandlung der als Ausgangsmaterial verwendeten Zellwände mit den zwei Enzymen wird gewöhnlich in einer Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,5 in. Gegenwart eines Konservierungsmittels, wie Chloroform oder Natriumnitrit bei etwa 37°C durchgeführt. Im Fall der Anwendung von Endo-N-acetylmuramidase ist die Lysereaktion beendet, wenn die Menge an freigesetzten reduzierenden Zuckern einen konstanten Viert erreicht. Im Fall der Anwendung von Endopeptidase ist die Umsetzung beendet, wenn die Menge an freigesetzten freien Aminogruppen einen konstanten Wert erreicht. Die Umsetzungsdauer ändert sich in Abhängigkeit von den Enzymen, den Mengen und Eigenschaften der Zellwände. Im allgemeinen liegt sie im Bereich von 8 bis 60 Stunden, vorzugsweise 24- bis 48 Stunden. Die Endopeptidase kann nach einem bekannten Verfahren (beispielsweise Ichiro Chibata (Herausg») "Immobilized Enzyme", Kodansha, Tokyo, 1975) zur kontinuierlichen Verwendung immobilisiert werden. Beispielsweise kann das Enzym durch ionische Bindung an CM-Sephadex C-25.(Na Form, hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) oder durch Diazokupplungsreaktion an diazotierte p-Aminobenzylcellulose immobilisiert werden.

Die Abtrennung des gewünschten Produkts vom Reaktionsgemisch kann durch Ionenaustauschchromatographie, Säulenchromatographie mit Kieselgel, Gelfiltration oder ähnliche Verfahren, die üblicherweise verwendet werden, in Kombination

L j

von zwei oder mehreren davon durchgeführt werden. Wenn die als Ausgangsstoff eingesetzten Zellwände von Lactobacillus plantarum stammen, die nicht mit Alkali behandelt werden, werden GICP₅-A, GMP^-A, GMP₅-B und GMP^-B erhalten. Wenn es sich bei den Ausgangs-Zellwänden um alkalibehandelte Zellwände handelt, werden GMP₅-A und GMP^-A erhalten. GMP₅-B und GMP^-B können durch Hydrolyse unter sauren Bedingungen quantitativ in GMP₅-A und GMP^-A umgewandelt werden. Die Hydrolyse kann in 0,05 bis 0,5 N, vorzugsweise 0,1 bis 0,2K wäßrige Lösung einer Mineralsäure, wie Salzsäure, bei einer Temperatur von 40 bis 80 C, vorzugsweise von etwa 60 C, 2 bis 9, vorzugsweise 5 bis 7 Stunden durchgeführt werden.

Die Verbindungen der Formel I können durch Behandlung mit einer anorganischen Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid, einer organischen Base, wie Isopropylamin oder Diäthylamin, einer anorganichen Säure, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, oder einer organischen Säure, wie Methansulfonsäure, in üblicher Weise in Salze umgewandelt werden.

Die Verbindungen der Formel I und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze weisen ausgezeichnete pharmakologische Aktivitäten auf, wie immunstimulierende Wirkung und poten-

²⁵ tierende Wirkung auf die nichtspezifische Resistenz gegen

bakterielle Infektionen. Die Verbindungen sind deshalb wertvolle Arzneistoffe zur Verhütung und Behandlung verschiedener durch Mikroorganismen verursachter Infektionen und zur Behandlung von Krebserkrankungen bei Säugetieren einschließ-

³⁰ lieh des Menschen.

Die Verbindungen der Formel I und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze können auf oralem, parenteralem oder intrarektalem Weg in Form von herkömmlichen Zubereitungen im Gemisch mit üblichen Träger- oder Verdünnungsstoffen, vorzugsweise auf parenteralem Weg in Form einer wäßrigen Lösung

L-- -J

verabreicht werden. Die Dosierung der Verbindungen hängt von der Art der Verbindungen, dem Weg der Verabreichung, der Schwere der Erkrankung und dem Alter des Patienten ab. Sie liegt gewöhnlich im Bereich von 0,001 bis 50 mg/kg/Täg* Die Verbindungen können zusammen mit anderen antimikrobiellen Mitteln, Antibiotika oder Krebsmitteln gegeben werden.

Die pharmakologischen Wirkungen von GMP^-A, GMP^-A, GMP^-B

und GMP^-B werden folgendermaßen getestet. 10

' Test 1, Immunstimulierende Wirkung (Immunoadjivans-Aktivität) Die sensibilisierten Tiere werden folgendermaßen hergerichtet. Gruppen von 5 weiblichen Meerschweinchen (Stamm Hartley) mit einem Gewicht von 200 bis 300 g wird in die linke Hinterpfote 0,2 ml einer Wasser-in-öl-Emulsion mit einem Gehalt von 1 mg kristallines Ovalbumin als Antigen und 100 /ig der zu prüfenden Verbindung injiziert. Die Wasser-in-Öl-Emulsion besteht aus Drakeol 6VR (Pennsylvania Refining Co., USA), Arlacel A (Atlas Chemical Industries Inc., USA) und 1/75 M phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung vom pH-Wert 7»0 in einem Volumenverhältnis von 4:1:5· Vergleichs-Meerschweinchen wird eine Wasser-in-öl-Emulsion ähnlicher Zusammensetzung injiziert, die das Antigen, nicht aber die zu prüfende Verbindung enthält (Freund¹s unvollständiges

²⁵ Adj-uvans ).

Cornea-Antwort

Zur Prüfung auf die Induktion einer Spätreaktion gegen Ovalbumin, d.h. auf die Erhöhung der zellgebundenen Immunität 2 Wochen nach der Sensibilisierung wird den Meerschweinchen eine intracorneale Injektion einer Ovalbumin-Lösung (20 mg/ml Kochsalzlösung) gegeben, wodurch vorübergehend ein trüber Fleck von etwa 5 mm im Durchmesser erzeugt wird. Die Augen werden nach 4-8 Stunden geprüft. Größe und Ausmaß der Trübung der Cornea wird festgehalten. Die Reaktionen werden in eine Bewertung von 3.,0 für eine

L J

starke Reaktion, bei der die gesamte Cornea verdickt, trüb und grau-weiß ist, bis 1,0 eingeteilt, wenn eine leichte Trübung beobachtet wird. Wenn keine sichtbare Veränderung im Vergleich mit dem ungespritzten Auge zu entdecken ist, wird der Reaktion die Bewertung 0 gegeben.

Hautreaktion

Zur Prüfung auf die Induktion einer Spätreaktion gegen

Ovalbumin 3 Wochen nach der Sensibilisierung wird den Meer-

10 schweinchen eine intradermale Injektion einer

Ovalbumin-Lösung (0,1 mg/0,1 ml Kochsalzlösung) in eine hintere Pfote gegeben, von der die Haare entfernt wurden. Die Größe der Verhärtung wird nach 48 Stunden gemessen. Das Ausmaß der Verhärtung wird nach der in Biken Journal, Bd. 20

(1977), S. 95-103 beschriebenen Formel berechnet.

Erzeugung von humoralen Antikörpern

Zur Prüfung auf die Erhöhung der Erzeugung humoraler Antikörper wird den Meerschweinchen 4- Wochen nach der Sensibi-2° lisierung durch Herzpunktur Blut abgenommen. Die Menge des Antiovalbumin-Antikörper-Stickstoffs wird quantitativ unter Verwendung von spektrophotometrischen Verfahren gemessen.

Die Ergebnisse der vorstehend erläuterten Tests sind in Tabelle I zusammengefaßt.

L J

1 Tabelle I

Immunstimulierende Aktivität

5	Come a-Antwort	GMP2-A D	GMP^-A	GMP2-B 0	GMP^-B	FIA+
	Hautreaktion	2,2	2,0	2,4	2,2	O
	Antikörper-Stickstoff Oug/ml)	2,5	3,7	3,5	3,7	1,1
10	55O±5O	399±9O	25C^	216±57	26±9

Freund¹s unvollständiges Adjuvans

Test 2 Erhöhung der nichtspezifischen Resistenz gegen bakterielle Infektionen

Es werden männliche Mäuse vom Stamm Std-ddY mit einem Gewicht von etwa 23 g verwendet. Die zu prüfenden Verbindungen werden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und den Tieren 72, 48 und 2Pr Stunden vor der intraperitonealen Infizierung mit Pseudomonas aeruginosa Nr. 12 (inokulierte Menge: 2 χ 10 Zellen/Maus) intravenös verabreicht. ¹J? Tage nach der Infizierung wird die Anzahl der überlebenden Tiere festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.

L J

Tabelle II

Erhöhung der unspezifischen Resistenz gegen bakterielle Infektionen·

5	Dosis (mg/kg)	Anzahl der überlebenden/Gesamtzahl der Versuchs tiere - -··■■«	GMP4-A	GMP3-B	GMP4-B
	12,5	GMP3-A	16/16	16/16	16/16
	3,1	16/16	7/16	12/16	10/16
10	0,8 ■ ■	14/16	7/16	10/16	9/16
	0,2	10/16	4/16	9/16	6/16
	0,05 0,0125	8/16	6/16 6/16	7/16 5/16	4/16 ί 4/16
15	0,0031	9/16 · 9/16		-	-
	7/16

Bemerkung: Vergleichsgruppe, der nur physiologische Kochsalzlösung verabreicht wird: 0/16 - nicht geprüft

25

Die Erfindung wird anhand der folgenden Bezugsbeispiele und Beispiele näher erläutert, wobei die Bezeichnung "%" Gewichtsprozent bedeutet soweit nichts anderes angegeben ist.

30 35

Bezugsbeispiel 1

~~ des Stammes

Ableitung / Streptomycee nitrosporeus SK von Streptomyces sp. L-3:

Eija von Kotani und Mitarb, (vgl. Biken Journal, Bd. $ (196O)₁ S. 139)aus einer Bodenprobe in Kashiwara, Nara, Japan gewonnener Elternstamm Streptomyces sp. L-3 wird 15 mal einer wiederholten Subkultur auf einem Schrägraedium (pH 7*4·) unterzogen, das Λ% lösliche Stärke, 0,2# Hefeextrakt, 0

Zellwände von Lactobacillus plantarum ATCC 801 4- und 2$ Agar enthält. Dadurch wird der Elternstamm an das Medium ange-· paßt.

Der so behandelte Elternstamm wird dann 7 Tage bei 30°C auf dem genannten Medium kultiviert, um ausreichend Sporen zu bilden. Die Sporen werden mit 5*0 ml keimfreier physiologischer Kochsalzlösung entnommen. 0,5 ml des Gemisches mit der Kochsalzlösung werden auf das vorstehend genannte Medium in einer Petri-Schale gestrichen und 4- Tage bei 30 C kultiviert. Die erhaltenen Kolonien, die von großen lysierten Zonen umgeben sind, werden gesammelt und dann auf das vorstehend genannte Schrägmedium transferiert. Dieses Verfahren wird 15 mal wiederholt. Ein Stamm, der ausgezeichnete Produktivität von Endopeptidase aufweist, wird ausgewählt. Der durch die vorstehend beschriebene Monozellkultur erhaltene Stamm wird auf das genannte Schrägmedium gegeben und kultiviert, bis Sporen genügend wachsen. Die Sporen werden mit 5,0 ml sterilisierte physiologische Kochsalzlösung entnoramen, zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann auf eine Petri-Schale transferiert, die 10 Minuten aus einer Entfernung von 15 cm mit einem 15 W Toshiba UV-Sterilisator mit UV-Licht bestrahlt /0,£ ^ml der erhaltenen bestrahlten Lösung werden in einer Petri-Schale auf das vorstehend genannte Medium gebracht und in gleicher Weise kultiviert. Dabei wird ein Stamm mit einer größeren lysierten Zone im Verhältnis zur Größe der Kolonie erhalten. Dieses Verfahren wird 5 ^ma-l wiederholt, wobei schließlich der gewünschte Stamm SK erhalten wird. 30

Die morphologischen, Kultur- und physiologischen Eigenschaften des neuen Stamms SK, der durch die vorstehend beschriebene Mutation erhalten wird, sind in Tabellen III bis

VI zusammengefaßt. 35

L J

1 . Tabelle III

. Morphologische Eigenschaften

5 Form der sporentragenden Hyphen einfach verzweigt

Oberfläche der Sporenkette glatt

Zahl der Sporen 10 bis

Sporen mit Flagellen, Sporangium nein

L . J

ω
ο

ro ο

cn

cn

Tabelle IV Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien

Medium

Wachstum

_

dürftig

gerunzelt

Farbe

Luftmycel

keine

Form

Farbe

Lösliches

sehr wenig

I

Vegetation Gestalt

ausbreitend

mäßig

ausbreitend erhaben

mm

Vegetation

Pigment

keines

ι , t C £

Hefeextrakt- Malz extrakt -Agar

gut

ausbreitend

mäßig

ausbreitend

hellgelb grün

dick

—

graustichig braun sehr wenig

keines ;■

< ( I %

Hafermehl-Agar .

gut

erhaben

mäßig

spiralig, am Boden wachsend

oliv braun

reichlich

—

grau

keines t

< . ν I

Anorganische Salze- Stärke- Agar

gut

erhaben

mäßig

hell gelb

reichlich

pulvrig

grau

hell gelblich- , braun (Spur) :,

4 t * t C * * *

Glycerin-Asparagin- Agar

mäßig

hell gelb

-

hell grau braun

keines

< * *, * * *

Glucose-Asparagin- Agar

mäßig

hell braun

dürftig

baumwoll artig

-

keines

CO CO

Tyrosin-Agar

gut

hell gelb

—

pulvrig

hell grau

keines

019

Saccharose-Nitrat-* Agar

farblos

wenig

—

—

sehr wenig

CD

Pepton-Hefeextrakt- Eisen-Agar

hell gelb

keine

pulvrig

—

dunkelbraun J

Stärke-Hefeextrakt- Agar

mäßig

—

graurot

Glycerin-Calcium- maleat-Agar

hellgelb- wenig lich-braun

—

—

Gelatinestich

—

Γ & 8 S g ■ ■ «π S . cn

Tabelle IV Fortsetzung

Medium	Wachstum	spiralig; am Boden - wachsend ·	Luftffijcel	Farbe	Lösliches	t
	Vegetation Gestalt Farbe	gerunzelt -	Vegetation ' Form	-	Pigment	.ro I
Magermilch	mäßig	flechtenartig -	keine -	— ■ ■	hell gelblich braun
Kitrat-Flüssig medium	mäßig	■" . —	wenig -	—	keines
Löffler's Pferde serum	mäßig	keine	—	dunkelbraun
Ei	mäßig	keine -	dunkelbraun

Bemerkung: Die Beobachtung wird in der in International Streptomyces Project (ISP),

Inter. J. Syst. Bacteriol. Bd. 16 (1966), S. 3>13 beschriebenen Weise durchgeführt,
-, nicht geprüft

GO CO O

Tabelle V Physiologische Eigenschaften

Test Ergebnis

Melanoidpigment-Erzeugung

Gelatineverflüssigung Milchpeptonisierung H-S-Produktion Ca-Maleat-Hydrolyse Nitratreduktion Stärkehydrolyse Kolonie-Rückseite Antibiotika-Erzeugung Endopeptidase-Produktivität Dunkelbraunes Pigment in Gelatinestich", Löffler' s Pferdeserum- und Eimedium, negativ auf den anderen Medien

positiv positiv positiv positiv positiv positiv keine Änderung negativ außerordentlich gut

Γ ■ -

Tabelle VI

Verwertung von Kohlenstoffquellen (Pridham und Gottlieb Agar)

Zucker Wachstum

D-Glucose ++

L-Arabinose ++

D-Xylose ++

Inosit ί

D-Mannit ±

D-Pructose ++

Ir-Rhamnose i

Saccharose -

Raffinose i

Salicin ++

Galactose ++

Cellulose ί

++) gutes Wachstum, ί schlechtes Wachstum

L " ■· J

Die Zellwände der vorstehend erläuterten Mutante enthalten L,L-2,6-Diaminopimelinsäurereste.

Der Vergleich der morphologischen, Kultur- und physiölogi-

BeSchreibung sehen Eigenschaften des Stamms SK mit aer./m Eergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl., der Klassifizierung von ISP und dem Hütter-System der Streptomyces zeigt als verwandte Mikroorganismen Actinomyces atrolivaceus, Streptomyces halstedii und Streptomyces nitrosporeus. Jedoch ist Actinomyces atrolivaceus mit der vorliegenden Mutante nicht identisch, da es eine warzenartige Oberflächenstruktur der Sporen aufweist. Streptomyces halstedii ist ebenfalls mit der vorliegenden Mutante nicht identisch, da es drei bis zehn Sporen hat. Am ähnlichsten mit der vorliegenden Mutante ist Streptomyces nitrosporeus, wobei die beiden Stämme jedoch einen leichten Unterschied zueinander in der VerWer·^ tung von Fructose und Rhamnose aufweisen. Die vorliegende Mutante ist somit ein neuer Stamm von Streptomyces nitrosporeus und wird als Stamm SK bezeichnet. Der Stamm SK unterscheidet sich von dem Elternstamm klar in der Produktivität von Endopeptidase; vgl. nachstehende Tabelle VII.

Tabelle VII

Produktion von Endopeptidase (U/ml) 25

Kulturdauer, Tage	Schüttelkultur	stationäre	0	0	Kultur
1	Stamm SK Elternstamm Stamm SK	0	0	Elternstamm
2	0,9	0	0,1	0
3	2,5	0	0,3	0
5	2,0	0	0,4	0
7	0,5	0	0,6	0,2
9	0,2	0,3
0,1	0,2

L J

1 Bemerkung:

Die Zahlenwerte in der Tabelle bezeichnen die Lyseaktivität der erzeugten Endopeptidase. Die Lyseaktivität wird durch Messung der Geschwindigkeit der Verminderung der Trübe einer Zellwand-Suspension von Lactobacillus plantarum ATCC 8014-bestimmt. Es wird ein Gemisch aus einer geeigneten Menge der Zellwand-Suspension, Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH 8,0, Endkonzentration 0,05 M) und einem Anteil an Enzymlösung in einem Gesamtvolumen von 4,0 ml hergestellt, so daß eine Ab-

10 sorption von 0,5 bei 600 nm erhalten wird. Dieses wird in einem Wasserbad bei 37°C reagieren gelassen. Eine Einheit der Lyseaktivität ist definiert als die Menge des Enzyms, die eine anfängliche lineare Abnahme der Absorption bei 600 nm von 0,001 pro Minute ergibt. Die Einheit der Lyse-

¹⁵ aktivität einer Enzymlösung wird nach folgender Gleichung berechnet:

OD_o-OD_t 1 1

U/ml = ο,ΟΟΙ ^x T" ^x Volumen der Enzymlösung

(ml) 20

Es bedeuten ODq: Die optische Dichte des Reaktionsgemisches

zur Reaktionszeit 0;

OD.: Die optische Dichte nach t Minuten; t: Die Reaktionsdauer (Minute) mit der Maßgabe, daß 0,03 <· = ODq-QD^^0,13

Die beiden von dem Stamm SK und dem Elternstamm erzeugten Endopeptidasen zeigen die gleiche Wirkungsart. Es läßt sich aber nicht bestätigen, ob die beiden Enzyme identisch sind oder nicht, da der Elternstamm eine zu geringe Produktivität für das Enzym hat. Aus dem genannten Grund wird die vom Stamm SK erzeugte Endopeptidase als SK-Endopeptidase bezeichnet und im Rahmen der Erfindung von der vom Elternstamm erzeugten Endopeptidase unterschieden.

L J

Der Stamm SK mit den vorstehend aufgeführten morphologischen, kultur- und physiologischen Eigenschaften wird in einem geeigneten Medium kultiviert. Die Kultivierung kann entweder als Schüttelkultur oder stationäre Kultur durchgeführt werden. Bevorzugt ist die Schüttelkultur bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C, insbesondere bei etwa 30°C, für 1 bis 4 Tage, vorzugsweise 2 bis 3 Tage. Als Nährmedium eignen sich alle üblichen zur Kultivierung von Mikroorganismen der Art Streptomyces verwendeten Medien, beispielsweise ein Medium mit einem pH-Wert von 6 bis 9» vorzugsweise 7 bis 8, das Zucker, wie Glucose, Dextrin, Maltose, lösliche Stärke, Stickstoffquellen, wie entfettetes Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Polypepton, Fleischextrakt oder Mais.quellwasser, anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Zinksulfat,Calciumchlorid, Calciumcarbonat oder Phosphat, Vitamine und weitere übliche Zusätze enthält. Ganze Zellen oder Zellwände bestimmter Mikroorganismen, wie Lactobacillus plantarum oder Corynebac terium diphtheriae können dem Medium gegebenenfalls zur Induktion der Erzeugung von SK-Endopeptidase zugesetzt werden.

Zur Abtrennung der SK-Endopeptidase aus der Kulturbrühe können die Zellen und andere unlösliche Rückstände aus der Kulturbrühe entfernt und die erhaltene Lösung mit einem Kationenaustauscher behandelt, mit Ammoniumsulfat ausgesalzt, und mit CM-Sephadex C-25 (Na⁺-Form) behandelt werden. Diese Verfahren werden in einer Kombination von mindestens zwei von ihnen angewendet.

.Bezugsbeispiel 2

Kultivierung von Streptomyces nitrosporeus SK und Herstellung von SK-Endopeptidase:

Der Stamm SK wird in einer Menge von 2% auf 50 Liter eines Mediums (pH 7,4) überimpft, das 2% Dextrin, 2# entfettetes

L J

Sojabohnenmehl, 0,5$ Hefeextrakt, 0,2$ Natriumchlorid und 0,256 Zellwände von Lactobacillus plantarum ATCC 8014 enthält. Der Stamm wird mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 50 Liter/Minute 3 Tage bei 3O⁰C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 180 U.p.M.. kultiviert. Danach werden 2 kg Filterhilfe zu der Kulturbrühe gegeben und das Gemisch durch eine Filterpresse filtriert. Das Filtrat (50 Liter) wird mit 2,5 kg (in feuchtem Zustand) Amberlite CG-50 (H⁺-Form; hergestellt von Rohm und Haas Co.) versetzt. Das Gemisch wird auf den pH-Wert 5,0 eingestellt und 1 Stunde gerührt .Dann wird das Harz abgetrennt, mit Wasser gewaschen und anschließend mit 10 Liter 0,2 M Kochsalzlösung eluiert. Das Eluat wird auf den pH-Wert 7,5 und auf 80$ Ammoniumsulfatsättigung eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wird in der kleinstmöglichen Menge Wasser gelöst und die Lösung 2 Tage bei 4°C gegen Wasser dialysiert. Sodann wird die Lösung auf eine Säule (5,6 χ 40 cm) mit CM-Sephadex C-25 aufgetragen (Na⁺-Form; hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden), die mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,5 M NaCl eluiert wird. Die mit 0,05 bis 0,1 M NaCl eluierten Fraktionen werden vereinigt, eingeengt, entsalzt und dann lyophilisiert. Es werden 300 SK-Endopeptidase erhalten.

²⁵ Bezugsbeispiel 3

Herstellung von AfU-Endopeptidase

Der Stamm Streptomvces globisporus B-1829 wird in einer Menge von 1% auf 70 Liter eines Mediums (pH 7,5) überimpft, das 2# Dextrin, 0,5$ entfettetes Sogabohnenmehl, 0,2$ PoIypepton, 0,2% Natriumchlorid, 0,156 MgSO₄, 0,5$ Na₂HPO₄ und 0,0256 CaCIg enthält. Das Gemisch wird mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 70 Liter/Minute 3 Tage bei 3O⁰C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 25Ο U.p.M. kultiviert. Danach wird die Kulturbrühe filtriert. Das Filtrat (70 Li-

³⁵ ter) wird mit 6,5 kg Amberlite CG-50 (H⁺-Form) versetzt.

Das erhaltene Gemisch wird 1 Stunde gerührt. Dann wird das

L J

-* 28* -

Harz abgetrennt, mit Wasser gewaschen und hierauf mit 0,2 M

(pH 7/5) P/li

7/5)

₂^eluiert. Das Eluat wird auf 60% Ammoniumsulfatsät-

tigung eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und in einer kleinen Menge entionisiertes Wasser gelost. Die Lösung wird elektrodialytisch 2 bis 5 Stunden entsalzt (Selemion Dialyse-Kabinett Typ DU-Ob, hergestellt von Nippon Rensui Co., Japan). Sodann wird die erhaltene Looting auf eine Säule (5,0 χ 20 cm) mit CM-Sephadex C-25 (Na⁺-Form) aufgebracht, die mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,06 M NaCl eluiert wird. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, konzentriert, einer Gelfiltration durch Sephadex G-25 (hergestellt von Pharmacia, Schweden) unterzogen und dann lyophilisiert. Es werden 800 mg AM-,-Endopeptidase erhalten.

Die Eigenschaften der erhaltenen SK- und AJYL-Endopeptidasen sind in nachstehender Tabelle VIII zusammengefaßt. Das Molekulargewicht der Enzyme wurde nach dem in J. Biol. Chem.', Bd. 24-6 (1971), S. 6328 beschriebenen SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophoreseverfahren geschätzt. Der isoelektrische Punkt wird nach dem in Acta Chem. Scand., Bd. 20 (1966), S. 820 beschriebenen Verfahren bestimmt.

Tabelle VIII Eigenschaften von SK- und ΑΜ-,-Endopeptidase

	SK-Endopeptidase	AJyU-Endop ept idas e
Quelle	Streptomyces	Streptomyces globis-
	nitrosporeus SK	porus B-1829 '
Kulturb e dingung	Belüftung	Belüftung
Induzierung	erforderlich	nicht erforderlich
pH-Stabilität	stabil bei	stabil bei pH 7,0-
	pH 5,0-9,5	9,0, inaktiviert
		unter pH 5,0
günstigster pH-Wert	pH 9,0	pH 8,5
günstigste Temperatur	55-6O0C	55-6O°C
günstigste Pufferkon zentration	0,02 M	0,04- M
Molekulargewicht	1,6 χ 10^	1,3 x 1CT
Isoelektrischer Punkt	pH 8,3	pH 9,0 J

1 Bezugsbeispiel 4-Herstellung von Μ,,-Acetylmuramidase:

Der Stamm Streptomyces globisporus B-1829 wird auf 70- Liter eines Mediums (pH 7,5) kultiviert, das 2# Dextrin, O,5# ent-'fettete© Sojabohnenmehl, 0,2# Polypepton, 0,17$ Natriumchlorid, 0,1# MgSO₄, 0,5# Na₂HPO^ und 0,02# CaCl₂ enthält. Die Kultivierung erfolgt mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 70 Liter/Minute 3 Tage bei 30°C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 250 U.p.M. Danach wird die Kulturbrühe filtriert und die erhaltenen 70 Liter Piltrat werden mit 6,5 kg AmberliteCG-50 (H⁺-Form) versetzt. Das Gemisch wird dann 1 Stunde gerührt und erneut filtriert. Das abgetrennte Harz Wird mit 0,2 M Na₂HPO^ (pH 7,5) eluiert. Das Eluat wird auf 60$ AmmoniumsulfatSättigung eingestellt. Der erhaltene Kiederschlag wird abfiltriert und in einer kleinen Menge entionisiertes Wasser gelöst. Sodann wird die Lösung auf eine mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0) equilibrierte Säule (3,0 χ 70 cm) mit CM-Cellulose (Na⁺-Form; hergestellt von Bio-Rad Laboratories, USA) aufgebracht. Die Eluierung wird

²⁰ stufenweise mit 0,05 M und 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0)

durchgeführt. Die mit 0,1 M Phosphatpuffer eluierte Fraktion wird gegen Wasser dialysiert und auf eine mit 0,05 M Phosphatpuffer equilibrierte Säule (3,0 χ 60 cm) mit CM-Sephadex C-25 (Na^Form) aufgebracht, die dann stufenweise mit 0,05 M und 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert wird. Die mit 0,1 M Phosphatpuffer eluierte "Fraktion wird gegen 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert. Anschließend wird die dialysierte Lösung durch Sephadex G-75 (hergestellt von Pharmacia, Schweden) gelfiltriert. Die erhaltene aktive Fraktion wird entsalzt, konzentriert und dann lyophilisiert. Es werden 1100 mg M^-Acetylmuramidase erhalten.

Bezugsbeispiel 5 Bereitung von Zellwänden: ³⁵ 520 g feuchte ganze Zellen von Lactobacillus plafitarum

ATCC 8014 werden in 4 Liter physiologische Kochsalzlösung

suspendiert und mit einer DYNO-Laboratory Mühle (hergestellt von Shinmaru Enterprices Corporation, Japan) aufgebrochen. Das Gemisch wird dann 10 Minuten zur Entfernung nichtaufgebrochener Zellen zentrifugiert (800 χ g). Der Überstand wird mit Natriumchlorid in einer Konzentration von 1 M versetzt. Sodann werden die Zellwände durch 30 Minuten Zentrifugieren (9000 χ g) geerntet, mit einer großen Menge entionisiertes VJasser gewaschen und durch Zentrifugieren gesammelt. Diese Behandlung wird dreimal wiederholt. Die gewaschenen Zellwände werden hierauf in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, mit 4,2 g Trypsin versetzt und 6 Stunden bei 37°C stehengelassen. Danach wird das Reaktionsgemisch abgekühlt und zur Entfernung unlöslicher Rückstände 15 Minuten zentrifugiert (800 χ g). Danach wird der Überstand zur Abtrennung der ZeIlwände weitere 30 Minuten zentrifugiert (9000 χ g). Die Zellwände werden mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und durch Zentrifugieren gesammelt. Diese Behandlung wird zweimal wiederholt. Es werden 86 g gereinigte Zellwände erhalten.

Bezugsbeispiel 6

Herstellung von alkalibehandelten Zellwänden:

80 g der in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Zellwände werden in 4,4 Liter 0,1 N NaOH suspendiert. Die Suspension wird dann bei Raumtemperatur 30 Minuten bis 2 Stunden gerührt, mit konzentrierter Salzsäure neutralisiert und dann zum Sammeln der Zellwände 30 Minuten zentrifugiert (9000 χ g). Die Zellwände werden mit 1 M Kochsalzlösung und Wasser gewaschen und dann lyophilisiert. Es werden 40 g alkalibehan—

³⁰ delte Zellwände erhalten.

Bezugsbeispiel 7

Herstellung von alkalibehandelten Zellwänden: 121 g feuchte ganze Zellen von Lactobacillus plantarum ATCC 8014 werden in 1 Liter Leitungswasser suspendiert und mit 4 g festes NaOH versetzt. Nach vollständiger Lösung des NaOH

L J

wird das Gemisch 30 Minuten bei Kaumtemperatur gerührt. Danach wird das Gemisch mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa 7,0 eingestellt und 10 Minuten zentrifugiert (800 χ g). Der erhaltene Niederschlag wird einmal mit Wasser gewaschen. Die dabei erhaltenen alkalibehandelten ganzen Zellen werden dann in der in Bezugsbeispiel 5 beschriebenen. Weise behandelt. Es werden 18 g alkalibehandelte Zellwände erhalten.

10 Bezugsbeispiel 8 Immobilisierung von AM^-Endopeptidase:

500 mg in Bezugsbeispiel 3 erhaltene AM^-Endopeptidase werden in 20 ml 0,05 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gelöst. Die Lösung wird mit 1000 mg p-Aminobenzyl-Cellulose versetzt, die in üblicher Weise diazotiert ist. Hierauf wird das Gemisch 20 Stunden bei 4-⁰C" gerührt und anschließend 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert. Nach Beendigung der Umsetzung wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und zur Entfernung von freiem Enzym mit 0,25 H Phosphatpuffer (pH 8,0) und Wasser gewaschen.

Das dabei erhaltene immobilisierte Enzym wird bei niedriger Temperatur aufbewahrt.

Bezugsbeispiel 9

Immobilisirung von AM-z-Endopeptidase:

200 mg in Bezugsbeispiel 3 erhaltene AM^-Endopeptidase wird ferner dadurch gereinigt, daß sie durch eine Säule (2,0 χ 100 cm) mit Sephadex G-100 gelfiltriert wird. Das gereinigte Enzym wird dann zu 5,0 g (in feuchtem Zustand) einer Suspension von CM-Sephadex C-25 (Na⁺-Form) in 50 ml 0,.001 M

Phosphatpuffer (pH 6,5) gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 24 Stunden bei 4°C gerührt. Danach wird das CM-Sephadex C-25 abfiltriert und gut mit 500 ml des vorstehend erwähnten Puffers gewaschen. Es wird an CM-Sephadex C-25 gebundene

AM_X-Endopeptidase erhalten. 35 '<

'■-32-

1 Beispiel 1

Herstellung von GMP₃-A, GMP₄-A, GMP₅-B und GMP₄-B: 43 g in Bezugsbeispiel 5 erhaltene, gereinigte Zellwände werden in Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH 8,5) zu einer Endkonzentration von 0,02 M suspendiert.Durch Behandlung mit Ultraschall werden sie gut dispergiert und dann 10 Minuten bei 120⁰G wärmebehandelt. Nach dem Abkühlen wird die Suspension mit 43.mg in Bezugsbeispiel 4 erhaltene M^-Acetylmuramidase und 280 mg Natriumnitrit versetzt. Außerdem wird die Suspension mit entionisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4,3 Liter aufgefüllt. Das Gemisch wird dann 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wird das Gemisch mit 105 mg in Bezugsbeispiel 2 erhaltene SK-Endopeptidase versetzt und das erhaltene Gemisch bei der .gleichen (Temperatur 24 Stunden gerührt und hierauf 2 Minuten zur Beendigung der Umsetzung auf 100°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird dann abgekühlt und zur Entfernung unlöslicher Stoffe 30 Minuten zentrifugiert (9000 χ g). Der Überstand wird durch eine Säule (5,6 χ 50 cm) mit ECTEÖLA-Cellulose (hergestellt von Brown Co., USA) geschickt. Die nichtadsorbierte Fraktion wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur, unter 50 C eingeengt. Sodann wird die eingeengte Lösung durch eine Säule (5)6 x83 cm) mit Sephadex G-50 geschickt, die in Reihe mit einer Säule (5*6 χ 77 cm) mit Sephadex G-25 verbunden ist. Die Fraktionen, die die Stoffe mit mittlerem Molekulargewicht enthalten, werden gesammelt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 50 G eingeengt. Die eingeengte Lösung wird mit Dowex 5OW χ 2 (Na⁺-Form; hergestellt, von Dow Chemical Co., USA) behandelt.

Die nichtadsorbierte Fraktion wird in gleicher Weise konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird dann auf eine Kieselgelsäule (7 χ 70 cm) aufgebracht und mit 700 ml 70$ Propanol entwickelt. Die GMP₅-A, GMP₄-A, GMP₅-B und GMP₄-B enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und konzentriert.

Anschließend wird die konzentrierte Lösung auf eine Nylon-Kieselgelsäule (7 x 80 cm) aufgebracht und mit Isobuttersäure/

0,5 M WH^OH im Volumenverhältnis 5:3 entwickelt. Die Säule wird an einer bestimmten Stelle geschnitten. Ein Teil jedes Bereichs wird mit dem gleichen Lösungsmittel wie oben extrahiert. Der Extrakt wird einer Dünnschichtchromatographie (TLC) unterzogen und mit dem Lösungsmittel entwickelt. Dabei wird aufgezeichnet, welcher Bereich die Peptidoglycane enthält. Es werden jeweils zwei Gruppen von Bereichen, die auf TLC homogenes Peptidoglycan enthalten, gesammelt und mit Diäthyläther zur Entfernung der Isobuttersäure gewaschen und dann mit Wasser extrahiert. Der Extrakt wird konzentriert und durch Gelfiltration entsalzt. Die ein Gemisch aus GMP^-A und GMEV-A enthaltende Fraktion sowie die ein

Gemisch aus GMP₂-B und GMP,.-B enthaltende Fraktion werden

2 Q-

jeweils chromatographisch an einer Säule (4,5 x 30 cm) mit CM-Sephadex C-25 (H⁺-Forra) behandelt, die mit 2,0 Liter 0,5 x 10"^ N Salzsäure eluiert wird. Dabei werden GMP^-A, GMP^-A sowie GMP,-B und. GMP^-B in getrennte Fraktionen aufgetrennt. Die Fraktionen, die vorwiegend eine einzelne Verbindung enthalten, werden gesammelt und sorgfältig mit 0,01 K NaOH neutralisiert. Dann werden sie unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 50°C konzentriert. Jede der konzentrierten Lösungen wird dann durch Gelfiltration durch eine Säule (5,0 χ 80 cm) mit Sephadex G-25 entsalzt, unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 50⁰C konzentriert und lyophilisiert. Es werden GMP₃-A, GMP₄-A, GMP₃-B und GMP₄-B in Mengen von 0,7 g, 0,7 g, 1,6 g bzw. 1,4 g erhalten.

Die physikochemischen Eigenschaften und die chemischen _g0 Analysewerte der vier Verbindungen sind in Tabelle IX zusammengefaßt.

ω
ο

to
σι

to
ο

Tabelle IX
Physicochemische Eigenschaften -und chemische Analyse der Verbindungen

I

,Glucosamin

GMP3-A

GMP.-A 4

GMP3-B

GMP,-B

weißes Pulver

-11.4°

+4.7°

-1.2°

2.16

Diaminopimelinsäure

Aussehen

• Muramivnsaure

löslieh in·Wasser, 50$ 0^_^ Alkohol5-unlöslich in Diäthyläth.

C37H63°1?V6H2°

C36H60°19N8-3/2H2°

C39H65°20V2H2°

1.19

Löslichkeit^

Glutaminsäure

-7.8°

CUN 42.49 7.18 12.06 42.39 6.93 11.78

CHN 46.20 6.78 11.97 46.50 6.91 11.95

CHN 46.10 6.87 12.41 45.97 6.66 12.36'

Alanin..

Spezifische Drehung rofi ^ 1 JD (c=1.0,Wasser,na.cn 24Stdi

Alanin

C34H58°18N8'5H2°

0.94

0.83

0.85

Molekülformel

Diaminopimelinsäur

CHN 42.68 7.11 11.72 42.94 7.17 11.78

1.06

0.91

0.89

E lernen ta. ranalyse ber.· - ■ gef-.

c-terminaie Aminosäure

0.90

(1.00)

(1.00) t (1.00)

Analyse VOI Amino zucken und Amino säuren . + )

N-terminaie Aminosäure

1.08

2.14

1.13

(1.00)

1.18

1.20

1.11

Alanin ι

Diaminopimelin säure

5 1.20

Diaminopimelin säure

+■) Die Werte sind als Molverhältnis zur Gesamtmenge der Glutaminsäurereste angegeben.

CO OJ CD

Die vier Verbindungen werden jeweils mit N-Acetylmuramyl-N-alanin-Amidase, die aus Streptomyces- globisporus B-1829 isoliert wurde, hydrolysiert. Es werden die in Tabelle X mit ihren analytischen Daten aufgeführten Abbauprodukte erhalten. Die Analysen werden nach bekannten Verfahren durchgeführt; vgl. Biochemistry, Bd. 5 (1966), S 3079; ibid., Bd. 6 (1967), S. 921 und Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 40 (1970), S. 5?. Ihre chemische Struktur wird durch Instrumentenanalyse (MS, GCMS, NMR, IR, UV) und enzymatische Analyse bestimmt.

03 O

to

Ol

cn

Tabelle X Analyse der Abbauprodukte

	Aminosäuresequenz (Edman -Abbau)	GMP3-A	GMP4-A	GMP3-B	GMP4-B	β -1,4-wgebunden	N-AcMur	N,6-0-diAcMur
Abbauprodukt -bei Katalyse durch N-Acetylmuramyl-L-alanin -Amidase	Abbauprodukt bei Katalyse durch exo-vS-N-Acetylglucosamidase*	N-AcGlc-N-AcMur, ühripeptid	N-AcGlc-N-AcMur, Tetrapeptid	N-AcGIc-N,6-0- diAcMur,' ^ripeptid	N-AcGIc-N,6-0- diAcMur, Tetrapeptid
Peptid - fraktion	0-Acetylgruppe	L-Ala-D-isoGln- meso-A„pm	L-Ala-D-isoGln- meso-A-pm-D-Ala	L-Ala-D-isoGln- meso—A„pm	L-AIa-D-i s 0 GIn- meso-A_pm-D-Ala
Zucker fraktion	Glycosid-bindung	N-AcGIc, N-AcMur	N-AcGIc, N,6-0-diAcMur
Redu. zierender Zucker	-	+

Die Abkürzungen bedeuten:

N-AcGlc-N-AcMur ='ß-N-Acetylglucosaminyl-Ci—^ 4)-N-acetylmuraminsäure;

N-AcGIc-N, 6-diAcMur = ß-N-Acetylglucossminyi-Ci-—■>4)-N,6-0-diacetylmuraminsäure;

I^Ala-D-isoGln-meso-Appm = L-Alanyl-D-isoglutaminyl-(L)nieso-2,6-diaminopimelinsaure-CD)-amid;

L-Ala-D-isoGln-meso-Appm-D-Ala, L-Alanyl"-D-isoglutaminyl-(L)-meso-2,6-diaminopimelinsäure-

(D)-amid-(L)-D-alanin;

N-AcGIc, N-Acetylglucosamin; N-AcMur, N-Acetylmuraminsäure und

N_?6_0-diAcMur, N^-O-Diacetylmuraminsäure.

+) Biochem., J., Bd. 77 0960), S. 170

CJ CD

CD (JD

1 ■ Beispiel 2

Herstellung von GMP₅-A, GMP₄-A, GMP₅-B und GMP^-B: 1200 g gereinigte Zellwände von Lactobacillus plantarum ATCC 8014, erhalten nach dem Verfahren von Bezugsbeispiel 5» werden in 30 Liter Phosphatpuffer (pH 8,0) zu einer Endkonzentration von 0,04· M suspendiert. Die Suspension wird mit 2,4· g M^-Acetylmuramidase, 50 ml Chloroform, 14-,J g CoC^'öHgO, 0,58 g AM₅~Endopeptidase und außerdem mit Leitungswasser auf ein Gesamtvolumen von 60 Liter versetzt» Bas Gemisch wird dann 24- Stunden bei 37°C gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit konzentrierter Salzsäure auf den pH-Wert 2,5 bis 3»0 eingestellt und zur Entfernung von unlöslichen Stoffen zentrifugiert. Der überstand wird vorsichtig mit verdünnter Natronlauge neutralisiert und dann

¹⁵ zur Entfernung von Verunreinigungen durch eine Säule

(10 χ 14-0 cm) mit Diaion PA 316 (Cl""-Form,· hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan) geschickt. Die nichtadsorbierte Fraktion wird dann auf eine Säule (14- χ 190 cm) mit Diaion PE 212 (H⁺-Form; hergestellt von

^Q Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan) aufgebracht, die mit 0,3 M Kochsalzlösung eluiert wird. Das Eluat wird mit verdünnter Natronlauge vorsichtig neutralisiert und danach auf eine Säule (5*0 x 50 cm) mit Kieselgel (Kieselgel 60PpCi,, hergestellt von E. Merck AG, Deutschland)

nc fcP*r

aufgebracht. Die Säule wird mit 10 Liter eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 15:10:2 gewaschen und mit 15 Liter eines Gemisches von Chloroform, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 10:10:2 eluiert. Es wird eine Fraktion erhalten, die ein

Gemisch aus GMP_x-B und GMP,.-B enthält. Danach wird mit

3 4-

10 Liter Methanol eluiert. Es wird eine Fraktion erhalten, die ein Gemisch aus GMP₅-A und GMP^-A enthält. Beide Fraktionen werden jeweils unter vermindertem Druck bei einer

Temperatur unter 50 C konzentriert. Dann werden sie jeweils 35

auf eine Säule (20 χ 135 cm) mit Diaion HP-20 (hergestellt

von Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan)

aufgebracht. Beim Eluieren der Säulen mit 10 Liter Leitungswasser unddann mit 10 Liter 5$ Methanol werden GMP-,-A bzw.

GMP-z-B in den mit V/asser eluierten Fraktionen und GMP..-A 5 4

und GMP^-B in den mit 5% Methanol eluierten Fraktionen erhalten. Jede der Fraktionen GMP^-A, GMP^-A, GMP^-B und GMP₂I-B wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 50°C konzentriert und dann auf eine Säule (15 x 135 cm) mit CM-Sephadex (H⁺-Form) aufgebracht, die mit 10 Liter 0,5 x 10 N Salzsäure eluiert wird. Das Eluat wird mit verdünnter Natronlauge neutralisiert, unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 50°C konzentriert und durch Gelfiltration durch eine Säule (6,0 χ 160 cm) mit Sephadex G-25 entsalzt. Die erhaltene Lösung wird dann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 50 C eingeengt und lyophilisiert. Es werden GMP₅-A, GMP^-A, GMP₅-B und GMP^-B in einer Menge von 38 g, 38 Si 67,8 g bzw. 56,2 g erhalten.

Beispiel3 Herstellung von GMP₅-A und GMP^-A:

1200 g alkalibehandelte Zellwände von Lactobacillus plantarum ATCC 8014, erhalten im Verfahren von Bezugsbeispiel 6, werden in 30 1 Phosphatpuffer (pH 8,5) zu einer Endkonzentration von 0,02 M suspendiert und gut dispergiert. Danach wird die Suspension mit 2,4 g M^-Acetylmuramidase, 50 ml Chloroform, 14,3 S CoOI₂-OH₂O und 1,0 g (in trockenem Zustand) immobilisierte AM^-Endopeptidase, erhalten in Bezugsbeispiel 8, versetzt und mit Leitungswasser auf ein Gesamtvolumen von 60 Liter aufgefüllt. Das erhaltene Gemisch wird 48 Stunden bei 3?°C gerührt. Danach wird das immobilisierte

Enzym mit einem Dehydrator aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Der Überstand wird mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 bis 3,0 eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit entfernt. Sodann wird der Überstand vorsichtig mit verdünnter Natronlauge neutralisiert und zur Entfernung von Verunreinigungen durch eine Säule (10 χ 140 cm) mit Diaion

PA 316 (Cl~-Fonn) geschickt. Die nichtadsorbierte Fraktion wird sodann auf eine Säule (14- χ 190 cm) mit Diaion PK (H -Form) aufgebracht, die mit 0,3 M Kochsalzlösung eluiert wird. Das Eluat wird mit verdünnter Natronlauge neutrali-

5 siert und auf eine Säule (20 χ 135 cm) mit Diaion HP-20

aufgebracht, die mit Wasser und dann mit 5$ Methanol eluiert wird, wobei zunächst eine Fraktion mit GMP₂-A und dann eine Fraktion mit GMP,.-A erhalten wird. Die beiden GMP-,-Α bzw.

μ. τ,

GMP^-A enthaltenden Fraktionen werden entsalzt und durch

umgekehrte Osmose (RO-Modul RT-1, hergestellt von Sumitomo Chemical Co., Ltd., Japan) konzentriert. Anschließend werden sie jeweils auf eine Säule (15 x 135 ^cm) ^m^ CM-Sephadex (H⁺-Form) aufgebracht, die mit 10 Lite.r 0,001 N Salzsäure eluiert wird. Das Eluat wird mit verdünnter Natronlauge neu-

¹⁵ tralisiert, unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 50⁰C eingeengt und dann durch Gelfiltration durch eine Säule (6,0 χ 160 cm) mit Sephadex G-25 entsalzt. Das dabei erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 50°C eingeengt und lyophilisiert.

²⁰ Es werden GMP^-A und GMP^-A in einer Menge von 110 bzw. 90 g erhalten.

Beispiel 4-Herstellung von GMP₅-A und GMP^-A: ²^ 1200 g alkalibehandelte Zellwände von Lactobacillus plan-

tarum ATCC 8014·, erhalten im Verfahren von Bezugsbeispiel 7» werden in 30 Liter Phosphatpuffer (pH 8,5) zu einer Endkonzentration von 0,02 M suspendiert und gut dispergiert. Danach wird die Suspension mit 2,4- g M^₁ -Ac et ylmuramidas e und 50 ml Chloroform vermischt und mit Leitungswasser auf ein Gesamtvolumen von 60 Liter aufgefüllt. Anschließend wird das Gemisch 24- Stunden bei 3?°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird hierauf mit konzentrierter Salzsäure auf den pH-Wert 2,5 bis 3^0 eingestellt und der ausgefallene Nieder-

schlag durch Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit entfernt. Der Überstand wird mit konzentrierter Natronlauge

neutralisiert und zur Entfernung von Verunreinigungen durch eine Säule (ΊΟ χ 140 cm) mit Diaion PA 316 (Cl""-Form) geschickt. Die nichtadsorbierte Fraktion wird elektrodialytisch entsalzt (Selemion Dialyse Kabinet Typ-DU-Ob) und dann mit Salzsäure auf den pH-Wert 6,5 eingestellt. An CM-Sephadex C-25 gebundene ΑΜ,,-Endopeptidase, hergestellt nach dem Verfahren von Bezugsbeispiel 9, wird in eine Säule (10 χ 100 cm) gepackt, durch die die vorstehend beschriebene Lösung mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/Minute geschickt und dabei auf 37°C gehalten wird. Dieses Verfahren wird zweibis dreimal wiederholt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch v/ird auf eine Säule (14 χ 190 cm) mit Diaion PK 212 (H⁺-Form) aufgebracht, die mit 20 Liter 0,3 M Kochsalzlösung eluiert wird. Das Eluat wird mit verdünnter Natronlauge neutralisiert und auf eine Säule (20 χ 155 cm) mit Diaion HP-20 aufgebracht. Danach werden die entsprechenden Behandlungsschritte wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Es werden¹ GMP-z-A und GMP^-A in Mengen von 100 bzw. 80 g erhalten.

20 Beispiel 5

Umwandlung von GMP₅-B und GMP^-B in GMP₅-A und GMP₄-A: 1000 mg GMP₅-B werden in 10 ml 0,1 N Salzsäure gelöst und 8 Stunden auf 6O⁰C erwärmt. Nach dem Abkühlen wird das Reaktionsgemisch mit verdünnter Natronlauge auf den pH-Wert 6,0 eingestellt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 5°°C konzentriert. Anschließend wird das Konzentrat durch Gelfiltration an einer Säule mit Sephadex G-25 entsalzt. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 50⁰G konzentriert und lyophilisiert.

30 Es werden 960 mg GMP₇-A erhalten.

In gleicher Weise werden 1000 mg GMP^-B behandelt. Es werden 966 mg GMP₂₁-A erhalten.

Claims (10)

OSSIUSVOSSIUS TAÜCJH'iVER:· HpNEMANN RAUH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE Λ ■ 8OOO MÜNCHEN B6 · PHONE: (O89) 47 AO 75 CABLE! BENZOLPATENT MÖNCHEN · TELEX B-594S3 VOPAT D u.Z.: S 226 (Ra/H) Case: 502974 DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD. Osaka, Japan "Verfahren zur Herstellung von Disaccharid-Tripeptiden und Disaccharid-Tetrapeptiden" Patentansprüche

1./Verfahren zur Herstellung von Disaccharid-Tripeptiden und Disaccharid-Tetrapeptiden der allgemeinen Formel I

CH₂OH

HO

H OH

NHCOCH-

HN

(L) CHCO CH₃

(D)

H-Y "O /^H

H
CD) CHCH.

•CO

NH

H₀NCOCH(CH₉) (D) J

HN

H>>NCH(CH_O) -CHCOR₀

OH.H

NHCOCH.

CD

in der R- ein Wasserstoffatom oder eine Acetyleruppe und

^Λ (D)

Ro eine Hydroxylgruppe oder den Rest -nhcHCOOH

darstellen und die Symbole (D) und (L) q_E die Konfiguration bezeichnen,
5 dadurch gekennzeichnet,

daß man Zellwände von Bakterien, die eine Muraminsäure-Einheit mit acetylierter Aminogruppe, Isoglutamin und Meso-2,6-diaminopimelinsäure mit einer amidlerten Carboxylgruppe als Bestandteile von Zellwand-Peptidoglycan enthalten, mit einer Endo-N-acetylmuramidase aus Streptomyces globisporus und einer D-Alanyl-meso~2,6-diaminopimelinsäure-endopeptidase aus Streptomyces nitrosporeus SK (S¹ERM BP-216) oder Streptomyces globisporus hydrolysiert und, falls ein Produkt der allgemeinen Formel I erhalten wird, in der R_x, eine Acetylgruppe darstellt, dieses Produkt gegebenenfalls hydrolysiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Streptomyces globisporus den Stamm Streptomyces

20 globisporus B-1829 (ATCC 21553) einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellwände von Lactobacillus plantarum oder Coryne-

babterium diphtheriae einsetzt. .. .

4. Verfahren zur Herstellung von Disaccharid-iDripeptiden und Disaccharid-Tetrapeptiden der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellwände von Lactobacillus plantarum mit einer Endo-N— acetylmuramidase aus Streptomyces plobisporus B-1829 (ATCC 21553) und einer D-Alanyl-meso^^-diaminopimelinsäure-endopeptidase aus Streptomyces nitrosporeus SK (FERM BP-216) oder Streptomyces g;lobisporus B-1829 (ATCC 21553) hydrolysiert, und, falls ein Produkt der Formel I erhalten wird, in der R- eine Acetylgrupppe darstellt, dieses Produkt gegebenenfalls hydrolysiert.

L J

5· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellwände einsetzt, die nicht mit Alkali behandelt wurden, daß man das Produkt der allgemeinen Formel I, in der It, eine Acetylgruppe darstellt, nicht hydrolysiert, und als Endprodukte ß-N-Acetylglucosaminyl-O—>>4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-meso-2,6-diaminopimelinsäure-(D)-amid, ß-N-Acetylglucosaminyl·- (1—>4)-N-acetylmuramyl~L-alanyl-D-isoglutaminyl--(L)-meso-2,6-diaminopimelinsäure-(D)-amid-(L)-D-alanin, . ß-N-Acetylglucosaminyl-Ci—j>'4)-N,6-0-diacetyliauramyl-l!- alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-meso-2,6-diaminopimelinsäure-(D)-amid und ß-N-Acetylglucosaminyl-Ci—^ 4)-N,6-0-diacetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-mes0-2,6-diamino-

pimelinsäure-(D)-amid-(L)-D-alanin erhält. 15

6. Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß nan Zellwände einsetzt, die nicht mit Alkali behandelt wurden,daß man das.Produkt der Formel I,in der R. eine Acetylgruppe darstellt, unter sauren Bedingungen hydrolysiert . und als Endprodukte ß-N-Acetylglucosaminyl-Ci—£4-)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-meso-2,6-diaminopimelinsäure~(D)-amid und ß-N-Acetylglucosaminyl-(1--^ 4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-

meso-2,6-diaminopimelinsäure~(D)-amid-(L)-D-alanin erhält· 25

7· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellwände einsetzt,die mit Alkali behandelt wurden und als Endprodukte ßHtf-AcetylgluaDsammyl-{1 -^ 4-)-K-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-meso-2,6-diaminopimelinsäure-(D)-amid und ß-N-Acetylglucosaminyl-O—> 4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-meso-2,6-diaminopimelinsäure-(D)-amid-(L)-D-alanin erhält. ,

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8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß die mitAlkali behandelten Zellwände durch Behandlung der Zellwände mit einer 0,05 bis 0,5 N wäßrigen" Alkalilosung oder durch Behandlung der ganzen Zellen mit einer 0,05 bis 0,5 N wäßrigen Alkalilösung und anschließende übliche Behandlung der mit Alkali behandelten ganzen Zellen zur Herstellung von Zellwänden hergestellt wurden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Alkalilösung eine Konzentration von 0,1 bis 0,2 N aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkali ein Alkalimetallhydroxid oder ein Alkalimetallcarbonat einsetzt.

20 25 30 35

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