DE2723463A1

DE2723463A1 - Verfahren zur herstellung von 7-amino- cephem-verbindungen unter verwendung von schimmelpilzen

Info

Publication number: DE2723463A1
Application number: DE19772723463
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Goi; Fumio Kai; Shinji Miyado; Taro Niida; Tomizo Niwa; Chuhei Nojiri; Shigeo Seki; Yujiro Yamada; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1976-05-24
Filing date: 1977-05-24
Publication date: 1977-12-01
Also published as: DE2723463C3; JPS52143289A; CA1086668A; GB1566830A; FR2352820B1; FR2352820A1; US4141790A; DE2723463B2

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Wlickmanh, DiPL₁-PhYs. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

S MÜNCHEN «6, DEN

POSTFACH 160*20

MOHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 913921/22

HtM/cb

Case: P73/4O5

MEIJI SEIKA KAISHA LTD.

No. 8, Kyobashi 2-chome, Chuo-ku,

Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen unter Verwendung von Schinunelpilzen

709848/1183

Meiji Seika Kaisha Ltd.
Case: P73/4O5

~S~ 2723A63

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen.

Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen der allgemeinen Formel I

COOH

in der X für eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsäurerest steht.

Nützliche Antibiotika der Cephalosporinreihe, wie beispielsweise Cephalothin,Cephaloridin oder Cephaloglycin, erhält man im allgemeinen durch Umwandlung des durch Fermentationsverfahren gebildeten Cephalosporins C in 7-Aminocephalosporansäure (die im folgenden auch als "7-ACA" bezeichnet wird), welche Säure man chemisch in geeigneter Weise modifiziert. Daher ist die 7-Aminocephalosporansäure das wichtigste Ausgangsmaterial zur Herstellung dieser Cephalosporin-Antibiotika. Weiterhin tragen sowohl Cefoxithin das als neues synthetisches Cephalosporin-Antibiotikum entwickelt wird und das aufgrund seiner bei Bewertungsuntersuchungen festgestellten ausgezeichneten Eigenschaften (siehe Antimicrobial Agents and Chemotherapy,VoI. 5 (1974) 25) erhebliches Interesse findet, als auch Cefuroxim, das sich ebenfalls im Entwicklungszustand befindet und ausgezeichnete Eigenschaften aufweist (siehe The Journal of Antibiotics, Vol. 29 (1976) 29) in der 3-Stellung Carbamoyloxymethylgruppen. Für die Synthesen dieser Verbindungen stellt die 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure (im folgenden auch als "D-7-ACA" bezeichnet) ein besseres Ausgangsmaterial dar. Die 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure ist auch als Ausgangsmaterial für die Synthese von inder 3-Stellung substituierten Vinyl-cephalospori-

709848/1183

nen geeignet, die aufgrund ihrer starken antibakteriellen Wirkung auf gramnegative Bakterien (vgl. Journal of Medical Chemistry, Vol.18 (1975) 986) allgemeines Interesse finden.

Es sind bereits eine Reihe von Verfahren vorgeschlagen worden, mit denen die Desacylierung von Cephalosporin C in der 7-Stellung, die im folgenden der Einfachheit halber als "Desacylierung" bezeichnet wird, auf chemischem Wege erreicht wird, wobei diese Desacylierung tatsächlich mit Hilfe chemischer Verfahrensweisen in technischem Maßstab durchgeführt wird. Ein bekanntes Verfahren zur chemischen Desacylierung von Cephalosporin C ist beispielsweise das Iminohalogenid-Verfahren (siehe die veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. Sho-41-13862). Dieses Desacylierungsverfahren umfaßt die folgenden Schritte: Schutz der Aminogruppe des Cephalosporin C, Schutz der Carboxylgruppe, Umwandlung in das Iminochlorid, Umwandlung in den Iminoäther, Desacylierung und Abspaltung der Schutzgruppe der Carboxylgruppe. Da dieses Verfahren eine Reihe von Schritten umfaßt, ist die Durchführung der aufeinanderfolgenden Verfahrensschritte sehr aufwendig und zeitraubend. Weiterhin wurde als Verbesserung des Iminohalogenid-Verfahrens das sogenannte Silylchlorid-Verfahren vorgeschlagen (vgl. die veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. Sho-45-40899). Dieses Verfahren ist im Vergleich zu dem Iminohalogenid-Verfahren dadurch vorteilhaft, daß es eine geringere Anzahl von Verfahrensschritten benötigt; es wirft jedoch weitere Probleme auf, wie das Abkühlen auf Temperaturen von unterhalb -60 C, die Anwendung kostspieliger Reaktionsvorrichtungen und dergleichen. Neben diesen Problemen leiden die chemischen Desacylierungsverfahren an dem weiteren Nachteil, der darin zu sehen ist, daß es zur Erzielung hoher Ausbeuten erforderlich ist, hochreines Cephalosporin C als Ausgangsmaterial einzusetzen.

Die theoretische Möglichkeit der direkten Desacylierung von Cephalosporin C durch die Anwendung von Mikroorganismen oder

709848/1183

Enzymen scheint aufgrund von Erfahrungen bei der Herstellung von 6-Amino-penicillansäure (6-APA) aus Penicillin gegeben zu sein. Es sind bislang jedoch noch keine Berichte über die Herstellung von 7-Amino-cephalosporansäure oder von 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure ausgehend von Cephalosporin C in technischem Maßstab veröffentlicht worden. Es wird angenommen, daß dies eine Folge der Tatsache ist, daß in der 7-Stellung des Cephalosporins C eine spezifische Gruppe (das heißt die D-5-Amino-5-carboxy-pentanoylgruppe) vorhanden ist, was erwarten läßt, daß die enzymatisch bewirkte direkte Desacylierung schwierig oder nicht durchzuführen ist.

In der US-PS 3 239 394 ist ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephalosporansäure aus Cephalosporin C unter Verwendung von Mikrobenzellen beschrieben. Dieses Verfahren besteht darin, daß man Cephalosporin C mit den gezüchteten Zellen eines bestimmten Bakterienstammes aus der Gruppe der Genera Brevibacterium, Achromobacterium und Flavobacterium, behandelt, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, die 7-Aminocephalosporansäure und 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure enthält. Bei einem solchen Verfahren ist jedoch keine Verbesserung der Reaktionsausbeute aufgrund der Tatsache zu erwarten, daß die verwendeten Mikrobenstämme eine extrem geringe Desacylierungsaktivität besitzen und daß das eine Desacylierungsaktivität aufweisende Enzym auch eine ß-Lactamase-Wirkung entfaltet, was zur Folge hat, daß die ß-Lactamringe von sowohl Cephalosporin C als auch dem daraus gebildeten Produkt, nämlich 7-Amino-cephalosporansäure, gespalten werden.

Es wurde nun von der Anmelderin überraschenderweise gefunden, daß gewisse Mikroorganismenstänune, die zu den Genera Aspergillus oder Alternaria gehören, eine starke Desacylierungswirkung entfalten und dafür geeignet sind, aus Cephalosporin C oder seinen Derivaten 7-Amino-cephalosporansäure oder 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure zu bilden. Die Erfindung beruht nun auf dieser überraschenden Erkenntnis. Das erfin-

709848/1183

dungsgemäße mikrobiologische Desacylierungsverfahren besitzt gegenüber den herkömmlichen Verfahren eine Reihe von Vorteilen, beispielsweise den, daß lediglich eine einzige Verfahrensstufe erforderlich ist, daß das Verfahren einfacher und wirksamer durchgeführt werden kann, daß insbesondere keine Ausgangsmaterialien mit hoher Reinheit erforderlich sind, und daß nur geringe Vorrichtungskosten aufgewandt werden müssen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephemverbindungen der oben angegebenen allgemeinen Formel I bereitzustellen, das darin besteht, daß man Homologe des Cephalosporins C der enzymatischen Wirkung des gezüchteten Myzels von Schimmelpilzen oder den daraus bereiteten Sekundärpräparaten unterwirft. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Desacylierungsverfahren unter Verwendung bestimmter Mikroorganismenstämme des Genus Aspergillus anzugeben oder alternativ 7-Amino-cephalosporansäure oder Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure (D-7-ACA) aus Cephalosporin oder seinen Derivaten herzustellen.

Diese Aufgaben werden durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen der allgemeinen Formel I

(I) COOH

in der X für eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsäurerest steht, gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man auf Verbindungen der allgemeinen Formel II

709848/1183

HOOCCH(CH₉) CONH

^n 1 J₁ I (id

COOH

in der

R- ein Wasserstoffatom, eine niedrigmolekulare Alkanoylgruppe, eine Aryl-alkanoylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe, eine niedrigmolekulare Halogenalkoxycarbonylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Aroylgruppe, eine N-Arylcarbamoylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe, R^ entweder ein Wasserstoffatom oder gemeinsam mit der Gruppe der Formel R- - N - eine Phthalimidogruppe und X eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsäurerest bedeuten,

oder auf deren Metallsalze oder Salze mit organischen Basen eine Kultur von Mikroorganismen, die die Verbindungen der allgemeinen Formel I aus den Verbindungen der allgemeinen Formel II zu bilden vermögen, oder ein aus der Kultur gewonnenes Sekundärpräparat in Gegenwart eines wäßrigen Mediums einwirken läßt.

Vorzugsweise läßt man auf die Verbindungen der allgemeinen Formel I in Gegenwart eines wäßrigen Mediums die Kultur eines Cephalosporin C-Acylase-bildenden Stammes eines Mikroorganismus, insbesondere eines Schimmelpilzes, eines Pilzes oder das daraus bereitete Sekundärpräparat einwirken.

Der Einfachheit halber werden die 7-Amino-cephem-Verbindungen der allgemeinen Formel I im folgenden als "7-Amino-cephem-Verbindungen I" bezeichnet, während die Homologen des Cephalosporins C der allgemeinen Formel II als "Verbindungen I?!" bezeichnet werden.

Im folgenden sei zunächst ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der 7-Amino-cephem-Verbindungen I angegeben, die

709848/1183

durch Behandlung von Cephalsporin C oder seinen Derivaten mit den gezüchteten Myzelen der oben beschriebenen Mikroorganismenstämme erhalten wurden; weiterhin sind einige experimentelle Ergebnisse angegeben, die mit den folgenden Methoden ermittelt wurden:

A) Methode zur quantitativen Bestimmung der 7-Amino-cephem-Verbindungen I.

1. Für in organischen Lösungsmitteln lösliche Substrate:

Reagentien:

Lösung A: 2 %-ige Lösung von Phenylacetylchlorid in Aceton,

Lösung B: 5 %-ige wäßrige Natriumbicarbonatlösung.

Man stellt 1 ml der Reaktionsmischung, die man durch das Behandeln der Substratlösung mit dem gezüchteten Myzel erhält, mit In Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,5 und extrahiert (das heißt wäscht) zweimal mit gleichen Mengen Äthylacetat. Den Extrakt stellt man mit In Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 7, gibt bei 0 C 0,6 ml der Lösung B zu und versetzt unmittelbar danach mit 2 ml der Lösung A. Die erhaltene Mischung wird während 60 Minuten bei O C aufbewahrt. Anschließend untersucht man die antimikrobielle Wirkung der Reaktionsmischung mit Hilfe einer mikrobiologischen Untersuchungsmethode. Zu diesem Zweck führt man die Papierscheibenmethode bei 37°C während 16 Stunden auf einer Analysenplatte durch, wobei man als Test-Mikroorganismus Bacillus subtil.is ATCC 6633 verwendet. Getrennt davon bereitet man mit der authentischen 7-Amino-cephem-Verbindung eine geeignete Anzahl von wäßrigen Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen, die man in der oben beschriebenen Weise mit Phenylacetylchlorid umsetzt, worauf man das gebildete Reaktionsprodukt in der oben beschriebenen Weise auf seine antimikrobielle Wirkung untersucht. So

709848/1183

kann man die Menge der in der Probe der Reaktionsmischung vorhandenen 7-Amino-cephem-Verbindung mit Hilfe einer Eichkurve ablesen, die mit Hilfe der authentischen 7-Amino-cephem-Verbindung" ermittelt wurde.

2. Für in organischen Lösungsmitteln unlösliche Substrate: Reagentien etc.:

Papierchromatographie:

Filterpapier (Toyo Nr. 50 Filterpapier) der Größe 2 cm χ 40 cm.

Lösungsmittelsystem: Acetonitril/Wasser-Mischung (4/1).

Hochspannungspapierelektrophorese: Pufferlösung: Ameisensäure/Essigsäure-Mischung (1/4) (der pH-Wert der Mischung beträgt 1,9),

Filterpapier: Toyo Nr. 51 Filterpapier Spannung: 160 V/cm
Zeit: 30 Minuten

Man trägt einen aliquoten Anteil der Reaktionslösung des Substrats und des Myzelins oder des Konzentrats davon auf das Filterpapier (Toyo Nr. 50) auf und entwickelt das Filterpapier bei Raumtemperatur nach der absteigenden Methode während 4 Stunden mit dem oben beschriebenen Lösungsmittelsystem. Anschließend wird das Filterpapier an der Luft getrocknet, worauf zwei 3 cm breite Streifen aus dem Filterpapier herausgeschnitten werden, 'und zwar von Stellen, die 7,5 cm bzw. 13,5 cm von dem Startpunkt des Filterpapiers entfernt sind, wobei diese Bereiche die Mitten der Streifen betreffen. Jeder der Ausschnitte wird gut mit 2 ml einer 0,05 m-Phosphatpufferlösung (mit einem pH-Wert von 7) extrahiert, worauf man 1 ml des Extrakts mit Phenylacetylchlorid umsetzt und dann die antimikrobielle Wirkung des Materials in der unter Ziffer 1 be-

709848/1183

schriebenen Weise bestimmt. In dieser Weise kann getrennt die quantitative Bestimmung von Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure (D-7-ACA), die 7,5 cm vom Startpunkt entfernt vorliegt, und von 7-Amino-cephalosporansäure (7-ACA), die 13,5 cm vom Startpunkt entfernt vorliegt, durchgeführt werden, woraus die Ausbeuten der entsprechenden Produkte errechnet werden können.

Wenn das Substrat ein Buntesalz des Cephalosporins C ist, das heißt eine Verbindung der allgemeinen Formel I, in der X für eine Gruppe der Formel - S - SO^M steht, in der M den Rest einer anorganischen oder organischen Base darstellt (siehe E. H. Flynn, Cephalosporins and Penicillins, Academic Press, New York and London (1972) 20), wird ein aliquoter Anteil der bei der Umsetzung der Verbindung mit den Zellen oder ihrem Konzentrat erhaltenen Lösung mit Phenylessigsäure in der oben beschriebenen Weise umgesetzt. Man trägt einen aliquoten Anteil der gebildeten Reaktionslösung auf das Filterpapier (Toyo Nr. 51) auf und führt eine Hochspannungs-Papierelektrophorese durch. Anschließend trocknet man das Filterpapier und schneidet einen 3 cm breiten Filterpapierstreifen in einer Entfernung von 6 cm von dem Startpunkt an der Anodenseite des Filterpapiers heraus, wobei dieser Bereich die Mitte des Streifens darstellt. Dann wird der Ausschnitt extrahiert und es wird die antimikrobielle Wirkung des Extraktes in der oben beschriebenen Weise ermittelt. In dieser Weise kann man quantitativ das Buntesalz der 7-Amino-cephalosporansäure quantitativ über die antimikrobielle Wirkung des phenylacetylierten Derivates ermitteln.

B) Einige experimentelle Ergebnisse.

Wie aus der folgenden Tabelle I hervorgeht, bilden sich durch die Desacylierung von Cephalosporin C mit dem Myzel-Enzym 7-Amino-cephalosporansäure (7-ACA) und Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure (D-7-ACA). Weiterhin zeigt sich,

709848/1183

daß die letztere Verbindung, das heißt die Desacetyl-7-aminocephalosporansäure,das überwiegende Produkt darstellt. Dies beruht auf der Tatsache, daß in dem eine Desacylierungswirkung aufweisenden kultivierten Myzel neben dem desacylierenden Enzym ein Enzym enthalten ist, das die Esterbindung der 3-Acetoxygruppe des Cephalosporins hydrolysiert, das heißt eine Acetyl-esterase. Die Stärke der enzymatischen Wirkung dieser Acetyl-esterase variiert mit dem eingesetzten Mikroorganismenstamm. Beispielsweise zeigt Aspergillus sp. MA-13 eine starke enzymatische Wirkung dieses Enzyms, mit dem Ergebnis, daß vorzugsweise Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure gebildet wird. Demgegenüber weist Alternaria sp. MA-133 nur eine relativ schwache Aktivität dieses Enzyms auf, so daß 7-Amino-cephalosporansäure bevorzugt gegenüber der Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure gebildet wird.

Weiterhin hat sich gezeigt, wie aus der folgenden Tabelle II hervorgeht, daß die gezüchteten Myzele der oben beschriebenen Mikroorganismenstämme nicht nur eine desacylierende Wirkung auf die verschiedenen N-Derivate von Cephalosporin unter Bildung der entsprechenden 7-Amino-cephem-Verbindungen, sondern auch auf die Buntesalze des Cephalosporins C (das heißt die Derivate des Cephalosporins C, die einen Thioschwefelsäurerest in der 3-Stellung aufweisen) ausüben, wodurch die entsprechenden Buntesalze der 7-Amino-cephalosporansäure gebildet werden.

1. Man beschickt ein Reagenzglas mit 0,5 g (Naßgewicht) der Mikroorganismenkultur, die man durch Züchten der unten angegebenen Schimmelpilzstämme in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise unter Verwendung des Mediums 1 oder des Mediums 2, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind, erhält und mit einer aliquoten Menge von 10 ml einer 0,5 X-igen wäßrigen Lösung des Natriumsalzes von Cephalosporin C (die einen pH-Wert von 7 aufweist) und versetzt die Lösung mit einer solchen Menge Natriumazid, daß sich eine

709848/1183

Konzentration von 100 mg/ml ergibt. Man setzt den Inhalt des Reagenzglases um, indem man das Reagenzglas während 16 Stun den bei 28°C in einer Schüttelvorrichtung schüttelt. Anschließend filtriert man die Reaktionsmischung und unter zieht das Filtrat der quantitativen Bestimmung bezüglich 7-Amino-cephalosporansäure und Desacetyl-7-amino-cephalo sporansäure unter Anwendung der oben beschriebenen Metho de 2. Die Ausbeuten der entsprechenden Produkte sind in
der folgenden Tabelle I als Prozentsatz, bezogen auf die Menge des eingesetzten Substrates, angegeben.

TABELLE I

Mikroorganismenstamm	Medium	Ausbeute der 7-Amino-cephem-Verbindungen	D-7-ACA (%)	Insgesamt (%)
		7-ACA (%)	18,5	18,5
Aspergillus sp. MA-13 (FERM-P349O oder ATCC Nr. 20491)	2	0	11 3	16 7.5
Aspergillus sp. MA-76 (FERM-P3491) Alternaria sp. MA-133 (FERM-P3492 oder ATCC Nr. 20492)	1 1	5 4,5	6.5	6,5
Aspergillus niger MA- 308 (FERM-P3493)	2	0

2. Man züchtet Aspergillus sp. MA-13 (FERM-P349O) (ATCC Nr. 20491) in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise unter Anwendung des Mediums 2, das ebenfalls in Beispiel 1 erläutert ist. Die erhaltene Kultur des Schimmelpilzstamms
setzt man mit verschiedenen Substraten während 16 Stunden bei 30°C in der unter Ziffer 1 beschriebenen Weise um.
Man filtriert die Reaktionsmischung und führt eine quantitative Bestimmung des Filtrats hinsichtlich der gebildeten 7-Amino-cephem-Verbindung unter Anwendung der oben beschriebenen Methoden 1 und 2 durch. Die Ausbeuten der als Produkt erhaltenen Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure
(D-7-ACA) sind in der folgenden Tabelle II als Prozent-

709848/1 183

satz, bezogen auf die Menge des eingesetzten Substrats, angegeben .

TABELLE II

Substrat	Ausbeute an D-7-ACA
N-Formyl-cephalosporin C	12
N-(2-Chloräthoxycarbonyl)-cephalosporin C	11,5
N-(p-Chlorbenzoyl)-cephalosporin C-Tetraäthylen-	8
diaminsalz
N-Phenylcarbamoyl-cephalosporin C	8
N-Phthaloyl-cephalosporin C	11
Desacetyl-cephalosporin C-Natriumsalz	18,5
Cephalosporin C-Buntesalz	5⁺

Als Produkt erhält man das entsprechende Buntesalz.

Von der Anmelderin wurden verschiedene Kulturen von Schimmelpilzen hinsichtlich ihrer Desacylierungswirkung untersucht, wobei sich gezeigt hat, daß im Prinzip eine große Vielzahl von, verschiedenartigen Schimmelpilzen eine Desacylierungswirkung entfaltet, wenngleich diese im allgemeinen auch geringer ist als die der ausgewählten Stämme. Beispiele für solche Schimmelpilze umfassen die Genera Penicillium, Chaetomium, Gibberella, Macrosporium, Rhizoctonia, Glomerella, Sclerotinia und Microascus.

Es ist festzuhalten, daß der wesentlichste Vorteil des erfindungsgemäßen pesacylierungsverfahrens unter Anwendung von Kulturen von Schimmelpilzen der oben beschriebenen Art oder den daraus bereiteten Sekundärpräparaten darin zu sehen ist, daß sich in dem Reaktionssystem nur wenig ß-Lactamase findet, die zu einer Spaltung des Lactamrings der als Substrat verwendeten Verbindungen II oder der daraus gebildeten 7-Amino-cephem-Verbindungen I führen würde, was zur Folge

709848/1183

V 2723A63

Iv

hat, daß erfindungsgemäß in wirksamer Weise und mit hohen Ausbeuten die als Produkt erwünschten 7-Amino-cephem-Verbindungen I gebildet werden. In dieser Hinsicht ist das erfindungsgemäße Verfahren den herkömmlichen Verfahren, beispielsweise den unter Anwendung von Bakterien durchgeführten Verfahren überlegen, bei denen der Nachteil der ß-Lactamaseaktivität besteht.

Obwohl eine Vielzahl von Stämmen von Schimmelpilzen die oben beschriebene Fähigkeit aufweisen kann, seien im folgenden einige angegeben, die erstmals von der Anmelderin aus dem Erdboden oder von Pflanzen gewonnen wurden, die in den Präfekturen,Okayama und Hiroshima in Japan gefunden wurden, wobei auch deren mikrobiologische Eigenschaften angegeben sind.

Asperqillus sp. MA-13

1. Wachstum auf Agar

Der Stamm bildet, wenn er auf Kartoffel-Glucose-Agarplatten bei 26⁰C während 7 Tagen gezüchtet wird, eine Kolonie mit einem Durchmesser von 56 mm, dessen weißes Myzel sich radial ausbreitet. Die Kolonie zeigt ein samtiges Aussehen, wobei sich um das Zentrum des Myzels herum vereinzelt schwarze Sporen finden.

Züchtet man den Stamm in der oben beschriebenen Weise auf einer Agarplatte nach Czapeck, so bildet der Stamm eine Kolonie mit einem Durchmesser von 42 mm, die ein samtiges Aussehen zeigt. Um die Zentren des Myzels herum finden sich braungefärbte Sporen.

Die mikroskopische Untersuchung zeigt die folgenden morphologischen Eigenschaften: zusammen mit den ausgereiften Konidienköpfen tritt eine Vielzahl von dicht gepackten,

709848/1183

braungefärbten Konidien mit einem Durchmesser von 30 bis 5OyUm auf. Die Konidiophoren besitzen eine Länge von 200 bis 30OyUm, die fast senkrecht stehen und an ihren Spitzen sphärische Vesikel mit einem Durchmesser von 3 bis 4 -um aufweisen. Die Sterigmen umfassen zwei Bereiche und die Konidien sind kugelförmig ohne Fortsätze und weisen einen Durchmesser von 3 bis 4 -um auf.

2. Physiologische Eigenschaften

Optimale Wachstumstemperatur:

Der Stamm wächst bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 42°C, wobei die optimale Temperatur bei etwa 35°C liegt.

Optimaler pH-Wert für das Wachstum: Der Stamm kann bei pH-Werten im Bereich von 2 bis 8 wachsen, wobei der optimale pH-Wert im Bereich von 3 bis 6 liegt.

Nitrat-Anabolismustest: Negativ

Aufgrund der oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wurde der Stamm als zu dem Genus Aspergillus sp. gehörig identifiziert.

Aspergillus sp. MA-76

1. Wachstum auf Agar

Wenn man den Stamm bei 26°C während 7 Tagen auf einer Kartoff el-Glucose-Agarplatte züchtet, so bildet er eine Kolonie mit einem Durchmesser von 8O mm. Die Hyphen sind extrem kurz und weißgefärbt und tragen eine Vielzahl von grünen Sporen, so daß der Stamm ein samtiges Aussehen annimmt.

Züchtet man den Stamm in der oben beschriebenen Weise auf einer Agarplatte nach Czapeck, so bildet er eine Kolonie mit einem Durchmesser von 61 mm, die ein gelblich-braunes

709848/1183

ΊΪ

samtartiges Aussehen hat.

Die morphologische Untersuchung zeigt die folgenden morphologischen Eigenschaften:

Im unreifen Zustand zeigen die Konidienköpfe ein besenartiges Aussehen, da ihre Vesikel oval geformt sind. In ausgewachsenem Zustand besitzen die Konidienköpfe einen Durchmesser von 30 bis 50AIm, während die Vesikel in etwa die Form von Kügelchen mit einem Durchmesser von 15 bis 20 .um haben. Die Konidiophoren besitzen eine Länge von 25Ο bis 3OO .um und weisen um die Peripherie herum kleine warzenförmige Vorsprünge auf. Die Sterigmen bestehen aus einem Abschnitt, während die Konidien einen Durchmesser von 3 bis 4 ,um aufweisen und keine kleinen Vorsprünge besitzen.

2. Physiologische Eigenschaften

Optimale Wachstumstemperatur:

Der Stamm kann bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 42 C wachsen, wobei die optimale Temperatur bei etwa 35 C liegt.

Für das Wachstum optimaler pH-Wert:

Der Stamm kann bei pH-Werten im Bereich von 2,5 bis 9 wachsen, wobei der optimale pH-Wert im Bereich von 3 bis 6 liegt.

. Aufgrund der oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wird der Stamm als zu dem Genus Aspergillus sp. gehörig identifiziert.

Alternaria sp. MA-133

1. Wachstum auf Agar

Züchtet man den Stamm bei 26°C während 7 Tagen auf einer

709848/1183

Kartoffel-Glucose-Agarplatte, so bildet er eine Kolonie mit einem Durchmesser von 40 mm, die an der Peripherie eine grünlich-schwarze Färbung aufweist. Die Kolonie besitzt ein flauschiges baumwollartiges Aussehen und zeigt nur geringe Sporenbildung.

Züchtet man den Stamm in der oben beschriebenen Weise auf einer Agarplatte nach Czapeck, so bildet er eine Kolonie mit einem Durchmesser von 22 mm, die an der Peripherie grau-schwarz gefärbt ist und im Uhrzeigersinn gekräuselt ist. Um die Mitte der Kolonie herum findet sich eine dichte Ansammlung von hellbraun gefärbtem Myzel, das eine Sporenbildung zeigt.

Züchtet man den Stamm auf einem Medium, das aus Blättern von breitblättrigen Bäumen besteht, die auf Agar fixiert sind, so zeigt das Wachstum eine sehr aktive Sporenbildung. Die mikroskopische Untersuchung zeigt, daß vielzellige Konidien ziegelartigen Aufbaus einzeln oder in Ketten vorliegen.

Die Sporen besitzen Abmessungen von 8 bis IO χ 15 bis 20 ,um und sind oval oder rotationselliptisch bzw. eiförmig geformt. In ausgereiftem Zustand zeigen sie deutliche geringfügige Vorsprünge an ihren Oberflächen und sehen so aus, als ob sie von eins bis drei Wänden kreuzweise geteilt wären. Einige Sporen besitze« vertikale Scheidewände. Neben diesen Sporen zeigt sich auch die Bildung von ovalen Chlamydosporen, die rötlich-braun gefärbt sind.

2. Physiologische Eigenschaften

Optimale Wachstumstemperatur:

ller Stamm kann bei Temperaturen im Bereich von 5 bis 30 C

wachsen, wobei die optimale Temperatur bei etwa 25°C liegt.

709848/1183

Für das Wachstum optimaler pH-Wert: Der Stamm kann bei pH-Werten im Bereich von 3,5 bis IO wachsen, wobei der optimale pH-Wert bei etwa 6 liegt.

Aufgrund der oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wird der Stamm als dem Genus Alternaria sp. zugehörig identifiziert.

Aspergillus niqer MA-308

1. Wachstum auf Agar

Züchtet man den Stamm während 7 Tagen bei 26°C auf einer Kartoffel-Glucose-Agarplatte, so bildet er eine Kolonie mit einem Durchmesser von 63 mm. Das Myzel ist weiß gefärbt und zeigt ein flauschiges, baumwollartiges Aussehen und weist eine Vielzahl von schwarz gefärbten Sporen auf.

Züchtet man den Stamm in der oben beschriebenen Weise auf einer Agarplatte nach Czapeck, so bildet er eine Kolonie mit einem Durchmesser von 54 mm. Das Myzel ist weiß gefärbt und geringfügig mit gelblich-grüner Farbe durchzogen und weist ein flauschiges, baumwollartiges Aussehen auf. Das Myzel ist etwas länger als das Myzel, das sich auf der Kartoffel-Glucose-Agarplatte bildet, und weist eine Vielzahl von dunkelbraun gefärbten Sporen auf.

Die mikroskopische Untersuchung zeigt die folgenden morphologischen Eigenschaften:

Eine dichte Population von schwarzen Konidien, deren ausgereifte Konidienköpfe kugelförmig sind und einen Durchmesser von 50 bis 7O ,um aufweisen. Die Konidiophoren besitzen eine Länge von 150 bis 250 ,um und stehen praktisch senkrecht und weisen an ihren Spitzen sphärische Vesikel

709848/1183

mit einem Durchmesser von 20 bis 4O ,um auf- Die Sterigmen umfassen zwei Bereiche, wobei die Konidien in Form von Kügelchen mit einem Durchmesser
die kleine Vorsprünge aufweisen.

Kügelchen mit einem Durchmesser von 3 bis 4 ,um vorliegen,

2. Physiologische Eigenschaften

Optimale Wachstumstemperatur:

Der Stamm kann bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 42°C wachsen, wobei die optimale Temperatur bei etwa 35°C liegt.

Für das Wachstum optimaler pH-Wert: Der Stamm kann bei pH-Werten im Bereich von 2 bis IO wachsen, wobei der optimale pH-Wert im Bereich von 3 bis 6 liegt.

Aufgrund der oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wird der Stamm als dem Genus Aspergillus zugehörig identifiziert, wobei sich auf der Basis der Veröffentlichung von Raper & Fennel "The Genus Aspergillus", Williams &Wilkins CO., Baltimore, ergibt, daß der Stamm der Spezies Aspergillus niger zugehört.

Die vier Schinunelpilzstämme, deren mikrobiologische Eigenschaften oben angegeben sind, das heißt Aspergillus sp. MA-13, Aspergillus sp. MA-76, Alternaria sp. ΜΛ-133 und Aspergillus niger MA-3O8 sind die ersten Mikroorganismen, von denen gefunden wurde, daß sie Cephalosporin C-Acylase bilden. Sie wurden bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt und haben die Hinterlegunqsnummern FERM-P 349Ο, 3491, 3492 bzw. 3493 erhalten. Die Stämme Aspergillus sp. MA-13 und Alternaria sp. MA-133 wurden auch bei der American Type Culture Collection, USA, unter den Hinterlegungsnummern ATCC 2Ο941 bzw. 2Ο942 hinterlegt.

709848/1183

Wie ganz allgemein bei anderen Mikroorganismen auch, unterliegen die oben beschriebenen Schimmelpilzstämme Veränderungen hinsichtlich ihrer Eigenschaften. Beispielsweise können künstliche Mutanten oder Varianten aus den Stämmen gebildet werden, beispielsweise durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht, mit hochfrequenten Wellen, mit radioaktiver Strahlung oder unter Verwendung von chemischen Mutagenen. Diese Mutanten und Varianten können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenso verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie zu der angestrebten Desacylierung fähig sind.

Bei der Herstellung der erwünschten 7-Amino-cephem-Verbindungen I unter Anwendung der oben erwähnten Schimmelpilzstämme läßt man vorzugsweise die durch Züchten dieser Mikroorganismen erhaltenen Kulturen oder die daraus bereiteten Sekundärpräparate unter Anwendung geeigneter Bedingungen auf die Verbindungen II einwirken.

Zur Gewinnung der Kulturen kann man übliche Züchtungsmethoden anwenden, bei denen Kulturmedien verwendet werden, die Nährstoffe enthalten, die normalerweise von Mikroorganismen angenommen werden. Als Nährstoffquellen kann man irgendwelche Materialien einsetzen, die ganz allgemein zur Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden. Beispielsweise kann man als Kohlenstoffquelle Glucose, Saccharose, Stärke, Glycerin, Maissirup, Melassen und Sojaöl verwenden. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind: Sojabohnenmehl, Weizenkeime, Fleischextrakte, Pepton, Maiswasser, Trockenhefe, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat. Zusätzlich zu diesen Nährstoffen kann man in geeigneter Kombination jene Additive verwenden, die das Wachstum der Mikroorganismen fördern und die für die Steigerung der Desacylierungswirkung, das heißt für die Beschleunigung der Ausbildung der Cephalosporin C-Acylase-Aktivität erforderlich sind. Beispiele für solche Additive sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Phosphate und ähnliche anorganische Salze. Als Züchtungsverfahren kann man

709848/1183

irgendein übliches Verfahren anwenden, das für das Züchten von Mikroorganismen auf festen oder flüssigen Medien geeignet ist. Für die Herstellung in industriellem Maßstab ist die Anwendung von submersen Kulturen besonders geeignet.

Das Züchten erfolgt unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 37°C, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 28°C. Die Züchtungszeit hängt von anderen Züchtungsbedingungen ab, insbesondere der Züchtungsvorrichtung und der Zusammensetzung und der Temperatur des Mediums, wobei man die Bedingungen vorzugsweise derart auswählt, daß der Züchtungsvorgang zu dem Zeitpunkt unterbrochen wird, bei dem die Desacylierungswirkung der Kultur ihr Maximum erreicht. Beispielsweise beginnt im Falle von Aspergillus sp. MA-13 die Acylase-Aktivität am 3. Tag aufzutreten und erreicht ihr Maximum am 4. bis 5. Züchtungstag, wonach sie wieder abnimmt, bis sie völlig verschwunden ist, obwohl dies in gewissem Maß von der Art und der Konzentration des Mediums abhängt. Im allgemeinen arbeitet man bei einer Züchtungszeit im Bereich von vorzugsweise 3 bis 7 Tagen.

Wie'bereits erwähnt, verwendet man die Kultur oder das daraus bereitete Sekundärpräparat zur Desacylierung der Verbindungen II.Der Ausdruck "aus der Kultur gewonnenes Sekundärpräparat" oder die dafür verwendeten äquivalenten Ausdrücke stehen für irgendein Produkt, das man dadurch erhält, daß man die Kultur in der Weise behandelt, daß man ein Produkt erhält, dessen Wirkungsgrad bezüglich der Bildung der gewünschten 7-Aminocephem-Verbindungen Ierhöht ist, mit anderen Worten, ein Produkt, das für die Bildung der gewünschten Verbindungen vorteilhaft ist. Somit kann man, da für die Desacylierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren das Enzym von wesentlicher Bedeutung ist, das als "Cephalosporin C-Acylase" bezeichnet wird, eine Vielzahl von Sekundärpräparaten verwenden, die eine Cephalosporin C-Acylase-Aktivität aufweisen. Beispiele für solche Sekundärpräparate sind: das aus der Kulturbrühe

709848/1183

gewonnene und gewaschene Myzel; zellfreie Extrakte, die man durch physikalische oder chemische Behandlung des Mzyels erhält (beispielsweise die Zerkleinerungsprodukte, die man durch Vermählen oder durch Ultraschallbehandlung des Myzels erhält, und Myzellysate, die man durch Behandeln mit oberflächenaktiven Mitteln oder Enzymen bildet); teilweise oder vollständig gereinigte Präparate des gewünschten Enzyms, die man durch Reinigen der zellfreien Extrakte mit Hilfe üblicher Enzymreinigungsmethoden erhält, beispielsweise durch Aussalzen, durch fraktionierte Ausfällung, durch Dialyse, durch Gelfiltration und durch Ionenaustausch- oder Adsorptions-Chromatographie; Produkte mit desacylierender Wirkung, die man dadurch erhält, daß man das Enzym entweder physikalisch oder chemisch an wasserunlösliche, hochmolekulare Substanzen bindet; und Produkte mit einer Fähigkeit zur Bildung der 7-Amino-cephem-Verbindungen I, die man dadurch erhält, daß man das gewaschene Myzel an Celite oder wasserunlöslichen hochmolekularen Substanzen adsorbiert.

Die Herstellung der Verbindungen I aus den Verbindungen II durch Desacylierung unter Anwendung der beschriebenen Kulturen oder ihrer Sekundärpräparate erfolgt im allgemeinen in einem wäßrigen Medium. Bevor genauer auf die Reaktionsbedingungen eingegangen wird, seien im folgenden einige der Eigenschaften des intrazellularen Enzyms angegeben, das man in der Kultur findet, das heißt des Enzyms "Cephalosporin C-Acylase". Das Enzym übt seine Desacy1ierungswirkung bei pH-Werten im Bereich von 6 bis 8 aus, wobei nur eine verminderte oder keine Wirkung bei pH-Werten von weniger als 5 oder höher als 9 zu beobachten ist. Das Enzym arbeitet bei Temperaturen im Bereich von 28 bis 40°C und verliert seine Aktivität bei Temperaturen von mehr als 50°C. Daher wird die enzymatische Reaktion vorzugsweise bei pH-Werten im Bereich von 6,5 bis 7,5 und bei Temperaturen im Bereich von 28 bis 40°C durchgeführt. Weiterhin kann die Aktivität des Enzyms durch Enzyminhibitoren, wie Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) inaktiviert werden.

709848/1183

Wenn die Kultur oder das daraus bereitete Sekundärpräparat in Wasser unlöslich ist, wird die Reaktion in einem System, das die Form einer Suspension hat, durchgeführt, wobei es von Vorteil ist, die Suspension in geeigneter Weise zu schütteln oder zu rühren. Alternativ kann man die Kultur oder das Sekundärpräparat in eine Säule einführen, so daß man die angestrebte Desacylierungsreaktion kontinuierlich durchführen kann, währenddem man eine wäßrige Lösung der Verbindung II durch die Säule führt. Die Reaktionszeit hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise der Substratkonzentration, der Aktivität des desacylierenden Enzyms und der Reaktionstemperatur, liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von 6 bis 6O Stunden. Es ist ratsam, mit Hilfe einer Voruntersuchung die Zeit zu bestimmen, die für die maximale Bildung der 7-Amino-cephem-Verbindung I erforderlich ist, und die Reaktionszeit auf der Grundlage des Ergebnisses dieser Voruntersuchung zu bestimmen. Die Substratkonzentration hängt überwiegend von der Stärke der Desacylierungswirkung ab, liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von O,1 bis IO %. Weiterhin ist es auch möglich, um eine Verunreinigung des Reaktionssystems während der Reaktion mit fremden Mikroorganismen zu verhindern, irgend ein geeignetes Antikontaminationsmittel zu verwenden.

Die 7-Amino-cephem-Verbindungen I, die man durch Einwirkung der Kulturen der oben erwähnten Mikroorganismenstämme oder der daraus bereiteten Sekundärpräparate auf die Verbindungen II in Gegenwart eines wäßrigen Mediums erhält, kann man mit Hilfe irgendwelcher bekannter Verfahren reinigen. Somit kann man das Endprodukt beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie, durch Säulenchromatographie oder durch isoelektrische Ausfällung reinigen. Man kann das Produkt auch in der Weise reinigen, daß man die letztendlich erhaltene Reaktior.smischung, gegebenenfalls im Verlaufe einer weiteren Reinigungs stufe, mit einer geeigneten organischen Säure oder dergleichen umsetzt, so daß man ein Derivat des Endproduktes erhält, das man dann in ein wasserunlösliches Salz überführt, welches man

709848/1183

mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, oder das darin besteht, daß man das Endprodukt in eine für die anschließende Isolierung aus der Reaktionsmischung geeignete Form umwandelt. Diese Reinigungsmethoden können natürlich in irgendeiner geeigneten Kombination angewandt werden.

Wenn nicht anders angegeben, sind die in den folgenden Beispielen angegebenen Teile und Prozentteile auf das Gewicht bezogen, während das Verhältnis von Gewichtsteilen zu Volumenteilen sich so verhält, wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Beispiel 1

Medium 1:2% Glucose, 1 % Pepton, pH-Wert = 7 (vor der Sterilisierung) .

Medium 2: 2 % Glucose, 1 % Maiswasser, 1 % Pepton, O,1 X sekundäres Kaliumphosphat, O,5 % Calciumcarbonat, pH-Wert =6,5 (vor der Sterilisierung).

Man beschickt vier 500 ml-Sakaguchi-Kolben mit 100 ml des Mediums 1 und sterilisiert es während 15 Minuten in einem Autoklaven bei 120°C. Dann trägt man als Inoculum eine PIatinösenfüllung Aspergillus sp. MA-76 (FERM-P 3491) auf jedes der Medien auf und führt während 4 Tagen auf einer Schütteleinrichtung eine Schüttelkultur bei 28°C durch. Die Kulturen werden abfiltriert und mit Wasser gewaschen, so daß man eine gewaschene Myzelmasse erhält. Man beschickt dann einen 1 1-Erlenmeyer-Kolben mit 10,5 g (Naßgewicht) der Myzelmasse und mit 4OO ml einer O,5 %-igen wäßrigen Lösung des Natriumsalzes von Cephalosporin C mit einer Reinheit von 85 % (pH-Wert = 7). Man versetzt die Mischung mit 4O mg Natriumazid und führt die Reaktion unter Rühren während 22 Stunden in einem Wasserbehälter durch, der konstant bei einer Temperatur von 30°C gehalten wird. Man filtriert die Reaktionsmischung, wäscht die Myzelmasse und erhält schließlich 420 ml der Reaktionsmischung,

709848/1183

die aus dem Filtrat und den Waschflüssigkeiten besteht. Man adsorbiert die Reaktionsmischung an einer mit 120 ml vernetztem Dextran (DEAE-Sephadex A-25, in der Chloridform, hergestellt von der Firma Pharmacia) beschickten Säule, wäscht die Säule mit 12O ml destilliertem Wasser und eluiert unter Anwen dung eines linearen Gradienten mit ansteigender Natriumchloridkonzentration bis zu einer Konzentration von 0,1 Mol pro Liter. Die Mischkammer enthält 5OO ml destilliertes Wasser, während der Behälter 500 ml 0,1 m NaCl-Lösung enthält. Das Eluat fängt man in Form von Fraktionen von jeweils 19 ml auf. Die Fraktionen der Nummern 52 bis 60 (7-ACA-Fraktionen) und die Fraktionen der Nummern 63 bis 75 (D-7-ACA-Fraktionen) werden getrennt vereinigt und auf Volumina von 2 ml bzw. 6 ml eingeengt. Die entsprechenden Fraktionen werden dann mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 4,2 eingestellt und über Nacht bei 5°C stehengelassen. Die gebildeten Niederschläge werden abzentrifugiert, mit einer geringen Menge destillierten Wassers gewaschen und getrocknet und ergeben 35 mg 7-Amino-cephalosporansäure mit einer Reinheit von 9O % bzw. 117 mg 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure mit einer Reinheit von 95 %. Die Ausbeuten an 7-Amino-cephalosporansäure bzw. an 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure, bezogen auf das eingesetzte Substrat, betragen 3 % bzw. 12,4 Gew.-X, während sich eine Gesamtausbeute von 15,4 % ergibt.

Ähnliche Ergebnisse erzielt man, wenn man bei dem Verfahren des Beispiels 1 das Medium 2 verwendet.

Beispiel 2

Man beschickt eine Säule mit einem Durchmesser von 4,2 cm und einer Höhe von 28 cm mit 8,7 g (Naßgewicht) der Myzelmasse, die man durch Züchten von Aspergillus sp. MA-I3 (FERM-P 349O, ATCC Nr. 20491) in dem Medium 2 nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise erhält. Man verbindet die untere und die

709848/1183

2723AG3

obere Öffnung der Säule miteinander unter Bildung eines geschlossenen Reaktionssystems. Dann führt man von oben 200 ml einer O,5 %-igen wäßrigen Lösung (mit einem pH-Wert von 7) des Natriumsalzes von Cephalosporin C mit einer Reinheit von 85 % von oben nach unten durch die Säule und zirkuliert das Material mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml pro Minute mit Hilfe einer Pumpe (Perpex-Pumpe LKB, Produktor A.B., Schweden) durch das geschlossene Reaktionssystem, wobei man sicherstellt, daß ein guter Kontakt der Substratlösung mit der Myzelmasse erfolgt. Man beläßt das Reaktionssystem während 17 Stunden in einem Wasserbehälter, der bei einer konstanten Temperatur von 3O C gehalten wird. Anschließend trennt man die Myzelmasse von der Reaktionsmischung ab und wäscht sie mit Wasser. Man vereinigt die Reaktionslösung mit den Waschwässern, wobei sich ein Gesamtvolumen von 220 ml ergibt. Die gebildete Lösung führt man durch eine mit 60 ml vernetztem Dextran (DEAE-Sephadex A-25 in der Chloridform) beschickte Säule. Die Säule wird zunächst mit Wasser gewaschen und dann unter Anwendung eines ansteigenden Natriumchloridgradienten eluiert, dessen Konzentration von 0 bis 0,1 Mol pro Liter ansteigt, wobei man in der Weise vorgeht, die in Beispiel 1 beschrieben ist und die D-7-ACA-Fraktionen auffängt. Die vereinigten D-7-ACA-Fraktionen engt man ein und reinigt das Material durch isoelektrische Ausfällung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode, wobei man 90 mg S-Desacetyl^-amino-cephalosporansäure mit einer Reinheit von 90 % erhält. Die Ausbeute an dieser Verbindung beträgt 18,1 %, bezogen auf das eingesetzte Substrat.

Beispiel 3

Man beschickt einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit 10 g (Naßgewicht) der Myzelmasse, die man durch Züchten von Aspergillus sp.tMA-76 (FERM-P 3491) in dem Medium 2 in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise erhalten hat, und mit 195 ml einer 0,6 X-igen wäßrigen Lösung (mit einem pH-Wert von 7,2) von N-(2,4-Di-

709848/1183

nitrophenyl)-cephalosporin C. Man versetzt die Mischung mit 21 mg Natriumazid und führt die Reaktion unter Rühren während 16 Stunden in einem Wasserbehälter durch¹, der bei einer konstanten Temperatur von 37 C gehalten wird. Man filtriert die Myzelmasse von der Reaktionsmischung ab und wäscht sie mit Wasser. Das Filtrat und die Waschwässer werden vereinigt und ergeben ein Gesamtvolumen von 210 ml. Die erhaltene Lösung stellt man durch Zugabe von 5n Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,5 ein und extrahiert zweimal mit gleichgroßen Volumen Äthylacetat. Die wäßrige Phase stellt man dann durch Zugabe von 5n Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 7 ein und führt sie durch eine mit 60 ml vernetzten! Dextran (DEAE-Sephadex A-25 in der Chloridform) beschickte Säule. Man wäscht die Säule mit 60 ml destilliertem Wasser und eluiert unter Anwendung eines linear ansteigenden Natriumchloridgradienten mit Konzentrationen von 0 bis O,2 Mol pro Liter nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise. Das Eluat wird in Form von Fraktionen von jeweils 5 ml aufgefangen. Die Fraktionen der Nummern 37 bis 41 (7-ACA-Fraktionen) und die Fraktionen der Nummern 43 bis 50 (D-7-ACA-Fraktionen) werden getrennt vereinigt, eingeengt und durch isoelektrische Ausfällung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise gereinigt, wobei man 18 mg 7-Amino-cephalosporansäure mit einer Reinheit von 90 % bzw. 75 mg 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure mit einer Reinheit von 90 % erhält. Die Gesamtausbeute der gebildeten 7-Amino-cephem-Verbindungen, bezogen auf das eingesetzte Substrat, beträgt 17,6 %.

709848/1183

Claims

Patentansprüche

f y. Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen der allgemeinen Formel I

COOH

in der X für eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen
Thioschwefelsaurerest steht, dadurch gekennzeichnet, daß
man auf Verbindungen der allgemeinen Formel II

HOOCCH(CH₂)

^Rf ^R2

II

COOH

in der

R₁ ein Wasserstoffatom, eine niedrigmolekulare Alkanoylgruppe, eine Aryl-alkanoylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe, eine niedrigmolekulare Halogenalkoxycarbonylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Aroylgruppe, eine N-Arylcarbamoylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe,

R_ entweder ein Wasserstoffatom oder gemeinsam mit der Gruppe der Formel R- - N - eine Phthalimidogruppe und

X eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsaurerest bedeuten,

oder auf deren Metallsalze oder Salze mit organischen Basen
eine Kultur von Mikroorganismen, die die Verbindungen der
allgemeinen Formel I aus den Verbindungen der allgemeinen
Formel II zu bilden vermögen, oder ein aus der Kultur gewonne-

709848/ 1 183

ORIGINAL INSPECTED

nes Sekundärpräparat in Gegenwart eines wäßrigen Mediums einwirken läßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Aspergillus sp. MA-13 (FERM-P349O) ATCC Nr. 20491 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Aspergillus sp. MA-76 (FERM-P3491) verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Alternaria sp. MA-133 (FERM-P P3492) ATCC Nr. 20492 verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Aspergillus niger MA-308 (FERM-3493) verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei pH-Werten im Bereich von 6,5 bis 7,5 bewirkt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei Temperaturen im Bereich von 28 bis 40°C durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion im Verlaufe von etwa 6 bis etwa 60 Stunden durchführt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Substratkonzentration im Bereich von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent arbeitet.

709848/1183
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kontaminationen verhinderndes Mittel verwendet, um die Verunreinigung des Reaktionssystems mit fremden Mikroorganismen 2u verhindern.

709848/1183