DE2423058A1

DE2423058A1 - Cephalosporinverbindungen

Info

Publication number: DE2423058A1
Application number: DE2423058A
Authority: DE
Inventors: Stephen Arthur Goulden; Alan Smith
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1973-05-14
Filing date: 1974-05-13
Publication date: 1974-12-12
Also published as: NL159716B; ATA392874A; AT335057B; CA1021280A; US3912589A; ZA743023B; FR2229701A1; AU6885574A; DE2423058C2; FR2229701B1; JPS5443598B2; CH606002A5; ES426272A1; NL7406418A; GB1474519A; BE814937A; JPS5035395A

Description

GLAZO 3143ORAiDORIES LIMITED, Greenford, Middlesex / England

Cephaloaporinverbindungen

Die Erfindung "betrifft die Umwandlung von Cephalosporinverbindungen und insbesondere die enzymatisch katalysierte Hydrolyse von 3-Acyloxymethylcephalosporinen.

Die in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Cephalosporinverbindungen werden allgemein unter Bejsungnahme auf "Cepha,m" (J. Am. Chem. Soc 1962, 84, 3400) bezeichnet, Der Ausdruck "Cephem" beisieht sich auf die Cephamstruktur mit einer Doppelbindung.

3-Hydroxymethyl-eephalosporin~verbindungen sind wertvolle Zwischenprodukte, bei der Synthese einer Reihe von Cephalosporin·»» antibiotika, die in der 3-Stellung substituierte Methylgruppcm aufweisen, aufgrund der chemischen Reaktivität der Hydroxylgruppe und der daraus folgenden leichten Umwandlungsmöglichksit der Hydroxymethylgruppe in eine gewünschte ^-(substituierte Methyl)-Gruppe. Darüberhinaus besitzen 7~Acylamido-3-hydroxymethylceph- -3-em-4-carbonsäuren antibiotische Eigenschaften. Die Herstellung von 3-Hydroxymethyl-cephalosporiri-verbindungen durcrh Hydrolyse von 3-Acyloxymethyl-cephalosporinen, insbesondere von natürlich vorkommenden, durch Fermentation produzierten 3-Acetoxymethylcephalosporinverbindungen wie Cephalosporin C[(6R,7R)-3-Acetoxy-

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methyl-7~(D-5-amino-5-car"bozypentanamido ) ceph-3~ein.-4-carbonsäure] und Derivaten davon, z.B. EF-ge schlitzt en Derivaten und Verbindungen, worin die D-5-Amino-5-earboxypentanoy!gruppe in anderer Weise umgewandelt v/urde oder entfernt wurde und gegebenenfalls durch eine andere Acy!gruppe ersetzt wurde, ist daher von bedeutendem Interesse,

Die Hydrolyse von 3-Acyloxymethyleeph-3-em-4-earbonsäuren in ihre 3-Hydroxymethylanalogen durch chemische Methoden hat sich als im allgemeinen nicht praktizierbar erwiesen, da solche Reaktionen mit einer raschen und im wesentlichen irreversiblen Lactonbildung, die die Reaktion der 3-Hydroxymethyl- und ^Carboxylgruppen umfaßt und/oder mit der Zerstörung des ß-Laetamringsystems einhergehen.

Es wurde jedoch gefunden, daß es möglich ist, 3-Acyloxymethylceph-3-em~4-carbonsäuren durch enzymatisch katalysierte Methoden unter Bedingungen zu hydrolisieren, unter denen die Lactonbildung und die ß-Laetamzersetzung im wesentlich oder vollständig verhindert werden können. Während Esterasen, die sich von einer Reihe von Quellen, z.B. pflanzlichen Quellen, ableiten, bei.diesen enzymatisch katalysierten Methoden Verwendung finden können, können sich praktische Schwierigkeiten bei der Isolierung von ausreichenden Esterasemengen aus einigen der Quellen ergeben. Daher sind Esterasen, die man aus Mikroorganismen er~ hält,- in der Praxis am zweckmäßigsten hinsichtlich der im Vergleich leichten Kultivierimgsmoglichke.it von Mikroorganismen in großem Maßstab unter Verwendung von Standard-Permentationsteehniken zur Bildung einer bequemen Esteraeelieferung.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, daß Esterasen, die aus Hefemikr ο Organismen des Genus Rhodotorula und Mutanten hiervon erhalten wurden, vorteilhaft die Hydrolyse von 3-Acyloxymethylceph-3-em-4-carbonsäuren in ihre 3-Hydroxymethylanalogen -fördern bzw. beschleunigen und wesentliche Vorteile im Vergleich mit bisher vorgeschlagenen, durch Mikroorganismen produzierte Esterasen besitzen.

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Gemäß einem Merkmal der Erfindung wird daher ein Vorfahren zur Umwandlung einer 3~Acyloxymethylcepfr~3-em--4--carbonsäure in ein 3-Hydroxymethylanaloges daTon durch Hydrolyse geschaffen, das dadurch charakterisiert ist, daß die Hydrolyse durch eine Esterase katalysiert wird, die durch Kultivieren eines Hefemikroorganismus oder einer Mutante hiervon vom Genus Rhodotorula produziert wird.

3~Acylo:Kymethylceph-5«-em-4-carbonsäuren, die gemäß der vorliegenden Erfindung hydrolysiert werden können, umfassen Verbindungen, die durch die allgemeine Formel

CH₂O.CO.R³ (I)

COOK

dargestellt werden, worin R' eine Aminogruppe oder blockierte (bzv/_e geschützte) Aminogruppe ist, "beispielsweise eine ^c-j_po"* Carbonsäure-acylamidogruppG; R Wasserstoff oder eine niedrig-Alkyl-, niearig-Alkoxy-, niedrig-Alkylthio-' "oder niedrig-Alkanoylgruppe ist (der hier verwendete Ausdruck "niedrig" "bezeichnet Gruppen, die nicht mehr ,als 8, vorzugsweise nicht mehr- als 6 Kohlenstoffatome enthalten); R .GO eine C₂ oQ-Carbonsäure-äcyX-" gruppe ist; und B die Bedeutung von y S oder >S-?Ό (α- oder ß-) hat.

Acylamidogruppen R , die in den Verbindungen der Formel I vorhanden sein können, umfassen die D-5~Amino-5-oar"boxypentanamidogruppe, die in natürlich vorkommenden, durch Fermentation hergestellten Verbindungen wie Cephalosporin C gefunden wurde; H-geschützte Derivate der D-5~Amino-5-carboxypentanamidogruppe, z.B. worin die Aminogruppe substituiert ist durch eine Schutzgruppe des in einer der britischen Patentschriften 1 041 985; 1 302 015 oder 1 313 207 beschriebenen lyps, beispielsweise eine niedrig-Alkylgruppe, eine Aryl-niedrig-alky!gruppe, eine Arylgruppe

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(z.B. 2,4-Dinitrophenyl) oder eine Acylgruppe, insbesondere eine niedrig-Alkanoylgruppe (25.B. Acetyl, Propionyl oder Butyryl)^ eine α-Halogen- oder α,α-Dihalogen-niedrig-alkanoylgruppe (z.B. Chloracetyl oder Dichloracetyl), eine Aroy!gruppe (z.B. Benzoyl, Chlorbensoyl, Nitrobenzoyl oder !Dosyl), eine niedrig-Alkoxyearbonylgruppe (z.B. t-Butoxycarbonyl), eine Aryl-niedrig«alkoxyearbonylgruppe (z.B, Benzyloxycarbonyl) oder eine Diaoylgruppe wie Phthaloyl; eine Aoylamidogruppe, die durch. Umwandlung der D-5-Amino-5-carboxypentanamidogruppe erhalten wurde, z.B. eine 4~Carboxybutamidogruppe, die daraus .durch beispielsweise enzymatisch^ Oxydation erhalten wurde; Pormamido; eine Gruppe der Formel

R(CH₂)_n.CONH-

worin R eine carbocyclische oder heterocyclische Arylgruppe (z.B. Phenyl, durch einen oder mehrere der Reste Halogen, Hydroxy, niedrig-Alkyl, Nitro* Amino, niedrig-Alkanoyl, niedrig~Alkoxy oder niedrig-Alkylthio substituiertes Phenyl; Thienyl oder ihzryl) oder eine Aryloxy-, Arylthio-, Aryl-niedrig-alkoxy- oder Aryl-niedrig-alkylthiogruppe (z.B. Phenoxy, Phenylthio, 5-Methyl-1,^^-thiadiazol-Z-ylthio oder Benzylthio) und η eine ganze Zahl von 1 bis 4 bedeuten; eine Gruppe der Formel

R^a-CH-C0mi-X

worin R^a eine Arylgruppe (z.B. eine monocyclische oder bicyclische carbocyclische Arylgruppe wie Phenyl, Naphthyl oder durch einen oder mehrere der Reste Halogen, Hydroxy, niedrig-Alkyl, Hitro, Amino, niedrig-Alkanolyl, niedrig-Alkoxy oder · niedrig-Alkylthio substituiertes Phenyl) bedeutet und X Amino, geschütztes Amino (z.B. enthaltend die vorstehend in Verbindung mit der D-5~Amino-5-carboxypentanamidogruppe diskutierten N-Schutzgruppen, beispielsweise eine t-Butoxycarbonylgruppe), Carboxy, Carbalkoxy oder Hydroxy ist; und eine Gruppe der Formel

R^a-C-C0IH-

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worin R^a die vorstehend aufgeführten Bedeutungen besitzen, (z.B. worin R^a Phenyl, substituiertes Phenyl, ITaphthyl, Shienyl, Furyl oder Pyridyl ist), und R Wasserstoff, Acyl (z.B. niedrig-Alkaiioyl), niedrig-Alkyl (z.B. Methyl, Äthyl, Propyl oder Butyl), Cycloalkyl (z.B. enthaltend 5-7 Kohlenstoffatome wie Cyelopentyl oder Cyclohexyl), Aryl (z.B. carbocyclischen Aryl wie Phenyl) oder Aryl-niedrig-Alkyl (z.B. Benzyl oder Phenylethyl) ist. Beispiele für R¹-Gruppen,, die unter die vorstehende allgemeine Formel fallen, die in Verbindungen der Formel I vorhanden sein können, umfassen Pheny lac et amido, Ehienyläcetaisido, 2-Hydroxy-2-phenyIacetamido, 2-t~ButO2ry-earbonylamino~2~phenyl~ acetamido und syn-2-i'uryl-2-methO3cyiinino~acetamido.

Acylgruppen R .CO, die in Verbindungen der Formel I vorhanden sein können, umfassen einen Bereich von aliphatischen araliphatischen und aromatischen Gruppen, beispielsweise niedrig-Alkanoylgruppen wie Acetyl, Propionyl und Butyryl; niedrig-Alkencylgruppen wie Crotonoyl; Aryl~niedrig~allcanoy!gruppen wie'Phenyl·* acetyl; und Aroylgruppen wie Benzoyl* Wie vorstehend angezeigt, findet das erfindungsgemäße Verfahren eine spezielle Anwendung bei der Hydrolyse von Cephalosporin ö und Derivaten davon, d.h. Verbindungen der Formel I, worin R „00 eine Acetylgruppe ist*

Die Gruppen R und B in der Formel I stellen vorzugsweise Viasserstoff bzw* ^>S dar.

Die Hefemikrqorganismen, aus denen die Esterase erhalten wird, können zweckmäßig durch Gefriertrocknen in einer Suspension von 2 fo Molke (whey) in versiegelten Glasampullen konserviert werden* Die gefriergetrocknete Kultur kann durch Zugabe von sterilem Wasser wieder eingesetzt werden. Die resuspendierten Organismen können beispielsweise durch Aufstreichen auf ein festes Nährmedium kultiviert werden, beispielsweise einem wässrigem Medium, das 2 i> Glukose, 1 $> Hefeextrakt, 1 % Pepton und 0,5 % Kaliumdihydrogen-phosphat enthält, mit 2 fo Agar gefestigt wurde (alle Prozentangaben sind in Gevj/Vol. angegeben), bei einem pH-Wert von 5,6. Die Oberflächenkultüren werden z.B. bei 25⁰C aufgezogen,

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bis das Agar bedeckt ist und können anschließend mehrere Monate bei einer niedrigen (Demperatur, z.B. 5⁰O konserviert werden. Der Organismus kann in lauchkulturen bzw. flüssigen Kulturen (subme-rges culture) zweckmäßig bei 25⁰C gezüchtet werden, beispielsweise durch Inokulation eines flüssigen Nährmediums mit einer Probe der Oberflächenkultur; ein Beispiel für ein geeignetes Bahrmedium für diesen Zweck ist das vorstehend für die Oberflächenkultur beschriebene,ohne Agar. Es ist häufig zweckmäßig, eine flüssige Kultur des Organismus zn erhalten, die als Iiiokulat für spätere flüssige Kulturen verwendet werden kann, z.B. zur Herstellung von Schaleßlatlturen (scale cultures), da hierdurch der Nachteil einer größen Oberfläche für flüssig-Inokiilat ionen vermieden wird und es möglich wird, ein größeres Inokulum zu verwenden* Die nach der Inkubation einer solchen anschließenden flüssigen Kultur während einer geeigneten Zeit, Z₀B. während 3 iDagen, zweckmäßig bei 25⁰O erhaltene Hefesuspension kann anschließend als Quelle für die zur Deacylierung des 3~Acyloxymethylaeph-3-em-4-caX"bonsäure~ Ausgangsmaterials verwendete Esterase verwendet werden.

Die Bildung der Esterase kann in gewissen Fällen durch Zugabs eines Induktionsmittels zu dem flüssigen Kulturmedium vergrößert werden. Geeignete Induktionsmittel umfassen Cephalosporin C, Cephalotin [(6R,7R)-3-Acetoxyisethyl-7-(thien-2-yl)-acetami~ doceph-3-em-4~earbonsäure] und ihre Salze (z.B. Alkalimetallsalze wie das Kaliumsalz), wobei sich Induktionsmittel wie das Kaliumcephalosporin C als in Mengen von weniger als 0,1 $> Gew./Vol. wirksam erwiesen haben. Das Induktionsmittel (indueer) wird zweckmäßig nach der Sterilisation zu dem flüssigen Kulturmedium gefügt. Das Induktionsmittel kann durch Hindurchleiten durch ein steriles Filter sterilisiert werden, wohingegen das Kulturmedium durch beispielsweise Behandlung im Autoklaven bei etwa 121⁰C und 10 500 kg/m²,,z.B. während 15 Minuten sterilisiert werden.kann.

Die Esterase kann in mehreren verschiedenen Formen zur Hydrolyse des 3-Acylox^iiethylceph~3-em-4-carbonsäure-Ausgangsmaterials verwendet werden. So kann beispielsweise eine Probe des flüssi-

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gen, kultivierten Mediums selbst als Quelle für die Esterase verwendet werden gegebenenfalls nach dem Brechen der liefezellen_? "beispielsweise durch übliche Methode wie Ultraschallbehandlung oder Behandlung mit auflösenden (lytischen) Enzymen. Ein wässriger Extrakt der von einem derartigen Aufbrechen der Zellen resultierenden Suspension kann ebenfalls verwendet werden. Alternativ können ganze Zellen^ die von dem flüssigen Kulturmedium abfiltriert wurden, wie das entsprechende Filtrat, verwendet warden; wird es gewünscht, das Filtrat zu verwenden, so können die Zeilen erneut vor der PiItration gebrochen werden, z.B. wie vorstehend beschrieben.

Die Verwendung ganzer Zellen, die·leicht beispielsweise als Zellensuspension aus dem flüssigen kultivierten Medium abgetrennt werden können, ist besonders vorteilhaft, da diese leicht konserviert werden können, z.B. als getrocknete oder tiefgefrorene Paste, die direkt der Hydrolysereaktionsmischung zugefügt werden kann und leicht abtrennbar ist, z.¹⁵. durch Filtration aus der Reaktionsmisch.ung_fnacjMem die 'Hydrolyse beendet ist. Die'so abgetrennten Zellen können z.B. nach dem Waschen mit Wasser erneut zur Hydrolyse weiterer Proben von 3-=Acylosymeth3'^-lceph-3-eia«-4-car*Donsä.nre ~ Ausgangsmaterial verwendet werden. Es wurde gefunden,, daß e£äe ausreichende Esteraseaktivität zur Hydrolyse .eines Öephalooporinprodukts mit zufriedenstellender Qualität in gleichmäßiger Ausbeute während sogar 7 erneuten Einsätzen der Zellen beibehalten werden kanny wodurch diese Ausführungsform des Verfahrens von besonderem wirtschaftlichen Vorteil ist.

Falls gewünscht, können die gesamten Zellen in oder an einer inerten Matrix (z.B. einem Polymeren oder einer Membran) immobilisiert werden, beispielsweise durch kovalente Bindung an ein anorganisches oder organisches Polymerisat, oder durch Einschluß bzw. Einfangen in oder an eine Faser (z.B. Zellulosetriacetat) oder in eine Umhüllung wie eine Perle, vor ihrem Zusatz zu einem Hydrolysereaktionsaystem, um die Zellen zu schützen und Verluste während ihrer Recyclisierung bzw. ihrer erneuten Verwendung auf ein Minimum herabzusetzen. Eine bevorzugte

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Matrix zur Verwendung zur Immobilisierung der Zellen ist PoXyacrylamidgel.

Die Esteraso kann auch in zellfreier Form verwendet werden, beispielsweise erhalten durch Ausfällung aus einem PiItrat oder zellularen Extrakt, der sich von dem flüssigen kultivierten Medium wie vorstehend beschrieben ableitet, unter Verwendung eines £x-oigneten Proteinausfälltingsmittels, ■beispielsweise eines SaI?öö oder eines Lösungsmittels. Die ausgefällte, zellfreie Enterase kann beispielsweise direkt zu einem Hydro™ ■lysereaktionGsystem angesetzt werden oder kann in Wasser gelöst werden und als wässrige Lösung zugefügt werden.

Alternativ kann die Esterase in immobilisierter Form verwendet werden, z.B. durch Unlöslichmachimg oder Umhüllung bzw. Einfangen an oder in einer inerten Matrix, wobei geeignete immobilisierte Formen die in der britischen Patentschrift 1 224 947 und der belgischem Patentschrift ?82 646 beschriebeneneinschließen. So kann beispielsweise eine au& einem Extrakt des flliosigen Eulturmediuias oder durch Wiederauflösen von ausgefällter Esterass erhaltene Estersse covalent an ein sonst inertes, anorganicehes oder organisches Polymeres gebunden werden, in oder an einer Faser eingefangen werden (z.B. einem faserartigen Polymeren wie Zellulosetriacetat) odor an oder in einer Membrane oder einem Polymeren wie Polyacrylamidgel, absorbiert werden an einem lonenaustausoherharz oder eingeschlossen verden in eine Umhüllung wie eine Perle. Immobilisierte Eaterasen diesen Typs können vorteilhaft in Ansatzverfahren verwendet werden, worin die Esterase erneirt verwendet werden soll und bei der Hydrolyse eines kontinuierlichen Flusses von 3~Acyloxymethylceph-3-em-4-carboni3äure durch beispielsweise Hindurchleiten durch eine Säule, die die immobilisierte Esterase enthält. ,

Die Hydrolysereaktion wird zweckmäßig durch. Eontaktieren der Esterase mit einem wässrigen Medium initiiert, das die 5-Aoyloxymethylceph-5~em-4~carbonsäure oder ein Salz davon (z.B. ein Alkalimetallsalz wie das Natrium- oder Kaliumsais) enthält,

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wobei das Medium zweckmäßig 0,5 - 10 Gew./Vol.$ dor Cephaloeporinverbindung enthält. Das Medium kann, falls gewünscht, Tor der Hydrolyse sterilisiert werden, es hat sich jedoch gezeigt, daß die Reaktion die Aufrechterhaltung steriler Bedingungen nicht erfordert und dementsprechend kann die Hydrolyse vorteilhaft unter nicht stc-rilcsn Bedingungen durchgeführt werden_e

Ist die 3~Acylosymethylcöph-3~em-4~Qar^<bonsäure ein durch !Fermentation produziertes Cephalosporin wie im Falle von Cephalosporin C, bo kann die Fermentationsbrühe, die aus der Kultur des Cephalosporin erzeugenden Organismus (z.B. eines Organismus des Genus Cephalo3porium wie Cephalosporin acremonium Brotzu) selbst mit der Esterase behandelt worden, wobei die Notwendigkeit der Zwicchenproduktabtrennung der Cephalosporinverbindung vermieden wird. Mycelium kann, falls gewünscht, aus der Brühe vor der Behandlung entfernt werden, jedoch ist ec häufig zv/eclrmäßiger, die gesmat© Brühe direkt zu verwenden»

Im allgemeinen wird die Hydrolyse vorteilhaft bei einem pH-wert von 4 bis 8 durchgeführt« Der pH-Wert kann während der Reaktion unter Verwendung eines Puffers z.B. Phosphatpuffers, beispielsweise auf pH-Yert 6,0 gehalten werden. Die Hydrolyse wird zweckmäßig b&i Raumtemperatur,, d.h. etwa 25⁰C, vorteilhaft unter Rühren und/oder Belüften .der Reaktionraaisohung durchgeführt.

Die Menge an Esterase oder Esterase enthaltendem Material, die in einer gegebenen Reaktion erforderlich ist, kann leicht durch vorausgehende Versuchsansätze im kleinen Maßstab bestimmt werden, da sich gezeigt hat, daß das Verfahren gut maßstäblich vergrößert werden kann.

Die zur vollständigen Entacylierung der 3-Aoyloxymethylceph-3~ -em-4-carbonsäure erforderliche Zeit hängt von der Natur des Ausgangsmaterials und der Esterase und den verwendeten Reaktionsbedingungen ab, beträgt jedoch im-typischen Falle nicht mehr als 70 Stunden. Der Verlauf der Reaktion kann zweckmäßig durch !Trennen des Produkts durch Dünnschicht-oder Papierchroma-

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» ίο -

tograpliie unter Verwendung einer geeigneten Träger-Lösungsmittel-System-Kombination und densitometrische untersuchung verfolgt werden.

Besitzt das 3--AcyloxyIaet>lylceχJll-5~er>4-·caΓl)onsäure-AιlsgallgB-' material eine D-5-Amino-5~car"boxyi)Gntan'--amidogrtippe in der 7-StGllung, wie im Falle von Cephalosporin C, so kann das hydrolytische En-tacylierungsverfahren der Erfindung kombiniert werden mit der durch Eiizym katalysierten cxidativon. Desariinie rung der Gruppe in der 7--Stellung, beispielsweise in eins 4-Carfcoxyfctttananidügruppe durch Behandeln mit einer fungalen Oxidase, insbesondere einer Oxidase_? die sich von der Hefe !PricTonop3iB variabilis ableitet, v;ie in der britischen Patentschrift 1 272 769 und der- belgischen Patentschrift 782 393 beschrieben, kombiniert werden. Die ensyroatiöche Umwandlung der Gruppen in den 3- und 7-Steilungen k&xra entweder nacheinander oder gleichzeitig durchgeführt werden.

Die zur Isolierung des 5~Eydroxyraethylceph'~3"'em-4.-carbonsäureprodulrfces' verwendete Methode hängt von der Hatur des Produkts und des Reaktionssystems ab, wird jedoch in allgemeinen mittr Anviendung üblicher lechnikon durchgeführt. So können beispielsweise, falle ganse Zellen als Quelle für die Esterase verwendet werden, diese durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt werden (und falls gewünscht erneut verwendet v/erden) und die Lösung kann -weiter durch Filtrieren, £«B. durch ein Kieselgurbett geklärt werden. Mir den Pall_s daß die 3-Hydroxyraethylceph"3~em-4~earbüHsäure das Desacetyleephalosporin C ist, kann dieses beispielsweise dadurch isoliert werden, daß die Lösung durch Adsorption auf Kohlenstoff, gefolgt von Eluieren mit Aceton und Wasser, entsalzt wird, worauf das Eluat durch Adsorption auf ein Anionenaustausch^rharz (beispielsweise Amberlite IRA-68 in der Acetatform) und Eluieren des Desacetylcephalospörins von dem Hara mit Kaliumacetatlösung und Ausfällen des Prodiik-ts mit Aceton gereinigt werden. .Andere Techniken, die sur Isolierung von verschiedenen Cephalosporinprodukten angewendet v;erden können, umfassen die Lösungsmittelextraktion, Säureausfällung und Ausfällung beim isoelektrischen Punkt (im

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Falle von zwitterionischen Produkten wie (6R,7R)-7-"Amino-3-hydroxymethylceph~3~em-~4"-oarbonsäure).

Zusätzlich, ku den vorstehend beschriebenen Vorteilen und-praktischen Annehmlichkeiten, die die Verwendung von ganzen Zellen als Esterasecjuolle gemäß einer Ausführungsform des erfindimgjgemäßen Verfahrens mit sich "bringen können, ist das erfindungsgemäße 'Verfahren.aufgrund der leichten Kultivierbarkeit der Mikroorganismen des Genus Rhodetoru3.a zur Schaffung einer Esterasequelle, die Roprodusäierbarkeit dor IIydrolys ercakt ion unter Verwendung von Rhodotoriila-abgeloiteter Estcrass und die Leichtigkeit j mit der die erforderliche Esteraaeracsüge bestimmt werden kann, allgemein "bGGorders gut diirchiulwljas.¹ "bziv;. geeignet«,

Es haben sieh zahlreiche Spezies innerhalb des Genus Rhodotcrula als wirksaia erv/iesen, bevorzugt vervionöet vieröen 36Ö.ocl7 dio OrganiüJnon der Speis.tes Rhoclotorala rubra, Rhodotcruls. glutinis, Rhodotorula glutinis var* dairenensia imd Rhodotcrula graminia hinsichtlich der besondere v/jrksaiaen Hydrolyse von 3~Acyloxy3JiC-thyloepb--'3'--ei)i«-4-carbcrj.öä.urer)._idie durch clio, duroli diese Orgaiilcrieai produzierten Ecrteraseri gefördert "bsv.·* beschleunigt v;o:?:-dcn_e Das Verfahren viira Kweekraäßig unter Vex·« wendung von Sposieslculturtypen dieser Orgu,nieraen (erhalten vom CetraaXbareau voor Sohimmolcaltureß, 33«arn, DeIft, ITiedcrlande), d_uh* unter Verwendung der Stammt: Raodotorula rubra OES 17, Rhodotümla glutinis CBS 20, Rhodotorula glutinis var» dairenensis" CBS 4406 und Rhodotorala graiuinis CBS 2826 durchgeführt ·

Ein weiterer Rhodotorula rubra - Stamm, der sich als besonders v/irksam beim erfindungsgemäßen Verfahren erwiesen hat, ist der beim Gstntraalbureau voor Schimmelcultures unter der Nummer CBS 6469 hinterlegte. Dieser Stamm hat die folgenden Charaktex'ist ika ί

Nach 24"Stiüidiger und 72-stündiger Aufzucht auf Malz-Hefe-G-Xukose-Peptan-Plüsslgmedium waren die Zellen kurz und oval,

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2 - 4,5/WX 2,5 - 5,5m und traten einzeln oder in Paaren auf. Nach einmonatigem Wachstum lag eine nicht f lockenföriaige Abscheidung vor. Es hat sich kein Film, oder Ring von Zellen an der Oberfläche der Flüssigkeit gebildet und an der Wand des Rohres war mir ein leichtes aufsteigendes Wachstum au erkennen. Nach 72-stündigem Wachstum auf Mals-Hefe-Glukose-Pepton-Agar waren die Zellen sphärisch bis oval, 2 - 5aa χ 2,5 - 7a, und traten einzeln oder in Paaren auf. Fach einem Monat zeigte eine Streich- bzw, Streifenkultur strahlend rosa, sehr glänzende und sehr glatte ^ellen.

Nach 4 Wochen trat keine Pseudomycelentwieklung auf Oberflächenkulturen (ßlide-Kultur) unter Verwendung von Kartoffeldextrose-Agar oder Maismehl-Agar und keine Sporenbildung nach 5 oder 4 1/2 Wochen auf Karotten, ITatriumaoetat-Agar oder Gorodkowa-» Agar auf.

Nach 3 Wochen vmrde keine Gasbildung nach der Durhanv-Rohrmethode während der Zuckerfermentation unter Terwendung von Dextrose, Fructose, Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose, Melibiose, Raffinose, Srehalose oder löslicher Stärke auf.

Das Wachstum wurde nach 1,2 und 3 Wochen im flüssigen Medium unter der Verwendung der folgenden einzigen Kohlenstoffguellen beobachtet: Glucose, Galactose, Sucrose, Maltose, L-Sorbose (latentes Wachstum, .das nach zwei Wochen auftrat), Cellobiose, !Erehalose, Eaffinose, Melezithose, D-Xylose, I-Arabinose, D-Arabinose, DRibose, L-Rhamnose (latentes Wachstum trat nach 1 Woche auf X Äthanol,· Glycerin, Bernsteinsäure, Adonitol, D-Mannit, D-Sorbit und Salicin. Unter Verwendung von lactose, Melibiose, · 3-öslicher Stärke, Inulin, Milchsäure, Erythrit, DuIcit, α-Methylglucosid und Inosit wurde unter den gleichen Bedingungen kein Wachstum beobachtet.

Ein Wachstum wurde nach 1, 2 und 3 Wochen in flüssigem Medium unter Verwendung von Ammoniumsulfat und Äthylaminhydrochlorid als einzige Stickstoffquelle beobachtet. Es trat jedoch keine Ifitrat-Assimilation auf.

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Der Test auf die Hydrolyse von Fett 'and die Stärkeprodiiktion verlier/» die Spaltung von Arbutin war positiv. Es trat !rein Wachst-um in einem Medium mit 60 # osmotischem Druck auf und in einem vitaminfreieia flüssigen Medium trat lediglich nach 16 Sagen ein leichtes Wachstum auf. Im flüssigen Medium trat ein Wachstum in Anwesenheit von 100 ppm Actidion auf.

Unter Verwendung eines Kalk enthaltenden G-orodkowa-Mediums erfolgte .keine Klärung des Mediums während des Wachstums des Organismus, was anzeigt, daß Iceine Säure produziert wurde·

Dieser Stamm wurde in den Beispielen 1 - 11 und 14-16 verwendet.

Speziestyp-Eulturen „der Spezies des Genus Rhodotorula_? die in den Beispielen 12 und 13 verwendet wurden, wurden vom Gentraalburaau. voor Schiminelcultures erhalten*

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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Alle Temperaturen sind in Grad C angegeben.

Beispiel 1

Herstellung von (6r,7R)-7-(D-5-AminO"5-carboxypentanamido)-3--hydroxymethylceph-3-em-4-Garbonsäure

500 g (etwa 10% Reinheit) Kalium-(6r,7R)-3-acetoxyraethyl~7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)<ieph-5-em-<ty-carboxylat wurden in Wasser gelöst und durch Hindurchleiten durch einen sterilen Asbestbausch sterilisiert. Die Lösung wurde zu 2 Liter sterilem Phosphatpuffer (400-m-molar, pH 6) in einer 10-Literflasche gefüllt, wozu anschliessend etwa 2 Liter einer Suspension von Rhodotorula rubra gefügt wurden, die drei Tage auf einem mit 1 % Gew./Vol. (6r,7R)- -5-acetoxymethyl-7--(D-5-amino-5-carboxypentanamido)ceph-3-eni-4-carbonsäure versetzten ITährmedium gezüchtet wurde. Das Endvolumen betrug etwa 8 Liter und die Mischung wurde unter Verwendung eines MagnetrUhrers gerührt und durch-Einsprühen von steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern pro Minute belüftet.

Nach 60 stündiger Inkubation bei Raumtemperatur zeigte es sich durch Chromatographie, dass mehr als 90 jt des Cephalosporins als (6r,7R) -7- (D-5-Amino-5-carboxypentanamido) -J-hydroxymethylceph--^- -em-4-carbonsäure vorlagen. Die Brühe wurde durch Zentrifugieren geklärt und der pH-Wert vor dem Beladen auf eine'mit Kohlenstoff gepackte Säule auf 4,5 eingestellt. Nach dem Beladen wurde der Kohlenstoff mit gekühltem mineralisiertem Wasser (4 Betttfolumen, bed volumes)-gewaschen und mit 40 Jo-igem, wässrigem Aceton (4-Säulenvolumen) eluiert. Das Eluat w.urde an eine Säule von Amberlit IRA-68 Anionenaustauscherharz in der Acetatform absorbiert und mit gekühltem demineralisiertem Wasser (2-Säulenvolumen) gewaschen. Die Säule wurde anschliessend mit 0,1 m-Kaliumacetat eluiert und das Eluat wurde mit Aceton (5j75 Volumenteile) behandelt. Die resultierende Ausfällung wurde abgetrennt und an der Luft bei 55° getrocknet, wobei man 68 % der Tite!verbindung (68$- ige Reinheit)- erhielt, deren physikalische Charakter!stika denen einer authentischen Probe gleich waren.

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Beispiel 2

Herstellung von (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-^-em-4-carbonsäure

Es wurde eine Brühe von einer Cephalosporin C Fermentation (Cephalosporium acremonium Brotzu) aseptisch gesammelt. 4 Liter der gesamten Brühe wurden in ein steriles 5-Literfermentiergefäss (Fermenter) überführt. Der pH-Wert der Brühe wurde mit 5*i-Phosphorsäure auf 5,0 eingestellt und die Brühe wurde mit 8OO U/Min, gerührt. Sterile Luft wurde in das Fermentiergefäss in einer Geschwindigkeit von 5 Liter/Minute eingeblasen. Um die Autolyse des Cephalosporiumorganismus zu verhindern, wurde eine 50 $-ige (Gew./Vol.) Glukoselösung mit einer Geschwindigkeit von 7>Q ml/Std. eingeführt. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 5 n-Phosphorsäure je nach Erfox-dernis im Bereich von 5*0 bis 5*5 gehalten.

Die Kultur wurde mit 400 ml Rhodotorula rubra Brühe inoculiert, die durch Aufzucht des Organismus bei 25° während 36 Stunden auf einem Aufzuchtmedium hergestellt wurde, das 2,2 <$ (Gew./Vol.) Glukose, 0,25 % ( Gew./Vol.) Stickstoff als Mais-Einweichflüssigkeit, 0,5 fö (Gew./Vol.) Kaliumdihydr ogenpho sphat und 0,1 fa (Gew./ Vol.) einer 1:1 Mischung von Propylenglycol und von weissem Mineralöl (white mineral oil) enthielt (der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 5*8 eingestellt). Nach der Sterilisation wurde eine Lösung von Kaliurn-(6R,7R)~3-acetoxynethyl-7-(D-5-arnino-5-c£rboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carboxylat zu dem Aufzuchtmedium zur Bildung einer Konzentration von 0,1 ^ (Gew./Vol.) gefügt.

Proben der gemischten Kultur wurden zur Untersuchung entnommen. Die Brühe wurde I5 Minuten bei 3OOO U/Hin, zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten wurden durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Nach 12 Stunden war kein Cephalosporin C in der Probe mehr vorhanden, und eine neue Verbindung war entstanden, die als (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypenta.namido)-3-hydroxyrnethylceph-J-enl·-^-carbonsäure identifiziert wurde. Die Konzentration dieser Verbindung betrug 6,2 mg/ml.

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4 Liter der gemischten Kultur wurden anschliessend durch ein Bett ein sr Filterhilfe nach Einstellung des pH-Werts auf 4,5 filtriert und es wurde (6R,7R)-7~D-5-A.mino-5-car.boxypentanamido)-3Th;;^r'--OXyniethylceph-3-em-4-carbonsäure aus dem Piltrat in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 abgetrennt. Das Produkt wurde an der Luft bei 35°C, unter Bildung von 17,1 g der Titelverbindung, mit sirior Reinheit von 7δ>8 % ausgedrückt als freie Säure getrocknet.

Beispiel J>

Herstellung von (6R,7R)-jS-Hydroxymethyl^-(thlen-2-ylacetamido)-qeph-3 - e"*r ^ - c arbonsäur e

210 g (97,7 % als Na-SaIz) (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(thien-2-ylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure wurden in 2 Litern entmineralisiertem Wasser gelöst und durch Leiten durch ein steriles Äsöestfilter sterilisiert. Die Lösung wurde zu 4 Litern 0,5 m-Pho-sphatpuffer (pH 6,0) gefügt, die in einer 10-Literflasche tfghrsnd j50 Minuten bei 1400 kg/m einer Autoklaven Behandlung unterzogen worden waren. Die gepufferte Lösung von (6R,7R)-3-A.oetoxytTiet;hyl-7-(thien-2-ylacetamido5-ceph-3-era-4-carbonsäure wurde mit 2 Litern einer Kultur von Rhodotorula rubra inoculiert, die 3 Tage bei 25 . auf einem Rotationsschüttler in Anwesenheit

1 % (Gew./Vol.)- (6R,7R)~3-Acetoxymethyl-7-(thien-2-ylacet- e,mläo.)<te-ph^-em~M—G&rbons'ä.iire aufgezogen worden war.

Die· Kultur wurde mit 3 Litern pro Minute belüftet und unter Verwertduhg eines Magnetrührers gerührt. Die Umgebungstemperatur feetrug 25° und der pH-Wert der Kultur betrug durchwegs 6,0-6,4. Infc^rvraliweise wurden Proben zur Dünnschichtehronatographie gegsn Standarölösungen von (ÖR,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(thien-2--ylacetarnido)<:eph-3-em-4-carbonsäure und die Titelverbindung, entnommen. Eine komplette Umwandlung war nach 67 Stunden erzielt. Die. endgültige Potenz betrug ¹^ 25000 pg/ml und das Volumen 6630. ml.

Bevorzugte Systeme zur Prüfung der Ausgangs- und Endverbindungen waren die folgenden:

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Vorbeschichtete Celluloseplatten (MN 300, Camlab Cambridge) wurden in 0,1 m-Acetatpuffer (pH 5,0) getaucht und langsam getrocknet. Das Lösungsr.iittelsys-tera wurde durch Schütteln von 8 Vo lucent eilen Äthylacetat, einem Volumenteil n-Butanol und 8 Volumenteilen Acetatpuffer während 2 Stunden hergestellt. Die wässrige Phase wurde verworfen und die organische Phase wurde zur Befeuchtung der Platten verwendet. 1 nLiter einer geeignet verdünnten Probe wurde als Fleck am Ursprung aufgebracht und ein pLiter Standardlösung, die 5000 μg/l enthielten, wurde . zum Vergleich verwendet. Die Platten wurden in etwa 45 Minuten entwickelt, getrocknet und mit UV-Licht während 10' Minuten (A._mQ„ 253 nm)' bestrahlt und die getrennten Cephalosporine wurden densitometrisch quantitativ bestimmt.

Die nichtpolare Natur der Thienylacetamidogruppe in der 7-Stellung erlaubt die Lösungsmittelextraktion der 3-Hydroxymethylverbindung beispielsv/eise wie folgt:

Zu den 6630 ml Brühe wurden I30 ml Formalin zur Tötung der Hefe gefügt. Nach dem Stehen wurde die überstehende Lösung abdekantiert und in 1000 ml Ansätzen wie folgt extrahiert: Der pH-Wert der Lösung wurde auf 2,2-2,5 eingestellt und 2 Liter Butylacetat wurden zugefügt. Die wässrige Phase wurde erneut mit 200 ml Butylacetat extrahiert. Die Butylacetatfraktionen wurden vereint (2000 ml) und eine 12,5 $-ige Kaliumacetatlösung in Brennspiritus (vergällter Alkohol., bzw. industrial methylated spirit) wurde tropfenweise zugesetzt bis keine weitere Ausfällung mehr erfolgte. Das Produkt wurde filtriert und mit Aceton gewaschen. Die Wirksamkeit der Extraktion aus der Brühe für das Kaliumsalz betrug> 70 ?o und die Reinheit des Produkts war gross. Der Zersetzungs-Schmelzpunkt von 194-I98⁰ ist der gleiche wie
Titolverbindung veröffentlichte.

Beispiel 4

von 194-198 ist der gleiche wie der für eine authentische reine

Herstellung von (6R,7R)-3-Hydroxyraethyl·^7-■(fchien-2-ylacetarΓ,iάo)■ c eph-^3- Q-'·"'- 4- carbons äur e

a) Ί kg einer Rhodotorula rubra Suspension, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, und durch Gefrieren konserviert,

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wurde zu 10 Litern destilliertem Uasser gefügt und unter Rühren wurden 500 g Natrium-(6R,7R ^-acetozynethyl-^-(thien-2-ylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat, 250 g Kaliumdihydrogenorthophosphat und 28,5 g Dinatriumhydrogenorthophosphat zugefügt. Die Mischung (pH 5*8) wurde heftig gerührt, während ein rascher Luftstrom eingeleitet wurde. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtehroniatographie auf Siliciumdioxydgelplatten, entwickelt in 0,5 m-Natriumchloridlösung und durch UV-Licht sichtbar gemacht, verfolgt. Wach J>k Stunden war das gesamte Ausgangsmaterial verschwunden. Die Hefe wurde durch Zentrifugieren entfernt und zurückgehalten, und die überstehende Flüssigkeit wurde durch Filtrieren durch ein Kieselgurbett geklärt.

Das Filtrat wurde rasch mit 10 'fo Orthophosphorsäurelösung auf den pH-Wert 2,1 angesäuert, während bei Raumtemperatur gerührt wurde und der feste Niederschlag wurde so rasch wie möglich abfiltriert und sorgfältig mit destilliertem Wasser gewaschen bis die Viaschlösungen frei von Säure waren. Die (6R,7R)-J5-Kydroxymethyl-7-(thien-2-ylacetamido)-ceph-3-em-4—carbonsäure wurde im Vakuum bei 40° getrocknet und man erhielt J564 g (86 γ> der Theorie). Sie ergab eine klare Lösung in HeOH und 5 fo Natriumbicarbonatlösung und wies ein [a]^ + 135° (c_ 1 <p₃ MeOH) auf. Das Ultraviolett-, Infrarot- und PMR-Spektrum waren den für die authentische Titelverbindung veröffentlichten gleich.

b) Erneute Verwendung von Rhodotorula rubra. Die wie in vorstehend a) wiedergewonnene Rhodotorula rübra wurde in 10 Liter Wasser suspendiert und 500 g^v(6R,7R)-3-acetoxymethyl- -7-(thien-2-ylacetamido}ceph-3-em-4-carboxylat, 250 Kaliumdihydrogenorthophosphat und 28,5 g Dinatriumhydrogenorthophosphat wurden zugefügt, und es wurde wie vorstehend in a) belüftet und gerührt. Die DünnschichtChromatographie zeigte, dass die Reaktion nach 22 Stunden vollständig abgelaufen war, worauf das Produkt wie vorstehend in a) isoliert wurde, wobei man J)S¹J g (86,5 % der Theorie) erhielt. Lösungen in Methanol und Natriumbicarbonatlöfiung waren klar; ta] _D - I36⁰. Das. UV-, IR- und PMR-Spektrua .waren gleich den für die authentische Titelverbindung veröffentlichten.

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Die Hefe wurde, weitere 6 mal unter Bildung eines Produkts mit zufriedenstellender Qualität und bei gleichen Ausbeuten wiederverwendet.

Beispiel 5

Herstellung von (6r,7R)-7-1 2- (Fur-2-yl)-2-räetho:-;yiminoacetamiaoI -3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure (syn-Isomeres)

5,0 g (11.0 mMol)des syn-Isomeren von Natrium-(6R,7R)-3-acetoxymethyl-7-C 2- (f ur-2-yl) -2-methoxyiminoacetamido] ceph-3-eni-4-cart)oxylats wurden in einer gerührten Pufferlösung gelöst, die 1,23 g Kaliumdihydrogenorthophosphat und 0,144 g Dinatriumhydrogenorthophosphat in 100 ml destilliertem Wasser enthielt. Eine gefrorene Suspension von Rhodotorula rubra (10 g) wurde zu der Mischung gefügt, es wurde mechanisch gerührt und während 32 Stunden konti-,nuierlieh bei Raumtemperatur belüftet. Durch Dünnschichtchromatographie an Siliciumdioxydgel, bei Entwicklung in 0,5 m-Natriumchlorid und Sichtbarmachen durch Ultraviolettlicht ergab sich, dass die Hydrolyse vollständig war. Die Hefezellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die klare überstehende Flüssigkeit wurde auf 2° gekühlt und mit 100 ml 4-Methylpentan-2-on behandelt.-Zu der gerührten Mischung wurde bis zum pH-Wert 2,0 eine 20 #-ige wässrige Lösung von Orthophosphorsäure zugesetzt. Es wurde weitere 3 Minuten gerührt und das Produkt wurde anschliessend rasch durch Filtrieren isoliert, mit 2 χ 10 ml 4-Methylpentan-2-on, 1 χ 10 ml Salzlösung, 2 χ 10 ml Wasser bei 0° gewaschen und im Vakuum bei 40° getrocknet, wobei man 3,25 g (77,5 $ der Theorie) der Titelverbindung erhielt. Das Produkt wurde in der Atmosphäre equilibriert und zeigte einXmax (pH 6) von 275 nm (E 17050); das Infrarotspektrum und das PMR-Spektrum, sowie die Elementaranalyse . stimmten mit der zugeordneten Struktur überein; die Reinheit erwies sich durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPEC) als 98,2 ^.

Beispiel 6

von

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5*0 g (6R₃Jb)-J-Acetoriyinethjl-Y-aiuinoceph-J-o^-^-carbonsäure-toluolp-sulfonatdihydrat wurden in 100 ml destillierten Wasser bei Raumtemperatur suspendiert. Arnnioniurnhydrozydlösung (S.G. O,88o) wurde bis zur völligen Auflösung zugesetzt (pH 7*6). Die Lösung wurde
mit 10 g einer tiefgefrorenen Suspension von Rhodotorula rubra
behandelt. Die Suspension wurde mechanisch gerührt und kontinuierlich 30 Stunden bei Raumtemperatur belüftet, wobei während dieser Zeit die Hydrolyse zu 95 ίο vollständig war (überwacht durch Dünnschicht-Siliciumdioxydplatten, Entwicklung in 0,5 m-Natriumchlorid, Sichtbarmachen unter Ultraviolettlicht).

Die Hefezellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die klare überstehende Flüssigkeit wurde nach dem Abdekantieren auf 10° gekühlt. Der pH-Wert wurde mit 20 % Orthophosphorsäure auf 3,6 eingestellt und das Produkt wurde durch Filtrieren isoliert, mit
V/asser gewaschen und im Vakuum bei 4o° getrocknet, wobei man 1,23 g (52,0 % der Theorie) der Titelverbindung erhielt;A.„__v (pH 6)

max

264,5 nm (E 7000); Reinheit durch HPLC 94 %. Die Infrarot- und
K-IH-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

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Beispiel 7

Herstellung von (6r,7R,2'R)-7-(2'-t-Butoxycarbonylamino-a'-phony1-aoetamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure

Sine Suspension von 14,67 g (6r,7R, 2^fR)-3-A.cetoxymethyl-7-(2'-tbutoxycarbonylamino-2^t-phenylacetarnid(j)-ceph-3-em-4-carbonEäure in 100 ml' Wasser wurde mit 2n-Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 6 gebracht. Die resultierende Lösung wurde mit 100 ml 0,4m-Phosphatpuff er vom pH-Wert β verdünnt und eine gefrorene Paste von ganzen Zellen, die aus einer Kultur von Rhodotorula rubra (βθ g) erhalten wurde, wurde zugefügt. Die Suspension wurde heftig gerührt, wobei Luft durch die Mischung während 28 Stunden geblasen wurde. Die Mischung wurde zentrifugiert und die überstehende Lösung abdekantiert und mit 35 g Natriumchlorid behandelt. Die Lösung (die etwas gelatineartiges Material enthielt) wurde mit Kieseiguhr geklärt. Das Filtrat wurde mit 500 ml Äthylacetat behandelt-und auf 5 gekühlt, worauf es mit 25 fo Phosphorsäure unter heftigem Rühren auf den pH-¥ert 2 gebracht wurde. Die resultierende Emulsion vnirdedurch einen Trichter aus gesintertem Glas filtriert, und die organische Phase wurde abgetrennt und mit Salzlösung gewaschen und getrocknet. Das vorstehend erhaltene Kieseiguhr wurde mit 200 ml Wasser gewaschen und das Filtrat mit Natriumchlorid gesättigt und wie vorstehend beschrieben, unter Äthylacetat auf den pH-Wert 2 gebracht. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet. Die vereinten Äthylacetatlösungen wurden im Vakuum auf etwa 80 ml konzentriert und die Lösung auskristallisieren gelassen. Filtration ergab 5,93 g der Titelsäure in Form von feinen Nadeln vom F = I8o bis 188° (Zersetzung); [a]^⁰+ 19,1° (c = 1,1 Dioxan);J\ _ov (pH 6-Phosphatpuffer) 259 nm (£ 7200)

Beispiel 8

Herstellung von (6r,7R,2'R)-3-Hydroxyraethyl-7-(2*-hydroxy-2'"-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure

Eine Suspension von ?. g (6R,7R,2'R)-3-Acetox27meth3rl-7-(2^l-lr;droxy- -2^t-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure-Äthanolsolvat in. 30 ml Wasser wurde mit 2n-Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 6 gebracht ·

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und die resultierende Lösung wurde mit 30 ml O,4m-Fhosphatpuffer vom pH-Wert 6 und einer gefrorenen Paste von ganzen Zellen, die aus einer Kultur von Ehodotorula rubra (10 g) erhalten wurden, versetzt. Die Suspension wurde heftig während 16 Stunden in einem Becher gerührt. Die Mischung wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und. mit Natriumchlorid gesättigt. Die Lösung wurde mit Kieseiguhr geklärt und das Filtrat mit Kthylacetat behandelt. Es wurde anschliessend auf 5 gekühlt und mit 25 % Phosphorsäure unter heftigem Rühren auf den pH-Wert 2 gebracht. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Salzlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum auf ein geringes Volumen verdampft. Die Mischung wurde filtriert, wobei man 1,05 g der Titelsäure in Form von kleinen Plättchen vom F = 225 bis 2^0° (Zersetzung) erhielt; [α]ί:⁰+ 98° (c = 1,1, 0,1 m-NaHCO,),X _mav (pH 6-Phosphatpuffer) 2βθ nm (ε8200).

Beispiel 9

Herstellung von (6R,7R)-7--[ 2-(Fur-2-yl)-2-metho::yirninoacetariidol- -3-hydroxymethylceph-j3~em~4-carbonsäure (syn-Isomeres)

a) Eine Suspension von 101 mg des syn-Isomeren von (6R,7R)-3-Crotonoyloxymethyl-7-[2-(fur-2-yl)-2-methoxyiminoacetamido3-ceph- -3-em-4-carbonsäure in 3 ml Wasser wurde mit gesättigtem Natriumbicarbonat auf den pH-Wert 6,8 gebracht. J5 ml 0,4 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 und eine gefrorene Paste von ganzen Zellen, die aus einer Kultur von Rhodotorula rubra (Ig) erhalten wurden, wurden zugesetzt. Die Suspension wurde heftig in einem offenen Gefäss während 17 Stunden bei etwa 20° gerührt und anschliessend zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und mit Kieseiguhr geklärt und unter Bildung eines amorphen Feststoffs gefriergetrocknet. Dieses Material . glich chromatographisch (Rf 0,17- auf Merck Siliciumdioxydplatten mit Chloro- ■ form:Methanol:Essigsäure = 90:16:5) und im PMR-Spektrum (in DoO) der aus dem J-Acetoxyrnethy !derivat in Beispiel 5 hergestellten Verbindung.

b) Sine Suspension von 203 mg des syn-Isomeren von (6R,7B)-3-53Jßzoyloxymethyl-7-[ 2- (f ur-2-yl) - 2-methoxyiminoacetaniido] ceph-3-

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— 23 em-4-carbonsäure in 3 ml Wasser wurde mit gesättigten Natriurnbicarbonat auf den pH-Viert 6,5 gebracht. 3 ml O,4rn-Phospnatpufier vom pH-Wert "6 und eine gefrorene Paste von ganzen Zellen, erhalten aus einer Kultur von Rhodotorula rubra (Ig) wurden zugefügt und die Mischung- wurde wie vorstehend unter a) beschrieben, behandelt. Das Endprodukt hatte nach dem Gefriertrocknen einen Rf-Wert und ein PMR-Spektrum (DpO) das dem des authentischen Materials gleich war. · .

Beispiel 10

Entacylierung von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-forniamido-ceph-3-em- -4-carbonsäure

Eine Suspension von 12,0 g (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-formamido-"ceph-3-em-4-carbonsäure in 150 ml Wasser wurde mit Im-Natriumhydroxyd auf den pH-Wert β gebracht. Die resultierende Lösung wurde mit 90 ml 0,4m-Phosphatpuffer vom pH-Wert β verdünnt und es wurde eine gefrorene Paste aus ganzen Zellen, erhalten aus einer Kultur von Rhodotorula rubra (öl,5 g) zugesetzt. Die Suspension wurde 19 Stunden heftig gerührt. Nach dem Zentrifugieren der Mischung, Abdekantieren der überstehenden Flüssigkeit und Klären der Lösung mit Kieselgur wurde das Produkt durch Reaktion mit Diphenyldiazomethan charakterisiert, was 8, 44 g Diphenylmethyl-(6R,7R)-7-formamido-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carboxylat in Form von kleinen Nadeln vom F = I58⁰ (Zersetzung) ergab; [al_D + 16,2° (c = 1,1 Aceton){K._m„„ (Äthanol) 258 nm (£7300). Das Infrarot-Spektrum und das PMR-Spektrum sowie die Elementaranalyse stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

Beispiel 11

Entacylierung von (6R,7R)-3-Aoetoxymethyl-7~(D-S-carboxypentanamido)oeph-3-em-4-carbonsäure

1 g (6R,7R)-3-Aoetoxymethyl-7-(D-5-benzoylamino-5-carboxypentan amido)-ceph-3-em--4-carbonsäure wurde in 100 ml 0, lm-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 gelöst. Teile von 10 ml dieser Lösung vrurden

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- 2h -

in jeweils in zehn 100 nil kenische Glaskolben gefügt.

Zellen von Rhodotorula rubra, die in einem ITährrsedium wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgezogen wurden, wurden in 0,Im-Fhosphatpuffer durch Zentrifugieren gewaschen und erneut in einem gleichen Volumen des gleichen Puffers suspendiert. Teile von 2,0 ml dieser Suspension wurden, anschliessen in Jeden der 10 Kolben gefüllt, die (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-benzoylamino-5-carboxypentänamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure enthielten. Die Kolben wurden anschliessend bei 25° in einem Rotationsschüttler mit einer Schüttelweite (throw) von 5 cm, der bei 2^5 U/Min, arbeitete, inkubiert. Die Proben wurden durch Dünnschichtchromatographie auf mit Cellulose beschichteten Platten, unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 70 #-igem(Vol./Vol.) wässrigem n-Propanol analysiert. Eine Probe des Ausgangsmaterials wurde als Markierung chromatographiert. Die Ausgangsverbindung hatte einen Rf-Viert von 0,69, eier während der Inkubation verschwand. Nach 72 stündiger Inkubation war keine feststellbare (ÖR,7R)-J5-Acetoxymethyl-7-(D-5-benzoylamino-5-carboxypentanamido)ceph-3~ em-4-carbonsäure vorhanden, und es wurde eine neue Verbindung mit einem Rf-Wert von 0,59 beobachtet. Diese Verbindung wurde durch Reaktion mit Diphenyldiazomethan charakterisiert, was 0,70 g Diphenylmethyl-(6R,7R)-7-(D-5-benzoylamino-5-diphenylmethoxycarbonylpentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carboxylat ergab, das (durch Infrarot-Spektrographie) mit einer authentischen Probe identisch war.

Beispiel 12

Herstellung von (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-' hydroxyrne thyleeph-3- Qffl-4- carbons äur e

JB&s Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch eine Brühe von Rhodotorula graminis CBS ZoZo anstelle der Rhodotorula rubra Brühe verwendet wurde. Die Aufzuchtsarbeitsweise für Rhodotorula graminis war die gleiche wie die in Beispiel 2 für Rhodotorula rubra beschriebene. ' .

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Durch Chromatograph!sehe Analyse (Lünnschichtchronatographie wie in Beispiel 2) zeigte sich, dass die Bntacetylierung innerhalb 18 Stunden vollständig war und die Konzentration an (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanaraido)-3-hydrox3*niethylceph-3-eni-4-carbonsäure betrug 6,45 rag/ml. Die Brühe (4 Liter) wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert, wobei man 16,5 g der Titelverbindung mi't einer Reinheit von 73*3 ■» ausgedrückt als freie Säure erhielt. ■

Beispiel 13 Herstellung von (6R,7R)-7-(D~5-Amino-5-carboxypentanamido)-3·-

hydrojiymethylceph-^-ein-^-carbonsäure unter Vervrendung \T2 des genus Rhodotorula

Proben jedes Organismus wurden auf Agar-Schrägkulturen eines Hefeextrakt/Pepton-Aiifzuchtmediums subkultiviert und bei 25° inkubiert, bis die Oberfläche bedeckt war. Primäre flüssige Kulturen, die von den Schrägkulturen ' incculiert waren, vrurden unter Schütteln 48 Stunden kultiviert und ansohliessendzum Inoculieren von sekundären flüssigen Kulturen des gleichen Mediums mit 0,1 % (Gew./Vol.) (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure, die zur Induktion der Enzymaktivität zugesetzt wurden, verwendet. Nach 72 stündiger Inkubation wurden die sekundären Kulturen zur Entacylierung von ( 6R, 7R) -3- Ac etoxymethyl-7-(D-5- amino- 5- c arboxypent anamido )-ceph- -3-em—4-carbonsäure verwendet.

Proben von 8,5 ml 0,Im-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 und 1,0 ml einer 10 $-igen (Gew./Vol.) wässrigen Lösung von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)ceph-3-em-4-carbonsäure vrurden mit 0, 5 rnl-Teilen von Hefebrühen, die wie vorstehend hergestellt wurden, inkubiert. Jede Probe wurde durch Dünnschichtchromatographie auf Celluloseplatten, unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 70 Jj (Vol./Vol.) wässrigem n-Propanol ■untersucht, wobei auf jeder Platte Bezugsproben von (oR,7R)-j5~ Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5~carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-car-

bonaäure und (ÖR,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure auf jeder Platte mitliefen.

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Die Ergebnisse der Untersuchungen von (6R,7R)-J5-Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanaraido)<jeph-5-em-4-carbonsä'ure (Ceph, C) und (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-j5-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure (DAC) nach 24-stündiger bzw. 72-stündiger Inkubation waren gefolgt:

*	Stamm-	Konzentration von Ceph-C und DAC (im/ml)	DAC	nach 72 Stunden	DAC
Rhodotoru'la Species		nach 24 Stunden	6960	Ceph.C	61Ö0
	GBS 17	Ceph-. C	1130	-	2100
R* rufrra	CBS 317 ■	530	6100	3900	6840
R«. aurantiaca	CBS 4406	6820	7300	_"~ ■■	7060
R. glutixiis var. dairenensis	CBS 20	796	1130	_-	1740
R, glutinis	CBS 5826		1130	5320	4580
R. lactosa	CBS 2365	• 6730	1590	612	2700
R» marina	CBS' 319	7000	1130	4360	2320
R. minuta	CBS 320	5460	2720	4260	4520
R. pallxda	CBS 5804	6320·	976	1:750	1280
R. pllin^.nae		4700	512Ö
Kontrolle.;.-" keine Hefe · ·	6820

Beispiel 14

Herstellung von (6R,7R)--7-(4-Carboxybutanainido)-^-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure.

14 mg (6R,7R)-j5-Acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanaraido)-ceph-5-em-4-carbonsäure in 3,5 ml Wasser wurden mit 0, 5 ml Im-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 und 0,5 ml Wasser vermischt und mit 0,5 ml Rhodotorula rubra Brühe inoouliert. Kontrollproben, die keine Hefe-

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- 27 brühe enthielten, wurden auch aufgesetzt.

Nach Inkubation über Nacht bei 25° in einem Rotationsschüttler, wurden die Proben durch Dünnschichtchromatographie auf Celluloseplatten analysiert. Das. Lösungsmittelsystem war 70 $-iges (Vol./VoL) wässriges n-Propanol und die Zonen wurden unter Verwendung eines Densitometers ermittelt. In Proben, zu denen die Hefebrühe zugesetzt war, was das Ausgangsmaterial (Rf 0,62) verschwunden und durch eine neue Verbindung mit einem Rf-Wert von 0,47 ersetzt. Die Behandlung mit verdünnter Säure zeigte keine Wirkung auf die Kontrollproben, die mit Hefe behandelten Proben wurden jedoch in eine Verbindung mit einer erhöhten Mobilität (Rf = 0,50) auf der chromatographischen Platte umgewandelt. Dieses Verhalten spricht dafür, dass das Produkt der Hefebehandlung die Titelverbindung ist.

Das Produkt war auch mit dem durch Behandlung von (6r,7R)-7-(D-5-Amino-5~carboxypentanamido)-3-hydrox3?-methylceph-3>-em-4-carbonsäure mit-D-Aminosäureoxidase aus Trigonopsis variabilis in Anwesenheit von Natriurnazid erhaltenen Produkt identisch.

Beispiel 15 .

Herstellung von (6R,7R)-7~ _i (P.-5_i-Aniino _i ~5-Oarboxypentanamido)~^-»h.ydyoxymethylceph-^-em-ft-oarbonsäure unter Verwendung von- in PoIyacrylamidgel eingeschlossenen Rhodotorula rubra Zellen.

Eine Kultur von Rhodotorula rubra wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. 10 ml der Brühe wurden durch Zentrifugieren gewaschen und in einem gleichen Volumen von 0,1 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 erneut suspendiert.. Die Suspension wurde mit 40 $ (Gew./Vol.) Acrylamidmonomerem in 10 ml Puffer, 2,3 % (Gew./Vol.) Ν,Ν-Methylentoisacrylamid in 6'ml Puffer, 0,0575 g Ammoniumpersul-.fat, 0,048 ml Ν,Ν,Ν,Ν-Tetramethyläthylendiamin und 34 ml 0,lffl-Phosphatpuff.er vom pH-Wert 6 vermischt. Durch diese Suspension wurde Stickstoff geblasen, und es wurde bis zur vollständigen Polymerisation in ein Eisbad getaucht. Ein Teil des resultierenden Gels wurde durch ein Sieb ( lichte Maschenweite 0,84 mm = 20 mesh) zur

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Herstellung kleiner Teilchen extrudiert. Das gesiebte Gel wurde extensiv mit Puffer gewaschen, bis in den Waschlösungen keine Hefezellen mehr vorhanden waren.

Teile von 4,0 ml der Gelsuspension wurden Jeweils mit 5*0 nil 0, ImPhosphat puff er vom pH-Wert 6 in Glaskolben vermischt und mit 10 % (Gew./Vol.) (öRiTRj-^-Acetoxymethyl-T-^CD-S-amino-S-carboxypentanamido^eph-jj-em—ij—carbonsäure (1,0 ml) inoculiert. Nach 42-stündiger Inkubation bei 25 g auf einem Rotationsschüttler wurde durch dünnschichtchromatographische Analyse sichtbar gemacht, dass die Konzentration an (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-²}— carbonsäure 5,86 mg/ml betrug, wo-Jiingegen die Konzentration an (6R,7R)-3-Aoetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure auf 0,78 mg/ml gefallen war. Kontrollen mit Polyacrylamidgel ohne eingeschlossene Hefezellen wiesen lediglich Konzentrationen von (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-^-hydroxymethylceph-jj-em^-carbonsäure von 1,2 mg/ml und restliche Konzentrationen von (6r,7R)-J-Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)<ieph-3-em-4-carbonsäure von 5*48 mg/ml auf.

Beispiel 16

Herstellung von (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hyd- »roxymethylce«)h-3f em-4-carbonsäure unter Verwendung von Rhodotorula rubra Zellen, die in Cellulosetriacetatfasern eingeschlossen waren.

Rhodotorula :rubra wurde unter Schütteln bei 25°C während 72 Stunden in Anwesenheit von 0,1 % (Gew./Vol.) (6R,7R)-3-Acetoxymethyl- -7- (D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure kultiviert. Die Zellen von 40 ml der gesamten Brühe wurden gewonnen, durch Zentifugieren gewaschen und erneut in 7 ml Wasser suspendiert. Aus dieser Suspension wurde durch Zugabe von 2 ml der Suspension zu 10 ml einer 5 #-igen (Gew./Vol.) Lösung von Cellulosetriacetat in Methylenchlorid und rasches Rührten der Mischung während 2 Minuten, unter Verwendung eines mechanischen Rührers, eine Emulsion hergestellt. Die resultierende Emulsion wurde durch eine Injektionsnadel aus rostfreiem Stahl (Everett Star, Grosse 0) in einen

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Wirbel extrudiert, der durch heftiges Rühren von Toluol, unter Verwendung eines Magnetrührers, erzeugt wurde. Es wurde ein kontinuierlicher Faden herausgezogen und um den Rührer gesammelt. Der Faden wurde aufgenommen, in Wasser gewaschen und in Wasser bei 4° gelagert. Das Gesamtgewicht der gewonnenen feuchttroekenen Faser betrug 1,5 g.

Proben von 0,4 g derFaser wurden auf einem Filterpapier trockengepresst und anschliessend in eine Mischung von 9 ml 0,1 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 und 10 $> (Gew./Vol.) (6R,7R)-j5~Acetoxymethyl-7~(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-'ⁱl·-carbonsäure (1,0 ml) gefügt. Nach dem Inkubieren auf einem Rotationsschüttler bei 25° wurden zur chromatographischen Untersuchung Proben entnommen. Es zeigte sich, dass (6R,7R)-7-(D-5-Arnino-5-carboxypentanamido)-5-hydroxymethylceph-3-ern-4-carbonsäure in einer Geschwindigkeit von 2,75 mg/g Faser/Stunde gebildet wurde.

Die Faser wurde aus dem Inkubationssystem wiedergewonnen und in Wasser gewaschen. Die gleiche Faser wurde erneut zur Entacylierung von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-amino~5~carboxypentanamido)-ceph-J-em-*!— carbonsäure verwendet. Man erhielt eine Produktionsgeschwindigkeit von (6R,7R)-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxy*ethylceph-3-em-4-carbonsäure von K,15 mg/g Faser/Stunde ♦ mit der neuerlich verwendeten Faser.

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Claims

Patentansprüche

Λΐ/ Verfahren zur Umwandlung einer 3~Acyloxymethylceph-3-em~4-carbonsäure· in ein 3-Hydroxymethyl Analoges davon durch Hydrolyse, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse durch eine Esterase katalysiert wird, die durch Kultivieren eines Hefemikroorganismus oder einer Mutante davon, des Genus Rhodotorula, erzeugt wird.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die 3-Acyloxymefchylceph~j5-em-4-carbonsäure eine 3-Acetoxymethylceph-3-em-4-carbonsäure ist.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die 3-Acyloxymethylceph-^-em-^-carbonsäure eine Verbindung der allgemeinen Formel

r ~^N\^ CH₂O. CO. R

COOH

ist, worin !t. eine Aminogruppe oder blockierte bzw. geschützte Aminogruppe .ist; R₂ ein Wasserstoffatom oder eine niedrig-Alkyl-, niedrig-Alkoxy-, niedrig-Alkylthio-· oder niedrig-Alkanoylgruppe ist; R^.CO eine carboxylische Acylgruppe mit 2-20 Kohlenstoffatomen ist; und B die Bedeutung von > S oder > S »0 hat.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, dass

R₂ ein Wasserstoffatom ist und B die Bedeutung von . > S hat.
5. Verfahren gemäss Anspr-uch 3 oder¹ 4, dadurch gekennzeichnet, ■ dass R. ausgewählt ist aus D-5-Amino-5-carboxypentanamido und

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2A23Ö58

N-geschützten Derivate davon; 4-Carboxybutanamido; Formamido; einer Gruppe der Formel

. R.(CH₂)_n.C0NH -

worin R eine carbocyclische oder heterocyclische Arylgruppe oder eine Aryloxy-, Arylthio-, Aryl-niedrig-alkoxy- oder Aryl-niedrigalkylthiogruppe ist, und η eine ganze Zahl von 1 bis K ist; einer Gruppe der Formel

R^a-CH-C0NH-t

worin R^a eine Arylgruppe ist und X 'Amino, geschütztes Amino, Carboxy, Carbalkoxy oder Hydroxy bedeutet; und einer Gruppe der Formel

R^a - C - CONH-

Il

a b

worin R wie vorstehend definiert ist und R ein Wasserstoffatom oder eine Acyl-, niedrig-Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder Arylniedrig-alkylgruppe ist.
6. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass R. ausgewühlt wird aus D-S-Benzoylamino-S-carboxypentanamido, Thienylacetamido, 2-Hydroxy-2-phenylacetamido, 2-t-Butoxycarbonylamino~2~phenylacetamido und syn-2-Furyl-2-methoxyiminoacetamido.
7. Verfahren gemäss einem, der Ansprüche j5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass R-χ.CO eine Acylgruppe ist, die ausgewählt wird aus niedrig-Alkanoyl, niedrig-Alkenoyl, Aryl-niedrig-alkanoyl und Aroyl.
8. . Verfahren gemäss Anspruch 7* dadurch gekennzeichnet, dass R-*.CO Crotonoyl oder Benzoyl ist.
9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass R-2.CO Acetyl ist.

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10. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die ^-Aeetoxymethylceph-J-em-^-carbonsäure Cephalosporin C ist.
11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte Brühe einer Cephalosporin C-Fermentation mit der Esterase behandelt wird.
12. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die ^-Acyloxymethylceph-^-em-^-carbonsäure mit einer Esterasequelle in Kontakt gebracht wird, die ganze Zellen enthält, die aus einer kultivierten Brühe des Hefemikroorganismus erhalten wurden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die ganzen Zellen in oder auf einer inerten Matrix immobilisiert sind.
14. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 1\ dadurch gekennzeichnet, dass die 5-Acyloxymethylceph-^-em-4-carbonsäure mit zellfreier Esterase in Kontakt gebracht wird, die in- oder auf einer inerten Matrix immobilisiert ist.
15· ■ Verfahren gemäss Anspruch 1J> oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die inerte Matrix Polyacrylamidgel oder Cellulosetriacetat umfasst.
16. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die 3-Acyloxymethylceph-j5-em~4-carbonsäure direkt mit einer kultivierten Brühe des Hefemikroorganismus behandelt wird.
17. Verfahren geraäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus der Species Rhodotorula rubra oder- eine Mutante hiervon verwendet wird.
18/ Verfahren gemäss Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Rhodotorula rubra CBS 6469 verwendet wird.
19. Verfahren gemäss Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Rhodotorula rubra CBS 17 verwendet wird.

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20'." Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bisl6, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus die Species Rhodotorula glutinis, Rhodotorula glutinis var. dairenensis oder Rhodotorula graininis oder eine Mutänte von diesen verwendet wird.
21. Verfahren gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Rhodotorula glutinis CBS 20 verwendet wird.
22. Verfahren gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Rhodotorula glutinis var.dairenensis CBS 4406 verwendet wird.
23. Verfahren gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Rhodotorula graminis CBS 2826 verwendet wird.
24. ^-Hydroxymethylceph-J-em-if-carbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch ein Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Patentanspruchshergestellt wurden.

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ORIGINAL INSPECTED