DE1545915A1 - Verfahren zur Herstellung von Antibiotika - Google Patents

Description

.F.Zuimtein

Dr. R. Koenigsb*rg«r ^Hlb

Case 3.78-906

GLAXO IiABORATORIES LIMITED, Greenford, Middlesex, England

iSSMSSiS^MSSifcnSS

Verfahren zur Herstellung von Antibiotika

Die Erfindung betrifft Verbesserungen bezüglich der Herstellung von Abbauprodukten von Cephalosporin C und Derivaten davon.

Cephalosporin C ist ein Antibiotikum der Struktur

	CH2.0.COCH,	t
/CH2		- CO
S	o.aoüH,
Nm
I
CH
X*

worin X¹ eine α-Aminoadipoylaminogruppe ist. Derivate von Cephalosporin C, In welchen die Seltenkette X* eine andere Acyläminogruppe als eine a-Aminoadipoylaminogruppe ist, z. B.

—*

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eine Phenylaoetaminogruppe oder eine Thlenv-laiietamidogruppe, oder in denen der Amidostickatoff weiser substituiert ist", können ebenfalls über 7-Aminooephalo8porßnsäure {7 -ACA) hergestellt werden, mid der Ausdruck "Derivate von Cephalosporin C" bedeutet hier auch Derivate dieeer Art sowie /-ACA selbst. Beispiele anderer Varianten der Seitenkette X' sind unter anderem in den belgischen latent 3 :;hrif -;on "635 13',» 64I 338, 645 868, 645 869 und 650 445 beschrieben.

Cephalosporin C ist; ein Derivat der biaycliachen Verbindung Cepham, welche folgend« Struktur aufv/cist:

CH₂ ~ CH ' ₂CH, O = C^-N^ ³CH,

(vgl. J.A.C.S., 84 (1962), Heite 3400) und wird v;ie angegeben beziffert«. Die hier verwendeten systematischen Bezeichnungen für die Cephalosporin-Derivate beruhen auf dieser Molekülaratruktur-

Cephalosporin C und dessen Derivate können einer enzymatiachan Hydrolyse unter Verwendung einer aus Orangenschale stammenden Eaterase (britische Patentschrift 966 222) unterworfen werden, um Produkte zu ergeben» worin die Acetoxygruppe durch eine Hydroxygruppe ersetzt ist, und aue derartigen Produkten können

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Analoge von Ceph&2 :/3}.« /-in 0 und dessen Feriva^en hgrges-te-i it vrerden, die. -s^att oj-i.'.?:. "oetuxygruppe -beiBpje .8weisi andere ,layj.o.'cygriyp'T: cd'-'!" -·-. V·'xyßr'i}".'üi. aufweisen. iSol.ehe-- Analogen oind v-o ti ,T.n-tersi>FC'_r äa. ir.shrfire von vhren ,ins Vergib?, oh mj t Cep'ial-Oi*P^v>-'i-^r '■ ■' *— incdifiKJ -.v':a Y/rlrlcsanikeit b f. f.» It κ en.

JJie. encyaatj i"jhe liyirn^yse vors Cepiialosporiln C und descen r-er*'.-vatßn mit.teJ.ε dor vjj ii'i-tjesterQao let uvibaquem, "or alreia» wer?n ■ man in größerem Maßa^at· arbeitet, da olna r=c-I>r έ',ϊ-^ße .rmaah".. von Orangen erforder3,ioli ist, uk r.i'Gr-ei.^hond ^nsyra su:v livd^O-'yae oelbst irleiiier wongcv· :-v, e:e~<;i' ieiii

Ko wurde -gefunden,. άπ5 -οί£r.i..kriiaoD-;e2'f_i33 "und' Εε"';?:ΐοΘη, die aus. Specie.3 der Gc.iu;= -)-if;w>"'u:ii ctaima'?/', sui- Η,γΰΐ·.; yog von Cephalosporin u "nd -'a. "^-2Π βϊ\'ί.''-r 'can f-su den e:itsp:-:i: '"ikonden Ilydroxymath^ !•%crbi:ii«>r;.· ο - hu±:^:> '.,_;L e'ivifl- ^!)ie '-'sr-v..üidung von V/cisenkeiiaea'ternsc ist bosc:cc τ ,sv.'so'kriäßig-,.- la ^:¹.; ". v' ¹Ii^ in verhältnismäßig grcSi-m 7-aßrt?l: Oi;}\alten v^crdea 2ro7;i,

Me Verwendung ein 3 α 1-i >:.'■«:o:.v-;.-:-.i-J-ömicr £>Is Quej ■ e von i^iKyre ist auch besonders Ev/sekttäf: iß _t da im a.'.r.geiceineii ier Crganitnuo 'leicht in i-reßeia I-j^ßstfb anr^h or ai 2)1 cckunnte /vbeitövrclt-sn« die in der li'srKC-rtuiitioraiudustrie grit eingeführt sind, gozixoh-Tet werden icann* .uie sii2,yiaati-s-?li^ Hydrcij.yas korn t-öispielsweiae einfach fcevrirkt v/erßöü,, inüem a&r Organismus sit deir. Cöplialc-sporin C odsr dem Berivat davon inkubiert ivini, oder, was bevorzugter ist, dar Organisüma Iz&nn gez-ü?*htet '/erden und es^erese-

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haltiges Material daraus hergestellt werden, das für eine anschließende Hydrolysentufe benutzt werden kann.

Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren aur Herstellung von Verbindungen der Formel

^GH₂.OH

S C. COOH II,..,,.. L-H — I» .

CH GO
t

worin X eine Acyimriiuo- oder eine AmiUo(NHp)-K-uppe bedeutet, dur;ih Hydrolyse von Verbindungen der Formel

JGH₂.0.COCH₇,
S ^C,COOH I₁

It'

CH - 00

in v;eIcher X die oben angegebene Bedeutung besitzt, mittels einer Eijteraee, v/obei sich dan Verfahren dadurch auszeichnet, daß man als Lstcrsas V/eiKenksinestsrase oder eine von einer Species der Genus Rhiaobium stammende Estera3e verv/endet.

Vi^reir,enkeimeoter-aäe ivjrd 7oraug&weise ale eaterasehaltige Extrakte ""-on V/elsonlreiii vsi'v/endöt« Solche Extrakte werden zweckmäßig hergestellt, indem nteii V/eiHenkeiai .durch Extraktion mit einem

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Kohleiiwasserstofflösungsmittel, zv B. Petroläther, entfettet«. Der entfettete Weizenkeini kann 'dann als solcher verwendet werden, oder das Enzym kann aus dem festen Rücketand durah Extrak ti gh mit Wasser extrahiert werden, wobei sish die erhaltenen " - ■ wässrigen Extrakte zur direkten Verwendung im erfindungsge- . mäßen Verfahren eignen, &in Verfahren zur Herstellung von Extrakten von Weizenkeimesterase ist beispielsweise von Singer et al. in Arch, Biochem, und Biophys» ,18, 229 (1948} beschrieben.

Bakterien der Genus RhiEobium sind bekannt al3 die Stickstoffbindenden Bakterien._t die sioii in den-Wurzelkuollsn; /on verschiedenen Leguminosen pflanzen, a. B. Klee .i'frifoliuin), Lupine (Lupiiius) und Süßbohne (Lathyrus-odoratus) finden. Zu Species der Genus Rhieobium, bei welchen gefunden wurde, daß sie eine Esterase des gewünschten- -Eyps bilden, gehören Rhizobium trifolii, Rhizobium lupinil, Rhisobium japonicura, Rhizobium leguminosarum und..Rhizobium. phaaeoli.

Im allgemeinen scheint, die gewünschte Rlvizobiumes+erase am besten aus einer Wilöktiltür eines Organismus der Genus Rhizobium abzustammen (das heißt eines Stammes, der direkt von einer Pflanze isoliert wurde), und in einigen Pällen wurde gefunden, daß unzufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden können, wenn mail einen Organismus verwendet, der aus einer Kultursammlußg (culture öoliection) stammt,'möglicherweise aufgrund einer Mutation de~a Organismus unter den Bedingungen, unter welchen er

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■fc" j

in der Sammlung gehalten wird. Die. Isolation des Organismus aus natürlichen: Quellen kann nach Methoden durchgeführt werden» wie sie von Buchanan et al„ in "Bacteriology", 5·- Auflage, The Macmillan Co. New York, 1951» beschrieben sind. . , _;

Bis ,jetzt,wurden beste Ergebnisse durch Verwendung von Rhizo-. bium trifolii erhal.ten, das als fjtämme. ,vom wilden Typ aus Trifolium dubium isoliert wurde.. Solche Stämme entsprechen der Beschreibung von Rhizobium trifolii, die. von,Bergey in "Manual of Determinative Bacteriology", 7. Auflage, Baliere, Tindall and Gox, London, 1957» Seite 295» beschrieben Bind. Es wurde Jedoch; festgestellt, deß_f zusätzlich zu den van Bergey angegebenen- Merkmalen■ £>tamme von-lic tri£olii_r die oichala besonders brauchbar zeigten, ein wasserlösliches rotes Pigment auf _..-., Mannit-Agar bilden.

Wie oben angegeben,, .kann die-erfindungsgemäße.-Hydrolyse, ,ypn-, ,,, Verbindungen dar. oben beschriebenen Formel I einfach durch,..;,. =-, Inkubiereji des Rhisobium-Organismua mit der zu. hydrolysieren--. .. den Substanz durchgeführt werden, oder indem man alternativ· _ί!(Γ zuerst den Organismus züchtet und dann ein enzymreiches Material daraus .herstellt, das man in einer, getrennten. Hydrolysistufe , r verwendet. Die zweite dieser .Arbeitsweisen jwird bevorzugt.,

Organismen der Genus ..Rhizobium können auf üblichen Medien entweder mittels Oberflächenkultur oder aerober Submerskultür . gezüchtet werden» wobei letztere bevorzugt wird. Geeignete- Medien sind beispielsweise von levine et al. in ¹¹A compilation

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of culture media for the cultivation of micro-organisms¹¹. The Williams and Wilkins Co., Baltimore 1930, unter dem Stichwort "nitrogen fixation" (Stickstoffbindung) beschrieben. Ein Medium auf der Basis von Fleischextrakt und Peρton hat eich ale sehr zufriedenstellend gezeigt. Ein anderes Medium, das verwendet werden kann, ißt ein solches auf der Baals von Hefeextrakt, Mannit und üblichen Näh real zeit «* Im* allgemeinen liegt der Stick stoffgehalt'des Mediums vorzugsweise zwischen 0,i und 0,3 ?£ N, z* B. 0,2 i» N. Kohlehydrate können nach Erfordernis zugegeben werden.

Zur Durchführung der Hydrpl5^rse der Verbindung der Formel I in einem Züehtungsmedium wird die Verbindung einfach in das Medium einbezogen, und der Organismus wird in üblicher Weise gezüchtet.

Um ein enzymha]tiges Material ßiio einer Züchtung einer Species der Genus Rhizobluin heraus te Ilen, wird die Züchtung durchgeführt, um ein reichliches Wachstum zu liefern, wobei eine Züchtungszeit von etwa 24 Stunden, im allgemeinen zufriedenstellend ist. Die* Zellen können denn ge erntet v/erden, beispielsweise durch Zentrifugieren und anschließendes Waschen» Die isolierten !Zellen werden dann einer Behandlung mit einem mit Wasser mischbaren Organischen Lösungsmittel aur Entfernung von Wasser und Fett unterworfen. Geeignete Lösungsmittel sind mit Wasser mischbare Ketone, s. B. Aceton_r und mit Wasser mischbare Alkohole, z. B. Äthanol. Eine solche Behandlung kann beispielsweise durchgeführt werden,'.indem man die isolierten Zellen wieder in Wasser

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suspendiert, und die erhaltene Suspension in einen großen Überschuß des mit Wasser mischbaren Lösungsmittels gießt und an-Bchiießend rührt. Die erhaltene Festsubstanz kann mit frischem Lösungsmittel gewaschen werden und 1st dann fertig zur Verwendung.

Die erfindungsgemäße Hydrolyse einer Verbindung der Formel I (wie eingangs definiert) un^er Verwendung einer oben beschriebenen enzymhaltigen FeBtsubstanz aus Rhizobium oder unter Verwendung von Weizenkeimesterase kann in wässrigen Medien, vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8, durchgeführt werden. Wenn 7-ACA das Substrat ist, wird der pH-Wert vorzugsweise bei etwa 6,45 gehalten. Die enzymhaltlge Festsubetanz aus Rhizobium kann im Wasser suspendiert und für eine kurze Zeit inkubiert werden, um die Zellen zu hydratisieren. Die Verbindung der Formel I wird dann zugegeben, zweckmäßigerweise als Sal»,, z. B. das Natriumsalz. Der pH-Wert wird dann rasch auf den gewünschten Wert eingestellt» Die Hydrolyse wird dann durchgeführt, indem man das Gemisch bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise zwischen 20 und 45° C, hält, bis die Hydrolyse beendet ist. Die Beendigung der Hydrolyse kann festgestellt werden, indem man von Zeit zu Zelt einen Anteil des Reaktionsgemische D mit Alkali titriert.

Der pH-Wert kann mit fortschreitender Hydrolyse eingestellt werden, um ihn innerhalb der gewünschten Grenze zu halten, in-- dem man Alkali zur Neutralisierung der gebildeten Essigeäure

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zugibt. Wenn bei dieser Arbeitsweise die theoretische Menge an Alkali, die dem Acetatgehalt der zu hydroIysierenden Verbindung entspricht, verbraucht ist, kann die Reaktion als beendet betrashtet werden. Die Beendigung kann auch durch chroma, tographisehe Analyse verfolgt werden.

Die Hydrolyaeprodukte können durch übliche Methoden gewonnen werden, wobei das tatsächliche Verfahren von der Art des Produktes abhängt. AIa Vorstufe wird die Hydi'olyaeflüsaigkeit vorzugsweise zuerst zur Entfernung von X^Jrotein daraus, ζ. B. durch Zugabe eines Proteinfällungsinittela, wie einea mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Aceton oder Methanol, und anschließende Abtrennung des gefällten Proteins, z. B. durch Zentrifugleren und/oder Filtrieren, behandelt.

Bei LÖBungemittei-löaliehen Hydroxymethylderivat en von Cephalosporin G, ζ. B. 7-PhenylaeetanidQ~;^4iydroxymethyl-eeph-3-em~-4-säure und 7-(Thienyl~2'"acetamido)-3--hydroxymethyl-ceph-3-eni-4-säure, kann die Kultur aus der Hydrolyse (unter Verwendung entweder lebender Organismen oder einer enzymhaltigen Peatsubstanz) bei einem saueren pH-Wert der Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren lösungsmittel für das gewünschte Produkt unterworfen werden. Die Extraktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 3 - 4 durchgeführt, Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören beispielsweise Esterlösungsmittel, e. B. Äthylacetat oder Butylaoetat, und mit Wasser nicht mischbare Ketone, s. B. Methylisobutylketon, Die ao erhaltenen LÖBungsmittelextrakte Kinnen mit Wasser, zweckmäßiger\\reise bei einem pH-Wert von

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■ *

BAD OBJGiNAL

6 - 8, ζ. B. etwa 7,5» reextrahiert v/erden, und das gewünschte Produkt kann gewonnen werden, z. B, durch Xyophilisieren," oder die LÖBungsmittelextrakte können zur Trockne verdampft werden. Das erhaltene Produkt kann nach Wunach umkristallisiert werden. Im Falle von Produkten, die nicht in Lösungsmitteln lös-IAoh sind, a. B. 7-(D-V-AmInO--^¹ oarboxypentanamido)-3-hydroxymeihyl-ceph-3 - em-4-3äure und 3-Hydroxyme thyl -7-amino~ceph-3-ein~ 4-3äure, kann das Raaktionsgeniiach" zuerst zur Entfernung von Protein und anderf.m, hochmolekularen Material wie oben beschrieben behandelt werden. Das gewünschte Produkt kann dann durch Adsorption aus einen geeigneten AnJ.onenaustaußclierharz aus gepufferter Lösung und anschließende EIution gewonnen werden. Die erhaltenen Extrakte können aufgearbeitet v/erden» am die gewünschte Substanz zu gewinnen, beispielsweise lyophilisiert/und weiter nach. Wunsch behandelt werden.

3-HydroxymDthyl~7"amino-ceph-3-eni-4~säure (das Reaktionsprodukt von 7-ACA) wird zweckmäßiger gev/onnen, indem man den pH-Wert des Reaktionsmediuias auf den isoelektriachen Punkt des Produktes, daa heißt einen pH-Wert von etwa 4,5t einstellt, um die Ausfällung des Produktes zu bewirken. Der Niederschlag kann dann abfiltriert oder abzentrifugiert und gewaschen werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

9 0ä8 8 57 17.3,7*

- 'i 1

Vorarbeiten;

Wenn wässrige Weizenkeimesterase in den Beispielen verwendet wird, wurde diese vd.e folgt hergestellt:

100 g Weizenkeim wurden durch Extraktion mit 3x5 Volumen niedrig-siedend,ern Petroläther (Kp 40 - 60° C) entfettet und dann an Luft trocknen gelassen* Die entfetteten Weizenkeiine wurden dann mit 1 Liter .«asser bei 4° C 15 Minuten gerührt und bei 0° C 20 Minuten bei 1800 U.p.H. (1100 χ g) zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann entweder sofort bei den Versuchen verwendet oder im Tiefkühlschrank aufbewahrt, bis sie gebraucht wurde.

Herstellung,von Rhigobium-acetyleateraae-haltigen Featsubstanzen

a) Schüttelflaschenkultur^ Aus Trifolium dubium durch Züchtung von oberflächensterilisierten Wurzelknollenabsehnitten auf N&hragarmedium isoliertes Rhizobium trifolii wurde auf Nahragarschräg3clinitten gehalten. Zellen aus einem Schrägschnitt wurden in 10 ml sterilem Wasser suspendiert und zur Beimpfung von 10 χ 40 ml Flaschen von Nährbrühe, wie nachfolgend unter b) beschrieben, verwendet. Die Flaschen wurden auf einem Drehschüttler 2 Tage bei 26° inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 5° geerntet,einmal mit Ringerlösung gewaschen und wieder zur Bildung eines dicken Zellbreies zentrifugiert.

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Der Zellbrei aus 200 solcher Flaschen wurde in 50 ml Wasser verteilt und in 1 Liter kräftig gerührtes Aceton gegossen. Das Rühren wurde bei Zimmertemperatur 30 Minuten fortgesetzt worauf die trockene Zellmasse durch Filtrieren gewonnen wurde. Nach Waschen mit frischem Aceton und Xther wurde der Filterkuchen an der Luft getrocknet. Ausbeute * 8,0 g.

b) ZÜchtung in Laborator1umsfermentationagefäßen. Der gleiche Stamm von Rhizobium wurde auch in 5""Liter Fermentationsgefäßen wie folgt gezüchtet:

120 g ^MLab.Lemco"-Fleischextrakt, 120 g "Oxoid^tl-Pepton und 60 g Natriumchlorid wurden in 12 Liter Leitungswasser gelöst und 30 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde mit 12,5 al 1On Natriumhydroxyd auf 7,2 eingestellt. Dann wurden Mengen von 3x3 Liter in 5-Liter Fermentationsgefäße unter Rühren zusammen mit 3 ml 30 tigern (Vol./Vol.) "Foamrex" (Mobil Oil Co.) in weißem Mineralöl, um als Antischaummittel.zu wirken, eingefüllt. Die Fermentationsgefäße wurden 30 Minuten bei 1,05 at (15 psi) sterilisiert. Jedes Fermentationsgefäß wurde mit 20 ml aus einer 24 Stunden alten Nährbrühkultur des Organismus beimpft und bei 26° inkubiert. Das Fermentationsgefäß wurde mit 6 Liter/Minute belüftet und mit 600 U.p.M* gerührt. Die Fermentation wurde bei 46 Stunden abgebrochen, wo der pH-Wert auf 8,90 gestiegen war. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 5° C geerntet, einmal mit Ringerlösung gewaschen und wieder in 50 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wurde in 1 Liter Aceton gegossen und bei Zimmertemperatur 30 Minuten gerührt. Der Niederschlag wurde

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filtriert, mit frischem Aceton und Äther gewaschen und an der Luft getrocknet, was ein enzyrahaitigea Pulver ergab. . Ausbeute « 11,6g.

c) Eine alternative Nährbrühe für die Kultur dor ßhizobium apeciea ist wie folgt:

irDifco"-Hefeextrakt	50 g
Mannit	50 g
K2HPO4	1 6
MgSO4 .	ig
NaCl	' ig
CaCl2.6H2O	1g
FoGl3 Wasser	Spur ad 51
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,1	eingestellt.

Es sei darauf hingewiesen, daß die BeEeiehnungen "Difco", "Amberiite¹¹, "Oxoid", "Lab. Lerne ο", "Nujol", "Foamrex" und "Whatraan", die in den Böispielen und dem einleitenden Abschnitt verwendet werden, eingetragene Warenzeichen sind.

Der in den Beispielen erwähnte Thienylrest ist der 2'~Thienylreat. ' ' '■■ ■'.·■" ■ ' ♦

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·■.■■■'.'-"

^BAD

Beispiel 1;

Hera teilung von 7-(D-5' -Amino- 5' ~oarbpxypentaiiainldo) -3-hydroxyme thyl--ceph- 3 - em-4"

1,62 g Cephalosporin O-Natrlumsalz ;atwa 00 $ig rein) wurden In 325 ml Y/eizenkeimextrakt gelöst und der pH-Wert vurde auf 6,7 eingestellt. Diese Lösung wurde dann bei 37° G inkubiert, und der pH-Wert wurde mit ^n NaOII in stündlichen Intervallen eingestellt. Nach 4 Stunden v/ar die theoretische Menge an in NaOH (2,4 ml) zugegeben, was einer vollständigen Freisetzung der Essigsäure entsprach.

Dann wurden 2 Volumen Aceton zugegeben und dae ausgefallene Protein wurde abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann im Vakuum bei 30° C auf ein Volumen von 28 ml eingeengt. Nach der Zugabe eines gleichen Volumens 0,6n Pyridinacetat bei pH 5tO wurde die Löeung oben auf eine Säule von Araberiite XE58-Harz in der Acetatform gegeben, die in 0,3n wässrigem Pyridinaeetat bei einem pH-Wert von 5»O gepackt war. Die EIution wurde mit O,3n wässrigem Pyridinacetat bei pH 5_f0 begonnen, und es wurden 25 ml Fraktionen gesammelt, wobei das Produkt in den Fraktionen 24 - 54 nach der Winhydrinmethode festgestellt wurde, Diese Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Die PeetiBubstanz wurde in 15 ml/:Wasser, gelöst und .' ." durch Zugabe von 100 ml trockenem Aceton ausgefällt. Hach : Mahlen zu einem Pulver unter trockenem Aceton wurde die. Peat* .-■-·, substanz in 20 ml V/asser aufgenommen» der pH-Wert wurde mit 1n NaOH auf 7,5 eingestellt und die Lösung wurde gefriergetrocknet.

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Die 850 mg des so erhaltenen Feststoffes wurden in 7,5 ml Wasser gelÖ3t und 17 ml Äthanol langsam .zugegeben.. Es wurde ein gefärbter Niederschlag; erhalten, der. verworfen wurde, und die Kristallisation wurde in der überstehenden Lösung durch langsame Zugabe von weiterem Äthanol angeregt. Das Produkt wurde mit Äthanol und Äther gewaschen und im Vakuum über CaCIp getrocknet. Ausbeute = 45^C3 mg.

200 mg wurden aus wässrigem Äthanol kristallisiert» wonach das Produkt die folgenden Eigenschaften hatte:

\nax. = 260 ayu ^Elcm >*> »/*-^V E«lf = ^{+ 109}°

Analyse; C^H^gO^N^S.lia · 2,5 HgO

Berechnet: C 36,7 II 5,5 N 9,4 S 7,0 '/. Gefunden: 36,4 5t8 9,51 6,89 .£..■

Eine Spur Cephalosporin C (< 2 f£) kannte durch Bioautographie in Methanol auf feuchten_f auf pH 6,0 'gepufferten Papieren, die 16 Stunden entwickelt'und .-auf Vibrio Gholerae-Platten inkubiert waren, nachgewiesen werden.

Beispiel g;

Herstellung^ von 7^PIi^enylacetamido-3~h^^^ 'eiii'""4·^ säure

25 E Natriuffl-t-phenylacetamidocephalosporanat wurden in 5 Liter

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wäBsrigem Weizenkeimesteraeepräparat gelöst. Der pH-Wert wurde auf 6,7 eingestellt und das Gemisch bei 37° C 4 Stunden inkubiert, wobei der pH-Wert in 1-etündigen Abständen mit 1n Natriumhydroxyd auf pH 6,7 eingestellt wurde. In 4 Stunden waren 87 1> der theoretischen Aufnahme von 61 ml erforderlich und die Reaktion wurde nach der chromatographischen Untersuchung als beendet betrachtet.

Nach Einengen im Vakuum bei 18° C auf ein Volumen von 1600 ml wurde das Protein in der Lösung durch Zugabe von 2 Volumen Aceton und anschließendes 10-minütiges Zentrifugieren bei 1500 U.p.M. ausgefällt. Der Niederschlag wurde mit 1 Liter 66 tigern Aceton in Wasser gewaschen, und die WaschflUssigkelten wurden mit der überstehenden Lösung vereinigt. Die Lösung wurde dann im Vakuum auf ein Volumen von 1500 ml eingeengt und mittels Filtrieren durch eine Asbestschicht geklärt.

Die Extraktion der 7-Phenylaeetamido-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-säure wurde durch Einstellung des pH-Wertes der wässrigen Lösung auf 3»5 mit 10 #iger Phosphorsäure und Extraktion in 3x1 Volumen Äthylacetat bewirkt. Dann wurde sie in 3 x 750 ml Wasser durch Zugabe vo» In llatriumbicarbonat zur wässrigen Phase bis der Gleichgewichts-pH-Wert 7,0 betrug, zurückextrahiert. Der Überschuß an Natriumbicarbonat wurde durch Behandlung mit überschüssigem Amberlite IRC 50 (H⁺)-Harz zerstört, die Lösung im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, was

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14 f 34 g amorphes Natrium- 7- phenylacetamido-3"hydroxyme thy I-

t _t *

ceph-'3-em-4~oat von 62 #iger Reinheit ergab.

Die Kristallisation wurde vorgenommen, indem diese Festsubetanz mit 500 ml Methanol extrahiert und die Lösung dann langsam eingedampft wurde, was in der ersten Ausbeute 3t266 g Material (95 % rein) und in der zweiten Ausbeute 4»3 g (65 $> rein) ergab. Die Reinheit dieser Proben wurde durch IFV-Absorption bestimmt, wobei ein theoretischer Wert von E-j _om ^ß 260 nyu - 240 fUr diese reine Substanz angenommen wurde.

Beispiel 3?

Herstellung von 7-!-Thienylaoetamldo-3-hydroxymethyl-ceph'-3-em-4-8äure

3,63 g T-Thienylacetamido-eephalOBporanaäure wurden in 50 al Wasser unter Zugabe von 1n Natriurabicarbonat, bis der pH-Wert 7,0 betrug, gelöst. 700 al wässrige Weieenkeimeeteraselösung wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37° C 4 1/2 Stunden Inkubiert, wobei der pH-Wert bei 6,3 gehalten wurde. Dann wurden 1200 ml Aceton unter Rühren zugegeben und das ausgefallene Protein durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum bei 30° 0 auf 250 ml eingeengt» der pH-Wert wurde mit verdünnter Phosphorsäure auf 3,5 eingestellt und die Lösung wurde mit 3 χ 250 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden* dann mit 3 x 50 ml H₂O unter Zugabe von 1n HaHCOyLöaung bei jeder Extraktion, bis der pH-Wert im Gleichgewicht 7,0 betrug, rückextrahiert. Diese vereinigten Extrakte wurden von

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überschüssigem NaHCO, durch Zugabe von "Amberlite" IRG 50 (H⁺) befreit, bis der pH-Wert auf 5.8 fiel.» Beim Gefriertrocknen wurden 2,76 g einer amorphen Feataubatanz erhalten. Dieae wurde in 110 ml Methanol gelöst» duroh Zentrifugieren geklärt und dann langsam eingedampft, bis die Kristalliaation einsetzte Diese war nach 24 Stunden bei 4° 0 beendet, was 926 mg einer kristallinen Pestsubstanz ergab» Λ « 235 m/U, R''° «

*a · £ \ CIu

235 m/u ~ 278.

Angenommene Reinheit» bezogen auf UV-Absorption, = 90 $.

Beispiel 4?

Herstellung von 7-BenzylthioaGetamido-3-hydroxyiaethyl>ceph-

4 g T-Benzylthioacetamido-eephalosporansauerea iiatriumsalz wurden in einer EnzymlÖsung gelöst, die aus 100 g entfetteter Weizenkeime, wie oben beschrieben, erhalten war, Der pH-Wert wurde sofort mit 1n Natriumhydroxyd auf 6,7 eingestellt und das Ganze bei 37° inkubiert. Der pH»Wert wurde in Zeitabständen mit In Natriumhydroxyd auf 6-7 eingestellt und die Reaktion beendet, wenn kein weiteres Alkali mehr verbraucht wurde«

Das Inkubat wurde mit 2 Volumen Aceton gerührt und das ausgefallene Protein abfiltriert. Aceton wurde dann, vom Piltrat durch Einengen im Vakuum bei 30° C entfernt. Me erhaltene wässrige Lösung wurde mit konzentrierter Phosphorsäure auf pH 2,5 eingestellt und mit 3x1 Volumen Äthylacetat extrahiert, wobei der pH-Wert nach Erfordernis wieder eingestellt wurde«

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"V4£

Oj β Λ jh^'^etatis^liiehi'j-j wurden abgetrennt und nc-foj't in t/'ϊ Volunion Wasser suruake:: träniert, daa so viel gesät Nctriumbi^arbonatlöeui¹^ -enthielt, um dio wässrige !.Milcht auf pH 7,0 e:u !»r.-.ngan. Bio'vereinigten wässrigen Πol'J.oJi",en wurden dann mit '"Amberlite" "KG 50-Harz ^; Rohm und Haas Go, auf einen pH Wert von etwa 5,0 eingestellt,, das Hara wurde ab:'iltrlert und das Filtrat lyophiXieiert. Die Auobeute betrug i!,84 ß.

Die Analyse durch UV-SpektrOBlcopie zeigte eine HeinLeit von 68 ^o Die ChroraatogrnphlG in J'*thy*ii?tietat-pH -'itO-Hat^iumäcetat- ?uffer&ya fcerß und die anochließör.da BioriUtographiG auf ■Staphylo-:< ecus aureus-Platten zeigten nur einen I\Ie<jken, welcher dor Hydroxyaäure entsprach.

Das Produkt, v.ürde weiter durcli Solventextraktion

Die oben erhaltene Festsubatan?. v/urde in 100 ml Wasaer gelöst und der pH^V/art-wurde wie vorher auf 2,5 ■ eingestellt. Die Hydroxysäure v/urde in Äthylacetat aufgenommen, indem sie mit 3 χ 50 ml Lösungsmittel geschüttelt wurde,» Dann wurde sie in PO ml Wasser reextrahiert, welches die theoretische Menge an ■Natriumbicarbonat enthielt (420 mg). Die Athylacetacschicht vrr.rde dann :iit ?ö nil Wasser gevasehen, das etwas gesättigtes Katriuiabioarbonat enthielt,,

Me wässrigen Schichten wurden vereinigt, der pH-We:."t wurde mit "Amberli"e" IHC 50-Harz wie vor! er eingestellt und dann vmrde

909885/1737 -,

BAD ORJGiMAL

Iy>philialert. Dies ergrtb ein Produkt, dan nach der UV-epektroekooiechen Anc.l,vse eine Heinhei t von 79 '% aufwieo.

Di ·} Dndreinigun?; wurde durch I'-i^otallisation bewirkt, uie obige Fe 3^OUbSt?. nz (". ;iö mg) wurde in hinein Gemisch von 2 ial 'Umei.hylsulfoxyd und 2 ml. Methanol' durch ge linde β Erwärmen gelöst. Naoh Ii Ltrieren wurden 6 ml Λ the;? rufjegeben und beim Abkühlen und sohieöcn o:u;h Krißtalle c\ia. .Oiese Kristallx· wurden ge~

v;o men und schienen nach der UV-Analyse rein zu "sein.

jo^hj¹,'!^' '-thienylaootP-mido-ce^h-^-cgi-^~r>äurc (ALtemativver.':'n.hren su Beiopie!· 5)

Vr'eU'.erikeime wurden --atfettei, indeif; aie in eine u"hron.-fttoß"ra,phl-HC ie oäulc- gepackt v.urden und Petroläther (Kp 40 - 60°) duroh üi.2 perko'.iorcii £*elessen vmrden» bia d.ao j-IIutvi l'arbloe war. Bi3 getrockneten Keine :</urden in eineii Polythenbeutel bei Ziianertemperatur aufbewahrt«

Eine ΠαερεηοίοΛ ν cn 250 g entfetteten V.'eizenkeiiaen in 2 Liter destilliertem Viaaser vnirde unter Rühren auf 37° 0 erwärmt. 30 g Hatrium-T-thienylacetamldo-ceph&losporanat wurden zugegeben ur.d düö ß-emiä3h Wurde 3 Stunden bei 37° gehalten. Während dieser Zeit wurde der pH-Wert durch Zugabe von 2n Hatriumhydroxyilösung bei 6,6 — 6_r9 gehalten. Bann wurden 3 Liter Aceton

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si gegeben, umi.Proteine cuusaufalieft, und die ausgefallene- Fesi stbatanii wurde durch Vakuum filtrier en entfernt vnü g-i»v5idl.Xüh mdt Wasoex· gewaschen. Das i^|liltra:t wurde im Vakuum auf atv/a 3 liter eingeengt, bevor ea mit 2 χ 500 ml jithylace^at wirde, um jsgirahea rteutralss Material zu entfernen> b±o wässrige Schicht wurde abgetrennt, mit i Liter Athyiactetat bedeckt und mit airupöeer Phosphorsäure auf pH 3,5 angesäuert. Während des Ans8,uerns wurde das Semisch kräftig gerührt. Die organisehe Schichtwurde abgetrennt und die wässrige Schicht gründlieh mit 2 χ 500 ml Äthylaoetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit SaIζsoIe gewaschen, über Magne— siumsulfat getrocknet und eingedampft· Während des Eindampfens schied eioh die kriatalline 3-Hydroiyjaetliy 1-7· thienylacetaeidoceph-3-eÄ«4-8öure aus und wurde aWiltriert. Äiiebeute » 13,4 β (55 5?ϊ· Einengen des Piltratö ergab eine weiter· Ausbeute von Ο»5 g en weniger reinem Material.

Des Produkt wurde aus Methanol umkristalliaiert. £8 hatte dann einen Sclimelzpunkt von 2Ö5 - 215° C (ZeraatZUiig),

138° (Methanol, * ^{a }}»⁰^ ^jaax. CWWÄ^batpufiStr* pH 6) nyu (B^_om * 596# £ * .14 000 )> ;Inflexton bei 259 ■/*

^{β 8 9}

1760 (ß-1mctaitt), 1720 C^COOH)_n und 1652 und 1555 cm"*¹ N.K.R,-Spektrum (D_g0_r JEiaHGO^)f If= 2,60, 2,98, 4,40, 4,95, 5,72_r 6,ίΟ, e_t33> 6*16 p.p^m.

Rj = 0,06 (Whatman Papier ITr. 1* mit Katriumacetat auf pH 5 gepuffert* Iiöaungainitteli Obere Phase Äthylacetatt n-Butanol t

90988 57 ff 0' ^C:

BAD ORIGINAL

.Ό-, i m Natriumacetat (pH 5,0) - B: 1:8 im absteigenden System bea 38°), Rj₁ - 0,68 (n-Propanol ι Wasser ~ 7.3) _t Hj, = 0,26 auf Kiiselsäurepiatten mit n-Butanol:Äthanol:Wasser - 4:1:5.

Berechnet! C 4*7,5 H 4,0 ϊί 7,9 S 18,1 Ge runden: 47,9 4,0 7,6 \Ί,9

Be.spiel β:

3-_} lydroxymethyI- 7-^Iiei}£l^:^%.etpjrrlCo--2eph--3- nia-l^yji·¹^ (A.Lternatiwerfahren zu Beispiel 2)

Diii oben be zeichne te Verbindung vmrde in ^lj0 /Üger Ausbeute aus Ka>rium-7-pKeny_lacetainido-cephelosporanat unter Anwondung der in Beispiel 5 beschriebanen Arbeitsv/cise hergastellt. Bes ProdiLit wurde aus Äthylacetat-I'iethtmol umltriBtalliöiort, F -■-19'-) - 195° C (Zersetzung), C-iIq⁵ = +■ Ϊ52° (Methanol, a = 1,0), ^iaax (IhOB-phetpu-ffe-r, pH 6; - 260 B/U (B j^_m * 248} £ «' 8 700), ^■eax. (^Nui^o1} ^{:ϊ 5 56}° (OK), 3 200 XHH), 1 752 fß--Lactam), 1 718 (COOH) und 1 642 und *, 540 ?ai"' (COiIH). U.Tl.R,-Spektrum 11)»Ο,- HaHCO₅): V- 2,58j 4,35; 4,88; 5,69? 6,26; 6,45 p,p.m, R« = 0,06 (V/hati89n Papier Hr, 1, auf pH 5 mit Hatrlumacetab gesuffert. Lösungsmittelι Obere Phase Äthylanatat:n-Butanpl: 0,im Natriumacetat (pH 5) - 8:1:8 im absteigenden System bei 38° C), Ht, - 0_f66 (n-Propanoi:i7asssr = 7O).

09885/173 7

Λ/iclyao: C _rH,_rN_o0_rS

hnf t: Π "S2 II 4,6 N 8,0 C «,2 ?'

JL',-?£· ?Λ .7.1. ■

3-I;/y cL-ü^yinothy 1- ?- "^T ~tS' Jil¹ ί^Γ.-ί^'Ρί;™'VrU¹I^ölΓ.Λ°^^".S'-:.?,¹⁵! :4ζέ"5Βϊ5.

3-H,ydrox:=ßf!-ihiI· *.-·ι2" , ö^r-eii-f cthoxybcne.aniido «-oopb-5 cm-4-eäure wurde aus Natriun-"'- _v ?' ,-C--' - ö.J.jr.etlwxjbcnzaraido) -cephalosporanat nach der in Beinpliv " bc f-oli/.·' ebenen Arbeitsweise he.vgestellt.

Das Produkt kristall^u^rtfv i-ua .!ethanol mit [äj^^> ~ +■ 68° (Mf-'-hf.noi , ν- - i,0). t. ,,. . Phoophat puffe?.¹, pH 6) 253 - 256 m,u tEJ^_m - 276, £ --⁴Q-900), . ^_ax. .iNiUül: 1770 (^Lactam), .

■'.6'.·0 (-COOK), '"40'UUdMb¹SO (-3OiJII-/ und 12'i? ciii ' (Metho^ynryl)j K M.R.-J-.pf j.rtrum ''D₉O- IJat/^iüribi^srlionat): Resonanzen bei Gi 14; 2. - ;; I, 2^!- _;. ■ \._f

^cr.; R,- - 0,0-· ·,Vt'hatnjan-.l'apier Nr. "^:,"."'mit -Kätrixua- .. ecetat Guf pU ^ -gepuffert* Lösungsnrittel·: Obere Phase Athyl-■ ivoc ta.t'.«n--Bi'f.ar.'oi.i"0,.^m, iiatriumacetet {pH 5} -.,8;.'*-:8» im aba*^:;eigerden System \;&< 38^ C), E,_? -■ 0.73 (n .-rropanoliWaeaer = 7:3,'.

Ber-eclmetj C 5^J«7- H 4,6 N 7_f1 . ·,£■ Geiiindem '5? ,8 4, β 6*8 ^.

Die Verbindung seigte blaue Fluoreazene bei Bestrahlung mit UV-Licht.

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BAD ORJGiHAL

Beispiel 8:

^a) jBinwirlcung yon.. RMgobium-a_oetylesteraae auf 7»PhenyJLaQetamidp^oapXaloBppran3äure

5 g· Rhizobiumaeetonpulver, das wie im einleitenden Teil beschrieben hergestellt war, wurden in 200 ml Wasser suspendiert und 30 Minuten bei 30° C inkubiert. 1 g 7-Phenylaoetamidocephalosporansaueree liatriumsalz (7PAGA) wurde dann zugegeben, das Ganze wurde schnell mit 10 $iger (Vol./Vol.) Phosphorsäure auf pH 7,0 eingestellt und eine Probe von 0,1 ml wurde für die biologische Prüfung entnommen. Das Gemisch wurde dann bei 30° inkubiert und in Eeitabständen mit 1n Hatriumhydroxyd auf pH 7,0 titriert. 0,1 ml Proben für die biologische Prüfung wurden in entsprechenden Intervallen abgenommen. Me Reaktion zeigte den folgenden Verlauf:

Seit \3td.) zugegebene 1n iiaOH (ml) Titer an TBhCk (f/ml bei

1/2000 Verdünnung)

0,0	0,00	2,1	-
0,5	0,90 _	1,05
1,0	1,62	0*79
1,5	2,05	0,575
2,0	,.2,10
	Theor. - 2,22

Die Reaktion wurde dann abgebrochen, indem das Ganze unter Rühren in 400 ml Aceton gegossen wurde. Nach 10 Minuten wurde der niederschlag abfiltriert. Aceton wurde vom Piltrat durch

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Verdampfen unter Vakuum entfernt und der Rückstand mit Wasser auf 200 ml verdünnt. Nach Filtrieren durch ein Seitz-Filter wurde die klare braune .Flüssigkeit biologisch untersucht.

b) Extraktion von 7-

Die obige Lösung wurde mit 10 %iger (Vol./Vol») Phosphorsäure auf pH 3,3 eingestellt und sofort mit 3 χ 200 ml Äthylacetat extrahiert. Der verbrauchten wässrigen Schicht wurde nach jeder derartigen Extraktion eine 0,1 ml Probe für die biologische Prüfung entnommen, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Extrakt Nr Titer an 7PACA (y/ml bei Extrakt ar. 1/100 Verdünnung)

0 v- 10,8

1 6,0

2 3,25

3 1,44

Es wurden also etwa 87 $der biologischen Aktivität in das lösungsmittel extrahiert.

Die vereinigten Äthylacetatschichten wurden dann mit 100 ml. und 2 χ mit 50 ml Wasser extrahiert, das mit gesättigter Natriumbiearbonatlösung auf pH 7,5 eingestellt /war. Der vereinigte Biearbonätexträkt wurde dann durch 30-minütiges Äühren

9 0 9 8 8 5 /17 3 7 ^8A0

mit "Amberlite" IRC 50-Harz (Rohm und Haas Go.) in der Waseerstofforra auf pH 5,5 eingestellt.. Das Harz wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, und die vereinigten Filtrate und V/asch~ wässer wurden lyophilisiert. Dies ergab das Natriurasalz von 7->PhenylacetamidO"'3-hydroxyrnethyl'>ceph-3-em-4-säure als weiße amorphe Festaubstanz (681 mg» 75 # Ausbeute), das biologisch und durch UV-Analyae in wässriger Lösung analysiert wurde.

^E1^cbj ^^{260 m}/^u^ " ^{157t 5 6B}'⁵ * ^rein· Biologische Untersuchung 64_r2 5a rein.

Die Hioautographie dießer Peatsubstanz unter Anwendung des ursprünglichen Äthylaeetat-O_t1m Natriumacetat (pH 5,0)-Systems zeigte nur eine biologisch aktive Zone an der Stella von 7-PhcαlylacetaJnido-3*-hyäroxymethyl-ceph-3-em-4--säurF:,

°) KJ'iBtalllaation des rohen Natriiungalsee von 7-Fhenjlacet--

839 ng rohes, wie in Beispiel 8b hergestelltes 7-Phiⁱnylaoetamido-3-hydroxymethyl-ceph-3'-em-4-saure8 liatriumsalz wurde mit 25 al» 10 ml und 4 ml Methanol extrahiert und der lUlckatand durch. Zentrifugieren entfernt. Die methanolische Lösung wurde dann gelinde in einem langsamen Luftstrom bis zur beginnenden Kristallisation eingedampft, worauf sie 1 Stunde auf 5° C abgekühlt wurde. Es wurden weiße federartige Nadeln erhalten, die noch kalt abfiltriert und mit etwas kaltem Äthanol gewaschen wurden. Die Ausbeute nach Trocknen im Vakuum betrug 300 mg.

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Die ans Produkt wurde- biologisch und durch UV-Analyse wie oben uni ersucht.

^E-w_m (²⁶O «a/«) ^:" "^f9-^{J 8}? £ rein.

Biologische Prüfung 92 fs rein.

Bar Verdampf eil der ^T-'utt erlauben ergab eine swei te Ausbeute von 90 mg an Kristallen. Die Iieinheit-wer jedoch viel geringer (6%5 # durch UV, 75,8 # durch biologische Prüfung).

Beispiel.· Q?

EliΛ/irkurif; von RMsobium-'acetylestcgaae! £ffll\ ^-(¹IhJqnyl'-g'-acc

V/if im einleitenden Teil hergesfcel/«es IihicobiurapuJ.ver (5 ß) wu3"ds in 200 ml ^T'nßßer suspenaiert "und be;i 30 ' Π i'i'-.x- JO Minuten inlübiert, 1_r0 g 7-\'i'hien,vl-2'--acetaffiido>»cephalospGransau:.'es Na*iriiiinsal;; ν 7 TACJ* 's wurden zugcgebeji, und das Gans ο wurde rasch 10 ^igei· (VuIc/ i.d. \ Tlui ^hav=töU2:a auf pH 7,0 gebraoli-j. Das

Gen iseh K¹Urde dann bei 30° ΰ . inicuMort und ^nit "n NotriUEhydroxyc in regelmäßigen zeitabständen auf pH 7,0 titriert. In entspj'eaheiide:i 'i-Ieitabständen wui-den 0, I ml Proben aur biologischen Irri.fung ab.-i&iiorninen.. ^:ie !?<?al:i Lon. se ig te den fcv- gonden Verlauf:

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Zeit (8td.) zugegebene ta NaOH (ml)

0	. 0,00	1,68
0,5	0,90	1.05
1.0	1,60	0,81
2.5	2,30	0.68
3.0	2,30	0,57
	Theor. « 2,22.

Die Reaktion wurde dann durch Eingießen in 400 ml Aceton unter Rühren beendet. Nach 10 Minuten wurde der Niederschlag abfiltriert und das Aceton aus dem Piltrat durch Vakuumverdampfen entfernt. Der Rückstand wurde mit Waeeer auf 200 ml verdünnt und durch ein Seits-Pilter filtriert, üae klare, braune Filtrat wurde mit 10 #iger (Vol./Vol.) Phoephorsäure auf pH 3,3 einge-Bttlit und mit 3 x 200 ml Äthylacetat extrahiert. Die verbrauchte wässrige Schicht wurde nach jeder Extraktion auf biologische Aktivität geprüft, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden:

Extrakt Nr Titer on 7TACA (γ/ml _!_L_. bei 1/100 Verdünnung)

0 13,2

1 7,5 ■2 ^l 4,95

3 2,2

Ee wurden also etwa 83 # der biologischen Aktivität in das Lösungsmittel extrahiert.

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Die Äthylacetatechichten wurden vereinigt und mit 100 ml und 2 χ 50 ml Waseer extrahiert, dae mit gesättigter Bicarbonate Ii sung auf pH 7,5 eingestellt war. Der Bioarbonatextrakt wurde dcjin durch Verrühren mit "Amberlite" IRC 50-Harz (Rohm und Haas Cc.) in der Wasserstofform auf pH 5,5 eingeetellt. Das Harz wurde abfiltriert und mit Waseer gewaschen, und die vereinigten Filtrate und Waechwässer lyophilisiert, wan 592 mg (66 $> der Theorie) des Natriumaalzes von 7-(Thienyl-2'-acetamldo)-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4 säure ergab.

Das Produkt wurde biologisch und durch UV-Analyse untersucht:

^E1cm ^^{256 m}/^u* ^{β 276 81 C/i rein}· Biologische Prüfung 65 i> rein.

Bioautographie unter Verwendung des Äthylacetat-O,1m Natriumacetat (pH 5,O)-Systems eeigt eine gröBere biologisch aktive Zcne an der Stelle der Hydroxymethylverbindung zusammen mit einer schwachen Spur der ursprünglichen Cephaloeporansaure.

Beispiel 10;

2S g 7-ACA wurden in 100 ml Wasser durch Zugabe von 110 ml Ir. NaOH gelöst. Biese Lösung wurde zu 5 Liter rohem Weissenkelmextrakt zugegeben und 4 1/2 Stunden bei 57° C umgesetzt, wobei alle Stunden 1n KaOH zugegeben wurde, um den pH-Wert bei 6,45 zu halten. In dieser Zeit wurden 51 ml (55 £ der Theorie)

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^e/lD

-30- 1045315

an 1n NaOH zugegeben. Weitere 41 ml 1n NaOH wurden zugegeben und daa Gemisch wurde bei 22° C über Nacht stehen gelassen.

Nach Einengen im Vakuum auf 2,5 Liter bei 25° C wurden unter Rühren 5 Liter Aceton zugegeben, Der ao gebildete Niederschlag wurde entfernt und das FiItrat im Vakuum auf 450 ml eingeengt. Die Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 4,5 mit Eisessig führte zur Ausfällung des Produktes, das abfiltriert, mit Aceton und Äther gewaschen und getrocknet wurde. Ausbeute » 10 g. (Die Mutterlaugen wurden nicht untersucht.)

Eigenschaften: UV-Absorption X _mnv = 265 n»/U (in ⁿ/40 NaHCG ''

max * / j

l!L

l!L ²⁶O m/u = 380 ( £= 8750) • ein /

Die Reinheit wurde, bezogen auf die UV-Analyse, zu 15 - bestimmt„

Beispiel 11:

Einwirkung von lüiizobium-acetylesteraBe auf 7-ACA und Cephalosporin^ P

Rliizobium trifolii (wilder Stamn . wurde in einer Kährbrühe gezüchtet und Teile der Kulturflüü jigkeit wurden dann mit einem gleichen Volumen einer Lösung von entweder Y-ACA TO mg/ml) oder Cephalosporin C (10 mg/ml/ in Phosphatpuffer von pH 7,0 oder von Puffer allein gezüehtet. Die zwei Substratlösungen wurden auch mit einem gleichen Volumen an nichtbeimpfter Brühe gemischt, wobei le^ntere als Kontrollen wirkte.

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Alle Prüf lösungen wurden dann in einem Wasserbad bei. 33° C „über Nacht inkubiert. 100X Anteile wurden auf Papiere, die , auf pH 6_f0 gepuffert waren, aufgetupft und die ^{1hromatogramrae wurden in 70 tigern (VoI*/Vol.) wässrigem n-Propanol ÜberNacht entwiclcelt.

Di.e Chromatogramme wurden unter TJV-Mcht geprüft und die absorbierenden Zonen vmrden markiert» Dann wurde ein Papier mit 1n Pyridln in Aceton und anschließend-mit- 1 #igera (Vol./Vol.) Phenylacetylehlorid in Aceton besprülit, Dieses Papier und ein identisches nicht besprühtes Papier wurden dann auf Platten aufgebracht, die mit Bacillus ßubtilis beimpft"waren. Nach Inkubieren über Facht wurden auch die biologisch aktiven Zonen fiistgestellte

■U) 1_

Di. e Inkubation von'7~AGA. mit Ganzkulturen von Rhizobium trlfolii (vilder Stamm) führten ε-ur Bildung einer Subatans init R* '«" " Ό,-62 .3; demjenigen von 7-AGA, das heißt, an der erwarteten Stelle filr die entsprechende Hydrascymethylverbindung« Überdies aeigte dieser fleck biologische Aktivität gegenüber B. subtilis nur, nachdem das Papier ait Pyridin und Plienylacetylchlorid besprüht ν/ί.-rden war, Bie'Papiershrojnatogramaie seigten_P daß kein-7-ACA ncah der Inkubation übrig geblieben v/ar, während in den Kontrollen 7-Α0Λ festgestellt werden konnte» Diese Ergebnisse zeigiii deliar_s daß i-hisobium trifolii 7-ACA aesacetylxeren kann.

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(i:L) Oephaiosporin C

Es wurde ouch gezeigt» dafi lüiizobium trifolii Cephalüaporin C nach der gleichen Arbeitsweise wie für 7-AOA beschrieben de.'jacetyliert. In diesem PaIXe v/ar es jedoch nicht notwendig, da;3 Papier mit Pyridin und Phenylacetylohlorid zu besprühen, um die biologische Aktivität des Produktes zu geigen·

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Claims (15)

λ- ει ν G ϊϊ τ# ■ vv η ο Jj ϊγ u w χ* β

1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel

CHg.öir

S CCOOH II,

GH-i χ

worin X eine Acylamino- oder eineAmino(NH₂)-Gruppe bedeutet, durch Hydrolyse von Verbindungen der Formel

CH₂v0.e0CH₃

S OH- C.COOH I i «co CH-» I X

I,

worin X die oben angegebene Bedeutung besitzt, mittels einer Esterase, dadurch gekennzeichnet, daß man als Esterase Weizenkeimeateraae oder eine von einer Species der Genus Rhizobium stammende Esteraee verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, 'dadurch gekennzeichnet, daß man als Rhizobium Species Rhiaobium trifolii, Rhizobium lupinii,

903385/1737 bad

-34- Ί ο4 591

Hhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum oder Rhizobiura phaesoli verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bhizobiumesterase von einer Wildkuitur eines Rhizobium· Organismus stammt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß Rhizobium trifolii, das als Stämme vom wilden Typ aus Trifolium dubium isoliert wurde, verwendet v/ird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche i - 4» dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Rhiaobium trifolii verwendet wird, der auf Mannitagar ein wasserlösliches, rotes Pigment bildet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - ^fj_f da durst-· gekennzeichnet, daß ein enzymreiches Ilateriai verwendet v;ird_t dae aua einer Kultur einer Rhizobium-Species hergestellt ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das enzymreiche Material aus einer Kultur geerntet und mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel zur Entfernung von V/asser und Fett behandelt Is^t₀

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser mischbares Lösungsmittel ein "Kerton oder einen Alkohol verwendet.

909885/1737

BAD

- 35 - / TbA5915

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser mischbares Lösungsmittel Aceton oder Äthanol verwendet.

10_o Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rhisobiumeaterase durch Züchtung von Rhieobitira in aerober Submerskultur erhält,

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 1Q, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rhisobiumesterase durch Züchten von Rhizobiu» in einem Medium auf der Basis von Fleischextrakt und Peptoiyoder Hefeextrakt, Mannit und Nöhrsal&en, erhält.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Stickstoffgehalt des Züchtungemediums zwischen O,1 und 0,3 % liegt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekenneeiahnet, daß der Stickstoffgehalt des Nährmediums etwa 0,2 % beträgt.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Weisenkeimesterase aus entfetteten Weizankeimen stammt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse in wäsarigem Medium bei einem pH-Vert zwischen 5 und 8 durchgeführt wird.

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BAD OBiQMAL