DE1545915C3

DE1545915C3 - Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxymethylcephalosporinen

Info

Publication number: DE1545915C3
Application number: DE1545915A
Authority: DE
Inventors: Benjamin Harry Slough Arnold; David Arthur Farnham Royal Gilbert; Norman Iver Heath Buckinghamshire Haddow
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1964-10-30
Filing date: 1965-10-29
Publication date: 1978-03-02
Also published as: DE1545915B2; NL6514046A; BE671692A; DE1545915A1; SE333931B; CH484192A; IL24529A; GB1121308A; NL147438B; AT277455B; US3436310A

Description

ClI, ■ OH

CII, C

S CCOOII (II)

,o CU N

CH CO

^IS worin X eine Acylamino- oder eine Aminogruppe bedeutet, durch Hydrolyse von Verbindungen der allgemeinen Formel

worin X eine Acylamino- oder eine Aminogruppe bedeutet, durch Hydrolyse von Verbindungen der allgemeinen Formel

CW₁ ■ O · COCII₁
ClU C

C·COOH

(I)

cn - n'

CW - CO X

worin X die oben angegebene Bedeutung besitzt, mittels einer Esterase, dadurch gekennzeichnet, daß man als Esterase Weizenkeimesterase verwendet und die Hydrolyse in wäßrigem Medium bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchführt.

.1"

4.Ϊ

Cephalosporin C und dessen Derivate können einer enzymatischen Hydrolyse unter Verwendung einer aus Orangenschale stammenden Esterase (britische Patentschrift 9 66 222) unterworfen werden, um Produkte zu ergeben, worin die Acetoxygruppe durch eine Hydroxygruppe ersetzt ist, und aus derartigen Produkten können Analoge von Cephalosporin C und dessen Drivaten hergestellt werden, die statt einer Acetoxygruppe beispielsweise andere Acyloxygruppen oder Alkoxygruppen aufweisen. Solche Analogen sind von Interesse, da mehrere von ihnen im Vergleich mit Cephalosporin C eine modifizierte Wirksamkeit besitzen.

Die enzymatische Hydrolyse von Cephalosporin C und dessen Derivaten mittels der Citrusesterase ist unbequem, vor allem, wenn man in größerem Maßstab arbeitet, da eine sehr große Anzahl von Orangen erforderlich ist, um ausreichend Enzym zur Hydrolyse selbst kleiner Mengen zu erhalten.

Es wurde gefunden, daß Weizenkeimesterase zur Hydrolyse von Cephalosporin C und dessen Derivaten zu den entsprechenden Hydroxymethylverbindungen befähigt ist.

CW₂ · O · COCH, CW₁ C

S C(OOH (I)

CW N

I I cw co

I
χ

in welcher X die oben angegebene Bedeutung besitzt, mittels einer Esterase. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Esterase Weizenkeimesterase verwendet, und die Hydrolyse in wäßrigem Medium bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchführt.

Weizenkeimesterase wird vorzugsweise als esterasehaltiger Extrakt von Weizenkeimen verwendet. Solche Extrakte werJen zweckmäßig hergestellt, indem man Weizenkeime durch Extraktion mit einem Kohlenwasserstofflösungsmittel, z. B. Petroläther, entfettet. Die entfetteten Weizenkeime können dann als solche verwendet werden, oder das Enzym kann aus dem festen Rückstand durch Extraktion mit Wasser extrahiert werden, wobei sich die erhaltenen wäßrigen Extrakte zur direkten Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren eignen. Ein Verfahren zur Herstellung von Extrakten von Weizenkeimesterase ist beispielsweise von Singer et al. in Arch. Biochem. und Biophys. 18,229 (1948) beschrieben.

Die erfindungsgemäße Hydrolyse einer Verbindung der allgemeinen Formel I unter Verwendung von Weizenkeimesterase wird in wäßrigen Medien bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchgeführt.Wenn 7-ACA (7-Aminocephalosporansäure) das Substrat ist, wird der pH-Wert vorzugsweise bei 6,45 gehalten. Die Hydrolose wird durchgeführt, indem man das Gemisch bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise zwischen 20 und 45°C hält, bis die Hydrolyse beendet ist. Die Beendigung der Hydrolyse kann festgestellt werden, indem man von Zeit zu Zeit einen Anteil des Reaktionsgemisches mit Alkali titriert.

Der pH-Wert kann mit fortschreitender Hydrolyse eingestellt werden, um ihn innerhalb der gewünschten Grenze zu halten, indem man Alkali zur Neutralisierung der gebildeten Essigsäure zugibt. Wenn bei dieser Arbeitsweise die theoretische Menge an Alkali, die dem Acetatgehalt der zu hydrolysierenden Verbindung

entspricht, verbraucht ist, kann die Reaktion als beendet betrachtet werden. Die Beendigung kann auch durch chromatographische Analyse verfolgt werden.

Die Hydrolyseprodukte können durch übliche Methoden gewonnen werden, wobei das tatsächliche Verfahren von der Art des Produktes abhängt. Als Vorstufe wird die Hydrolyseflüssigkeit vorzugsweise zuerst zur Entfernung von Protein daraus, z. B. durch Zugabe eines Proteinfällungsmittels, wie eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Aceton oder Methanol, und anschließende Abtrennung des gefällten Proteins, /.. B. durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren, behandelt.

Bei Lösungsmittel-löslichen Hydroxymethylderivaten von Cephalosporin C, ζ. Β. 7-Phenylacetamido-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsäure und 7-(Thienyl-2'-acetamido)-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsäu- re, kann das Hydrolysegemisch bei einem saueren pH-Wert der Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren·Lösungsmittel für das gewünschte Produkt unterworfen werden. Die Extraktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 3 bis 4 durchgeführt. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören beispielsweise Esterlösungsmittel, z. B. Äthylacetat oder Butylacetat, und mit Wasser nicht mischbare Ketone, ζ. B. Methylisobutylketon. Die so erhaltenen Lösungsmittelextrakte können mit Wasser, zweckmäßigerweise bei einem pH-Wert von 6 bis 8, z. B. etwa 7,5, reextrahiert werden, und das gewünschte Produkt kann gewonnen werden, z. B. durch Lyophilisieren, oder die Lösungsmittelextrakte können zur Trockne verdampft werden. Das erhaltene Produkt kann nach Wunsch umkristallisiert werden. Im Falle von Produkten, die nicht in Lösungsmitteln löslich sind, z. B. 7-(D-5'-Amino-5'-carboxypentanamido)-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsäure und 3-Hydroxymethy!-7-amino-ceph-3-em-4-carbonsäure, kann das Reaktionsgemisch zuerst zur Entfernung von Protein und anderem hochmolekularen Material wie oben dargelegt behandelt werden. Das gewünschte Produkt kann dann durch Adsorption an einem geeigneten Anionenaustauscherharz aus gepufferter Lösung und anschließende Elution gewonnen werden. Die erhaltenen Extrakte können aufgearbeitet werden, um die gewünschte Substanz zu gewinnen, beispielsweise lyophilisiert, und weiter nach Wunsch behandelt werden.

3-Hydroxymethyl-7-amino-ceph-3-em-4-carbonsäure (das Reaktionsprodukt von 7-ACA) wird jedoch zweckmäßiger gewonnen, indem man den pH-Wert des Reaktionsmediunis auf den isoelektrischen Punkt des Produktes, das heißt einen pH-Wert von etwa 4,5, einstellt, um die Ausfällung des Produktes zu bewirken. Der Niederschlag kann dann abfiltriert oder abzentrifugiert und gewaschen werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Vorarbeiten:

100 g Weizenkeime wurden durch Extraktion mit 3x5 Volumen niedrig-siedendem Petroläther (Kp. bis 60⁰C) entfettet und dann an der Luft trocknen f,o gelassen. Die entfetteten Weizenkeime wurden dann mit 1 Liter Wasser bei 4°C 15 Minuten gerührt und bei 0°C 20 Minuten bei 1800 U.p.M. (1100 χ g) zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann entweder sofort bei den Versuchen verwendet oder im (,<; Tiefkühlschrank aufbewahrt, bis sie gebraucht wurde.

Der in den Beispielen erwähnte Thienylrest ist der 2'-Thienylrest.

Beispiel I

7-(D-5'-Amino-5'-carboxypentanamido)-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsäure

1,62 g Cephalosporin C-Natriumsalz (etwa 80%ig) wurden in 325 ml Weizenkeimextrakt gelöst und der pH-Wert wurde auf 6,7 eingestellt. Diese Lösung wurde dann bei 37"C inkubiert, und der pH-Wert wurde mit 1 n-NaOH in stündlichen Intervallen eingestellt. Nach 4

ίο Stunden war die theoretische Menge an 1 n-NaOH (2,4 ml) zugegeben, was einer vollständigen Freisetzung der E-'ssigsäure entsprach.

Dann wurden 2 Volumen Aceton zugegeben und das ausgefallene Protein wurde abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann im Vakuum bei 30⁰C auf ein Volumen von 28 ml eingeengt. Nach der Zugabe eines gleichen Volumes 0,6 n-Pyridinacetat bei pH 5,0 wurde die Lösung oben auf eine Säule eines schwach basischen Polyamin-Anionen-Austauschharzes aus vernetztem Polystyrol/Divinylbenzol in der Acetatform gegeben, die in 0,3 η-wäßrigem Pyridinacetat bei einem pH-Wert von 5,0 gepackt war. Die Elution wurde mit 0,3 η-wäßrigem Pyridinacetat bei pH 5,0 begonnen, und es wurden 25 ml Fraktionen gesammelt, wobei das Produkt in den Fraktionen 24 bis 54 nach der Ninhydrinmethode festgestellt wurde. Diese Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Die Festsubstanz wurde in 15 ml Wasser gelöst und durch Zugabe von 100 ml trockenem Aceton ausgefällt. Nach Mahlen zu einem Pulver unter trockenem Aceton wurde die Festsubstanz in 20 ml Wasser aufgenommen, der pH-Wert wurde mit 1 n-NaOH auf 7,5 eingestellt und die Lösung wurde gefriergetrocknet. Die 850 mg des so erhaltenen Feststoffes wurden in 7,5 ml Wasser gelöst und 17 ml

.15 Äthanol langsam zugegeben. Es wurde ein gefärbter Niederschlag erhalten, der verworfen wurde, und die Kristallisation wurde in der überstehenden Lösung durch langsame Zugabe von weiterem Äthanol angeregt. Das Produkt wurde mit Äthanol und Äther gewaschen und im Vakuum über CaCb getrocknet. Ausbeute = 435 mg.

200 mg wurden aus wäßrigem Äthanol kristallisiert, wonach das Produkt die folgenden Eigenschaften hatte: λ,,,,,».= 260 ηιμ El;',¹,, 260 ηιμ = 181 [<x]² _D° = +109°

Analyse für:Ci4H,_sO₇NiS · Na · 3,5 H₂O:

Berechnet: C 36,7, H 5,5, N 9,4 , S 7,0 %;
Gefunden: C 36,4, H 5,8, N 9,51, S 6,89%.

Eine Spur Cephalosporin C (< 2%) konnte durch Bioautographie in Methanol auf feuchten, auf pH 6,0 gepufferten Papieren, die 16 Stunden entwickelt und auf Vibrio cholerae-Platten inkubiert waren, nachgewiesen werden.

Beispiel 2

7-Phenylacetamido-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure

25 g Natrium-7-phenylacetamidocephalosporanat wurden in 5 Liter wäßrigem Weizenkeimesterasepräparat gelöst. Der pH-Wert wurde auf 6,7 eingestellt und das Gemisch bei 37°C 4 Stunden inkubiert, wobei der pH-Wert in lstündigen Abständen mit 1 n-Natriumhydroxyd auf pH 6,7 eingestellt wurde. In 4 Stunden waren 87% der theoretischen Aufnahme von 61 ml erforderlich und die Reaktion wurde nach der chromatographischen Untersuchung als beendet betrachtet.

Nach Einengen im Vakuum bei 18"C auf ein Volumen von 1600 ml wurde das Protein in der Lösung durch Zugabe von 2 Volumen Aceton und anschliei3endes lOminütiges Zentrifugieren bei 1500 U.p.M. ausgefällt. Der Niederschlag wurde mit 1 Liter 66%igem Aceton in Wasser gewaschen, und die Waschflüssigkeiten wurden mit der überstehenden Lösung vereinigt. Die Lösung wurde dann im Vakuum auf ein Volumen von 1500 mJ eingeengt und mittels Filtrieren durch eine Astbestschicht geklärt.

Die Extraktion der Z-Phenylacetamido-S-hydroxymethyl-ceph-3-cm-4-carbonsäure wurde durch Einstellung des pH-Wertes der wäßrigen Lösung auf 3,5 mit 10%iger Phosphorsäure und Extraktion in 3 χ 1 Volumen Äthylacetat bewirkt. Dann wurde sie in 3 χ 750 ml Wasser durch Zugabe von 1 n-Natriumbicarbonat zur wäßrigen Phase, bis der GleichgewichtspH-Wert 7,0 betrug, zurückextrahiert. Der Überschuß an Natriumbicarbonat wurde durch Behandlung mit überschüssigem Carbonsäure-Kationenaustauscherharz aus vernetzten Polyacrylsäuren/Divinylbenzol zerstört, die Lösung im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, was 14,34 g amorphes Natrium-7-phenylacetamido-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-oat von 62%iger Reinheit ergab.

Die Kristallisation wurde vorgenommen, indem diese Festsubstanz mit 500 ml Methanol extrahiert und die Lösung dann langsam eingedampft wurde, was in der ersten Ausbeute 3,266 g Material (95% rein) und in der zweiten Ausbeute 4,3 g (65% rein) ergab. Die Reinheit dieser Proben wurde durch UV-Absorption bestimmt, wobei ein theoretischer Wert von E\"",„ 260 ηιμ = 240 für diese reine Substanz angenommen wurde.

Beispiel 3

7-Thienylacetamido-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure

3,63 g 7-Thienylacetamido-cephalosporansäure wurden in 50 ml Wasser unter Zugabe von 1 n-Natriumbicarbonat, bis der pH-Wert 7,0 betrug, gelöst. 700 ml wäßrige Weizenkeimesteraselösung wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C 4'/2 Stunden inkubiert, wobei der pH-Wert bei 6,3 gehalten wurde. Dann wurden 1200 ml Aceton unter Rühren zugegeben und das ausgefallene Protein durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum bei 30⁰C auf 250 ml eingeengt, der pH-Wert wurde mit verdünnter Phosphorsäure auf 3,5 eingestellt und die Lösung wurde mit 3 χ 250 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden dann mit 3 χ 50 ml H2O unter Zugabe von 1 n-NaHCC»3-Lösung bei jeder Extraktion, bis der pH-Wert im Gleichgewicht 7,0 betrug, rückextrahiert. Diese vereinigten Extrakte wurden von überschüssigem NaHCCb durch Zugabe von Carbonsäure-Kationenaustauscherharz aus vernetzten Polyacrylsäuren/Divinylbenzol befreit, bis der pH-Wert auf 5,8 fiel. Beim Gefriertrocknen wurden 2,76 g einer amorphen Festsubstanz erhalten. Diese wurde in 110 ml Methanol gelöst, durch Zentrifugieren geklärt und dann langsam eingedampft, bis die Kristallisation einsetzte. Diese war nach 24 Stunden bei 4⁰C beendet, was 926 mg einer kristallinen Festsubstanz ergab.
A_m;„.= 235 Γπμ, Ei;'¹; = 235 ιημ = 278.
Angenommene Reinheit, bezogen auf UV-Absorption, = 90%.

Beispiel 4

7- Benzyl thioacctamido-3-hydroxymcthy I-ccph-3-em-4 -carbonsäure

^s 4 g 7-Benzylthioacctamido-cephalosporansaures Natriumsalz wurden in einer Enzymlösung gelöst, die aus 100 g entfetteten Weizenkeimen erhalten wurde. Der pH-Wert wurde sofort mit 1 n-Natriumhydroxyd auf 6,7 eingestellt und das Ganze bei 37⁰C inkubiert. Der pH-Wert wurde in Zeitabständen mit 1 n-Natriumhydroxyd auf 6 bis 7 eingestellt und die Reaktion beendet, als kein weiteres Alkali mehr verbraucht wurde.

Das Inkubat wurde mit 2 Volumen Aceton gerührt und das ausgefallene Prolein abfiltriert. Aceton wurde dann vom Filtrat durch Einengen im Vakuum bei 30°C entfernt. Die erhaltene wäßrige Lösung wurde mit konzentrierter Phosphorsäure auf pH 2,5 eingestellt und mit 3 χ 1 Volumen Äthylacetat extrahiert, wobei der pH-Wert nach Erfordernis wieder eingestellt wurde.

Die Äthylacetatschichten wurden abgetrennt und sofort in V5 Volumen Wasser zurückextrahiert, das so viel gesättigte Natriumbicarbonatlösung enthielt, um die wäßrige Schicht auf pH 7,0 zu bringen. Die vereinigten wäßrigen Schichten wurden dann mit Carbonsäure-Kationenaustauscherharz aus vernetzten Polyacralsäuren/Divinylbenzol auf einen pH-Wert von etwa 5,0 eingestellt, das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 2,84 g.

Die Analyse durch UV-Spektroskopie zeigte eine Reinheit von 68%. Die Chromatographie in Äthylacetat-pH 5,0-Natriumacetat-Puffersystem und die anschließende Bioautographie auf Staphylococcus aureus-Platten zeigten nur einen Flecken, welcher der Hydroxysäure entsprach.

Das Produkt wurde weiter durch Solventextraktion gereinigt.

Die oben erhaltene Festsubstanz wurde in 100 ml Wasser gelöst und der pH-Wert wurde wie vorher auf 2,5 eingestellt. Die Hydroxysäure wurde in Äthylacetat aufgenommen, indem sie mit 3 χ 50 ml Lösungsmittel geschüttelt wurde. Dann wurde sie in 50 ml Wasser reextrahiert, welches die theoretische Menge an Natriumbicarbonat enthielt (420 mg). Die Äthylacetatschicht wurde dann mit 50 ml Wasser gewaschen, das etwas gesättigtes Natriumbicarbonat enthielt.

Die wäßrigen Schichten wurden vereinigt, der pH-Wert wurde mit Carbonsäure-Kationenaustauscherharz aus vernetzten Polyacrylsäuren/Divinylbenzol wie vorher eingestellt und dann wurde lyophilisiert.

Dies ergab ein Produkt, das nach der UV-spektroskopischen Analyse eine Reinheit von 79% aufwies.

Die Endreinigung wurde durch Kristallisation bewirkt. Die obige Festsubstanz (110 mg) wurde in einem Gemisch von 2 ml Dimethylsulfoxyd und 2 ml Methanol durch gelindes Erwärmen gelöst. Nach Filtrieren wurden 6 ml Äther zugegeben und beim Abkühlen und Kratzen schieden sich Kristalle aus. Diese Kristalle wurden gewonnen und schienen nach der UV-Analyse rein zu sein.

El?: = 240(A„,_a.= 259).

Beispiel 5

3-Hydroxymethyl-7-thienyIacetamido-

ceph-3-em-4-carbonsäure
(Alternativverfahren zu Beispiel 3)

Weizenkeime wurden entfettet, indem sie in eine chromatographische Säule gepackt wurden und Petrol-

äther (Kp. 40 bis 60°) durch sie perkolieren gelassen wurde, bis das Eluat farblos war.

Die getrockneten Keime wurden in einem Polyäthylenbeutel bei Zimmertemperatur aufbewahrt.

Eine Suspension von 250 g entfetteten Weizenkeimen in 2 Liter destilliertem Wasser wurde unter Rühren auf 37° C erwärmt. 30 g Natrium-7-thienylacetamido-cephalosporanat wurden zugegeben und das Gemisch wurde 3 Stunden bei 37°C gehalten. Während dieser Zeit wurde der pH-Wert durch Zugabe von 2 n-Natriumhydroxylösung bei 6,6 bis 6,9 gehalten. Dann wurden 3 Liter Aceton zugegeben, um Proteine auszufällen, und die ausgefallene Festsubstanz wurde durch Vakuumfiltrieren entfernt und gründlich mit Wasser gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum auf etwa 3 Liter eingeengt, bevor es mit 2 χ 500 ml Äthylacetat gewaschen wurde, um jegliches neutrales Material zu entfernen. Die klare wäßrige Schicht wurde abgetrennt, mit 1 Liter Äthylacetat bedeckt und mit sirupöser Phosphorsäure auf pH 3,5 angesäuert. Während des Ansäuerns wurde das Gemisch kräftig gerührt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht gründlich mit 2 χ 500 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzsole gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Während des Eindampfens schied sich die kristalline S-Hydroxymethyl^-thienylacetamidoceph-3-em-4-carbonsäure aus und wurde abfiltriert. Ausbeute = 13,4 g (53%). Einengen des Filtrats ergab eine weitere Ausbeute von 0,5 g an weniger reinem Material.

Das Produkt wurde aus Methanol umkristallisiert. Es hatte dann einen Schmelzpunkt von 205 bis 215° C (Zersetzung),

[«]" = +138° (Methanol, c= 1,0)
A_ma,.(Phosphatpuffer, pH 6) 236 Γημ(Εκ';, = 396, ε = 14 000), Inflexion bei 259 Γημ(Ε!:; = 251, ε=8 950), IW(NuJoI) 3400 (OH), 3220 (NH)₁ 1760 (^-Lactam), 1720 (- COOH),
und 1652 und 1555 cm - >( - CON H). N.M.R.-Spektrum (D₂O, NaHCO₃): τ = 2,60 2,98,4,40, 4,93,5,72,6,10,6,33,6,16 p.p.m.

Rf= 0,06 (Standard-Chromatographiepapier, mit Natriumacetat auf pH 5 gepuffert.
Lösungsmittel: Obere Phase
Äthylacetat: n-Butanol: 0,1 m-Natriumacetat (pH 5,0)= 8:1 :8 im absteigenden System bei 38°), Rf= 0,68(n-Propanol: Wasser = 7:3); Rf= 0,26 auf Kieselsäureplatten mit n-Butanol: Äthanol: Wasser= 4:1:5.

Beispiel 6

S-Hydroxymethyl^-phenylacetamido-

ceph^:3-em-4-carbonsäure (Alternativverfahren zu Beispiel 2)

Die oben bezeichnete Verbindung wurde in 50%iger Ausbeute aus Natrium-7-phenylacetamido-cephalosporanat unter Anwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt. Das Produkt wurde aus Äthylacetat-Methanol umkristallisiert, F= 190 bis 195° C (Zersetzung),
[«]»= +152° (Methanol, c= 1,0), A_ma.,.(Phosphatpuffer,pH6)= 260 πιμ, (E!',!; = 248; ε = 8700),
i„_m.(Nujol) = 3360(OH),

3200 (N H), 1752 (j3-Lactam),
1718 (COOH) und 1642 und 1548 cm -■ (CON H).
N.M.R.-Spektrum(D₂O,NaHCOj):τ= 2,58;4,35;4,88;
5,69; 6,26; 6,45 p.p.m.

Rf= 0,06 (Standard-Chromatographiepapier, auf pH 5 mit Natriumacetat gepuffert.
Lösungsmittel: Obere Phase
Äthylacetat: n-Butanol :0,l m-Natriumacetat
(pH 5)= 8 :1 :8 im absteigenden System bei 38°C),
ίο Rf= O,66(n-Propanol: Wasser = 7 :3).

Beispiel 7

3-Hydroxymethyl-7-(2',6'-dimethoxybenzamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure

3-HydroxymethyI-7-(2',6'-dimethoxybenzamido)-

ce^!ph-3-em-4-carbonsäure wurde aus Natrium-7-(2',6'-dimethoxybenzamido)-cephalosporanat nach der in Beispiel 5 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt.
Das Produkt kristallisierte aus Methanol mit

[«]%= +68° (Methanol, c= 1,0),

A,„_a,.(Phosphatpuffer, pH 6)253-256 ΓημΕϋ = 276,

ε= 10 900),v_mjI.(Nujol) 1770 (β- Lactam),

1690 (-COOH), 1540 und 1630 (-CON H-)
und 1253 cm-'(Methoxyaryl);

N.M.R.-Spektrum (D₂O, Natriumbicarbonat);

Resonanzen bei 6,14; 2,55; 3,25; 4,19; 4,79 und 5,72 τ.

Chromatographische Einzelheiten:

Rf= 0,05 (Standardchromatographiepapier, mit Natriumacetat auf pH 5 gepuffert.

Lösungsmittel: Obere Phase

Äthylacetat: n-Butanol :0,l m-Natriumacetat

(pH5)= 8:1 :8 im absteigenden System bei 38°C),

Rf= 0,73(n-Propanol: Wasser= 7 :3).

Analyse für: Ci₇Hi₈N₂O₇S:

Berechnet: C 51,7, H 4,6, N 7,1%;
gefunden: C 51.8, H 4,8, N 6,8%.

Die Verbindung zeigte blaue Fluoreszenz bei Bestrahlung mit UV-Licht.

Beispiel 8

25 g 7-ACA wurden in 100 ml Wasser durch Zugabe von 110 ml 1 n-NaOH gelöst. Diese Lösung wurde zu 5 Liter rohem Weizenkeimextrakt zugegeben und 4 '/2 Stunden bei 37° C umgesetzt, wobei alle Stunden 1 n-NaOH zugegeben wurde, um den pH-Wert bei 6,45 zu halten. In dieser Zeit wurden 51 ml (55% der Theorie) an 1 n-NaOH zugegeben. Weitere 41 ml 1 n-NaOH wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei 22°C über Nacht stehen gelassen.

Nach Einengen im Vakuum auf 2,5 Liter bei 25°C wurden unter Rühren 5 Liter Aceton zugegeben. Der so gebildete Niederschlag wurde entfernt und das Filtrat im Vakuum auf 450 ml eingeengt. Die Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 4,5 mit Eisessig führte zur Ausfällung des Produktes, das abfiltriert, mit Aceton und Äther gewaschen und getrocknet wurde.
Ausbeute = 10g. (Die Mutterlaugen wurden nicht untersucht.)

Eigenschaften:

UV-Absorption A_m„. = 265 πιμ (in"/40 NaHCO₃)
Ek.¹;, 260 πιμ = 380(ε= 8750)

Die Reinheit wurde, bezogen auf die UV-Analyse, zu 95% bestimmt.

809 609/9

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxymethylcephalosporinen der allgemeinen Formel

CH₂ · OH
CH, C

S C(OOII (II)

CW N

I I cn co

Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel