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Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B.
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mit ionisierbaren Cyaniden wie vorzugsweise Metallcyaniden, Ammoniumcyanid oder Cyanwasserstoffsäure in einer der Menge an vorhandenen Vitamin B-ähnlichen Substanzen zumindest äquimolaren Menge behandelt und gegebenenfalls in an sich bekannter Weise weiter gereinigt werden. Nach einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens wird die Behandlung der Konzentrate mit den Cyaniden in Gegenwart eines Lösungsmittels, wie z. B. Wasser, Alkoholen mit 1-3 Kohlenstoffatomen oder Mischungen dieser Lösungsmittel durchgeführt, während feste Konzentrate mit wasserfreier Cyanwasserstoffsäure behandelt werden. Für praktische Zwecke hat sich die Durchführung der Reaktion in einem wässerigen Medium gut bewährt.
Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 aus Leber und aus Kulturflüssigkeiten bekannt. So haben z. B. Rickes u. a. gezeigt, dass Vitamin B12 aus durch Streptomyces griseus fermentierten Kulturflüssigkeiten gewonnen werden kann (Science 108, 634 - 38, Dezember
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aus2952).
Es wurde gefunden, dass Kulturflüssigkeiten, welche bei Züchtung von Vitamin B12 produzierenden Mikroorganismen, ; anfallen, auch Fermentationsprodukte enthalten, welche mit Vitamin B12 nahe verwandt sind, aber nur einen Teil der anti-perniciösen Wirksamkeit des Vitamins B12 aufweisen und nach-
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Verfahren möglich.
Erfindungsgemäss werden nun die Vitamin B12-ühnlichen Substanzen mit ionisierbaren Cyaniden zur Reaktion gebracht und dabei in Vitamin BI2 umgewandelt ; auf diese Weise erhält man aus Kulturflüssig- keiten oder deren Konzentraten, welche sowohl Vitamin B12 wie auch Vitamin B12-ühnliche Substanzen. enthalten, stark vergrösserte Ausbeuten von reinem Vitamin B122. Gleichzeitig wird12, wie bereits oben er- wähnt, die Isolierung von reinem Vitamin B erheblich erleichtert.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, je Mbl vitaminähnlicher Substanzen mehr als 1 Mol Cyanionen anzuwenden, um eine vollständige Umwandlung zu erzielen. Bei Behandlung einer wässerigen Lösung von B12-ühnlichen Substanzen mit einem Überschuss von Metallcyanid, z. B. Cyannatrium oder Ammoniumcyaniden in alkalischer Lösung wird ein purpurfarbener Komplex als Zwischenprodukt gebildet.
Bei diesem purpurfarbenen Komplex scheint es sich um die gleiche Substanz zu handeln, wie sie bei Zu- fügung von Natriumcyanid zu einer wässerigen Lösung von Vitamin B12 gebildet wird. Beim Ansäuern einer Lösung, welche diesen purpurfarbenen Komplex enthält, nimmt die Lösung wieder die rote Farbe an, welche für Vitamin B charakteristisch ist ; wird kein Überschuss an Metallcyanid verwendet oder im nichtalkalischen Bereich gearbeitet, so wird der purpurfarbene Komplex nicht gebildet. Bei Verwendung
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von Cyanwasserstoff wird der purpurfarbene Komplex auch dann nicht gebildet, wenn der Cyanwasserstoff in beträchtlichem Überschuss angewendet wird.
Das durch die vorstehend beschriebene Reaktion erhaltene Vitamin B12 ist in jeder Hinsicht identisch mit reinem Vitamin B , das direkt aus Kulturflüssigkeiten gewonnen wird. zur Durchführung des Verfahrens gemäss Erfindung können Vitamin B12 -ähnliche Stoffe in verschiedenen Stufen ihrer Gewinnung aus Kulturflüssigkeiten mit Cyanionen liefernden Stoffen in Reaktion gebracht werden.
Wenn eine Kulturflüssigkeit, welche sowohl Vitamin B als auch Vitamin B-ähnliche Substanzen enthält, erfindungsgemäss behandelt wird, wird das Cyanid vorteilhaft im Überschuss zugefügt, um eine vollständige Umwandlung der B12-ühnlichen Substanzen in Vitamin B12 zu bewirken, worauf dieses durch Adsorption an ein geeignetes adsorbierendes Material, wie Fullererde, Aktivkohle u. dgl. der Kulturflüssigkeit entzogen wird. Das Adsorbat kann als Zusatz zu Tierfutter oder als Ausgangsmaterial für die Isolierung von reinem Vitamin B12 dienen.
Das Verfahren gemäss Erfindung wird vorteilhaft unter Anwendung eines Konzentrats von Vitamin B-ähnlichen Stoffen durchgeführt, da hiedurch das Volumen der reagierenden Stoffe vermindert und Schwierigkeiten mit nicht umgesetzten Cyaniden und damit verbundene Gefahren vermindert werden.
Wenn ein festes Konzentrat mit flüssiger oder gasförmiger Cyanwasserstoffsäure behandelt wird, so wird sie genügend ionisiert, um die erforderlichen Cyanionen auch in Abwesenheit eines Lösungsmittels zu liefern. Es ist aber vorteilhaft, in Gegenwart eines Lösungsmittels zu arbeiten.
Die Reaktion zwischen B -haltigen Stoffen und Salzen von Cyanwasserstoffsäure wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel durchgeführt, in welchem das Salz dissoziiert und in denen die Vitamin B12-ühnlichen Stoffe und die Cyanide löslich sind.Beim betriebsmässigen Arbeiten lässt sich der Vorgang störungsfrei und wirtschaftlich in wässerig-alkalischer Lösung durchführen.
Es empfiehlt sich, die erforderliche Menge an Cyanid für jede Charge an Rohmaterial experimentell zu bestimmen, da die Zusammensetzung der verschiedenen Kulturflüssigkeiten und Konzentrate beträchtlich variieren kann. Eine annähernde Bestimmung der Menge der erforderlichen Cyanionen kann durch Messung der optischen Dichte der zu behandelnden Probe bei einer Wellenlänge von 5500 2 erfolgen (bei dieser Wellenlänge hat reines Vitamin B eine seiner charakteristischen Adsorbtionsspitzen). Der erhaltene Wert, der dem anwesenden Vitamin B12 und den Vitamin B-ähnlichen Substanzen proportional ist, wird als potentielles Vitamin B12 berechnet. Für jedes so errechnete Milligramm von potentiellem Vitamin B12 werden vorzugsweise etwa 0,5 bis 2 mg Cyanionen zugeführt, was einem beträchtlichen Überschuss entspricht.
Zusammen mit den Vitamin -ähnlichen Substanzen sind gewöhnlich noch zahlreiche, nicht identifizierbare Verunreinigungen vorhanden. Soweit diese Verunreinigungen ebenfalls mit Cyanionen reagieren, ist es notwendig, einen genügenden Überschuss dieser Ionen vorzusehen, um auch unter diesen Bedingungen eine vollständige Umwandlung der B-ähnlichen Substanzen zu gewährleisten.
Wenn die Reaktion in wässeriger Lösung unter Verwendung eines Metallcyanids bei einem alkalischen pH-Wert durchgeführt wird, ist die Bildung des oben erwähnten, purpurfarbenen Komplexes ein sichtbares Zeichen dafür, dass ein Überschuss an Cyanid zugefügt worden ist. Die purpurfarbenen Komplexe können durch Ansäuern des Reaktionsgemisches auf einen PH-Wert von etwa 5 oder weniger in Vitamin B12 üb er- geführt werden. Zur Ansäuerung können gebräuchliche Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure od. dgl. verwendet werden.
Nach Beendigung der Reaktion kann das nicht inReaktion gegangene Cyanid durch Verdampfung bei einem sauren PH-Wert beseitigt werden. Die Verdampfung kann bei einer Temperatur von etwa 50-600 durchgeführt werden ; sie wird vorteilhaft unter vermindertem Druck vorgenommen, bis der gesamte überschüssige Cyanwasserstoff praktisch beseitigt ist. Wenn ein festes Konzentrat mit flüssigem oder gasförmigem Cyanwasserstoff zur Reaktion gebracht wird, kann das nicht umgesetzte Cyanid durch Verdampfung im Vakuum oder bei Atmosphärendurck entfernt werden. Wenn eine Lösung mit Cyanid in Reaktion gebracht wird, ist es manchmal ratsam, einen Strom von Stickstoff oder Luft zwecks beschleunigter Entfernung von überschüssigem Cyanid durchzuleiten.
Nach Behandlung mit Cyanid, eventueller Ansäuerung und Entfernung von überschüssigem Cyanid bzw. Cyanwasserstoff wird das Reaktionsgemisch zwecks Gewinnung von reinem Vitamin B12 weiterbehandelt.
Es sind bereits verschiedene Verfahren für die Gewinnung von reinem Vitamin B12 aus solchen enthaltenden Mischungen bekannt. Ein solches praktisch brauchbares Verfahren besteht darin, dass eine Vitamin B enthaltende Lösung mit einem anorganischen Salz wie z. B. Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Natriumsulfat oder Aluminiumsulfat gesättigt, die gesättigte Lösung mit Benzylalkohol ausge-
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zogen und der gewonnene Auszug z.
B. durch Erhitzung im Vakuum auf etwa 75 - 800 getrocknet wird, worauf durch Zusatz von Äther rohes Vitamin B12 ausgefällt wird. Der Niederschlag wird dann in mit Benzylalkohol gesättigtem Wasser, das etwa 2 - 30/0 Eisessig enthält, gelöst, die Lösung mit dem gleichen Volumen Wasser, das mit Benzylalkohol gesättigt ist, verdünnt und anschliessend mit etwa dergleichen Menge von mit Wasser gesättigtem Benzylalkohol entweder kontinuierlich oder nacheinander extrahiert. Die vereinigten Benzylalkoholextrakte werden getrocknet und dann mit Äther behandelt, wobei gereinigges Vitamin B12 ausgefällt wird. Durch Lösen des Niederschlages in Wasser und Auskristallisieren kann
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eignet ist.
Eine noch weitergehende Reinigung kann durch Umkristallisieren aus Wasser erfolgen.
Wenn der nach der Benzylalkoholextraktion erhaltene Niederschlag nicht so weitgehend gereinigt ist, dass Vitamin B12 von einem 95 < % igen oder höheren Reinheitsgrad erhalten wird, dann wird das in Methanol gelöste Vitamin B12 aus der Lösung durch Adsorption mit Hilfe einer Kolonne von aktiver Tonerde entfernt und die Kolonne mit Methanol entwickelt und eluiert. Das angereicherte Eluat liefert nach Zusatz von Äther einen Niederschlag von gereinigtem Vitamin B. Statt dessen kann die Weiterreinigung auch durch eine Wiederholung des oben beschriebenen Extraktionsverfahrens mit Benzylalkohol stattfinden.
Bemerkt sei, dass wässerige Rückstände aus der Benzyl-alkoholextraktion und Fraktionen von Eluaten mit niedrigem Vitamin B-Gehalt bei der chromatographischen Reinigungsstufe erneut mit Cyanionen behandelt werden können, um zusätzliche Mengen von Vitamin B zu gewinnen.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Überführung von Vitamin B12-ähnlichen Stoffen mit Cyaniden in Vitamin B12 sowie die erfindungsgemäss erzielbaren Ausbeuteerhöhungen an Vitamin B12.
Beispiel l : Etwa 83001 einer Kulturflüssigkeit, welche bei der Kultur eines Stammes von S. griseus erhalten wurde und eine LLD- (Lactobacillus lactis Dorner) Aktivität von 4630 Einheiten je cm3 aufweist, wird mit Phosphorsäure auf PH 2, 5 angesäuert, einer Vorklärungsfiltration mit Diatomeenerde unterworfen, mit Natriumchlorid auf PH 7 bis 8 eingestellt und nochmals mit Diatomeenerde filtriert.
Das Filtrat wird mit Aktivkohle behandelt, die abfiltrierte Aktivkohle mit etwa 150 1 n-Butanol 15 Minuten gerührt, der Mischung ungefähr 115 1 Wasser zugefügt, eine Filterhilfe zugesetzt und die Mischung 45 Minuten lang gerührt. Die festen Bestandteile werden mittels einer Korbzentrifuge entfernt und mehrmals auf der Zentrifuge mit. ungefähr 150 1 Wasser, das mit Butanol gesättigt ist, gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit werden miteinander vereinigt und die Butanol- und wasserphase getrennt. Die Wasserschicht, welche praktisch das gesamte LLD-aktive Material enthält, wird filtriert, um Kohlenfeinteilchen zu entfernen.
Zum Filtrat (ungefähr 3001) werden ungefähr 45 1 Benzylalkohol und ungefähr 192 kg Ammoniumsulfat gegeben, worauf die Mischung 15 Minuten gerührt und dann eine Stunde stehen gelassen wird. Die Wasserschicht wird abgetrennt und nochmals mit etwa 30 1 Benzylalkohol ausgezogen.
Die benzylalkoholischen Extrakte wurden miteinander vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Volumen des getrockneten Extraktes beträgt etwa 80 1 (die Volumenvergrösserung beruht auf der Anwesenheit von Butanol). Die benzylalkoholische Lösung wird an 20 kg aktiver Tonerde chromatographiert und die Kolonne mit einer Mischung von Methanol und Aceton l : 2 gewaschen, bis der Abfluss farblos ist. Die Kolonne wird dann mit Methanol entwickelt, die rot gefärbten Eluate werden gesammelt (ungefähr 521) und im Vakuum unterhalb 350 auf zirka 2 1 konzentriert und dann durch Zufügung eines Gemisches von 1 Volumen Aceton mit 4 Volumen Äther ein Niederschlag gefällt, der portionenweise mit Methanol extrahiert wird, bis ein weisser Rückstand verbleibt.
Die optische Dichte der Methanollösung, gemessen bei 5500 A, zeigt einen Gehalt von maximal 460 mg an Vitamin B12 und Vitamin B-ähnlichen Stoffen an. Ein aliquoter Teil der Methanollösung wird mit Äther versetzt ! nid der gebildete Niederschäg einer Gegenstromverteilung mit dem System Benzylalkohol-Wasser unterworfen. Der maximale Betrag an vorhandenem Vitamin B12 wurde hiebei mit 187 mg bestimmt.
Der restliche Teil der Methanollösung wird in zwei Hälften geteilt und die eine Hälfte mit Äther behandelt. Der hiebei erhaltene Niederschlag wird in ungefähr 100 cm3 Wasser gelöst. Zur Lösung wird 8 cm3 10/0ige wässerige Kaliumcyanidlösung unter Umrühren zugefügt und die Lösung ungefähr 15 Minuten stehen gelassen. Hierauf wird mit Salzsäure auf ungefähr PH = 4 angesäuert, dann 70 g Ammoniumsulfat zugefügt und die Mischung mit drei Portionen Benzylalkohol (20,10, 10 cm3) ausgezogen. Die benzylalkoholischen Auszüge wurden durch Erhitzen auf 75 - 800 im Vakuum getrocknet, filtriert und bis zur Ausfällung eines Niederschlages mit Äther versetzt.
Der Niederschlag wird in 20 cm3 Wasser, das mit Benzylalkohol gesättigt ist und 0,5 cir ? Eisessig enthält, gelost und die Lösung einem Gegenstrom* verteilungsverfahren mit dem System Benzylalkohol-Wasser unterworfen. Die erhaltenen benzylalkoholischen Lösungen werden vereinigt, durch Erwärmen im Vakuum getrocknet und mit Äther versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird in 1, 1 cm3 Wasser gelöst und kristallisieren gelassen. Die Kristalle werden durch Zentrifugieren abgetrennt und durch Lösen in 10 cm3 Wasser, Zufügen von ungefähr 120 cm ? Aceton
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bis zur Trübung und Stehenlassen zur Kristallisation gebracht. Das Gewicht der erhaltenen Kristalle beträgt nach Trocknen im Vakuum bei 1000 127 mg.
Der durch Gegenstromverteilung festgestellte Rein- heitsgrad betrug 95 %. Die Identität der erhaltenen Kristalle mit reinem Vitamin B wurde durch Vergleich der physikalischen und chemischen Eigenschaften festgestellt. 12
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Extrakt mit Äther versetzt. Der gebildete Niederschlag wird in einer geringen Menge Methanol gelöst und wieder Äther zugefügt. Der so erhaltene Niederschlag wird in 0,13 cm3 Wasser gelöst und zur Kristallisation gebracht. Die Kristalle werden aus einer Wasser-Aceton-Mischung umkristallisiert. Das Gewicht der erhaltenen Kristalle beträgt nach Trocknung bei 1000 im Vakuum 47 mg.
Die Kristalle ent-
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weggelassen wird, bei sonst gleicher Aufarbeitung wie bei der ersten Hälfte eine Ausbeute von nur ungefähr 50 mg Vitamin Bs2. Hieraus geht hervor, dass die Cyanidbehandlung eine dreifache Vergrösserung der Menge des gewonnenen Vitamin bis bewirkt.
Weitere Versuche, unter Anwendung von Ammonium-, Barium - und Calciumcyanid, an Stelle von Kaliumcyanid, führen praktisch zu gleich guten Ergebnissen. Auch hiebei wird eine ungefähr dreifache Erhöhung der Ausbeuten an Vitamin B12 erhalten.
Beispiel 2 : Ein nicht mit Cyaniden vorbehandeltes Konzentrat aus einer Kulturflüssigkeit von
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trocknet. Ein Teil des amorphen Niederschlages wird für Vergleichszwecke ohne Cyanidzusatz aufgearbeitet. Andere Teile wurden in der nachstehend beschriebenen Weise mit Cyaniden behandelt : a) Ein Teil des amorphen Niederschlages wird in Wasser gelöst und spektrographisch analysiert, wobei Adsorptionsspitzen bei 3610 A und 5200 A beobachtet werden. Die Lösung wird dann der Gegenstromverteilung zwischen Wasser und Benzylalkohol unterworfen. Es zeigt sich, dass 1 mg des festen Ausgangsmaterials nur 0,112 mg Vitamin B12 enthält. b) 10, 5 mg des amorphen Niederschlages werden in 3 cm 3 Wasser gelöst und 0,2 cm3 flüssiger Cyanwasserstoff zugefügt.
Die Lösung wird kurze Zeit stehen gelassen und dann auf 50 bis 600 erhitzt, um überschüssigen Cyanwasserstoff zu entfernen. Spektrographische Analysen zeigen Absorptionsspitzen bei 3610 , 5200 A und 5. 500 A, also eine Annäherung an das Vitamin jSpektrum. Die Lösung wird der Gegenstromverteilung zwischen Wasser und Benzylalkohol unterworfen. Dabei zeigt es sich, dass 0,220 mg Vitamin bis je 1 mg des Ausgangsmaterials vorhanden sind, also ein Zuwachs von 96 % stattgefunden hat. c) 9,6 mg des amorphen Niederschlages werden in 2 crrss Methanol gelöst und 0, 2 cm3 flüssiger Cyanwasserstoff (wasserfrei) zugegeben. Die Lösung wird 15 Minuten in einem Eisbad stehen gelassen und dann bei 50 bis 600 zur Trockne gebracht. Der Rückstand wird in Wasser gelöst.
Die spektrographische Analyse zeigt Absorptionsspitzen bei 3610 A, 5200 und 5500 , also Annäherung an das Vitamin B-Spektrum. Die wässerige Lösung wird der Gegenstromverteilung zwischen Wasser und Benzylalkohol
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Bei Behandlung von weiteren Teilen des amorphen Niederschlages mit flüssigem, wasserfreiem Cyanwasserstoff in Äthanol, Benzylalkohol und Kresollösung wurden' entsprechende Erhöhungen des
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d) 10, 8 mg des amorphen Niederschlages werden innig mit 2, 2 cm3 flüssigem, wasserfreiem Cyanwasserstoff gemischt und die Mischung stehen gelassen, bis der Cyanwasserstoff verdampft ist. Der Rückstand wird in Wasser gelöst.
Eine spektrographische Analyse der Lösung zeigt Absorptionsspitzen bei 3610 , 5200 und 5600 , also eine Annäherung an das Vitamin B-Spektrum. Die wässerige Lösung wird der Gegenstromverteilung zwischen Wasser und Benzylalkohol unterworfen. Die Gegenstromver-
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Stammes von S. griseus werden gemäss Beispiel l durch Behandlung mit Aktivkohle, Elution mit ButanolWasser, Benzylalkohol-Extraktion und chromatographische Behandlung und Fällung mit Äther aufgearbeitet, der Niederschlag wird mit Methanol ausgezogen, bis ein weisser Rückstand verbleibt. Die er- haltene Methanollösung zeigt bei Messung der optischen Dichte, dass 540 mg Vitamin B 2 und Vitamin B12-ähnliche Substanzen anwesend sind.
Der Methanollösung werden zur Fällung Aceton und Äther zuge- setzt bis die Flüssigkeit keine rosa Färbung mehr zeigt. Der Niederschlag wird in 300 cm 3 Wasser gelöst und mit Natronlauge auf PH = 8 eingestellt. Dann werden 2,7 g Natriumcyanid zugegeben und die Lösung 40 Minuten unter gelegentlichem Umrühren stehengelassen. Die Lösung nimmt Purpurfarbe an ; ein Beweis dafür, dass ein ausreichender Überschuss von Cyanid zugesetzt worden ist und wird dann mit Salzsäure auf PH 3 eingestellt, worauf zwecks Entfernung des Cyanwasserstoffes Stickstoff durch die Lösung geleitet wird. Dann werden 210 g Ammoniumsulfat zugegeben und mit Benzylalkohol in Portionen von 50 cm3, 25 cm3, 25 cm3 und 10 cm3 extrahiert. Die Extrakte werden durch Erwärmen auf 75'- 800 im Vakuum getrocknet und dann durch ein Sinterglasfilter filtriert.
Das Filtrat wird mit Äther versetzt und der entstandene Niederschlag einem Gegenstromverteilungs- und Reinigungsverfahren mit Benzylalkohol und Wasser unterworfen. Die hiebei erhaltenen Benzylalkoholextrakte werden vereinigt, durch Erhitzen auf 70 - 800 im Vakuum getrocknet und mit Äther versetzt. Der Niederschlag wird in Methanol gelöst und an aktiven Tonerde chromatographiert. Die Kolonne wird dabei mit Methanol entwickelt und die mit aktiven Substanzen angereicherte Hauptfraktion zur Niederschlagsbildung mit Äther versetzt. Die Rest-
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gefähr 90 mg Vitamin B12 enthalten, werden weiter verarbeitet. Der Niederschlag wird in 1, 9 cm Wasser gelöst und zur Kristallisierung gebracht.
Die roten Kristalle werden in 20 cm3 Wasser gelöst, die Lösung filtriert, mit 20 cm3 Wasser nachgewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat vereinigt. Dann werden 520 cm3 Aceton zugefügt, die gebildeten Kristalle abzentrifugiert, mit Aceton gewaschen und bei 560 im Vakuum getrocknet. Es werden 324,7 mg roter Kristalle erhalten, die bei weiterem Trocknen bei 1000 noch 5 % ihres Gewichtes verlieren. Die getrocknete Probe besteht aus 940/oigem Vitamin B12 Praktisch die gleichen Resultate werden erhalten, wenn die Cyanidbehandlungen in wässerigem Methanol und wässeriger Äthanollösung durchgeführt wurden.
Beispiel 4 : 31 der mit Hilfe eines Stammes von S. griseus erhaltenen Kulturflüssigkeit werden mit 2, 1 g in wenig Wasser gelöstem Natriumcyanid behandelt. Die Lösung wird zwei Stunden lang gerührt und mit konzentrierter Salzsäure auf PH = 4 eingestellt und dann über Nacht durchlüftet. Danach wurden der Lösung 2150 g Ammoniumsulfat und 30 cm3 Benzylalkohol zugefügt. Die Mischung wird gerührt, absetzen gelassen und die gebildete Benzylalkoholschicht abgezogen. Die wässerige Schicht wird nochmals mit 20 cm3 Benzylalkohol und 3 Portionen von je 10 cm3 Benzylalkohol ausgezogen.
Die erschöpfte wässerige Schicht wird verworfen, die vereinigten Benzylklkoholauszüge werden mit 2 Raumteilen Chloroform verdünnt und dann mit drei Portionen Wasser von je 5 cm3 ausgezogen. 10 cm3 der wässerigen Lösung, enthaltend etwa 300. 000 LLD-Einheiten je cm3 werden einem 8-Stufen-Gegenstromverteilungsverfahren mit Benzylalkohol unter Verwendung von 10 cm3-Phasen unterworfen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle veranschaulicht.
Zum Vergleich werden 31 der gleichen Kulturflüssigkeit einer entsprechenden Behandlung, jedoch ohne Cyanidzusatz unterworfen. Auch die erhaltenen Ergebnisse sind aus der Tabelle ersichtlich.
Verteilung der Aktivität in % der Gesamtaktivität
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<tb>
<tb> Rohre <SEP> Unbehandelte <SEP> Kulturflüssigkeit <SEP> Behandelte <SEP> Kulturflüssigkeit <SEP> Reines <SEP> Vitamin <SEP> B1,
<tb> 1 <SEP> 28,7 <SEP> 1 <SEP> 1,4
<tb> 2 <SEP> 19, <SEP> 1 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 8, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 23, <SEP> 4 <SEP> 29, <SEP> 0 <SEP> 20,9
<tb> 4 <SEP> 15, <SEP> 5 <SEP> 29, <SEP> 2 <SEP> 29, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 20, <SEP> 9 <SEP> 24, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 3,9 <SEP> 11, <SEP> 2 <SEP> 12,1
<tb> 7 <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP> 3,3
<tb> 8 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb>
Aus vorstehender Tabelle geht hervor,
dass die prozentuelle Verteilung der in der Ausgangslösung enthaltenen LLD-Aktivität auf die einzelnen Rohre bei Verwendung von esfadungSgemäss behandelter
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sehr ähnlich ist, wie insbesondere der Vergleich der Verteilungen in den Rohren 1 und 4 zeigt.
Beispiel 5 : 100 l einer bei der Züchtung eines Stammes von Strept. griseus anfallenden Kultur- flüssigkeit werden mit Salzsäure auf PH 2,5 angesäuert, dann mit 220 mg Natriumcyanid versetzt und 10 Minuten gerührt. Danach werden 100 g Fullererde und 100 g Diatomeenerde aufgeschlämmt und 30 Minuten lang gerührt, das Adsorbat abfiltriert und bei 500 getrocknet. Es zeigt eine Aktivität von 843. 000 Einheiten/g und ist als Wachstumsfaktor für Küken verwendbar.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von Vitamin bunter Erhöhung der Ausbeute, aus Kulturflüssigkeiten, welche durch Züchtung von Vitamin B12 produzierenden Mikroorganismen, wie z. B. Streptomyces griseus, in einem geeigneten Nährmedium erhalten wurden oder aus flüssigen oder festen Konzentraten dieser Kulturflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass diese Flüssigkeiten oder Konzentrate mit ionisierbaren Cyaniden wie vorzugsweise Metallcyaniden, Ammoniumcyanid oder Cyanwasserstoffsäure in einer der Menge an vorhandenen Vitamin B-ähnlichen Substanzen zumindest äquimolaren Menge behandelt und gegebenenfalls in an sich bekannter Weise weiter gereinigt werden.