DE869679C - Verfahren zur Erzeugung und Gewinnung eines antibiotischen Stoffes - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist die Erzeugung eines neuen antibiotischen Stoffes.

In den vergangenen Jahren wurde eine Anzahl Stoffwechselprodukte aus dem Wachstum von Bakterien und Pilzen isoliert, in denen wertvolle therapeutische Eigenschaften festgestellt wurden. Unter diesen seien erwähnt Penicillin, .Streptomycin, Gramicidin, Tyrocidin, Bacitracin, Subtüin, Actinomycin, Clavacin, Streptothricin und viele andere. Bei einigen derselben wurde nachgewiesen, daß sie außerordentlich wertvoll waren wegen ihrer Wirksamkeit gegen pathogene Organismen. Bei anderen wurde festgestellt, daß sie von begrenzter Brauchbarkeit waren wegen ihrer toxischen Eigenschaften oder wegen des geringen Bereiches ihrer antibakteriellen Wirksamkeit.

Einige dieser vorstehend beschriebenen antibiotischen Mittel sind hauptsächlich wirksam gegen gewisse positive Organismen und von geringer oder keiner Wirksamkeit gegen viele pathogene Organismen gewisser negativer Klassen. Penicillin ist ein prominenter Vertreter dieser Klasse. Wenige der beschriebenen antibiotischen Stoffe sind so weit wirksam gegen gewisse negative Organismen, und diese Stoffe besitzen in der Hauptsache nicht wünschenswerte Eigenschaften; so sind sie beispielsweise toxisch für einige Patienten, unwirksam, wenn sie per os angewendet werden, und haben das Bestreben, ihre Wirksamkeit zu verlieren infolge der Entwicklung von dem Mittel entgegenwirkenden Eigenschaften im Organismus.

Gemäß der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung einer antibiotischen Substanz vorgesehen, die als Aureomycin bezeichnet wird, ein Verfahren, welches das Impfen einer wäßrigen Nährlösung mit einer Kultur von Streptomyces aureofaciens umfaßt,

wobei' eine ■ aerobe Gärung stattfindet und Aureomycin aus der Gärungslösung gewonnen wird.

Weiter wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Nährmittel verwendet, wodurch die Ausbeute an Aureomycin gesteigert wird. Die Erfindung umfaßt verschiedene alternative Maßnahmen zur Gewinnung von Aureomycin aus der Gärlösung. Streptomyces aureofaciens, der wohl als Ultraschimmelpilz bezeichnet werden könnte, wurde einst ίο unter A-377 registriert und wurde zuerst aus dem Feldboden von^Timothy in Missouri, USA, isoliert. Er ist typisch aerobisch mit begrenztem Wachstum, wenn untergetaucht. Es bildet sich ein Mycel, und in jungem Zustand bilden sich getrennte Kolonien in Äsparagin-Fleischextrakt-Agar (späterhin als AMD-Agar bezeichnet), welche Nebenzweige aussenden, die sich schnell überschneiden und eine dichte, knopfartige Kolonie bilden, aus der die freien Enden der Ausläufer im allgemeinen geschlängelt herausragen. Oberflächenkolonien werden gezüchtet, die oft im Zentrum etwas zusammengedrückt sind. Auf Agarboden ausgesäte, gut verteilte zahlreiche Sporen ergeben ein Zusammenfließen der Kolonien, d.h. eine kontinuierliche Mycelschicht auf der äußeren Nährbodenschicht, eine Wachstumsart, die im allgemeinen als Oberflächenwachstum bezeichnet wird. In diesem Wachstumszustand sind auf AMD-Agar gewachsene Kolonien im allgemeinen glasig, etwa 48 Stunden lang, und gehen allmählich in ein Orangegelb über (matt bis hell leuchtend) und in mehreren Formen.

Das AMD-Agar wird wenig, wenn überhaupt, durch das Wachstum von Streptomyces aureofaciens pigmentiert. Auf dem AMD-Agar bilden sich auf einer kontinuierlich wachsenden, schräg ansteigenden Oberfläche einer Pilzkultur Luftableger,' die zuerst weiß aussehen und dann schwarzgrau werden und Sporen bilden (7 bis 10 Tage). Sie sind in diesem Zustand gelbbraun. Bruchteile von Ablegern bleiben ebenfalls grau.

Junge Ableger sind gramnegativ (bei älteren Ablegern variiert es) und nicht säurefest; diese jungen Ableger haben ungefähr einen Durchmesser von 0,7 bis 0,8 μ und werden zweimal so groß, wenn man sie von Conidia unterscheiden will. Die Conidia sind sphärisch bis oval und messen bis zu 1,5 μ im größten Durchmesser.

Das Wachstum auf AMD-Agar ist sehr gut und die Conidiaerzeugung äußerst reichlich bei günstiger Temperatur.

Das Wachstum auf Fleischbrüheagar ist gut, aber

die Erzeugung von Luftablegem und Conidia ist gehemmt. Durch Zufügung von NaNO₃ wird keine Besserung erzielt, eine geringe Besserung ergibt sich lediglich bei der Zufügung von Dextrose.

Das Wachstum auf mit Kornbrühe eingeweichtem Agar ist sehr gut, die Conidiabildung langsam, aber schließlich (nach 15 Tagen) umfangreich.

Das Wachstum auf synthetischem Agar (Uschinskys Asparagin) ergibt schwere, glasige, gelbliche Ausbreitungen von Mycel, keine Conidia, und in der Mitte bildet sich eine wolkige gelblichbraune Pigmentierurig. ■

Das Wachstum auf gedämpften Kartoffeln ist orangegelb (bis bräunlichgelb bei gewissen Spielarten), beträchlich gesteigert, wobei die Oberfläche stellenweise knotenartige Gebilde aufweist.

Gelatineteilchen verursachen in 15 Tagen bei 26⁰C keine Verflüssigung.

Bei Nährbouillon entsteht ein Kragen von fast glasigem Wachstum an der Glasoberfläche; bei Zufügen von Nitrat ist das Wachstum ähnlich, aber sowohl bei Dextrose als auch bei Stärkezusatz wird dieser Kragen gelblichbraun.

Lakmusextrakt unterstützt auch ein wenig die kragenartige Wachstumsform, die oben gelblichbraun aussieht, aber in 15 Tagen zeigt sich weder eine zu bezeichnende Änderung des pH, noch wird eine Peptonisierung erkennbar.

In Gärröhren (mit Phenolrot als Indikator, pji 6,8 bis 7) ergibt sich keine Anreicherung von Gas beim Zufügen von Xylose, Glucose, Galaktose, Saccharose, Maltose, Laktose, Glycerin oder Mannit zur Nährlösung. Die Azidität geht im Verlauf von 5 Tagen in Gegenwart von Glucose oder Saccharose ein wenig zur alkalischen Seite über unter gleichzeitiger Farbänderung. In Gegenwart von anderen Kohlenstoff liefernden Stoffen tritt entweder kein Wechsel ein (Maltose, Glycerin), oder es zeigt sich eine wachsende Alkalität, am stärksten beim Zusatz von Mannit. g₀

Beim Zusatz von anderen Kohlenstoff liefernden Stoffen, Dextrose, Saccharose, Maltose, Laktose, Dextrin, Stärke, Glycerin und Mannit, zeigt sich, daß das Wachstum verbessert wird.

Im Agar dispergiert wird lösliche Stärke in einer Zone um die Kolonien herum hydrolysiert (p# = 5,8 bis 6,0). Die Hydrolyse der Stärke tritt auch ein, wenn die Dispergierung in Nährbouillon stattfindet. Optimales Wachstum und Sporenbildung tritt bei Streptomyces aureofaciens in dem Temperaturbereich von 28 bis 37⁰C auf. Bei 17⁰C ist das Wachstum sehr langsam. Die obere Grenze des Wachstums liegt etwa bei 42⁰C. Die Wärmetoleranz (oder LD 50) liegt angenähert bei 55°C bei Standardzeiten (10 Minuten), wobei als Eintauchbehälter besonders dünnwandige ausgezogene Glasröhren verwendet werden. Vollständiges Abtöten erzielt man bei ungefähr 65⁰C. Die vorstehend gegebene Charakteristik differenziert Streptomyces aureofaciens und seine Formen von irgendeiner anderen beschriebenen amerikanischen Spezies.

Zur Isolierung von Streptomyces aureofaciens zwecks Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine Bodenprobe in Wasser suspendiert und auf 54⁰C 10 Minuten lang erhitzt zur Eliminierung zahlreicher Streutypen von Schwarzschimmel und gewisser hitzeempfindlicher Bakterien. Eine Parallelprobe wurde mit einem nicht erhitzten Muster durchgeführt. Ein Agar aus 2 g Fleischextrakt, 0,5 g Asparagin, 10 g Dextrose, 0,5 g K₂HPO₄ und 18 g Agar auf 11 Wasser wurde hergestellt und in üblicher Weise Platten ausgegossen. Die Bodensuspension wurde aufgelöst und auf den Agarplatten ausgebreitet und letztere bei 26 bis 28⁰C in den Brutschrank gebracht. Gewisse Teile der Platten können vorsichtig nach Wunsch mit der Probe eines Organis-

mus, wie Escherichia coli, ausgegossen werden, um die Isolierung einer Kultur zu unterstützen.

Wenn ein Organismus, der die vorstehend beschriebenen ^Eigenschaften besitzt, aus dem Bodenmuster in einer einzelnen Kolonie isoliert ist, kann er auf andere Wachstumsböden überführt und in der Folge zum Impfen im großen Umfang zur Erzeugung von Gärmedien von Aureomycin auf kommerzieller Basis verwendet werden,
ίο Aureomycin ist wirksam gegen viele Bakterien einschließlich Grampositiv und Gramnegativ und zeigt gewisse bemerkenswerte Eigenschaften in seiner Wirkung gegen gewisse Viren- und rachitisartige Erkrankungen.
Unter den^gramnegativen'Organismen, welche in vitro in Gegenwart von Aureomycin nicht gedeihen, seien .erwähnt Escherichia coli, Eberthella typhosa, Salmonella pullorum, Shigella gallinarum, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Aerobacter aerogenes, Neißeria catarrhalis und Brucella abortus. Unter den grampositiven Organismen, deren Wachstum in vitro durch Aureomycin gehemmt wird, seien erwähnt Bacillus cereus, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Bacillus subtüis und Streptococcus pyogenes. Andere pathogene Lebewesen werden ebenfalls in verschiedenen Graden durch Aureomycin angegriffen.

Aureomycin bildet mit Säuren Salze und ist in verdünnter Säure löslich, hat aber das Bestreben, aus der Lösung in der Nähe des Neutralitätspunktes auszufallen. Es wird bei dem Erwärmen in wäßrigen Lösungen von starken Säuren oder Alkali zersetzt. Es enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Chlor und Sauerstoff. Die chemische Analyse einer Anzahl von Mustern des gereinigten mono-salzsauren Salzes ergab einen mittleren Kohlenstoffgehalt von 51,49 %, Wasserstoff 5»44%. Stickstoff 5,53 %, Chlor 13,51 %, keine Asche, Sauerstoff 24,03 °/₀ mit Unterschied. Andere saure Salze der freien Base bilden sich leicht nur bei Neutralisation mit Säuren, wie Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure u. dgl. Derartige saure Salze bilden die bevorzugte Form für das neue Produkt wegen ihrer leichten Erzeugung und Handhabung» Niederschläge mit Picrinsäure, Reineckes Säure und Ammoniummolybdat bilden sich ebenfalls in wäßrigen Lösungen.

Kristalle des Salzsäuren Salzes zeigen eine röhrenförmige oder equidimensionale orthorhombische Form, bisweilen mit rhombischen Begrenzungslinien. Es ist keine bevorzugte Spaltungsrichtung vorhanden, und beim Zerbrechen der Kristalle zeigen sie eine muschlige Bruchfläche. Ihre Farbe ist hell, glasig Citronengelb. Untersuchungen unter dem Polarisierungsmikroskop ergäben, daß die Kristalle zweiachsig sind mit einem optischen Winkel von mehr als 6o°, mit optisch negativen Vorzeichen. Der Brechungsindex betrug a — 1,633 ± °.⁰⁰5< ^: = ^x>7°5 ± 0,005, γ = 1,730 J₁ 0,005. Alle Auslöschungen waren entweder parallel oder symmetrisch. Die Kristalle der freien Base sind sehr klein, nadeiförmig, im allgemeinen abgeflacht und haben einen Refraktionsindex parallel zur Längsrichtung, der etwas größer ist als 1,674, aber nicht mehr als ungefähr 0,020. Die spezifische Drehung der freien Base in Methanol beträgt [a] ^ = ·—-274,9. Die spezifische Drehung des salzsauren Salzes in Methanol betrug M23 — —²95»9 ^un(i ^m Wasser [a]₂° = —227,9.

Die freie Base ist sehr löslich in Pyridin und löslich in Methanol und Aceton bei 25⁰C, bis zu 13 bis 14 mg pro Kubikzentimeter. Die Löslichkeit in Äthanol ist eine beträchlich geringere, und in Wasser beträgt die Löslichkeit bei 25⁰C ungefähr 0,55 mg pro Kubikzentimeter. Andererseits ist das salzsaure Salz in Wasser und Methanol löslich, weniger löslich in Äthanol und löslich in Aceton bei 25⁰C bis zu einem Ausmaß von 0,13 mg pro Kubikzentimeter.

Aureomycin weist charakteristische Absorptionsbande sowohl im Ultraviolett als auch im Ultrarot auf. Wenn das salzsaure Salz in einer wäßrigen Lösung bei einem pn von 2 und einem Gehalt von 0,1 Mol Phosphorsäure aufgelöst ist, wies die Absorptionskurve die Maximalabsorption im Ultraviolett bei ungefähr 365 ταμ, 264 ταμ und 226 ταμ auf. Die geringste Absorption lag bei 305 ταμ, 242 ΐημ und 215 ταμ. Bei einem pn von 4,3 unter Verwendung von 0,1-molarem KH₂PO₄ als Puffersubstanz, lag die Maximalabsorption bei 370 ταμ, 265 ταμ, 251 ταμ und 229 ταμ. Bei einem ph von 8,9 in einer wäßrigen Lösung von 0,11-molarem K₂HPO₄ als Puffersubstanz lag die Maximalabsorption bei 276 ταμ, 248 ταμ go 240 ταμ und 223 ταμ. Das Absorptionsminimum lag bei 325 ταμ, 262 ταμ, 245 ταμ und 233 ταμ. Im allgemeinen sind diese Maximal- und Minimalabsorptionsbande nicht sehr scharf definiert und verschiedene Beobachter stellen möglicherweise die genauen Umkehrpunkte bei ein wenig verschiedenen Wellenlängen fest. Charakteristische Infrarotabsorptionsspektren, die an einem Muster des salzsauren Salzes festgestellt wurden, das in Mineralöl emulgiert war, zeigten das nachfolgende Bild: eine O—H- oder N—H-Absorptionsbande nahe bei 3295 cm"¹, eine Phenol-C—H-Absorption bei 3050 cm"¹, ein mögliches Amidcarbonyl bei 1665 cm""¹, eine mögliche C=C-Bindungsfrequenz bei 1616 cm""¹, eine mögliche N—H-Beugungsvibration bei 1575 cm"¹, eine p-substituierte Phenylabsorption nahe bei 1523 cm"¹, eine mögliche R—CH=CH—R-, CH-Biegungsvibration bei 969 cm""¹ und vielleicht eine p-Phenylbande bei 840 cm"¹ mit genügender zusätzlicher Substitution (3-symmetrisch), wie sich durch die Absorption bei 851 und 863 cm"¹ zeigt.

Die Infrarotabsorptionsspektren des salzsauren Salzes in Mineralöl zeigt sich durch nicht deutbare Absorptionsbande besonders in der Gegend von 650 bis 1350 cm"¹, die bisweilen auch die Fingerdruckgegend des Infrarotspektrums genannt wird. Die Absorptionskurve in dieser Gegend ist in der Abb. 1 der Zeichnung wiedergegeben. Diese Absorptionsbande zeigt, daß Aureomycin sich von irgendeinem früher beschriebenen antibiotischen Material unterscheidet.

Ähnlich zu dem oben Gesagten zeigt die freie Base ine starke O—H- oder N—H-Absorptionsbande in der Nähe von 3420 cm"¹, höchstwahrscheinlich eine O—Η-Absorption und eine weitere O—H- oder N—H-Absorptionsbande im Bereich zwischen 3200 und 3300 cm"¹. Die Absorptionskurve zeigt auch eine

Phenyl-C—H-Absorptionsbande bei 3050 cm""¹, ein mögliches Amidcarbonyl bei 1643 cm""¹, eine mögliche C=C-Bindungsfrequenz bei 1609 cm"·¹, eine mögliche N—H-Biegungsvibration bei 1580 cm"¹, eine p-substituierte Phenylabsorption bei 1523 cm"¹, eine mögliche R-CH=GH-R-, CH-Biegungsvibration bei 969 cm""¹ und eine p-Phenylbande bei 825 cm""¹ mit zusätzlicher Substitution bei 844 cm"¹ und 867 cm""¹, wie in Abb. 2 wiedergegeben, ist. Zusätzliche charakteristische. Absorptionsbande zeigen sich auch im Bereich zwischen 650 cm"¹ und 1350 cm"¹ in Abb. 2. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzeugung von Aureomycin läßt man eine Kultur von Streptomyces aureofaciens aerobisch wachsen, vorzugsweise in einer Tieftankkultur in einem geeignetem Nährmedium unter zeitlichen, .;. Temperatur-, pjr- usw. Bedingungen, wie nachstehend beschrieben wird. Das Nährmittel enthält im allgemeinen wie andere Medien, in welchen andere Pike zur Erzeugung von antibiotischen Substanzen gewachsen sind, eine Kohlenstoff quelle, wie beispielsweise ein lösliches Kohlehydrat, eine Stickstoff quelle, organisch oder anorganisch, gewisse Mineralsalze; wie Phosphate und Spuren verschiedener Metalle, die üblicherweise als Verunreinigung in den anderen Bestandteilen des Mediums sich finden.

Als Kohlenstoffquelle kann man im allgemeinen Stärke verwenden, die sogenannte lösliche Stärke und Zucker, wie Saccharose, Glucose, Maltose, Dextrose od. dgl., und andere wasserlösliche oder teilweise wasserlösliche Kohlehydratstoffe, wie Zuckeralkohole usw. Die Menge der Kohlenstoffquellen zur besten Erzeugung der antibiotischen Stoffe in dem Medium kann beträchlich variieren, von etwa ¹Z₂ bis 5 Gewichtsprozent des Gesamtgewichtes des Gärungsmediums, Geeignete Stickstoffquellen für den Gärungsprozeß - ■ sind weitgehend verschiedene Stoffe, wie Aminosäuren, Kasein, beide hydrolysiert oder nichthydrolysiert, Fischmehl, Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Leberkuchen und verschiedene andere stickstoffhaltige Stoffe pflanzlichen oder tierischen Ursprungs. Chemikalien, wie Harnston, Nitrate und Ammoniumverbindungen, können auch zum Nährmedium als Stickstoffquelle zugefügt werden. Chemisch vorgebildete Stoffe können zugefügt werden als Quelle von teilweise vorgeformten Molekülgruppen, wodurch _t ■ höhere Ausbeuten erhalten werden. Maisquellwasser ist wegen der großen Mannigfaltigkeit der darin enthaltenen organischen und anorganischen Stoffe ein wertvoller Zusatz zur Gärmasse. Es ist natürlich wegen der rohen Natur vieler dieser stickstoffhaltigen ι Stoffe nicht möglich, definierte Angaben über das zuzufügende Material zu machen. Eine Menge von etwa 0,1 bis 5,0 Gewichtsprozent fester Stoffe umfaßt in den meisten Fällen die brauchbare Menge von zur Gärmassezuzufügenden stickstoffhaltigen Substanzen, In bei Gärungsverfahren üblicher Weise wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung in flüssigem Medium durchgeführt, das gewisse anorganische Salze, wie Phosphate, enthält. Unter Elementen, deren Gegenwart in kleinen Mengen wünschenswert .-2 erscheint, befindet sich Kalium, Calcium, Magnesium, - Schwefel, Eisen und gewisse Elemente in Spuren.

Bei Verwendung von rohen Substanzen als Stickstoff- oder Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise Mais- quellwasser, sind jedoch viele dieser Elemente hierin enthalten und brauchen nicht besonders zu der Masse zugefügt zu werden.

Das pn bei Verwendung der vorstehend beschriebenen Gärmasse sollte vorzugsweise auf der sauren Seite liegen, etwa bei einem pn von 6 bis 7 zu Beginn des Gärungsprozesses. Dieses Ph kann durch Einjustierung des Mediums, falls notwendig, mit geeigneten Puffersubstanzen, wie Phosphatsalzen, erhalten werden.

Die günstigste Temperatur für den Gärungsprozeß liegt bei etwa 26 bis 28⁰C, obgleich niedrigere Temperaturen, wie 20° C, oder höhere, wie 35⁰C, bei 30 bis 40 Stundenlanger Gärung bei optimalen Temperaturen und Luftdruckbedingungen eingehalten werden können, aber natürlich könnten niedrige Ausbeuten in kürzeren Zeiträumen erhalten werden, und eine längere Periode könnte unter gewissen Bedingungen erwünscht sein.

Wirtschaftlich praktische Ausbeuten an Aureomycin wurden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Gärungsmediums erhalten, aber es hat sich gezeigt, daß die gewünschten Stoffwechselprodukte und vielleicht auch andere Produkte des Wachstums des Mikroorganismus Streptomyces aureoiaciens als Fäulnisprodukte wirken, welche das weitere Wachstum nicht nur irgendwelcher Bakterien, die vorhanden sein können, hemmen, sondern auch das des gewünschten Mikroorganismus selber. Der Zusatz gewisser Salze von gewissen Metallen als Kation scheint Niederschlagsbildung oder Absonderung der gebildeten Produkte zu verursachen. Kationen, welche hier geeignet sind, sind gewisse zweiwertige Kationen, nämlich die des Calciums, Bariums, Strontiums und Magnesiums. Diese können entweder als Salze von Metallen oder als Metallhydroxyd zugefügt werden. Im allgemeinen ist das Vorhandensein einer verhältnismäßig großen Menge solcher Kationen erwünscht, meistens in der Menge von etwa 0,1 °/₀ oder mehr, berechnet auf das Kation selber. BeträchHch größere Mengen hemmen das Wachstum im allgemeinen nicht und gewöhnlich sind sie nicht schädlich, so viele Metallkationen auch in der Lösung zurückbleiben. Es ist möglich, daß der Stoffwechsel derartig ist, weil Aureomycin eine wenig lösliche schwache Base ist und als Metallsalz ausgefäEt wird, und da das Antibiotikum, wie es sich bildet, aus dem Gärungsmedium entfernt wird, gestattet diese Entfernung ein kräftiges Wachstum des zu bildenden Mikroorganismus und der sich ergebenden zusätzlichen Bildung von Aureomycin.

Für Maximalwachstum ist es erforderlich, das pji der Gärflüssigkeit innerhalb enger Grenzen zu kontrollieren. Äußerst wirksames Wachstum kann im Bereich wischen 5,0 und 8,0 erzielt werden. Beste Ergebnisse werden erhalten im Bereich von angenähert 6,4 bis ,0. Das pji der Gärflüssigkeit muß stabilisiert werden, weil während des Gärungsprozesses gute Produkte ebildet werden, welche im allgemeinen dazu führen, daß das Medium sauer wird. Um diese innewohnende Tendenz nach der sauren Seite hin zu überwinden,

muß man entweder Alkali in solchen Mengen zufügen daß das ρκ kontrolliert wird, oder man muß einen Stoff zugeben, der als effektive Alkalireserve wirkt und in solchen Mengen vorhanden ist, daß das ph innerhalb des genannten Bereiches gehalten wird Die Gärung zur Erzeugung therapeutisch erwünschter Produkte sollte unter sterilen Bedingungen derartig durchgeführt werden, daß der gewünschte Mikroorganismus allein während des Wachstums zugegen ist. Die aseptische pn-Kontrolle ist ein außerordentlich schwieriges Verfahren, so daß man beispielsweise, während die vorliegende Erfindung unter Aufrechterhaltung der pg-Kontrolle durchgeführt wird, auf sterilem Wege Teile des Gärmediums zur Feststellung des ph entfernen muß, darauf genügend Alkali zur Aufrechterhaltung des gewünschten pn aseptisch zufügen muß, wobei ein derartiges Verfahren Komplikationen vom Standpunkt der Durchführung mit sich bringt.
Als besonders brauchbarer Arbeitsgang des Erfindungsgegenstandes erweist sich die pH-Kontrolle durch Einführung eines Materials, das infolge der ihm eigenen Eigenschaften das pH innerhalb der gewünschten Grenzen zu halten gestattet. Es hat sich ergeben, daß zu diesem Zweck ein Zusatz von Calciumcarbonat besonders erwünscht ist und auch Magnesiumphosphat sehr befriedigende Ergebnisse erzielen läßt. Durch diese Produkte werden gleichzeitig sowohl die gewünschten Metallkationen und auch die Alkalireserve hervorgebracht. Calciumcarbonat ist besonders wirkungsvoll innerhalb der Grenzen von 0,25 bis 1,0 Gewichtsprozent in der Masse. Außerordentlich hohe Ausbeute erhält man, wenn angenähert 0,625 % zugegen sind. Größere Mengen als 1 % sind unnötig und können Schwierigkeiten während der Gewinnung des Aureomycins mit sich bringen. Weniger als 0,25 °/₀ Calciumcarbonat ist nicht ausreichend zur Aufrechterhaltung der gewünschten pn-Kontrolle zur Erzielung maximaler Ausbeuten. Wenn weniger als diese Menge Calciumcarbonat benutzt wird, muß die Gärmasse entweder hinsichtlich des pn auf andere Weise kontrolliert werden, oder das Medium wird so sauer werden, daß die Erzeugung von pn gehemmt wird, ehe die Ausbeute erreicht wird, die auf anderem Wege als Maximum zu erzielen ist.

In der Gärmasse müssen Spuren gewisser Elemente für ein effektives Wachstum der Mikroorganismen vorhanden sein. Zu diesem Zweck ist es erwünscht, daß Verunreinigungen vorhanden sind und diese angenäherte Mengen an Salzen enthalten, die 0,00033% Mangansalz entsprechen, ausgedrückt als MnCl₂- 4H₂, 0,00033% Kupfer als CuSO₄-SH₂O und 0,005% Zink als ZnSO₄ · 7H₂O. Bei vielen Gärbedingungen findet man, daß genügend Spuren dieser Elemente als Verunreinigungen zugegen sind oder in den Nährzusätzen, wie in dem Maisquellwasser oder im Kasein usw., so daß zusätzliche Mengen dieser Salze nicht zugefügt zu werden brauchen. Die Mengen der verschiedenen Nährstoffe können in weiten Grenzen schwanken, und trotzdem kann eine praktisch befriedigende Ausbeute an Aureomycin erhalten werden. Zur Erzielung erwünschter Ergebnisse kann Maisquellwasser als teilweise Quelle für den erforderlichen Stickstoff und als Quelle für gewisse Spuren von Elementen und als Quelle für gewisse Kohlehydrate dienen. Eine geeignete Form, das Maisquellwasser zuzufügen, ist das Penicillin-Maisquellwasser, das ungefähr 50% feste Stoffe enthält. Hiervon werden optimale Ergebnisse erzielt bei Verwendung von 2%, auf Flüssigkeit berechnet, die ungefähr 50% feste Stoffe enthält. Bis zu 3 % können wirtschaftlich verwendet werden, aber ein Zusatz von mehr als 3 % ergibt weniger erwünschte Verfahrensbedingungen. Es ist nicht notwendig, daß das Maisquellwasser verwendet wird, aber wenigstens 1% ist aus Vernunftsgründen billig und ist eine effektive Quelle von Nährstoffen.

Saccharose -ist eine billige und leicht beschaffbare Quelle für Kohlehydrat. Für Maximalprodukte wird ein Zusatz von 3 Gewichtsprozent empfohlen. Bis zu 5 % mögen tatsächlich verwendet werden, aber auch andere Stoffe können ganz an die Stelle der Saccharose als Kohlehydratquelle treten.

Zum Impfen kann ein Ausläufer oder eine andere Quelle einer Kultur benutzt werden, aber die wirtschaftliche Erzeugung erhält man, wenn genügend Impfstoff verwendet wird, der zwischen angenähert ι und 5 Volumprozent der gesamten Gärmasse beträgt. Eine geeignete Arbeitsmethode liegt darin, dieselben Typen von Nährmittel zu benutzen und mit Streptomyces aureofaciens beschickte Schüttelflaschen aus Agarsaat zum Einsäen zu verwenden.

Um die Wirkung von Variationen in der Rasse zu verringern und sicherzustellen, daß jeder nachfolgende Gärtank zur Handelserzeugung in Gang gesetzt wird unter so ähnlichen Bedingungen wie möglich und um jede Verunreinigung zu vermeiden, ist es üblich, jeden Tank mit seiner eigenen Kultur in Gang zu setzen. Es versteht sich von selbst, daß ein Teil von jedem Tank als Kultur für den nächsten Tank zurückgehalten werden kann.

Eine Zeitdauer von angenähert 36 Stunden hat sich als die wünschenswerte in den meisten Fällen ergeben. Zwischen 24 und 60 Stunden werden befriedigende Ergebnisse bei 1 bis 5 % vorgeformter Impfmasse als Saatgut erhalten. Wenn der Gärtank zu lange in Gang gehalten wird, können die Ausbeuten sinken. Modifikationen in Zeit, Temperatur und Menge innerhalb verständiger Grenzen ergeben sich für die Fachleute von selber.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend einige Beispiele wiedergegeben, die nur gewisse Ausführungsformen der allgemeinen Erfindung darstellen sollen. Man kann von den bevorzugten Beispielen in bestimmter Weise abweichen und doch noch befriedigende Ergebnisse erhalten.

Beispiel 1

Aus Gründen der Bequemlichkeit wurde ein leitungswasserhaltiges Medium verwendet. Es wurde eine Impfmasse mit Sporen bereitet, vom Rand einer mit Kartoffeln beschickten Röhre entnommen, und diese wurde zum Impfen von acht Schüttelgefäßen mit Saatmasse verwendet. Dieses Saatmedium enthielt % Maisquellwasser, 3 % Saccharose, 0,5 % CaCO₃.

Nach 24stündiger Einlagerung bei 28°C, während welcher das Saatmedium dauernd geschüttelt wurde, wurden vier Flaschen zur Bildung von zwei Impfsätzen vereinigt. Mit diesen Impfsätzen wurden gleichartige Tanks besät, so daß die hieraus erhaltenen Ergebnisse einen Durchschnitt von mehreren Tanks und von mehreren Saatmassen ergaben und irgendwelche technischen Fehler die Beurteilung oder die Probe im Endergebnis zeigen mußten und die hierbei als Kontrolle für die Verfahren dienen konnten, wobei die Wirkungen zufälliger Vorkommnisse eliminiert werden konnten. Zuletzt wurde ein Gärtank angesetzt, der Leitungswasser als Verdünnungsmittel enthielt, ferner 2 °/₀ Maisquellwasser, Penicillin-Qualität, 50 % feste Stoffe, 3 % Saccharose, 0,625% CaCO₃, o,2 °/₀ Ammoniumsulfat. Genügende Mengen Mangansalze, Kupfer und Zink wurden zugefügt, um sicherzustellen, daß Spuren dieser Elemente bis zu dem früher angegebenen Ausmaß vorhanden waren. Das pn derJTankfLüssigkeit wurde auf 6,0 mit i/i n-Kaliumhydroxyd eingestellt und sterilisiert. Während der Sterilisation stieg das pH auf angenähert 7,2 bis 7,4 und fiel wieder auf 6,3 bis 6,6 während der Wachstumsperiode. Der Tank wurde mit der vorgebildeten Impfmasse, wie oben beschrieben, geimpft, wobei 5 Volumprozent der vorgeformten Impfmasse benutzt

	Tabelle	I	3,o	/0 Saccharose	5,o	36 Stunden Wachstumszeit	3>°	4,0	5,o	48 Stunden Wachstumszeit	Y0 Saccharose	5,o
		142	4,o	116	°/0 Saccharose	230	200	199		4,o	213
	Ausbeute in mg /ecm Maische	140	.125	180		235	280	3,o	22&	249
	24 Stunden Wachstumszeit	160	167	149	204	272	279	186	247	220
%	0	162		264	288
0,25		278
0,625
1,0

Aus den vorstehenden Ergebnissen sieht man, daß die Ergebnisse gemäß Beispiel ι als bevorzugt zur Erlangung höchster Ausbeuten bei Benutzung der speziellen hierbei verwendeten Rasse anzusehen sind.

Beispiel 28

Ein Gärmedium wurde hergestellt unter Verwendung von Leitungswasser und 1,0 % Kasein, 3,0% Saccharose, 0,02% MgSO₄-7 H₂O, 0,001% FeSO₄-H₂O, 0,00033 % Cu S O₄ · 5 H₂O, 0,00033 % MnCl₂-H₂O, 0,005 % ZnSO₄ ■ 7 H₂O, 0,5 % CaCO₃, o,6% • KaSO₄, 0,35 % NH₄OH. 100 ecm der Masse wurden in eine 500-ccm-Flasche gebracht, sterilisiert und mit ecm Impfmasse gemäß Beispiel 1 geimpft. Die Masse wurde dann dauernd geschüttelt, um sowohl Belüftung als auch Rührung unter aseptischen Bedingungen 40 Stunden lang zu ermöglichen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das Maischemuster auf eine Ph von 3 mit Schwefelsäure gebracht, abfiltriert und geprüft. Die Prüfung der Maische zeigte einen Gehalt von 274 mg Aureomycin pro Kubikzentimeter.

Beispiel 29

Ein Gärmedium wurde hergestellt, enthaltend 1,0 % Kasein, 3,0 % Saccharose, 0,18 % Ammoniak, 0,166% (NH^)₂SO₄, 0,001% FeSO₄-7 H₂O, wurden und die Masse unter ständigem Rühren und Belüften 36 Stunden bei 28° C ihrem Wachstum überlassen. Zusätzlich zu anderen Wirkungen wird durch das Rühren das Calciumcarbonat in Suspension gehalten. Es sei bemerkt, daß eine große Menge Antibiotikum aus der Masse während der Gärung infolge der Gegenwart von Calciumcarbonat entfernt wurde. Ein Teil der Schlußmaische wurde mit Schwefelsäure auf einen pn-Wert von angenähert 3 gebracht, abfiltriert und geprüft. Die Tankprobe zeigte einen Gehalt von 396 mg Aureomycin pro Kubikzentimeter.

Beispiel 2 bis 27

Ähnliche Arbeitsgänge wurden unter gleichen Bedingungen gemacht, jedoch in geringerem Umfang als die des vorstehenden Beispiels, um die Wirkung verschiedener · Variablen auf die Erzeugung von Aureomycin festzustellen. Außer den angegebenen Abänderungen waren alle Bedingungen im wesentlichen dieselben wie in dem vorstehenden Beispiel. Der Prozentgehalt an Saccharose an Calciumcarbonat und die Zeitdauer wurden in Verbindung miteinander variiert, um die Wirkung derselben auf diese Variablen festzustellen. Die Zeit und die Konzentrationen waren die in der folgenden Tabelle angegebenen.

0,00033% MnCl₂-4 H₂O, 0,00033% CuSO₄ · 5H₂O, 0,005% ZnSO₄ · 7 H₂O, 0,05% KCl, 0,05 % MgSO₄-7H₂O, 0,25% CaCO₃, 0,14% Calcium-a-oxyisobutyrat.

Die Flaschen wurden wie im vorstehenden Beispiel bereitet und enthielten das Gärmedium, deren Inhalt nach der Sterilisation mit 5 ecm vorgeformter Impfmasse gemäß Beispiel 1 geimpft wurde. Das anfängliche pH betrug 8 und sank nach 40 Stunden auf 6,8. Nach 40 Stunden bei 28° C wurde das Medium mit Schwefelsäure auf ein ph von 3 gebracht, abfiltriert und geprüft. Die Probe zeigte für den Flascheninhalt 269 mg Aureomycin pro Kubikzentimeter.

Beispiel 30 n*

Ein Gärmedium wurde bereitet und unter gleichen Bedingungen wie im vorstehenden Beispiel vergoren mit Ausnahme dessen, daß anstatt von Calciumhydroxyisobutyrat das Medium 0,0004 % Ca Cl₃ · 6 H₂ O enthielt. Das anfängliche pa betrug 7,7, zum Schluß 7,1 und bei der Probe enthielt die Maische 245 mg pro Kubikzentimeter.

Beispiel 31

Ein Gärmedium wurde bereitet mit folgender Zusammensetzung: 2% Maisquellwasser, 3% Sac-

charose, 0,2 % Ammoniumsulfat, 1,54 % Mg₃(PO₄)₂ · 7 H₂O. 100 ecm der Masse wurden in eine 500-ccm-Flasche gebracht, sterilisiert und 5 ecm Impfmasse gemäß Beispiel 1 geimpft. Die Masse wurde dauernd geschüttelt, um sowohl Rührung als auch Belüftung unter aseptischen .Bedingungen 40 Stunden lang sicherzustellen. Das anfängliche pH betrug 6,2, das Schluß-pH 5,8. Nach dieser Periode ergab eine Änylyse 217 mg Aureomycin pro Kubikzentimeter.

Beispiel 32

Ein Gärmedium wurde bereitet und das Wachstum in Gegenwart von 0,925 % Strontiumcarbonat anstatt Magnesiumphosphat 40 Stunden lang bei 28⁰ C in Gang gesetzt, wie in dem vorstehenden Beispiel angegeben. Alle anderen Bedingungen waren dieselben wie in dem vorstehenden Beispiel, und bei einer Analyse der Maische wurde ein Gehalt von 209 mg Aureomycin pro Kubikzentimeter gefunden. Das anfängliehe Ph betrug 6,4, das Schluß-pH 5,8.

Beispiel 33

Ein Gärmedium gemäß Beispiel 31 wurde bereitet mit einem Gehalt von 1,25 % Bariumcarbonat anstatt Magnesiumphosphat. Das anfängliche pH war 7,3, das Schluß-pH 7,1. Nach Durchführung der Gärung enthielt die Maische 192 mg Aureomycin pro Kubikzentimeter.

Beispiel 34

Ein Gärmedium wurde bereitet mit einem Gehalt von 2% Maisquellwasser, 0,2% Ammoniumsulfat, °,5% Calciumcarbonate 0,001% FeSO₄-7 H₂O, 0,00033 % CuSO₄ · 5 H₂O, 0,00033 % MnCl₂ · 4 H₂O,

35,0,005% ZnSO₄-7 H₂O, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 3 % Kohlehydrat. 100 ecm des Mediums wurden in eine 500-ccm-Flasche gefüllt, sterilisiert und mit 5 ecm Impf masse gemäß Beispiel 1 geimpft. Das anfängliche Ph betrüg 6,8. Man ließ das Material unter Rührung und Belüftung und unter aseptischen Bedingungen 40 Stunden lang bei 28⁰ C gären und am Schluß dieser Periode wurde die Maische analysiert. Wenn als Kohlehydrat Dextrin verwendet war, ergab sich ein Schluß-pn von 6,4 und eine Ausbeute von 132 mg pro Kubikzentimeter.

Beispiel 35

Ein Gärmedium wurde hergestellt gemäß einem Verfahren wie es im Beispiel 34 auseinandergesetzt ist mit der Ausnahme, daß das Kohlehydrat Maltose war und das endgültige pn 7,3 und die erzielte Maische 130 mg Aureomycin pro Kubikzentimeter enthielt.

Beispiel 36

Ein Gärmedium wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 34 hergestellt mit der Ausnahme, daß als Kohlehydrat Saccharose benutzt wurde und das Schluß-pH 6,2 betrug und die Maische 225 mg Aureomycin pro Kubikzentimeter ergab.

Es sei bemerkt, daß die besondere Rasse von Streptomyces aureofaciens einige Schwankungen in der Ausbeute ergibt und daß die Rassen nicht notwendigerweise echt bleiben, aber sie können mit der Zeit infolge ihrer Anhaftwandlungen sich ändern. Mit ähnlichen verschiedenartigen Rassen läßt sich am besten arbeiten mit leicht abgewandelten Medien; aber die oben beschriebenen Ergebnisse sind bezeichnend für den Weg, den man erwarten möchte und es liegt innerhalb der Fachkenntnis, kleine Abänderungen im Medium und in den Gärbedingungen, wie sie oben vorgeschlagen sind, zu machen, um jeden Stamm unter den besonderen Bedingungen zu behandeln, unter welchen es besonders befriedigend gedeiht.

Drei alternative Verfahren für die Gewinnung von Aureomycin aus Gärrnedien und deren Reinigung sollen nun beschrieben werden.

Verfahren A

Dieses Verfahren schließt chromatographische Adsorption ein.

Die aureomycinhaltige vergorene Maische kann verwertet werden, falls notwendig, unter Zusatz von Säuren, um das gesamte Aureomycin in Lösung zu bringen und dann das Mycel und andere unlösliche Wachstumselemente durch Filtration zu entfernen. Die klare Lösung kann dann vollständig auf verschiedenen aktiven Materialien adsorbiert" werden, wie z. B. Aluminiumoxyd, Magnesiumoxyd, Holzkohle oder Diatomeenerde. Das klare Filtrat kann nach dem Durchlaufen des adsorbierenden Materials entfernt und die Kolonne mit Wasser gewaschen werden, um Maischerückstand und andere Verunreinigungen zu entfernen. Die Kolonne kann dann mit einem geeigneten Fettlösemittel gewaschen werden, wie beispielsweise mit Aceton, das den größten Teil des Fettmaterials, das sonst stören könnte, entfernt, sowie eine beträchtliche Menge färbender Verunreinigungen. Andere Fettlösemittel, wie Methanol oder Äthanol, Chloroform usw., sind ebenfalls geeignet. Das Lösemittel ist vorzugsweise etwas wasserlöslich. Das Lösemittel kann aus den Waschrückständen wiedergewonnen und wiederbenutzt werden, und das Waschwasser wird entfernt. Die Kolonne enthält dann das aktive Material Aureomycin, zusammen mit gewissen Verunreinigungen. Wegen der Schwierigkeit, bei gewöhnlichem Licht festzustellen, wo der aktive Bestandteil sich befindet, wird die Kolonne dem Beleuchten mit ultravioletten Strahlen ausgesetzt. Eine saure Alkoholwäsche kann für diese Entwicklung benutzt werden; Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure in Methylalkohol, sind besonders geeignet, obgleich die anderen Alkohole einschließlich Äthylalkohol, Butylalkohol, Propylalkohol oder höhere Alkohole oder Aceton und höhere Ketone, Methoxyäthanol und 2-Alkoxyäthanol auch verwendet werden können, wenn das ph des Lösemittels unter 5,0 mit Hilfe einer Säure gehalten wird. Das pH kann so niedrig wie ungefähr um r liegen, aber in den saureren Stufen erhält man keine so gute Trennung. Der erste Streifen, der von der Kolonne entfernt wird, ist in ultraviolettem Licht blau und enthält wenig aktive Stoffe und kann entfernt werden. Der zweite Streifen ist glänzend gelb und enthält die Masse der aktiven Substanzen. Der dritte Streifen ist mattbraun und enthält eine kleine Menge aktiver

Substanzen, die aber normalerweise so gering ist, daß eine nachfolgende Behandlung dieses Materials wirtschaftlich nicht gerechtfertigt ist, obgleich das Material leicht wiedergewonnen werden kann. Der Teil, der das glänzende gelbe Material enthält, wird zur Trockne im Vakuum konzentriert und das trockene Produkt mit n-Butylalkohol extrahiert, wobei alles aktive Material in den n-Butylalkohol übergeht. Der n-Butylalkoholextrakt wird mit kleinen Mengen

ίο Wasser gewaschen, und die Butanolphase, die die aktiven Substanzen enthält, wird im Vakuum auf ein • geringes Volumen konzentriert, aus welchem das aktive Material durch Zusatz von absolutem Äther ausgefällt werden kann. Das Material kann stuf enweise

ausgefällt werden. Der Niederschlag wird mit Äther gewaschen und getrocknet. Das getrocknete Produkt kann dann mit Wasser gelöst werden, das mit Salzsäure auf einen pjrvon 2 bis 3 angesäuert ist, ausgefroren werden und das Wasser durch Sublimation entfernt werden. Das erhaltene trockene Produkt hat eine biologische Wirksamkeit von-20,oo Einheiten pro Milligramm bei Prüfung nach der Standardmethode für Penicillin G gegen Staphylococcus aureus.

Das aktive Material kann unter Salzzusatz in verschiedene Lösungsmittel eingebracht werden, wobei man Salze verwendet, wie Ammoniumsulfat oder

■ Natriumchlorid einschließlieh solcher Ester, wie Methylacetat, Amylacetat, Äthylacetat usw., Alkohole, wie Isopropyl-, Butyl- usw. Alkohol und Aceton oder andere Ketone. Wenn das aktive Material mit Hilfe der vorgenannten Lösemittel ohne Verwendung von Salzen extrahiert wird, ergibt sich eine wesentlich geringere Ausbeute, und weiterhin sind gewisse Lösungsmittel mit Wasser mischbar, wenn kein Salz zugeführt wurde. Unter keinen Umständen wird durch die Verwendung von Salzen die Löslichkeit des Lösungsmittels und 'des Aureomycins in Wasser verringert.

Verfahren B

Während' die verallgemeinerte chromatographische Adsorptionsmethode als eine der vielseitigsten und bedeutendsten aller Isolierungsmethoden für antibiotische Substanzen aus Gärungsmassen benutzt werden kann, erfordert sie doch große Mengen von Material und ergibt verhältnismäßig geringe Ausbeuten.

Das alternative Verfahren B ist begründet auf der

Tatsache, daß Aureomycin besondere Eigenschaften besitzt' derartig, daß gewisse Metallsalze nur wenig löslich in wäßrigen Lösungen in einem pn-Gebiet von 6,0 bis 10 sind. Die brauchbarsten dieser Salze sind Calcium-, Barium-, Magnesium- und Strontiumsalze. Besonders brauchbar wegen der leichten handelsmäßigen Beschaffung und des niedrigen Preises des Rohmaterials ist das Kaliumsalz, das aus der Ver-

■·■■■ Wendung von Calciumoxyd oder Calciumhydroxyd sich ergibt. Andere zweiwertige Metallhydroxyde, wie Barium-, Strontium- und Magnesiumhydroxyd, ergeben ebenfalls günstige Ergebnisse, aber wegen ihrer Giftigkeit und der höheren Kosten wird die Verwendung von Calciumhydroxyd im allgemeinen vorgezogen. Das Hydroxyd kann als solches zugefügt werden oder auch durch die Reaktion aus einem löslichen Salz dieser Metalle und einer Base gebildet werden. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Lithiumhydroxyd und Ammoniumhydroxyd können verwendet werden, um das Material alkalisch zu machen, wenn bereits eines der zweiwertigen Metalle zugegen ist, wobei das Hydroxyd hauptsächlich für die PH-Kontrolle verwendet wird.

Das bevorzugte pg-Gebiet für die Trennung ist verhältnismäßig breit. Es hängt ab von der besonderen Maische, die verwendet wird, der Konzentration'von Aureomycin in der Maische und von den vorhandenen Kationen sowie von den Temperaturen und anderen variablen Größen. In einer besonderen Maische war es möglich, bei einem pn von 6,2 ungefähr 25 % der Gesamtausbeute im Filtrat zu Anfang abzutrennen, während ein pg von 7 einen Verlust von 15 °/₀ zur Folge hatte. Ein pn von 8,5 bis 10 ergibt eine höhere Ausbeute und verringert den Verlust an dieser Stelle.

Bei Einstellung des pn auf ein Gebiet zwischen 6 und 10 in der Gärmaische kann die Maische abftltriert oder die festen Stoffe anderweitig abgetrennt werden, wobei der größte Anteil des Aureomycins in unlöslicher Form zugegen ist und mit dem Mycel in dem Filterkuchen zurückgehalten wird, so daß das Filtrat, welches die größte Masse der löslichen Verunreinigungen enthält, entfernt werden kann. Es hat sich oft herausgestellt, daß eine kleine Menge von Filtrierhilfsmittel ein schnelleres Filtrieren des Kuchens ermöglicht. Als bevorzugtes Verfahren wird der Kuchen gewaschen, wobei gewöhnliches Leitungswasser benutzt wird.

Das Aureomycin kann von dem Kuchen nach zwei Methoden abgetrennt werden. Eine dieser Methoden ist auf der Bildung von löslichem Aureomycinsalz mit Säuren unter einem pH von 3 begründet und die andere Methode auf der Löslichkeit von Aureomycin in gewissen organischen Lösemitteln. Die beiden Methoden sind nicht vollständig unabhängig insofern, als normalerweise bei dem Säurereinigungsverfahren der Säureextrakt wieder alkalisch gemacht wird mit derselben Gruppe von Metallionen und der Niederschlag der zweiten Ausfällung dann mit dem Lösemittel behandelt werden kann, wobei Aureomycin aus dem Kuchen durch die Verwendung der Lösemittel extrahiert wird. Dieser Kuchen enthält bei einer Prüfung praktisch keine Fette und die spätere Abtrennung von Fett ist alsdann nicht erforderlich.

Säurereinigung

Der gewaschene Kuchen kann in Wasser suspendiert und auf ein pH von angenähert 1 bis 3 angesäuert Werden, vorzugsweise auf ein pH nahe um 1,5. Irgendeine Mineralsäure oder starke organische Säure kann benutzt werden. Die untere pn-Grenze von 1 stellt sich normalerweise mehr durch die Korrosionseigenschaften des Apparaturmaterials ein, als durch line Begrenzung, die in dem Prozeß selber zu suchen ist. Wenn eine Glasapparatur verwendet wird, kann ein wesentlich unter 1 liegendes Ph ohne Gefahr verwendet werden, aber es hat dies keine besonderen Vorteile und erfordert mehr Säure. Die suspendierten

festen Teile werden dann abfiltriert. Das Aureomycin ist heiß löslicher und selbst so hohe Temperaturen wie 8o° C verursachen keine übermäßige Zersetzung. Der Extrakt kann einfach oder mehrfach sein und kann zur Erzielung bester Ergebnisse ein Gesamtvolumen haben von V₄-I)Is 2facher Größe des Originalvolumens der Maische. Die suspendierten festen Stoffe werden dann abfiltriert, mit verdünnter Säure von ungefähr derselben Konzentration gewaschen und die festen Stoffe ίο entfernt. Das Filtrat enthält das Aureomycin und wird nun mit den oben angegebenen alkalischen Stoffen alkalisch gemacht in Gegenwart eines der zweiwertigen, oben angegebenen Metalle und die festen Bestandteile gesammelt. An Stelle eines Filters kann auch eine Zentrifuge benutzt werden. Wenn als Säure Salzsäure und Calciumhydroxyd als Erdalkalihydroxyd verwendet wurde, enthalten in diesem Versuchsstadium die festen abgeschiedenen Teile mindestens etwa 25 °/₀ reines Aureomycin. Diese festen Teile können getrocknet und für orale Anwendung oder für Veterinäre Zwecke ohne weitere Reinigung verwendet werden, besonders wenn Calcium- oder Magnesiumsalze zur Isolation benutzt wurden. Für parentale menschliche Verwendung ist eine weitere Reinigung eras forderlich.

Die festen Teile können dann, mit oder ohne vorherige Trocknung, in Aceton oder anderen organischen Lösemitteln in Gegenwart von Wasser, einem Salz, wie Natriumchlorid, Ammoniumsulfat oder anderen löslichen Salzzusätzen zum Aussalzen des Aureomy eins suspendiert werden, wobei sich die wäßrige und die Lösemittelschicht scharf voneinander abtrennen, und die Lösemittelschicht wird von der wäßrigen Schicht und den festen Teilen abgetrennt. Zur Erzielung guter Ausbeuten sollte die Extraktion mindestens einmal zusätzlich wiederholt werden. Entweder die sauren oder die basischen Salze der Ammoniak- oder Alkaligruppe sind löslicher als das neutrale Material, oder die Erdalkalisalze und ein Alkali-, einschließlich Ammoniumhydroxyd, oder eine Säure kann zugefügt werden, um die Löslichkeit des Aureomycins zu erhöhen. Die Lösemittelnltrate werden dann vereinigt, das Lösemittel verdampft, das konzentrierte Material angesäuert und der Niederschlag auskristallisiert und als aureomycinsaures Salz abfiltriert.

Lösemittelreinigung

In einem abgewandelten Reinigungsverfahren kann der durch Ausfällung mit einem zweiwertigen Metallsalz bei einem pn von 6,0 bis 10 gewonnene ursprüngliche Filterkuchen durch Extraktion mit einem Lösemittel gereinigt werden. Gewisse Lösemittel lösen das vorhandene Aureomycin unter Rücklassung des größten Teiles der Verunreinigungen in dem Filterkuchen auf. Die Extraktion kann mit einem Lösemittel durchgeführt werden, das mit Wasser löslich ist, wie beispielsweise Aceton, Methyläthylketon, andere Ketone, Methylalkohol, Äthylalkohol oder andere Alkohole usw., und kann vorzugsweise bei einem ph von 8 bis 10 oder unter 3 durchgeführt werden. Das Lösemittel ist etwas weniger wirksam in dem nahezu neutralen Bereich, obgleich bei einem Verzicht auf eine befriedigende Wiedergewinnung das Lösemittel auch innerhalb dieses Bereiches benutzt werden kann. Wenn der Kuchen zur Entfernung des Wassers getrocknet wird, kann die Extraktion mit einem nicht mischbaren Lösemittel durchgeführt werden," in welchem das Aureomycin löslich ist und dieser Verfahrensschnitt unter Wasserausschluß durchgeführt werden. Für beste Gewinnung ist es wünschenswert, wiederholte Extraktionsbehandlungen zu benutzen. Drei oder vier Extraktionen sind im allgemeinen äußerst wirtschaftlich. Ein Gegenstromverfahren kann benutzt werden, wenn die Apparatur hierfür benutzbar ist. Der extrahierte Kuchen wird entfernt. Der Lösemittelextrakt oder das das rohe Mycin enthaltende Filtrat wird dann auf eine Verdampfungsvorrichtung gebracht, wo bei verhältnismäßig niedriger Temperatur und unter Anwendung von Vakuum das Lösemittel von Aureomycin entfernt wird. Das Lösemittel kann wiedergewonnen und nach geeigneter Reinigung wieder in den Kreislauf eingeführt werden, wobei, wenn notwendig, ein Wasserüberfluß entfernt wird. Nach Entfernung des Lösemittels wird im allgemeinen noch ein gewisser Anteil Wasser im Aureomycin enthalten sein. Dieser Wasserrückstand wird angesäuert mit ¹J₁₀ n-Säurelösung auf ein pn von angenähert 3 und in diesem Säurebereich auf ein genügendes Volumen verdünnt, so daß das Aureomycin in Lösung geht. Die wäßrige Lösung wird dann mit einem wasserunlöslichen Fettlösemittel extrahiert und der Extrakt abgetrennt. Geeignete Lösemittel sind Chloro-_ form, Tetrachlorkohlenstoff usw.

Das Raffinat der wäßrigen Phase wird dann auf ein PH zwischen 6 und 10 unter Zufügung eines der zweiwertigen, obenerwähnten Metallionen unter Zufügung eines der zweiwertigen, obenerwähnten Metallionen eingestellt. In diesem Zustand ist es im allgemeinen vorzuziehen, Calcium- oder Magnesiumionen zu verwenden, weil deren Salze weniger toxische Wirkung haben als Barium- oder Strontiumsalze und man leichter ein nichttoxisches Produkt gewährleisten kann, wenn toxische Salze lieber nicht angewendet werden als später entfernt. Der durch Zusatz von Alkalimaterial erhaltene Niederschlag wird abgetrennt. Die abgetrennten festen Teile werden dann in Wasser wieder suspendiert und mit Salzsäure angesäuert. Es ist vorzuziehen, eine verhältnismäßig geringe Menge Wasser zu benutzen. Als Säure wird bevorzugt Salzsäure verwendet, wobei das Aureomy cinhydrochlorid beim Abkühlen auskristallisiert. Das Sulfat oder das Phosphat oder Salze anderer Säuren können hergestellt und für therapeutische Zwecke benutzt werden. Das salzsaure Salz wird für ärztliche Zwecke bevorzugt und daher im allgemeinen gewählt.

Die Extraktions- und Reinigungsschnitte können wiederholt werden, aber im allgemeinen ist eine solche Wiederholung nicht nötig, da durch die Wiederholung dieser Schritte keine genügende Steigerung des Reinheitsgrades erzielt wird, die den Verlust an Ausbeute rechtfertigen könnte.

Das so isolierte Aureomycin kann in das Calcium- oder Natriumsalz übergeführt werden, wenn ein Metallsalz von dem betreffenden Praktiker, der das th'erapeutische Material benutzt, gewünscht wird.

Um das Verfahren B jedermann völlig verständlich zu machen, soll es nachstehend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben werden:

Beispiel 37

Ein i6oo 1 enthaltender Maischebehälter wurde ausgewertet unter Einstellung des pH auf 8,5 mit fein gepulvertem, ungelöschtem Kalk. 1 Gewichtsprozent Filtrathüf smittel, eine Diatomeenerde wirdzur Maische hinzugefügt. Eine Filtrierpresse wurde mit einer kleinen Menge Diatomeenerde überzogen und die Maische durch Filtrierpresse gegeben. Der Kuchen wurde mit iöol Leitungswasser gewaschen. Der erhaltene Kuchen wog etwas über 135 kg und enthielt nahezu 36% Feuchtigkeit. Der Kuchen wurde in 8001 Wasser suspendiert, auf ein pn von 1,5 mit Salzsäure angesäuert und abfiltrieft. Der Kuchen wurde erneut in 4001 Wasser suspendiert und filtriert, wobei die letzten zwei Filtrate als Anfangssäure für die Suspension der nachfolgenden Charge benutzt wurden. Das Filtrat wurde auf ein pH von 8,5 mit Calciumhydrpxyd eingestellt und die festen Teile in einer Zentrifuge abzentrifugiert. Die Verwendung eines Filterhilfsmittels in der Zentrifuge ist nicht erforderlich. Man erhielt 20 kg eines unreinen, angenähert 75 % Wasser enthaltenden Produktes. Das so gefällte Aureomycin wurde in einem Aceton-Wasser-Gemisch 80: 20 suspendiert, das pH mit Salzsäure auf 1,5 eingestellt und das auf 1501 gebrächte Volumen filtriert. Der Kuchen wurde wiederum mit einer ähnlichen Aceton-Wasser-Lösung behandelt, die Filtrate kombiniert, das Aceton abdestüliert und das so erhaltene Aureomycin in Gegenwart von Salzsäure auskristallisiert: Eine Ausbeute von 52 g wurde erhalten.

Beispiel 38

Eine Charge Von vergorener Maische, die 323 g Aureomycin in 16501 Maische bei einer Versuchsprobe enthielt, wurde auf ein pg von '8,5 unter Zusatz von iofäch normalem Natriumhydroxyd eingestellt.. Angenähert 1,5 1 waren hierzu erforderlieh. 1 Gewichtsprozent einer handelsmäßigen Diatomeenerde auf Filtergewicht berechnet, wurde zugefügt und die Maische durch eine Filterpresse abfiltriert. Der Kuchen wurde in 175 1 Aceton suspendiert, das pn auf 10,0 unter Zufügung von iofach normalem Natriumhydroxyd eingestellt, wobei angenähert 500 ecm erforderlich waren; 16,5 kg Salz wurden zugefügt, das Gemisch, aufgeschlämmt und filtriert. Der Filterkuchen wurde in ähnlicher Weise mit 1501 Aceton, das auf ein ph von 10 gebracht war und 16,5 kg Natriumchlorid enthielt, extrahiert und die Filtrate vefeinigt.

Die Äcetonlösungen'wurden im Vakuum auf 261 konzentriert und die zurückbleibende wäßrige Phase auf ein pn von 2 mit konzentrierter Salzsäure eingestellt, wobei ungefähr 160 ecm erforderlich waren.

Die angesäuerte Flüssigkeit wurde dreimal mit 51 Chloroform extrahiert. Jeder Chloroformextrakt wurde mit seinem eigenen Volumen Wasser gewaschen, auf ein pn von 2,0 mit Salzsäure angesäuert. Die kombinierten wäßrigen Phasen wurden vereinigt, filtriert und dann auf ein pH von 7,05 unter Zusatz von iofach normalem Natriumhydroxyd eingestellt, wobei angenähert 130 ecm benötigt wurden. Der so gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert, der Niederschlag dann in 250 ecm destilliertem Wasser suspendiert und gewaschen, wieder abgetrennt und dann in 600 ecm destilliertem Wasser suspendiert. Der so gebildete Schlamm wurde mit konzentrierter Salzsäure, die tropfenweise zugefügt wurde, auf ein pn von 1,2 bis 1,5 angesäuert. Der Niederschlag löste sich zunächst auf und kristallisierte dann als Aureomycinhydrochlorid aus. Die Kristalle wurden mit 650 ecm kaltem absolutem Alkohol gewaschen und dann mit einer ähnlichen Menge kalten Äther. Eine Ausbeute von 127 g Aureomycinhydrochlorid von einem Reinheitsgrad von 96 °/₀ wurde erhalten. Es ist dies eine allgemeine Ausbeute von 39,3,%·

Verfahren C -

Bei dem abgewandelten Verfahren C ist ebenfalls ein billigeres und geeigneteres System vorgesehen als es die chromatographische Adsorption ist, wobei kleinere Mengen billigeren Materials benutzt werden.

Das Aureomycin befindet sich in der Gärmaische weitgehend in Lösung oder kann in Lösung gebracht werden durch Herabsetzung des pp, indem man die Maische deutlich sauer macht. Das pji am Ende des Gärprozesses kann angenähert zwischen 7 und 4 schwanken, je nach dem verwendeten Verfahren und der verwendeten Brühe. Während bei den niedrigeren PH-Graden das Aureomycin vorwiegend in löslicher Form vorliegt, hat es sich herausgestellt, daß durch Herabsetzen des pn auf Werte in der Gegend von 3 oder weniger alles Aureomycin das Bestreben hat, in Lösung zu gehen und daß es weniger die Tendenz hat, adsorbiert zu werden oder durch das Mycel und andere feste Teile der Gärmaische festgehalten zu werden. Ein pn von der Größe von 5 ergibt volle Ausbeute bei niedrigwertigen Maischen; aber in den Fällen, in denen eine hochwertige Maische benutzt wird, kann ein gewisser Verlust eintreten, wenn nicht das pH saurer als 5 ist. Salzkonzentrationen, die Natur der vorhandenen Kationen, die Natur des Filterhilfsmittels usw., alle beeinflussen die Gewinnung im Bereich der angegebenen Säuregrenzen. Wenn Calcium, Barium, Magnesium, Strontium usw. zugegen sind, ist das Aureomycin bei höheren pn-Werten weniger löslich, als wenn die Maischeverhältnisse mehr Natrium, Kalium od. dgl. als kationische Komponenten enthält und weniger Erdalkali. Im Gegensatz zu vielen anderen Gärprodukten hat es sich herausgestellt, daß, wenn eine Säure zum Ansäuern benutzt wird, diese selber das Aureomycin nicht zerstört. Schwefelsäure, Salzsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und die starken organischen Säuren, wie Essigsäure, und ihre Gemische ergeben befriedigende Resultate, obgleich vom Kostenpunkt aus gesehen im allgemeinen Schwefelsäure bei diesem Schritt verwendet wird wegen ihres geringen Marktpreises. Die Maische kann auf ein pH von 3 bis 2,5 angesäuert werden, und man erhält befriedigende Ergebnisse. Größere Säuregrade sind nicht notwendig,

da hierdurch die Ausbeuten nicht in merklicher Weise gesteigert werden und unnötig Säure verbraucht wird. Die Vergärungsmaische wird filtriert oder zentrifugiert, um Flüssigkeit und feste Teile voneinander zu trennen. Die festen Teile werden gewaschen, vorzugsweise mit angesäuertem Wasser, und die festen Teile entfernt.

Das Filtrat wird dann alkalischer gemacht. Sofern noch keine alkalische Erde zugegen ist, ist es erwünscht,

ίο ein Alkalisierungsmaterial von Erdalkalihydroxyd zuzufügen. Calciumhydroxyd oder Stoffe, die Calciumhydroxyd in der Lösung bilden, sind besonders geeignet wegen der geringen Kosten und der Leichtigkeit, Material von vernünftigem Reinheitsgrad zu erhalten.

Strontiumhydroxyd, Magnesiumhydroxyd oder Bariumhydroxyd oder Stoffe, die diese Hydroxyde in alkalischer Lösung geben, sind ebenfalls brauchbar. Wenn ein zweiwertiges Ion zugegen ist, wie es im allgemeinen bei Gärungsverfahren vorliegt, so können Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Ammoniak oder andere basische Materialien zur Erhöhung des pn benutzt werden.

Die Ausfällung des Aureomycins ist abhängig von Temperatur und Konzentration und beginnt bei Erhöhung des pH auf angenähert 6, obgleich das Material leichter filtriert und zu handhaben ist, wenn das pH auf etwa 10 erhöht wird. Das pH kann etwas über 10 liegen, ohne das Material unnatürlich in Lösung zu bringen. Bei einem pn von etwa 9 bis 10 werden leichter reinere Fraktionen erhalten. Die ausgefällten festen Stoffe, die beim Zusatz von Alkali auftreten, werden durch Filtration entfernt oder abzentrifugiert, gegebenenfalls unter Verwendung eines Filterhilfsmittels gewaschen und die Filtrate entfernt. In diesem Punkt enthalten die festen Teile das unreine Aureomycin. Das so gesammelte unreine Aureomycin kann für therapeutische Zwecke verwendet werden, besonders bei oraler Abgabe und bei Behandlung von Tieren. Die Toxidität in diesem Zustand schwankt mit dem bei der Gärung verwendeten Stamm. Die Reinheit hängt in so großem Umfang von der verwendeten Maische ab, der Ausbeute aus der Maische und anderen Variablen, daß der Nutzeffekt weitgehend variiert; aber bei einer hochwertigen Maische können die festen Teile bis zu 25 % Aureomycin enthalten.

Wenn das Material für Tierbehandlung benutzt werden soll, kann es mit kleinen Mengen einer Säure angesäuert werden, um die mehr erwünschten Säuresalze zu erhalten, beispielsweise mit Salzsäure. Für parenterale Verwendung oder für die Verwendung bei Menschen ist es erwünscht, das Aureomycin weiter zu reinigen.

Mehrere Verfahren können bei dieser nachfolgenden Reinigung verwendet werden.

Säurereinigung

Eine geeignete Methode liegt wieder darin, die gesammelten festen Teile anzusäuern, beispielsweise mit denselben Säuren, die für die anfänglichen Stufen geeignet waren. Gegebenenfalls kann ein Gegenstromverfahren benutzt werden. Das pH mag wohl zwischen ι bis 3 liegen, obgleich ein pH von 2 bis 2,5 besonders befriedigende Ergebnisse zu gewinnen gestattet. Die unlöslichen Teile werden filtriert, gewaschen und entfernt. Die regenerierte Säurelösung wird dann alkalischer gemacht. Gewisse Verunreinigungen können durch Einstellung des ph auf 5,2 bis 5,5 mit Natriumhydroxyd entfernt werden, wobei ein gleiches Volumen Aceton zugefügt wird und der so gebildete Niederschlag abfiltriert und hierauf mit einem kleinen Volumen 50 % Aceton abgewaschen wird. Dieser Schritt ist normalerweise nicht notwendig, wenn bei den vorhergehenden Schritten Sorgfalt angewendet wurde. Die ursprüngliche regenerierte saure Lösung oder die so gereinigte Lösung wird dann alkalisch gemacht und auf ein pg zwischen 8 bis 10 mit einem Ätzalkali gebracht, und nachfolgend wird das Aureomycin mit dem gleichen Volumen Aceton ausgesalzen, unter Verwendung eines Salzes wie Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat oder anderen löslichen Salzen, die zur Folge haben, daß die Acetonschicht sich scharf abtrennt und die Löslichkeit des Acetons in der wäßrigen Schicht verringert wird. Die Abtrennung kann mit ultraviolettem Licht geprüft werden, und wenn sie richtig geführt wird, scheint die Acetonschicht glänzend gelb, während die untere Abfallschicht blau ist. Die Acetonschicht wird abgetrennt, die wäßrige Phase wiederum extrahiert, bis mit ultraviolettem Licht festgestellt wird, daß die aktiven Stoffe im wesentlichen aus ihr entfernt sind. Sodann wird die wäßrige Rückstandschicht entfernt und die Acetonextrakte im Vakuum konzentriert, bis das Aceton im wesentlichen entfernt ist. Wegen des rückständigen Wassers in der Acetonschicht bleibt eine wäßrige Flüssigkeit zurück, welche das Aureomycin als Niederschlag enthält. Die Lösung wird filtriert oder zentrifugiert und der Niederschlag ausgewaschen. Das so gebildete Aureomycin kann gut verwendet werden und wird als solches in Methylalkohol aufgelöst und mit Salzsäure angesäuert und der Methylalkohol im Vakuum entfernt. Falls erwünscht oder notwendig, kann das getrocknete Produkt mit absolutem Alkohol zur Entfernung von Farbstoffen gewaschen werden, dann wird es mit Äther gewaschen und getrocknet.

Zusätzliche Reinigung kann durchgeführt werden, falls erwünscht, durch Kristallisieren des picrinsauren Salzes, obgleich eine solche Reinigung im allgemeinen nicht nötig ist, aber als Sicherheit dafür dient, daß das isolierte Material einen genügenden.Reinheitsgrad besitzt, um pharmazeutische Ansprüche zu befriedigen.

Lösemittelreinigung

Die aus der ursprünglichen alkalischen Ausfällung stammenden abgetrennten festen oder getrockneten Teile können, anstatt sie in Säure aufzulösen, mit sauren organischen Lösemitteln extrahiert werden, wie oben erwähnt mit saurem Aceton, Methyläthylketon oder anderen Ketonen, Methylalkohol, Äthylalkohol oder anderen Alkoholen, wobei das pH auf 3 oder weniger gehalten wird, vorzugsweise bei 1,5. Die Menge Lösemittel kann in weiten Grenzen schwanken, je nach der verwendeten Maische, nach den Ausbeuten von Aureomycin in der Gärung und dem jeweiligen Reinheitsgrad. Ultraviolettes Licht kann zur Unter-

scheidung des extrahierten Aureomycins benutzt werden. Eine Lösemittelmenge von 5 bis 25 %, auf Maischevolumen berechnet, angewendet in zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Extraktionen, ergibt im allgemeinen die gewünschten Ergebnisse. Das Lösemittel in dem Extrakt wird dann verdampft, die festen Teile in angesäuertem Wasser aufgelöst und mit einem Fettlösemittel extrahiert, der Lösemittelextrakt entfernt und das Raffinat auf ein pH von 6 bis 10 mit Ätzalkali eingestellt, die festen Teile gesammelt, das Filtrat entfernt, die festen Teile mit Salzsäure angesäuert, mit Wasser aufgeschlämmt, gewaschen und getrocknet, wobei Aureomycinhydrochlorid gewonnen wird.

Wie es dem Fachmann selbstverständlich ist, können für besondere Zwecke irgendwelche oder alle Reinigungsschritte wiederholt werden, und während irgendeiner der Extraktionen oder Waschvorgänge können die Extrakte oder Waschlaugen wieder in den Arbeitsgang eingeführt werden, und die Extrakte oder Waschlaugen können schrittweise oder im Gegenstromverfahren verwendet werden und hierdurch die Ausbeuten etwas erhöht werden. Solche unbedeutenden Modifikationen werden alle durch die vorliegende Erfindung umfaßt und müssen als darin enthaltene Abwandlungen betrachtet werden. Gewisse unbedeutende Abwandlungen sind auch zu erwarten wegen der Schwankungen, die in besonderen Maischen begründet sind, und in den Kosten und der Beschaffbarkeit gewisser 3'o Lösemittel und/oder Säuren und Alkalien; beispielsweise kann bei den Alkalisierungsstufen, für welche Natriumhydroxyd oder Ätzalkali angegeben ist, Kaliumhydroxyd oder kaustische Potasche vom theoretischen Standpunkt aus befriedigende Ergebnisse bringen; aber diese Stoffe sind etwas teuer und demgemäß wird aus wirtschaftlichen Gründen eher Natrium als die Kaliumverbindung im allgemeinen zweckmäßig sein. In ähnlicher Weise können die Hydroxyde vom Barium, Strontium oder Magnesium an Stelle von Calcium benutzt werden, aber da Calciumhydroxyd billiger ist und im allgemeinen leichter beschaffbar, wird es beim wirtschaftlichen Arbeiten vorgezogen, obgleich auch die anderen verwendet werden können, sofern die Calciumverbindung aus irgendeinem Grund nicht beschafft werden kann. Natürlich muß bei der Verwendung von Barium oder Strontium Sorge getragen werden, daß alles Barium oder Strontium später wieder entfernt wird, damit das endgültig herauskommende Material diese giftigen Substanzen^ nicht enthält.

Um das Verfahren C ganz verständlich zu machen, soll es nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben~werden. _

Beispiel 39

- -Eine vergorene Maische wurde auf ein pn von 2,5 bis 3 mit 2fach molarer Schwefelsäure angesäuert, i°/₀ Filtrierhilfsmaterial wurde zugefügt und abfiltriert.

Zu 5 1 des Filtrates, das 1000 Einheiten pro Kubikzentimeter enthielt, wurde eine 20°/_Oige Lösung, die g Bariumchlorid enthielt, und eine genügende Menge I of ach normales Natriumhydroxyd, um das pn auf 9,7 bis 10 zu bringen, zugefügt. Eine geringe Menge des Filtrierhilfsmaterials wurde zugefügt, das Gemisch filtriert und die verbrauchte Maische entfernt. Die abfiltrierte Flüssigkeit enthielt ungefähr 6,4 ⁰/₀ der gesamten aktiven Masse. Der erhaltene Kuchen kann für Veterinäre Zwecke Verwendung finden, aber für menschlichen parenteralen Gebrauch wurde der erhaltene Niederschlag in Wasser suspendiert und mit Schwefelsäure auf ein pH von 2 bei einem Gesamtvolumen von 590 ml angesäuert. Die regenerierte saure Lösung wurde auf ein pg von 5,2 und 5,5 mit 5fach N-Natriumhydroxyd gebracht und ein gleiches Volumen Aceton zugefügt, der entstehende Niederschlag entfernt und das erhaltene Filtrat auf ein pn zwischen 9,2 und 9,5 eingestellt. Das pH kann leicht bestimmt werden durch Mischen eines Teiles des Acetons mit einem gleichen Volumen reinen Wassers und Bestimmen des ph mit einer Glaselektrode. Eine Lösung mit 250 g Natriumchlorid pro Liter wurde zugefügt und die Acetonschicht abgetrennt. Die Acetonschicht wurde dann entfernt und die wäßrige Phase wiederum mit einem kleineren Volumen Aceton extrahiert, das Aceton wieder abgetrennt und eine dritte Extraktion durchgeführt. Die drei Acetonextraktionen wurden zusammengebracht und, durch Vakuum destilliert, bis zur Entfernung des Acetons konzentriert. Das so aus dem rückständigen Wasser niedergeschlagene Aureomycin wurde durch Abzentrifugieren abgetrennt, mit einem kleinen Volumen Wasser gewaschen und in Methylalkohol aufgelöst, dann mit Salzsäure auf ein pH von 2,5 angesäuert. Das so gebildete Aureomycinhydrochlorid wurde im Vakuum bis zur Trockene konzentriert und erwies sich als rein genug für den therapeutischen Gebrauch, Zur Erzielung einer noch größeren Reinheit wurde das Material in Äthylalkohol gelöst und der aktive Anteil daraus mit absolutem Äther ausgefällt. Eine allgemeine Ausbeute von 25 % wurde erzielt.

Dieser letzte Schritt ist im allgemeinen nicht erforderlich; aber er dient als Sicherungsmaßnahme, um ein reines Produkt zu gewährleisten.

105 Beispiel 40

1600 1 einer Gärmaische wurden mit Schwefelsäure auf ein pH von 1,5 eingestellt, filtriert, das pn des Filtrates mit Calciumhydroxyd auf 10 eingestellt, die festen Anteile gesammelt und ausgewaschen. Der Kuchen wurde aufgeschlämmt und mit einer gesamten Menge von 200 1 Aceton in drei Portionen bei einem pH von 1,5 extrahiert, wobei Essigsäure für die pH-Kontrolle verwendet wurde. Der Extrakt wurde auf ein pn von 1,5 eingestellt und das Lösemittel Verdampft. Die zurückbleibende wäßrige Schicht wurde auf 30 1 Wasser verdünnt, das ph auf 1,5 eingestellt und dann mit 30 1 Chloroform extrahiert. Das Chloroform wurde für spätere Wiedergewinnung des Lösemittels abgestellt. Der wäßrige Rückstand wurde auf ein pH von 9,5 mit Natriumhydroxyd eingestellt und die festen Teile auf einem Filter gesammelt. Die festen Anteile wurden' wiederum in Wasser suspendiert, das pH mit Salzsäure auf 1 eingestellt, wobei man eine Gesamtmenge von 20 1 erhielt, und hieraus das ent-

stehende Aureomycinhydrochlorid abfiltriert und getrocknet. Ungefähr 30 °/₀ des in der ursprünglichen Maische enthaltenen Aureomycins wurden gewonnen.

Claims (24)

1. , PATENTANSPRÜCHE:

   i. Verfahren zur Erzeugung und Gewinnung eines antibiotischen Stoffes, der als Aureomycin bezeichnet wird, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Nährlösung mit einer Kultur von Streptomyces aureofaciens oder mit einem gleichwertigen, Aureomycin erzeugenden Organismus geimpft, eine aerobe Gärung eingeleitet und das Aureomycin aus den entstandenen Stoffwechselprodukten gewonnen wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aerobe Gärung derart unter pii-Kontrolle verläuft, daß der pH-Wert beim Beginn der Gärung 8 nicht übersteigt und am Ende des Gärprozesses nicht niedriger als bei 4 liegt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung bei einer Temperatur nicht über 37⁰C durchgeführt wird.
4. 4. Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung in Gegenwart eines Überschusses von 2wertigen Kationen, vorzugsweise der Gruppe Calcium, Barium, Strontium oder Magnesium, durchgeführt und das Aureomycin als unlösliches Salz dieser Kationen erhalten wird.
5. 5. Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung die erforderliche Menge kohlenstoffhaltiger Substanz, assimüisierbaren Stickstoff und Mineralstoffe enthält, die für das Wachstum der Mikroorganismen wesentlich sind.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die'Nährlösung 0,5 bis 5 Gewichtsprozent Kohlehydrate und 0,1 bis 5 Gewichtsprozent stickstoffhaltige Substanz enthält.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung Saccharose, vorzugsweise 3 bis 5 °/₀, Ammoniumsulfat, vorzugsweise 0,1 bis 0,4%, Maisquellwasser, vorzugsweise 1 bis 3 °/o, Calciumcarbonat und/oder Magnesiumphosphat, vorzugsweise 0,2 bis 1 °/₀, enthält.
8. 8. Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärlösung angesäuert und das gelöste Aureomycin auf chromatographischem Wege adsorbiert und dann eluiert wird.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das adsorbierte Aureomycin mit einem angesäuerten organischen Lösemittel eluiert wird, wobei die Fraktion, welche die hohen Anteile an Aureomycin enthält, ausgewählt und aus ihr das Aureomycin gewonnen wird.
10. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Maßnahmen einschließt: Abtrennen des Aureomycins aus der Gärlösung als unlöslicher Niederschlag eines zweiwertigen Metalls, vorzugsweise des Calciums, Bariums, Strontiums oder Magnesiums, bei einem pn von mindestens 6,0 zusammen mit dem Mycel und anderen festen in der Flüssigkeit erhaltenen Stoffen, sowie Extraktion des Aureomycins aus den abgetrennten festen Teilen.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Aureomycin von den festen Teilen durch eine wäßrige saure Lösung bei einem Ph kleiner als ungefähr 3 extrahiert wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Aureomycin als unlöslicher Niederschlag eines zweiwertigen Metalls, vorzugsweise des Calciums, Bariums, Strontiums oder Magnesiums, bei einem pn von mindestens 6 wieder abgetrennt wird, worauf die abgetrennten festen Teile mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert werden und das Aureomycin aus dem entstandenen Auszug (Extrakt) wiedergewonnen wird.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Maßnahmen einschließt : Abfiltrieren, Extraktion des Filtrates mit einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Salzes, Abtrennung der Lösungsmittelschicht, Entfernung eines Teiles des Lösungsmittels hiervon und Abfiltrieren des niedergeschlagenen Aureomycins von der verbleibenden Schicht.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Aureomycin wiedergewonnen wird durch Aussalzen aus einem organischen Lösungsmittel.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Aureomycin durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel unter Einhaltung eines pH-Wertes über etwa 8 von den festen Teilen getrennt wird.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie Aceton, welches im Wasser löslich oder mit diesem mischbar ist, durchgeführt wird.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Aureomycin von den festen Teilen durch ein organisches Lösungsmittel, vorzugsweise bei einem pH-Wert unter 3, extrahiert wird.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie Alkohol, der im Wasser löslich oder mit diesem mischbar ist, durchgeführt wird.
19. 19. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche ι bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärlösung durch Ansäuerung auf einen ρπ-Wert kleiner als 3 gebracht wird, worauf filtriert und Aureomycin aus dem Filtrat gewonnen wird.
20. 20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß Aureomycin aus dem Filtrat mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und Aureomycin aus dem Auszug gewonnen wird.
21. 21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß Aureomycin durch Aussalzen in einem organischen Lösungsmittel gewonnen wird.
22. 22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtrat mit einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Salzes extrahiert, diese Lösungsmittelschicht abgetrennt

    und der letzte Teil des Lösungsmittels hiervon entfernt und schließlich das ausgefällte Aureomycin von der restlichen Schicht abfiltriert wird.
23. 23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein pH-Wert zwischen etwa 6 bis 10 in Gegenwart von zweiwertigen Ionen, vorzugsweise von Calcium, Barium, Strontium oder Magnesium, eingehalten und das abgeschiedene Aureomycin getrennt wird.
24. 24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Maßnahmen einschließt: Ansäuern des ausgefällten Aureomycins bei einem pn kleiner als 3, Abfiltrieren, Extraktion des Filtrates mit einem organischen Lösungemittel in Gegenwart eines Salzes, Abtrennen der Lösungsmittelschicht, Entfernen des Lösungsmittels hiervon, Abfiltrieren des niedergeschlagenen Aureomycins aus der zurückbleibenden wäßrigen Schicht, Zufügen eines Alkohols und einer Säure zur Erzielung eines pn-Wertes kleiner als 3, Abdampfen der Flüssigkeit und Wiedergewinnung des Aureornycins.

    Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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