DE1016704B

DE1016704B - Verfahren zur Abtrennung von Tetracyclin aus seinen Gemischen mit Chlortetracyclin

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Publication number: DE1016704B
Application number: DEP13793A
Authority: DE
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1954-04-14
Filing date: 1955-03-19
Publication date: 1957-10-03
Also published as: FR1200015A; AT202701B; CH337986A; GB769239A; ES220866A1; US2804476A

Description

DEUTSCHES

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung von Tetracyclin von Chlortetracyclin, insbesondere aus Gärlösungen und anderen wäßrigen Lösungen, die Gemische beider enthalten.

Tetracyclin ist ein Antibiotikum von großer Wirkungsbreite, dessen Struktur erstmalig im Journal of the American Chemical Society, Bd. 74, 1952, S. 4976 beschrieben ist. Auch die Herstellung dieses Antibiotikums durch katalytische Hydrierung von Chlortetracyclin ist beschrieben worden (Journal of the American Society, Bd. 75, 1953, S. 4621 bis 4623).

Chlortetracyclin ist gleichfalls ein Antibiotikum von großer Wirkungsbreite und kann aus den Stoffwechselprodukten von Streptomyces aureofaciens gewonnen werden, wie in der USA.-Patentschrift 2 482 055 beschrieben ist, in welcher dieses Antibiotikum mit seinem Handelsnamen »Aureomycin« bezeichnet wird.

Man kann zwar Tetracyclin durch katalytische Hydrierung von Chlortetracyclin gewinnen, aber seine Gewinnung durch direkte- Fermentation bietet viele Vorteile. So ist dann die chemische Ausrüstung, die gewöhnlich zur Hydrierung von Chlortetracyclin erforderlich ist, entbehrlich, ferner braucht kein teurer Hydrierungskatalysator verwendet zu werden, und die bei der Ausführung von Hydrierungsreaktionen auftretenden Gefahren werden vermieden. Man hat nun Tetracyclin durch direkte Fermentation hergestellt, indem man ausgewählte Stämme von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces unter aeroben Bedingungen in Nährlösungen züchtet. Bei den meisten bekannten Verfahren aber ist in der Fermentationsbrühe außer dem erwünschten Tetracyclin noch Chlortetracyclin enthalten. Der Anteil des erhaltenen Chlortetracyclins schwankt beträchtlich, was unter anderem von dem jeweils verwendeten Organismus und der Zusammensetzung der Gärlösung abhängt. Wenn es in merklichen Mengen vorliegt, bildet die Trennung der beiden Antibiotika infolge der Ähnlichkeit der physikalischen und chemischen Eigenschaften ein schwieriges Problem.

Man hat zwar vorgeschlagen, die Trennung chromategraphisch vorzunehmen, aber eine solche Methode ist für ein technisches Verfahren nicht geeignet, ebensowenig die Behandlung des Gemisches mit verdünntem Alkali, wodurch das Chlortetracyclin zerstört wird.

Unter diesen Umständen werden mit gewöhnlichen Gewinnungsverfahren Gemische der beiden Antibiotika erhalten, die weiterbehandelt werden müssen, z. B. durch katalytische Hydrierung des Chlortetracyclins, um reines Tetracyclin zu gewinnen.

Ein ähnliches Problem kann bei der katalytischen Hydrierung von Chlortetracyclin auftreten, wenn diese Hydrierung nicht vollständig ist, wodurch Gemische von Tetracyclin und unverändertem Chlortetracyclin

Verfahren zur Abtrennung

von Tetracyclin aus seinen Gemischen

mit Chlortetracyclin

Anmelder:

Chas. Pfizer & Co., Inc.,
Brooklyn, N. Y. (V. St. A.)

Vertreter: Dr.-Ing. W. Abitz, Patentanwalt,
München 27, Gaußstr. 6

Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 14. April 1954

erhalten werden. Welche Bedeutung es hat, einen Weg zur Abtrennung von Tetracyclin von Chlortetracyclin zu finden, ist ohne weiteres zu erkennen.

Es ist bereits vorgeschlagen worden, Chlortetracyclin aus wäßriger Lösung in Form eines sauren Salzes zu isolieren und dabei in Gegenwart eines Lösungsmittels zu arbeiten, aber die Lösungsmittelmenge ist bei diesem Verfahren nicht ausreichend, um merkliche Mengen an Chlortetracyclin zu lösen oder zu extrahieren.

Es wurde gefunden, daß Tetracyclin von Chlortetracyclin aus Fermentationsbrühen oder anderen wäßrigen Lösungen, welche beide Antibiotika enthalten, abgetrennt werden kann, wenn man die Antibiotika bei einem sauren p_H-Wert mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel auszieht und anschließend das Tetracyclin durch Neutralisieren des Lösungsmittelextraktes ausfällt,- wobei das Chlortetracyclin in dem Extrakt zurückbleibt.

Gemäß der Erfindung wird ein in wäßriger Lösung vorliegendes Gemisch von Tetracyclin und Chlortetracyclin mit einer geeigneten anorganischen Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, auf einen p_H-Wert von etwa 0,5 bis 3,5, vorzugsweise etwa 2, angesäuert. Die wäßrige Lösung der Antibiotika kann aus Gärlösungen stammen, oder durch Suspendierung roher Feststoffe, die durch Fermentation oder auf andere Weise gewonnen werden, in Wasser hergestellt sein. Die Antibiotika, können auch

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in Form ihrer freien Basen, Salze oder Komplexver- kristallisieren aus Aceton, Monoäthern von Äthylenbindungen, wie sie bei den"'verschiedenen allgemein - glykol oder anderen organischen Lösungsmitteln bekannten Gewinnungsverfahren anfallen, verwendet weiter gereinigt werden.

werden. Das in dem urspünglichen Extrakt vorhandene Nach dem Ansäuern der die Antibiotika enthalten- 5 Chlor tetracyclin bleibt in der Lösung oder dem FiI-den wäßrigen Lösung kann man, wenn gewünscht, trat zurück, das nach dem Entfernen des Tetracyclins verschiedene Stoffe zusetzen, um die Qualität des erhalten wird. Dieses Filtrat kann, wie oben beschrie-Tetracyclin-Endproduktes zu verbessern. So kann man ben, weiter behandelt werden, um weiteres Tetracyclin Kaliumferrocyanid zusetzen, um unerwünschte färb- abzutrennen und zu gewinnen, das in dem Filtrat bildende Stoffe zu entfernen und zu verhindern, daß io neben dem Chlortetracyclin zurückgeblieben sein diese bei der späteren Abtrennung des Tetracyclins kann. Das Chlortetracyclin kann dann gewonnen werausgefällt werden. Man kann ferner, wenn die Lösung den, indem man die Flüssigkeit zur Trockne vereinen besonders hohen Gehalt an Calciumionen hat, dampft oder indem man sie bekannten Reinigungs-Ammoniumoxalat verwenden, um die spätere Aus- verfahren unterwirft.

fällung von Calciumsalzen zu verhindern. 15 Die Ausfällung von Tetracyclin nach dem Ver-Die auf diese Weise behandelte angesäuerte Lösung fahren gemäß der Erfindung ist in Anbetracht der wird dann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Ähnlichkeit der physikalischen und chemischen Eigenorganischen Lösungsmittel, wie niederen Alkoholen, schäften von Tetracyclin und Chlortetracyclin durchz. B. Butanol, Isobutanol, Pentanolen oder Hexanolen, aus unerwartet. Zum Beispiel bilden beide mit Säuren ausgezogen. Butanol hat sich als für diesen Zweck 20 Salze und werden in dieser Form von organischen recht vorteilhaft erwiesen. Im allgemeinen sind etwa Lösungsmitteln leicht extrahiert, nachdem man die 0,2 bis 2,0 Raumteile organisches Lösungsmittel je wäßrigen Lösungen, die beide Antibiotika enthalten, Raumteil der wäßrigen Lösung angemessen, um das angesäuert hat. Ferner können die Säuresalze beider gewünschte Ergebnis zu erzielen; man kann jedoch. Antibiotika leicht neutralisiert werden, wobei man wenn gewünscht, auch größere Mengen an Lösungs- 25 nach Zusatz einer Base die freien Basen erhält, mittel verwenden. Trotzdem aber fällt das neutralisierte Tetracyclin aus Es wurde gefunden, daß die Extraktion der beiden der Lösung leicht aus, während das Chlortetracyclin Antibiotika mit einem organischen Lösungsmittel unter den beschriebenen Bedingungen in der Lösung sehr erleichtert wird, wenn man die angesäuerte wäß- zurückbleibt.

rige Lösung vor der Extraktion mit einem wasserlös- 30 Deshalb war die Kenntnis des Verhaltens der einzellichen, anorganischen Salz, wie Natriumchlorid, nen Antibiotika für die Lösung der vorliegenden Natriumsulfat, Kaliumsulfat, Kaliumchlorid, Ammo- Aufgabe keine Hilfe, zumal sich die Löslichkeitsniumchlorid oder Ammoniumsulfat, behandelt. Diese Verhältnisse chemischer Verbindungen in reinem ZuBehandlung scheint auf die beiden Antibiotika eine stand stark ändern, wenn Verunreinigungen oder aussalzende Wirkung zu haben und erlaubt die Ver- 35 andere chemisch verwandte Substanzen zugegen sind wendung viel geringerer Raumanteile des organischen oder Misehkristallbildung eintritt. Lösungsmittels, als sie sonst zur Extraktion erforder- Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielich wären. Die zu diesem Zweck erforderliche Menge len näher beschrieben, an Salz kann beträchtlich schwanken, was von dem

Gesamtgehalt der wäßrigen Lösung an Antibiotika 40 Beispiel 1 und ihrer Konzentration in derselben abhängt. Im allgemeinen jedoch reicht für die meisten Zwecke eine Ein ausgewählter Streptomyces-Stamm, der bei der solche Menge des Salzes aus, daß in dem behandelten American Type Culture Collection in Washington, Gemisch eine Konzentration von etwa 3,0 bis 25,0% D. C, V. St. A., unter der ATCC-Nr. 11 654 hintererhalten wird. 45 legt ist, wird unter gelenkten Bedingungen auf Agar Nach beendeter Extraktion werden die organischen gezüchtet, um Sporen zur Impfung eines Nährmediums Lösungsmittelextrakte vorzugsweise filtriert, um un- der folgenden Zusammensetzung zu entwickeln: lösliche Stoffe zu entfernen, und dann mit Wasser Enzymin B, ein enzymatisch« Protein- und einer Base behandelt, um das Gemisch zu neutra- hydrolysat 10 g/l lisieren. Beispiele für geeignete Basen sind Natrium- 50 _wasserfreier Traubenzucker '.''.'.'.'.'.'.'.'. 10 g/l hydroxyd, Kahumhydroxyd, Ammoniumhydroxyd, Hefeextrakt 5 e/1

Triäthylamin und eine Vielzahl anderer aliphatischer Calciumcarbona't lg/1

Amine. Die Neutralisation wird leicht bewerkstelligt,

indem man den Lösungsmittelextrakt mit Wasser ver- Dieses Gemisch von Nährstoffen wird mit Wasser

mischt und die Base nach und nach zusetzt, bis der 55 auf 11 verdünnt, auf einen p_H-Wert von 6,7 eingestellt

p_H-Wert der wäßrigen Schicht zwischen etwa 5 und 8, und in der Wärme sterilisiert. Danach wird die

vorzugsweise 6 und 7 bleibt. Danach kann das Tetra- Lösung abgekühlt, und die Sporen werden unter asep-

cyclin als freie Base nach verschiedenen Verfahren tischen Bedingungen zugesetzt. Nachdem der Strepto-

ausgefällt werden. Man kann z. B. das Gemisch von mycesstamm 2 Tage in Schüttelflaschen gezüchtet

Wasser und organischem Lösungsmittel rühren oder 60 worden ist, bringt man das gebildete Gemisch von

einfach eine Zeit lang stehen lassen, z. B. 8 bis 12 Nährbrühe und Mycel in 95 1 einer sterilen Gärlösung

Stunden, wobei das Tetracyclin als freie Base aus- ein, die folgende Zusammensetzung hat:

kristallisiert. Man kann auch das Gemisch im Vakuum Soiabohnenmehl 4 0%

einengen, um das organische Lösungsmittel voll- Natriumnitrat ................ 0^5 %

ständig oder zum Teil zu entfernen, wobei stets im 65 Sojabohnenöl ..'.'.'.'.'.'..'.'.'..'...'.'.'.'.'.'..' 5 cm^s/l Konzentrat genügend Wasser zurückbleibt, um das

Trihydrat des Tetracyclins zu bilden. Das nach diesen Diese Lösung wird auf einen p_H-Wert von 6,25 ein-Verfahren auskristallisierte Tetracyclin wird leicht gestellt und in der üblichen Weise sterilisiert, bevor durch Filtration oder in anderer geeigneter Weise ge- man ihm Nährbrühe und Mycel von den Schüttelwonnen und kann, wenn gewünscht, durch Um- 70 flaschen zusetzt. Die Lösung wird dann mit dem

Streptomycesstamm beimpft, geschüttelt und unter sterilen Bedingungen 26 Stunden mit einer Geschwindigkeit von 1 Raumteil Luft/Raumteil Nährbrühe/ Minute belüftet. Die Temperatur wird während dieses Zeitraumes auf 28° gehalten.

Die auf diese Weise bereiteten 95 1 Impfstoff werden dann in 568 1 einer Gärlösung der gleichen Zusammensetzung eingebracht, die, wie oben beschrieben, sterilisiert worden ist. Die Fermentation wird gleichfalls unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wobei man 67 Stunden bei 28° mit ³At Raumteilen Luft/ Raumteil Brühe/Minute belüftet. Die Wirksamkeit der Nährbrühe wurde in diesem Zeitpunkt zu 715 y/cm³ bestimmt.

Die auf diese Weise bereiteten 409 1 Fermentationsbrühe werden mit Schwefelsäure auf einen p_H-Wert von 2,5 bis 3 angesäuert und über »Supercel« (mittelkörniges Kieselgur) nitriert, um das Mycel zu entfernen. Nach dem Waschen des Filterkuchens mit Wasser setzt man der filtrierten Brühe 0,4 Gewichtsprozent/Volumen Zitronensäure und anschließend je Liter 2,3 cm³ langkettige quaternäre Alkylamine (50%), die unter der Handelsbezeichnung »Arquad C« vertrieben werden, zu. Die Amine bestehen hauptsächlich aus Dodecylamin. Danach werden der Brühe je Liter 6 cm³ einer Calciumchloridiösung von 3 Gewichtsprozent/Volumen zugesetzt, und der p_H-Wert wird mit Ätznatron auf etwa 9 bis 9,5 eingestellt, um die quaternären Ammoniumsalze von Tetracyclin und Chlortetracyclin auszufällen. Diese ausgefällten Salze werden über »Supercel« filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

50 g der obigen Mischsalze, die eine antibiotische Gesamtwirksamkeit von etwa 30 000 γ/g haben, werden in 200 cm³ Wasser suspendiert, und der p_H-Wert wird mit 6 η-Salzsäure auf 2 eingestellt. Danach setzt man 2 g Kaliumferrocyanid und 25 cm³ einer 5%igen Ammoniumoxalatlösung zu und rührt das Gemisch 15 Minuten, worauf man den p_H-Wert wieder auf 2 einstellt. Das Gemisch wird filtriert und der Filterkuchen mit 100 cm³ Wasser gewaschen, das gleichfalls auf einen p_H-Wert von 2 eingestellt ist. Die Waschflüssigkeit wird mit dem Filtrat vereinigt, wodurch 305 cm³ Lösung mit einer antibiotischen Gesamtwirksamkeit von 1 690 000 γ erhalten werden. Diese Lösung wird dann sechsmal mit 100 cm³ n-Butanol extrahiert, wobei 217 cm³ einer extrahierten wäßrigen Schicht zurückbleiben, die eine antibiotische Gesamtwirksamkeit von 211 000 γ oder 12,4%· der antibiotischen Gesamtwirksamkeit der ursprünglichen Lösung besitzt.

Die Butanolextrakte werden filtriert, vereinigt und mit 100 cm³ Wasser geschüttelt. Dann setzt man langsam 10%ige Natronlauge zu, bis die wäßrige Schicht einen p_H-Wert von 6 bis 7 behält. Das Butanol-Wasser-Gemisch wird dann im Vakuum eingeengt, während man weiteres Wasser zusetzt, um die Entfernung des Butanols zu erleichtern. Man erhält etwa 80 bis 100 cm³ einer wäßrigen Lösung, die Kristalle der freien Tetracyclinbase enthält. Die so erhaltene Lösung wird mit weiterer 10%<iger Natronlauge wieder auf einen p_H-Wert von 5 bis 6,8 eingestellt, danach abgekühlt und filtriert. Das dabei erhaltene wäßrige Filtrat hat eine antibiotische Gesamtwirksamkeit von 374 000 γ oder 22,1%· der Gesamtwirksamkeit der ursprünglichen Lösung. Die Kristalle haben ein Gewicht von 0,89 g, ihre gesamte Tetracyclinwirksamkeit wurde zu 882 000 γ oder 990 y/mg bestimmt. Dies entspricht etwa 52% der gesamten antibiotischen Wirksamkeit der ursprünglichen wäßrigen Lösung, was anzeigt, daß ein wesentlicher Teil des in dieser Lösung enthaltenen Tetracyclins entfernt worden ist. Die UV-Analyse und Papierchromatographie zeigen, daß in dem kristallinen Produkt lediglich Tetracyclin enthalten ist.

Analyse für C₂₂H₂₄N₂O₈:

Berechnet C 59,45, H 5,44;

gefunden C 59,59, H 5,44.

Das obige Verfahren wurde mit einem Gemisch von quaternären Ammoniumsalzen von Tetracyclin und Chlortetracyclin unter Weglassung der beschriebenen Butanolextraktion wiederholt. Hierbei wird ein rohes Tetracyclinprodukt erhalten, das etwa 30 Gewichtsprozent Chlortetracyclin enthält.

Beispiel 2

Man suspendiert 500 g der vereinigten quaternären Ammoniumsalze von Tetracyclin und Chlortetracyclin bei einem p_H-Wert von 2 in 1500 g Wasser und setzt 20 g Natriumferrocyanid hinzu. Die entstehende Lösung wird dann filtriert und der Filterkuchen mit 1000 cm³ Wasser vom p_H-Wert 2 gewaschen. Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat hat eine antibiotische Gesamtwirksamkeit von 61 100 000' γ. Diese Lösung wird dann mit 340 g Natriumchlorid behandelt und anschließend dreimal mit je 800 cm³ n-Butanol extrahiert. Die verbrauchte wäßrige Lösung hat eine antibiotische Gesamtwirksamkeit von 870 000 y oder 1,4% der Gesamtwirksamkeit der Originallösung vor der Extraktion. Die Butanolextrakte werden vereinigt, mit Wasser geschüttelt und mit 10%iger Natronlauge neutralisiert, bis der p_H-Wert der wäßrigen Schicht 6,8 beträgt. Danach wird das Butanol im Vakuum zum Teil entfernt und das Gemisch unter Kühlung über Nacht stehengelassen. Hierdurch kristallisiert die freie Tetracyclinbase, wird aus der Lösung durch Filtration entfernt und im Vakuum getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene Produkt hat ein Gewicht von 22,1 g und eine Wirksamkeit von 1047 y/mg. Es hat eine Tetracyclin-Gesamtwirksamkeit von insgesamt 23 100 000 γ oder 37,7%· der Gesamtwirksamkeit der ursprünglichen Lösung. Das kristalline Produkt enthält kein Chlortetracyclin.

Das in dem Filtrat verbliebene Butanol wird im Vakuum entfernt. Man erhält 5,9 g weiteres Tetracyclin, dessen Wirksamkeit zu 950 jVmg bestimmt wurde. Die Gesamtwirksamkeit dieses weiteren Tetracyclins beträgt 5 610 000 γ, was 9,2% der antibiotischen Gesamtwirksamkeit der ursprünglichen Lösung entspricht. Andererseits haben die vereinigten Filtrate eine Wirksamkeit von 28 500 000 7, wovon 30 bis 40%· auf Chlortetracyclin entfallen. Bei Wiederholung des obigen Verfahrens wird aus den Mutterlaugen weiteres Tetracyclin und nach bekannten Gewinnungsverfahren, wie durch Lösungsmittelextraktion mit Butanol, Chlortetracyclin gewonnen.

Das Verfahren gemäß Beispiel 2 kann auch mit einem handelsüblichen Gemisch von Pentanolen an Stelle von n-Butanol durchgeführt werden. Man erhält die gleichen Ausbeuten an Tetracyclin.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von Tetracyclin aus seinen Gemischen mit Chlortetracyclin in wäßriger Lösung, in denen der Tetracyclingehalt überwiegt, dadurch gekennzeichnet, daß man die antibiotikahaltige Lösung auf einen p_H-Wert von

etwa 0,5 bis 3,5 einstellt, die beiden Antibiotika mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie niedermolekularen AIkanolen, extrahiert, den Extrakt abtrennt und in Gegenwart von Wasser neutralisiert, indem man den p_H-Wert der wäßrigen Phase auf etwa 5 bis 8 einstellt, und aus dem neutralisierten Gemisch, gegebenenfalls nach dem Entfernen eines Teils des organischen Lösungsmittels, das Tetracyclin auskristallisiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangslösung mit Salzsäure auf einen p_H-Wert von etwa 0,5 bis 3,5 einstellt und die beiden Antibiotika in Gegenwart eines Salzes, wie Natriumchlorid, mit Butanol extrahiert.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Französische Patentschrift Nr. 1 032 567;
J. Am. Chem. Soc, Bd. 75, 1953, S. 4621.