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Verfahren zur Gewinnung von Bromtetracyclin
Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Gewinnung eines neuen und therapeutisch wertvollen Antibiotikums mit breitem Wirkungsspektrum, das als Bromtetracyclin bezeichnet wird, sowie die Gewinnung und Reinigung dieser Substanz.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren zur Erzeugung von Bromtetracyclin wird ein wässeriges Nährmedium üblicher Zusammensetzung, das wenigstens 50 Teile Bromionen je Million enthält und einen Chlorionengehalt von weniger als 50 Teilen je Million aufweist, unter aeroben Bedingungen und bei einem PH im Bereich von 3, 5 bis 7, 5 mit einem Bromtetracyclin erzeugenden Stamm von Streptomyces aureofaciens fermentiert, bis das fermentierte Medium Bromtetracyclin in einer Menge von mindestens 251a der Gesamtmenge der erzeugten Antibiotica enthält.
Die Menge an zugesetzten Bromionen soll im allgemeinen 1500 Teile je Million nicht übersteigen, der Chlorionengehalt soll zweckmässig unter 10 Teilen je Million liegen.
Bromtetracyclin wurde erstmalig in guter Ausbeute und verhältnismässig hoher Konzentration aus einem üblichen Fermentationsmedium, welches zusätzlich Bromionen enthielt und im wesentlichen chlorionenfrei war, unter Verwendung eines aus einer Bodenprobe isolierten Stammes von Streptomyces aureofaciens gewonnen. Seine Molekularstruktur entspricht der des Chlortetracyclins, wobei es an Stelle von Chlor Brom enthält. Auf diese Weise ist es sofort von Chlortetracyclin und Oxytetracyclin zu unterschei- den.
Bromtetracyclin besitzt die Bruttoformel C22H2sN20sBr und folgende Strukturformel
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Btomtetracyclin reagiert als freie Base amphoter und bildet sowohl mit organischen und anorganischen Säuren als auch mit Basen Salze und kann in üblicher Weise, z. B. in Form des Hydrochlorids, Hydrobromids, Sulfats, Borats, Nitrats, Phosphats, Ascorbinats, Citrats, Succinats, Acetats, Sulfamats bzw.
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mit Salzen der Borsäure, beispielsweise Natriumborat, gebildet.
Salze der im vorstehenden beschriebenen Art sind bei Isolierungs- und Reinigungsverfahren wertvoll, da sie durch Neutralisation oder doppelte Umsetzung in die freie amphotere Substanz bzw. aus einer Form in andere Formen übergeführt werden können. Derartige Salze besitzen ausserdem antiseptische und
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therapeutische Eigenschaften. Die Löslichkeit des Bromtetracyclins in'Wasser weist bei einem pH-Wert von 6 ein Minimum auf (isoelektrischer Punkt). Die in diesem pH-Bereich in Wasser am wenigsten lösliche Form-wird als amphotere oder als freie Base bezeichnet. Durch Prüfungen in vitro wurde gefunden, dass sowohl die genannten Säure- und Basensalze als auch die freie Base gegen zahlreiche grampositive und gramnegative Bakterien wirksam sind.
Das Infrarotspektrum einer in Paraffinöl suspendierten freien Base zeigt charakteristische Maxima bei 830,950, 1525, 1575,1610, 1645, 3050,3320 und 3460 cm-l und zeigt nur geringe Unterschiede gegenüber dem des Chlortetracyclins.
Auch das antibiotische Wirkungsspektrum des Bromtetracyclins gleicht in vieler Hinsicht dem des Chlortetracyclins.
Die Fermentation wird vorzugsweise unter submersen Bedingungen durchgeführt, wobei die Belüftung und Bewegung entweder in einem Kolben auf einer Schüttelmaschine oder in einem mit Rührer versehe-
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zu Beginn nahezu neutral sein, obwohl auch in Nährmedien mit ursprünglichen pH-Werten bis herab zu 5,0 oder bis hinauf zu 8,5 eine gewisse Menge Antibiotikum gebildet wird.
Das zur Gewinnung von Bromtetracyclin verwendete flüssige Fermentationsmedium enthält als Kohlenstoffquelle entweder ein lösliches Kohlehydrat, wie Saccharose, oder ein unlösliches Kohlehydrat wie Stärke, beispielsweise Maisstärke bzw. Dextrin ; Laktose und Glukose sind weniger gut geeignet. Die Menge der Kohlenstoffquelle kann in weiten Grenzen von etwa 0, 5 bis 10, 0 Gel.-% des Gesamtgewichtes des Fermentationsmediums schwanken.
Als Quelle für assimilierbaren Stickstoff können sowohl anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw. als auch organische Stickstoffquellen, wie Aminosäuren und verschiedene eiweisshaltige Naturstoffe verwendet werden.
Von anorganischen Salzen kommen Phosphate, entweder Ammoniumphosphat oder ein Metallphosphat, beispielsweise Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, und wenn kein Kaliumphosphat anwesend ist, noch ein Kaliumsalz in Betracht.
Die Zugabe von geringen Mengen von Schwermetallen, wie Kupfer, Zink, Mangan, Eisen und Chrom, ist wünschenswert, wenn sie nicht bereits als Verunreinigungen in den andern Bestandteilen vorliegen.
Zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes innerhalb des notwendigen Bereiches kommen insbesondere Calciumcarbonat und Salze organischer Säuren, beispielsweise Citrate, Acetate und Lactate in Betracht, wobei die organischen Säuren ausserdem als Kohlenstoffquellen wirken. Die Verwendung eines Entschäu- mungsmittels ist bei den bei der technischen Durchführung verwendeten Fermentationsgefässen wünschenswert, obwohl die Verhinderung des Schäumens bei dieser Fermentation kein besonders schwieriges Problem darstellt und leicht durch Verwendung üblicher Entschäumungsmittel erzielt werden kann.
Streptomyces aureofaciens tritt im allgemeinen in zwei voneinander durch ihre biologischen Leistungen verschiedenen Formen auf. Die sogenannten chlorid-verwertenden Stämme besitzen die Fähigkeit, alle im Nährmedium vorhandenen Chlorionen unter Bildung von Chlortetracyclin zu verwerten. In Abwesenheit von Chlorid-und Anwesenheit von Bromidionen sind sie imstande, Bromtetracyclin zu produzieren. In jedem Fall wird daneben eine gewisse Menge an Tetracyclin gebildet, selbst in Gegenwart eines Chlorionenüberschusses. Welches Antibiotikum gebildet wird, hängt von der Zusammensetzung des Nährmediums ab.
Der chlorid-verwertende Stamm S-77 bildet in einem chloridhaltigen und bromidfreien Nährmedium neben Chlortetracyclin eine geringe Menge Tetracyclin, während in einem chloridfreien bromidhaltigen Nährmedium neben Bromtetracyclin eine verhältnismässig grosse Menge Tetracyclin gebildet wird. Der genannte Stamm liefert vorzugsweise Chlortetracyclin, während die Produktion an Tetracyclin und Bromtetracyclin an zweiter und dritter Stelle steht.
In Gegenwart begrenzter Chloridmengen und eines Bromidüberschusses wird zuerst das gesamte Chlorid verwertet und dann erst Bromtetracyclin und etwas Tetracyclin gebildet. In Gegenwart eines Überschusses an Chlorid und Bromid wird keine merkliche Menge Bromtetracyclin gebildet ; das Bromid zeigt jedoch eine chlorid-inhibierende Wirkung und kann so das Verhältnis von Tetracyclin zu Chlortetracyclin erhöhen.
Chlorid-nichtverwertende Stämme bilden unter keinen Bedingungen Bromtetracyclin, ob nun Chlorid zugegen oder abwesend ist. Es werden mässige Mengen Tetracyclin und bei Gegenwart von Chlorid ausserdem etwas Chlortetracyclin gebildet.
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Aus den vorstehend geschilderten Tatsachen geht hervor, dass eine wirtschaftliche Bromtetracyclingewinnung nur mittels eines chlorid-verwertenden Stammes von Streptomyces aureofaciens und nur in Abwesenheit oder bei Begrenzung von Chlorid erreicht werden kann.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, den Chlorionengehalt zu begrenzen, am einfachsten durch Verwendung von destilliertem Wasser und von chloridfreien Bestandteilen des Nährmediums, z. B. von synthetischen Medien. Es können aber auch die für Fermentationsmedien oft verwendeten, meist chloridhaltigen Naturstoffe Verwendung finden, wenn sie zuvor durch Behandlung mit Ionenaustauschern zur Entfernung von Chlorionen entionisiert werden. Ein für den vorliegenden Zweck geeignetes synthetisches Medium enthält im allgemeinen Saccharose als Kohlehydrat, Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle, Kaliumphosphat als Mineralstoff, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Natriumcitrat und Essigsäure als Puffersubstanz und Kupfersulfat, Zinksulfat und Mangansulfat in geringen Mengen als Spurenelemente.
Werden im wesentlichen chloridfreie Produkte und destilliertes Wasser verwendet, so enthält dieses Medium nicht mehr als 1 Teil je Million an Chlorid. Dieser Nährlösung wird ein ionisierbares Bromid in den angegebenen Mengen zugesetzt.
Zur Gewinnung des Impfmaterials werden Schrägagarkulturen auf Waksman-Agar mit der folgenden Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Glukose <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Pepton <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH, <SEP> pq <SEP> i <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgS04'70 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Agar <SEP> 20 <SEP> g/l
<tb>
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bei 500C während 60 Minuten und bei 120 C während 120 Minuten in einem Autoklaven abgebaut. Dann wird mit ungefähr 2, 5 ml wässerigem Ammoniak auf PH 6, 0 eingestellt.
Dieses Kaseinabbauprodukt dient als Stickstoffquelle einer Nährlösung, die noch folgende Bestandteile enthält :
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<tb>
<tb> Magnesiumlactat <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> CuS04. <SEP> 5H2O <SEP> 32, <SEP> 0 <SEP> mg <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2,5 <SEP> g <SEP> MnSO4. <SEP> 4H2O <SEP> 20,0 <SEP> mg
<tb> NaH2PO4. <SEP> H2O <SEP> 2,2 <SEP> g <SEP> ZnSO4.7H2O <SEP> 20,0 <SEP> mg
<tb> Saccharose <SEP> 15,0 <SEP> g <SEP> Cobaltacetat <SEP> 5,0 <SEP> mg
<tb> FeSO4.7H2O <SEP> 40,0 <SEP> mg <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 11 <SEP> aufgefüllt. <SEP>
<tb>
In adäquate Teile dieses Mediums wird Kaliumbromid in den unten angeführten Mengen eingeführt.
Dann wird mit Streptomyces aureofaciens fermentiert, wobei die Fermentation jeweils 72 Stunden bei 270C unter Bewegung und Belüftung durchgeführt wird. Die Untersuchung der Gärbrühen ergab die folgenden antibiotischen Wirksamkeiten, wobei eine Einheit der antibiotischen Wirksamkeit derjenigen von 1 Im1 Chlortetracyclin gegen Staphylococcus aureus als Testorganismus entspricht.
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<tb>
<tb>
Kaliumbromid <SEP> Antibiotische <SEP> Wirksamkeit
<tb> g/l
<tb> 0,1 <SEP> 415 <SEP> Einheiten
<tb> 0,2 <SEP> 450 <SEP> Einheiten
<tb> 0,4 <SEP> 430 <SEP> Einheiten
<tb>
Unter analogen Bedingungen werden nach 48stündiger Fermentation folgende Ergebnisse erhalten:
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<tb>
<tb> Kaliumbromid <SEP> Antibiotische <SEP> Wirksamkeit
<tb> g/l
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> 330 <SEP> Einheiten
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> 305 <SEP> Einheiten
<tb> 0,4 <SEP> 290 <SEP> Einheiten
<tb>
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<tb>
<tb> 2 <SEP> :
Saccharose <SEP> 30000 <SEP> mg
<tb> D, <SEP> L-Alanin <SEP> 450 <SEP> mg
<tb> L-Arginin <SEP> 570 <SEP> mg
<tb> D, <SEP> L-Methionin <SEP> 200 <SEP> mg
<tb> L-Glutaminsäure <SEP> 260 <SEP> mg
<tb> L-Histidin <SEP> 200 <SEP> mg
<tb> D, <SEP> L- <SEP> ss <SEP> - <SEP> Asparagin <SEP> 200 <SEP> mg <SEP>
<tb> (NH4) <SEP> 2 <SEP> 000 <SEP> mg <SEP>
<tb> Magnesiumlactat <SEP> 5 <SEP> 000 <SEP> mg
<tb> NH4H2PO4 <SEP> 2000mg
<tb> Kaliumacetat <SEP> 2000 <SEP> mg
<tb> MgH4(PO4)2 <SEP> 1000 <SEP> mg
<tb> FeS04. <SEP> 7H <SEP> O <SEP> 60 <SEP> mg
<tb> ZnS04. <SEP> 7H <SEP> O <SEP> 33 <SEP> mg
<tb> MnSO4.H2O <SEP> 19 <SEP> mg
<tb> CuSC. <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> mg <SEP>
<tb> Co(CH@COO)2.6H2O <SEP> 5 <SEP> mg
<tb>
in über Natriumhydroxyd destilliertem Wasser zu 11 gelöst ;
dann wird das pn mit 3n-Ammoniak (etwa 3 ml/l) auf einen Wert zwischen 6,2 und 6, 3 eingestellt und 5 g Calciumcarbonat zugesetzt. Die Lösung gibt mit Salpetersäure und Silbernitrat keinen Niederschlag, was zeigt, dass die Chlorionenkonzentration unterhalb von 0, 17 mg/l liegt.
Je 100 ml dieser Nährlösung werden in 500 ml fassende Erlenmeyerkolben 15 Minuten bei 1200C im Autoklaven sterilisiert, mit je 5 ml einer Sporensuspension von Streptomyces aureofaciens beimpft und
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zwecks Bildung einer Impfkultur 24 Stunden unter Bewegung auf 270C gehalten. In ein mit RUhrer und Belüfter ausgestattetes Fermentationsgefäss werden 6,3 l des sterilen Mediums, 35 ml Mineralöl, 50 ml einer sterilen wässerigen Lösung, die 0,97 g Kaliumbromid enthält, und schliesslich die Impfkultur aus sieben Kolben eingebracht. Die Fermentation wird bei 27, 40C geführt, wobei die Geschwindigkeit des Rührens 350 Umdr/min, die des Luftstromes 7 l/min beträgt.
Die Luft wird erst durch eine Waschflasche mit Salpetersäure, dann durch Silbernitrat, Wasser und schliesslich ein Sterilisationsfilter geleitet. Wenn nötig, wird ein polymeres Silikon als Entschäumungsmittel zugesetzt (General Electric Silicone SS24).
Während das vegetative Wachstum fortschreitet, fällt der pH-Wert langsam ab. Die Fermentation wird fortgesetzt, bis der pH-Wert sein Minimum erreicht hat und wieder zu steigen beginnt. Nach etwa 51 Stunden beträgt dann der pH-Wert ungefähr 5,9 und die gebildeten Antibiotika besitzen eine Wirksamkeit von 412 Einheiten.
Die Gärbrühe enthält sowohl Bromtetracyclin als auch Tetracyclin und wird zur-Abtrennung des Bromtetracyclins unter Rühren mit konzentrierter Salzsäure auf pH 1, 5 angesäuert, dann mit 95 g Filterhilfe gerührt und filtriert.
Der Filterkuchen wird bei 500C mit 1400 ml destilliertem Wasser aufgeschlämmt und filtriert. Die vereinigten Filtrate enthalten 94, 4% der gesamten wirksamen Substanzen. Der pH-Wert des Filtrats wird mit 32 ml 50% iger Natronlauge auf 2, 5 eingestellt und die Lösung im Vakuum bei einer Temperatur von 25 bis 30 C auf ein Endvolumen von 2070 ml eingeengt. Das Konzentrat enthält 83, 6% der gesamten wirksamen Substanzen. Es wird mit konzentrierter Salzsäure auf PH = 1, 5 eingestellt und mit 331 g Natriumchlorid versetzt. Die Lösung wird zweimal mit je 311 ml n-Butanol und dreimal mit je 207 ml n-Butanol extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und der pH-Wert mit piger Natronlauge auf 2,5 eingestellt.
Dann wird der Extrakt im Vakuum unter Stickstoff destilliert, wobei Wasser zugegeben wird, bis das gesamte n-Butanol azeotrop abdestilliert ist. Der wässerige Rückstand wird mit konzentrierter Salzsäure auf PH = 1, 5 eingestellt, mit 5 g Filterhilfe versetzt und durch einen Glassintertrichter filtriert.
Es wird schliesslich ein wässeriges Filtrat mit einem Volumen von 1100 ml erhalten, das 70, 5% der gesamten wirksamen Substanzen enthält.
Dieses Filtrat wird mit einer Lösung von 41, 5 g Bariumchlorid-Dihydrat in 119ml destilliertem Wasser versetzt, eine halbe Stunde gerührt, das PH mit Natronlauge auf 8,5 eingestellt und die Mischung zentrifugiert. Das Zentrifugat wird mit 40 ml destilliertem Wasser gewaschen, der gewaschene Kuchen mit 249 ml destilliertem Wasser aufgeschlämmt, das PH mit 50% figer Schwefelsäure auf 2,5 gebracht und die Mischung 1 Stunde kräftig gerührt. Dann wird das PH mit 50% figer Schwefelsäure auf l, 5 eingestellt, wieder eine halbe Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird unter Zentrifugieren zweimal mit 15 ml n/10 Schwefelsäure gewaschen ; die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten (260 ml) enthalten 62, 5% der gesamten wirksamen Substanzen.
Das oben beschriebene Fällungsverfahren wird wiederholt und die so erhaltene Lösung mit piger Natronlauge auf PH = 3, 5 eingestellt, 10 Minuten gerührt und zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit 10 ml Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der überstehenden Flüssigkeit vereinigt. Der pH-Wert der vereinigten Lösungen wird mit 10%iger Natronlauge auf 4,95 eingestellt, der Niederschlag gesammelt, gewaschen und der Gefriertrocknung unterworfen. Es werden 2,65 g eines Produktes mit 490 Einheiten erhalten, das 5, 43% Brom enthält.
Eine Gegenstromverteilungsvorrichtung nach Craig mit 30 Rohren wird mit einem Lösungsmittelsystem beschickt, das aus gleichen Volumina destilliertem Wasser und n-Butanol besteht, von denen jedes der beiden Lösungsmittel mit dem andern gesättigt ist und mit konzentrierter Salzsäure auf PH 2, 5 eingestellt wird. 1, 55 g der Trockensubstanz werden mit 160 ml der wässerigen Phase aufgeschlämmt, der pH-Wert erneut auf 2,5 eingestellt und nach Zugabe von 160 ml der n-Butanol-Phase unter Rühren wieder auf PH = 2,5 gebracht. Die Mischung wird abfiltriert und nach Trennung der Phasen 50 ml von jeder Phase in jedes der drei ersten Rohre der Gegenstromverteilungsvorrichtung gebracht.
Die übrigen Rohre werden mit 50 ml der mit n-Butanol gesättigten wässerigen Phase beschickt und die Verteilung durchgeführt, bis sich die obere Phase, anfänglich in Rohr 2, in Rohr 29 im Gleichgewicht befindet. Die Verteilung wird fortgesetzt, bis die obere Phase 18mal aus Rohr 29 abgezogen wurde. Auf diese Weise wird die wirksame Substanz im Rohr 29 angesammelt.
Die spektrophotometrische Untersuchung der Substanzen zeigt zwei Maxima, von denen das eine bei 355 - 365 mJ. L (Rohr 12) und das zweite bei 370 - 375 mJ. L (Rohr 21) liegt. Die Lösungen aus den Rohren 18 bis 29 enthalten den Hauptanteil des Materials mit dem zweiten Spitzenwert. Sie werden vereinigt und im Vakuum unter Stickstoff destilliert, wobei Wasser bei einem PH von 2,5 zugegeben wird, bis 50 ml einer wässerigen Lösung, die frei von n-Butanol ist, erhalten werden. Der PH- Wert wird mit Salzsäure
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auf 1,5 eingestellt, Filterhilfe zugefügt und die Mischung abfiltriert.
Der pH-Wert der Lösungen wird dann langsam unter Rühren mit 10% niger Natronlauge auf 5,0 gebracht, die Mischung mit Glasperlen geschüttelt und über Nacht bei 4 C stehengelassen. Die Lösung wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 200 mg eines festen Produktes erhalten werden.
152 mg dieses Produktes werden in 1, 4 ml trockenem 2-Äthoxyäthanol gelöst und abfiltriert. Nach Zugabe von 0,14 ml Wasser wird die Mischung unter Schütteln zur Kristallisation gebracht ; die Kristalle werden abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Die erste Ausbeute beträgt 49 mg Bromtetracyclin.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von Bromtetracyclin, dadurch gekennzeichnet, dass ein wässeriges Nährmedium üblicher Zusammensetzung, das wenigstens 50 Teile Bromionen je Million enthält und einen Chlorionengehalt von weniger als 50 Teilen je Million aufweist, unter aeroben Bedingungen und bei einem pH im Bereich von 3,5 bis 7,5 mit einem Bromtetracyclin erzeugenden Stamm von Streptomyces aureofaciens fermentiert wird, bis das fermentierte Medium Bromtetracyclin in einer Menge von mindestens 25% der Gesamtmenge der erzeugten Antibiotika enthält.