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Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Tetracyclinreihe
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Tetracyclinreihe.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird eine Hydroxylgruppe in die 12a-Stellung eines 12a-Desoxytetracyclins eingeführt, indem man diese Verbindung der Einwirkung eines oxydierenden Stammes
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durch chemische Reduktion von Tetracyclin mit metallischem Zink in emer wässerigen Lösung von Ammoniak hergestellt. Das wässerige Ammoniak wird vorzugsweise als 10-20%oigne Lösung verwendet. Die Verwendung von wässerigem Ammoniak als Lösungsmittel hat sich als notwendig erwiesen, da andere Lösungsmittel, z. B. ein schwachsaures Medium, entweder die Reduktion von Tetracyclin zu dem 12a-Des- oxytetracyclin nicht fördert oder aber zur Bildung weiterer unerwünschter Reduktionsprodukte Anlass gibt.
Die Umsetzung kann bei Temperaturen zwischen etwa 10 und 500C durchgeführt werden, wird aber vorzugsweise bei etwa Zimmertemperatur, d. h. zwischen etwa 20 und 25 C durchgeführt. Die Reaktionszeit ist nicht besonders kritisch und liegt im allgemeinen zwischen 1 und 4h. Eine Konzentration von etwa 4r1ío (Gew.-Vol.) des Tetracyclinantibiotikums in wässerigem Ammoniak reicht für die Reaktion aus. Das für die Umsetzung verwendete Zink liegt vorzugsweise in feinverteilter Form, z. B. als Zinkstaub vor, und wird in einem Verhältnis von wenigstens 2 Gew.-Teile/Gew.-Teil des Tetracyclinantibiotikums eingesetzt. Mengenverhältnisse von mehr als etwa 4 Gew.-Teilen Metall sind im allgemeinen nicht erforderlich.
In gleicher Weise erhält man 6-Desmethyl-12a-desoxytetracyclin durch chemische Reduktion von 6-Desmethyltetracyclin ; 7-Chlor-6-desmethyl-12a-desoxytetracyclin durch chemische Reduktion von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin ; 6, 12a-Didesoxytetracyclin durch Reduktion von 6-Desoxytetracyclin und 6-Desmethyl-6, 12a-didesoxytetracyclin durch Reduktion von 6-Desmethyl-6-desoxy-tetracyclin.
Die 12a-Desoxytetracycline sind wertvolle Zwischenprodukte für die Herstellung von 12a-Desoxyanhydrotetracyclinen. 12a-Desoxyanhydrotetracyclin kann durch Behandlung von 12a-Desoxytetracyclin mit einem Dehydratisierungsmittel, z. B. einer beliebigen starken Mineralsäure oder einer organischen Säure, wie Eisessig, bei einer Temperatur zwischen etwa 0 und 1000C hergestellt werden. Das so erhaltene 12a-Desoxyanhydrotetracyclin ist biologisch aktiv und weist eine Wirksamkeit gegen eine Anzahl grampositiver und gramnegativer Mikroorganismen, insbesondere gegenüber manchen Tetracyclin resistenten Stämmen von Bakterien auf.
Zu den Species der Klasse Fungi Imperfect, die sich als für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignet erwiesen haben, gehören u. a. Myrothecium roridum, J. C. Gilman,"A Manualof Soil Fungi, 2. Auflage, Seite 398, Iowa State College Press, Ames Iowa [1957], Hormodendrum hordei (Ibid, 330), Hormodendrum pallidum (Ibid, 330), Curvularia lunata (NRRL 2380 Ibid, 338), Curvularia lunata
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Diese Mikroorganismen können bei bekannten Stellen bezogen werden, z. B. bei den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois. der American Type Culture Collection, Washington, D. C. dem Headquarters Quartermaster Research and Development Command, Quartermaster Research and Development Center, U. S. Army, Natick, Mass., oder vom Centraalbureau voor Schimmelculturen in Baarn, Holland. Man kann sie aber auch aus natürlichen Quellen gewinnen, wobei die für Mikrobiologen geläufigen Arbeitsweisen angewandt werden.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das zu oxydierende IZa-Desoxytetracyclin der Einwirkung eines oxydierenden Stammes von Fungi der oben erwähnten Klasse unterworfen. Dies wird zweckmässigerweise dadurch erreicht, dass der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem geeigne- ten Nährmedium in inniger Berührung mit dem zu oxydierenden 12a-Desoxytetracyclin gezüchtet und die Züchtung so lange geführt wird, bis die gewünschte Hydroxylierung der 12a-Stellung eingetreten ist.
Das
Verfahren kann auch in der Weise durchgeführt werden, dass man zunächst den Mikroorganismus in einem geeignetenFermentationsmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, dann die Zellen von dem Fermenta- tionsmedium abtrennt und schliesslich das mit dem 12a-Desoxytetracyclin versetzte zellfreie Filtrat wäh- rend einer zur Erzielung der gewünschten Hydroxylierung ausreichenden Zeit belüftet.
Das 12a-Desoxytetracyclin kann dem Nährmedium als Suspension in einem geeigneten Lösungsmittel wie Wasser oder als Lösung in einem Lösungsmittel, wie Aceton, Propylenglykol, Dimethylformamid u. dgl. zugesetzt werden. Im allgemeinen ist es zweckmässig, wenn das 12a-Desoxytetracyclin in fein- verteilter Form vorliegt, um einen möglichst guten Kontakt mit dem oxydierenden Kulturmedium zu er- reichen und einen vollständigen Ablauf der Reaktion zu gewährleisten.
Die Fermentationsbedingungen sind im allgemeinen die gleichen wie diejenigen, die bei den be- kannten Verfahren der fermentativen Erzeugung von Tetracyclin angewandt werden. Das Fermentations- medium enthält die üblichen Nähr- und Mineralstoffe. Zu geeigneten Nährstoffen, die die notwendigen
Substanzen liefern, gehören u. a. Stärke, Dextrose, Rohrzucker, Glukose, Melasse, Sojabohnenmehl,
Erdnussmehl, Hefe, Fleischextrakte, Pepton, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Maisquellwasser, Distillers
Solubles und Fischmehl. Als anorganische Salze sind beispielsweise verwendbar Calciumcarbonat, Am- moniumsulfat, Ammoniumchlorid, Natriumdehydrogenphosphat, und die verschiedenen Spurenelemen- te wie Mangan, Cobalt, Zink, Kupfer und Eisen.
Die weiteren Fermentationsbedingungen, wie Wasserstoffionenkonzentration, Temperatur, Zeit, Be- lüftungsgeschwindigkeit, Herstellung des Inoculums, Sterilisation, Beimpfung u. dgl. sind die üblicher- weise angewandten und können ähnlich denjenigen ausgewählt werden, die für die Erzeugung von Tetra- cyclin in der USA-Patentschrift Nr. 2,734, 018 beschrieben sind.
Im folgenden werden Beispiele für geeignete wässerige Nährmedien angegeben, die bei dem erfin- dungsgemässen Verfahren zur Hydroxylierung von 12a-Desoxytetracyclinen verwendet werden können.
Medium Nr. 1
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 20 <SEP> g/l
<tb> Saccharose <SEP> 30 <SEP> g/l
<tb> CaCO-7 <SEP> g/l <SEP>
<tb> (NHSO <SEP> 2 <SEP> g/l <SEP>
<tb>
Medium Nr. 2
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<tb>
<tb> Maismehl <SEP> 20 <SEP> g/l
<tb> N-Z-Amine <SEP> B <SEP> (Casein-Hydrolysat) <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Cerelose <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Difco-Hefeextrakt <SEP> 2 <SEP> g/l
<tb> KHPO <SEP> 1 <SEP> g/l
<tb> CaCO <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb>
Leitungswasser wird bis zu einem Gesamtvolumen von l l Nährmedium zugesetzt, der pH-Wert wird auf 6, 5 - 7, 0 eingestellt und die Lösung wird im Autoklaven behandelt.
Wie oben erwähnt, eignet sich das erfindungsgemässe Verfahren vor allem für die Oxydation von IZa-Desoxytetracyclm, die Erfindung soll jedoch nicht auf die Hydroxylierung dieses speziellen 12a-Desoxytetracyclins beschränkt werden. Vielmehr können auch die andern 12a-Desoxytetracycline, nämlich die aus 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin, 6-Desoxytetracyclin, 6-Desmethyltetracyclin und 6-Desmethyl- 6-desoxytetracyclin erhaltenen in der gleichen Weise mit oxydierenden Stämmen der beschriebenen Mi-
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von wenigstens 72h hergestellt werden. Dabei wird die Hydroxylgruppe in 12a-Stellung und die Dimethylaminogruppe in 4-S. tellung des Tetracyclingerüstes entfernt.
Die gebildete Verbindung kann als 12a-Desoxy-desdimethylaminotetracyclin bezeichnet werden. Diese Reaktion ist für Clortetracyclin als Aus-
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Ein steriles Kulturmedium, z. B. das oben angegebene Medium Nr. l wird zunächst beimpft, indem man eine kleine Menge der Sporensuspension oder des vegetativen Wachstums eines oxydierenden Stammes von Fungi Imperfect, z. B. der Species Curvularia lunata einführt. Das beimpfte Nährmedium wird dann 48h auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung bei 280C bebrütet. Ein aliquoter Anteil des Inokulums wird entnommen und in einen das Medium Nr. 2 enthaltenden Fermentationskolben eingebracht. Der beimpfte Fermentationskolben wird auf einer Rundschüttelvorrichtung wenigstens 20h bebrütet, ehe man das 12a-Desoxytetracyclin zugibt, das in Form einer wässerigen Suspensionslösung mit einem Gehalt von 10-20 mg/ml eingesetzt wird.
Das Bewegen und die Belüftung des Nährmediums wird etwa 2 - 72h oder so lange fortgesetzt, bis die Oxydation vollständig ist. Die Oxydation kann sowohl in der Fermentationsflüssigkeit in der beschriebenen Weise als auch durch Zugabe des 12a-Desoxytetracyclins zu der durch Filtrieren derselben erhaltenen zellfreien Flüssigkeit durchgeführt werden, wobei die Inkubation eine gewisse Zeit lang weitergeführt wird, bis die Oxydation vollständig ist.
Nach dem Ende der Oxydation kann das Tetracyclin aus der Fermentationsflüssigkeit oder aus der zellfreien Flüssigkeit auf beliebige Weise gewonnen werden. Zur Gewinnung von Tetracyclin aus Fermentationsflüssigkeiten geeignete Verfahren wurden in grösserer Anzahl bereits beschrieben und können zur Gewinnung des nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Tetracyclins angewandt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel l : Etwa 50 ml eines Kulturmediums m it der als Medium Nr. l beschriebenen Zusammensetzung werden 20 min bei 1500C in einem 500 ml-Kolben sterilisiert. Das Medium wird dann mit etwa 2 ml einer wässerigen Suspension eines vegetativen Inokulums von Curvularia lunata (NRRL2380) beimpft.
Das Gemisch wird 48h auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung bei 280C inkubiert. Darnach wird ein 4o ausmachender aliquoter Anteil des Inokulums entnommen und in einen 500 ml Kolben eingebracht, der 50 ml eines Mediums mit der als Medium Nr. 2 beschriebenen Zusammensetzung ent-
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bebrütet.Beispiel 2 : Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, ausser dass eine 48stündiger Fermentationsflüssigkeit filtriert wird. 6 ml der zellfreien Flüssigkeit werden zusammen mit 3, 8 ml eines mit einem PH-Wert von 3,8 hergestellten Citrat-Phosphat-Puffers und 0, 2 ml einer 2, 5'7eigen Lösung von 12a-Desoxytetracyclin in einen 250 ml-Kolben gegeben.
Der Kolben wird aufeiner SchüttelvorrichtuÍ1g mit Hin-und Herbewegung bei 280 2h inkubiert. Die antibakterielle Wirksamkeit steigt von einem Anfangswert von 12 y/ml auf 186 y/ml.
Beispiel 3 : Die in Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, mit der Ausnahme, dass das Medium mit einer Kultur von Myrothecium roridum beimpft wird. Nach 24stündiger Fermentation wird 1 ml einer 0, 25longen Lösung von 12a-Desoxytetracyclin in den Fermentationskolben eingeführt.
Der Kolben wird 72h bei 280C auf einer Rundschüttelvorrichtung inkubiert. Danach beträgt die als Tetracyclin gemessene antibakterielle Aktivität 34, l y/ml. Die ursprüngliche antibakterielle Aktivität beträgt 2, 6 y/ml.
Beispiel 4 : Die im vorhergehendenBeispiel beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, ausser dass eine Kultur von Hormodendrum hordei verwendet wird. Die Durchführung der Fermentation und die Zugabe des 12a-Desoxytetracyclins erfolgen wie in Beispiel 3 angegeben. Nach 72stündiger Fermentation liegt die antibakterielle Aktivität gemessen als Tetracyclin bei 17, 3 y/ml.
Beispiel 5 : Die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, mit der Ausnahme, dass eine Kultur von Hormodendrum pallidum verwendet wird. Die Durchführung der Fermentation und die Zugabe des 12a-Desoxytetracyclins erfolgen wie in Beispiel 3 beschrieben. Nach 72stündi-
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ger Fermentation beträgt die antibakterielle Aktivität, bestimmt als Tetracyclin. 23, 0 y/ml.
Beispiel 6 : Die m Beispiel 2 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, mit der Ausnahme, dass eine Kultur von Curvularia pallescens (NRRL 2381) verwendet wird. 12a-Desoxytetracyclin wird wie in Beispiel 2 beschrieben, zu der zellfreien Flüssigkeit gegeben. Nach zweistündiger Inkubation beträgt die
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Ausnahme, dass eine Kultur von Botrytis cinerea (ATCC 12 481) verwendet wird. Das 12a-Desoxytetracyclin wird wie in Beispiel 2 angegeben, der zellfreien Flüssigkeit zugesetzt. Nach zweistündiger Inkubation beträgt die antibakterielle Aktivität, bestimmt als Tetracyclin, 185 y/ml.
Beispiel 8 : 5 ml einer Lösung vonISa-Desoxydesdimethylaminotetracyclin inMethanol mit einer Konzentration von 1 mg/ml, das durch 72stündige Behandlung von Tetracyclin mit metallischem Zink in Eisessig hergestellt worden war, werden zu 2 ml eines bei PH 3,8 hergestellten Zitrat-Phosphat-Puffers und 3,0 ml eines Gärmaischefiltrats gegeben, das durch Fermentation einer Kultur von Curvularia lunata (NRRL 2380) hergestellt worden war. Der Kolben wird 2h bei 280 auf einer Schüttelvorrichtung mit Hinund Herbewegung geschüttelt.
Die 12a-Hydroxylierung des Substrats gibt sich durch eine Abnahme der Absorption bei 465 mu in m/10 Natriumboratlösung zu erkennen, die für die 12a-Desoxydesdimethylaminoverbindung charakteristisch ist und durch die Zunahme der antibakteriellen Aktivität, wie sie durch die turbidimetrische Prüfung mit Hilfe von Micrococcus pyogenes bestimmt wird.
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<tb>
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Zeit <SEP> optische <SEP> Dichte <SEP> ylml <SEP> als <SEP> Desdimethylmin <SEP> bei <SEP> 465 <SEP> mit <SEP> in <SEP> aminotetracyclin
<tb> m/10 <SEP> Borat
<tb> 0 <SEP> 0, <SEP> 442 <SEP> 50, <SEP> 3
<tb> 30 <SEP> 0,291 <SEP> 121,0
<tb> 120 <SEP> 0,152 <SEP> 149,0
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Ausserdem zeigt die Papierchromatographie die erfolgte 12a-Hydroxylierung an.
Beispiel 9 : Eine wässerige Suspension von Curvularia lunata (NRRL 2380) von einem Kartoffeldextrose-Schrägagar wird in 4 sterile 500 ml-Kolben überimpft, die jeweils 50 ml eines Mediums mit der als Medium Nr. l beschriebenen Zusammensetzung enthalten. Die Kolben werden dann 48h auf einer Schüttelvorrichtung mit'Hin-und Herbewegung bei 280C inkubiert. Danach wird ein 4% ausmachendes Inokulum zu einer Reihe von Kolben gegeben, die jeweils 50 ml eines Mediums mit der als Medium Nr. 2 beschriebenen Zusammensetzung enthalten. Diese beimpften Fermentationskolben werden 44h bei 280C auf einer Rundschüttelvorrichtung inkubiert.
Danach wird das Mycel von der Gärmaische durch Filtrieren durch Seitz-Filterkisseil abgetrennt. 1044 rnl einer derartigen zellfreien Flüssigkeit werden mit 66 ml einer Suspensionslösung von 850 ml 12a-Desoxytetracyclin versetzt.
Lässt man das Reaktionsgemisch etwa 24h bei Zimmertemperatur stehen, dann steigt die antibakterielle Aktivität (als Tetracyclin) auf etwa das 10fache. Die Reaktionsgeschwindigkeit kann durch Belüftung des Reaktionsgemisches, z. B. mittels Durchleiten von Luft oder durch Bewegen des das Reaktionsgemisch enthaltenden Kolbens auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung gesteigert werden.
Das Reaktionsgemisch wird dann auf einen PH-Wert von 8, 5 - 8, 6 eingestellt und mehrmals mit Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte werden auf ein geringes Volumen eingeengt und das rohe Tetracyclin durch Zugabe von 10 Volumina Petroläther gefällt. Das Tetracyclin wird von dem Hauptteil der Verunreinigungen durch Verteilungschromatographie und anschliessende Kristallisation befreit. Das erhaltene kristalline Tetracyclin wird durch Infrarot-und Ultraviolettbestimmungen, Papierchromatogra- phie und auf Grund der mikrobiologischen Aktivität identifiziert.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Tetracyclinreihe, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Hydroxylgruppe in die 12a-Stellung eines 12a-Desoxytetracyclins einführt, indem man diese Verbindung der Einwirkung eines oxydierenden Stammes oder mehrerer solcher Stämme von Mikroorganismen der Klasse Fungi Imperfect, welche der Untergruppe Moniliales angehören, unterwirft.