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Verfahren zur Herstellung von Pimaricin
EMI1.1
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das die Kolonie zum Teil bedeckt. Luft-Myzel nach 7 Tagen weiss und verfilzt, nach 28 Tagen gelblichgrau, die Kolonie zu 30 - 7cp/a überdeckend. Kein lösliches Pigment. Unangenehm erdig riechend.
Kartoffel Gutes Wachstum. Vegetatives Myzel feucht, erhabene Klumpen, blass, rosa, gelbbraun bis rosa-gelbbraun, nach 28 Tagen tief olivgelbbraun.
Rückseite an der Glaswand nach 28 Tagen chamois. Nach 7 Tagen kein Luft-Myzel. Nach 28 Tagen reichlich Luft-Myzel, zuerst weiss, dann blassmausgrau, nach 57 Tagen grau mit gelblichgrauem Ton.
DieKanoffel nach 7 Tagen nicht verfärbt, nach 57 Tagen ebenso wie die Flüssigkeit am Boden des Rohies zu einem gelbbraunen Ton ver- färbt. Riecht erdig.
Sabouraud-Glukose
Agar Mässiges Wachstum. Vegetatives Myzel klumpig, erhaben, nach
7 Tagen olivgelbbtaun wie die Rückseite, nach 28 Tagen dunkler (tief olivgelbbraun bis dunkel olivgelbbraun). Die Rückseite hat nun Ton- farbe. Das Luft-Myzel ist zunächst weiss, kurz und verfilzt, nachher matt mausgrau. Kein lösliches Pigment nach 7 Tagen erkennbar, jedoch nach 57 Tagen mittelkastanienbraun.
Emerson Agar Sehr gutes Wachstum. Vegetatives Myzel olivgelbbraun. Die Rückseite erscheint dunkler (cremig gelbbraun bis chamois). Das Luft-Myzel ist kurz und filzig, weiss. Kein lösliches Pigment. Riecht stark erdig.
Stärke Agar Mässiges Wachstum. Vegetatives Myzel und Rückseite blass olivgelb- braun. Kolonie ein wenig erhaben, bedeckt etwa zur Hälfte durch filziges, weisses Luft-Myzel. Kein lösliches Pigment. Riecht stark erdig.
Glukosenitrat Agar Gutes Wachstum. Runde, feuchte, graue Kolonien, im Zentrum etwas erhaben, etwa 2-2, 5 mm Durchmesser (heller als matt olivgelb- braun). Luft-Myzel kärglich, in Tüpfeln oder konzentrischen Ringen, filzig, weiss. Kein lösliches Pigment. Riecht erdig.
Natriumcitrat Agar Sehr geringes Wachstum. Runde, feuchte, graue Kolonien, im Zentrum etwas erhaben, etwa l mm Durchmesser (heller als matt olivgelb- braun). Rückseite matt olivgelbbraun. Kein lösliches Pigment. Kein
Geruch.
Nähr Agar Gutes Wachstum. Kolonie feucht, leicht erhaben, sehr klein, nasse
Büschel, rauh und wirr, mit flachen und unbestimmten himartigen
Windungen, cremefarben bis cremig gelbbraun. Riecht unangenehm.
Kein lösliches Pigment.
Czapek Agar (13 Tage) Wachstum sehr spärlich. Vegetatives Myzel durchsichtig. Kein Luft-
Myzel. Kein lösliches Pigment.
Bacto Agar 2 Wachstum sehr spärlich, nicht vor 13 Tagen zu erkennen. Vegetatives
Myzel durchsichtig. Kein Luft-Myzel. Kein lösliches Pigment.
Der gemäss der Erfindung für die Erzeugung von Pimaricin verwendete Organismus gehört zur Streptomycesart und ist nicht identisch mit irgendeiner bisher beschriebenen Streptomyces-Spezies. Im Hinblick auf die im einzelnen oben ausgeführten Eigenschaften gehört er in Gruppe 1 gemäss Waksman in Berge's Manual (z. Vgl. a. uch S. A. Waksman "The Actinomyceres" [1950], S. 30).
Streptomyces natalensis nov. spec. kann auch in die Reihe der"Neo-Ingri"von Baldacci (z. Vgl.
Symposium Actinomycetales. VIth Congr. Intern. Micro., Roma [1953], page 31) klassifiziert werden.
Zu bsmsrken ist, dass der Name Streptomyces natalensis nov. spec. nicht nur Actinomyceten zukommt,
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die ganz genau der hier gegebenen Beschreibung entsprechen, sondern dass der Ausdruck sich auch auf verwandte Stämme bezieht, die im grossen und ganzen die gleichen spezifischen Eigenschaften besitzen und das Antibiotikum Pimaricin erzeugen ; sie können betrachtet werden als Subspezies, Varietäten,
Rassen, Formen, Gruppen serologischer oder anderer Typen, Varianten, Phasen, spontane Mutanten, Modifikationen od. dgl. dieser Spezies.
Das neue Antibiotikum Pimaricin ist in der Hauptsache aktiv bezüglich saprophytischer und parasitärer Pilze und Hefen.
Tabelle 11 gibt einen Überblick über die antibiotischen Eigenschaften von Pimaricin im Verhältnis zu Hefen und Pilzen, die bezüglich des menschlichen Körpers nicht pathogen sind. Für jede Spezies ist die Menge des Antibiotikums in y/ml des Nährmittels angegeben, die gerade das Wachstum hemmt.
Tabelle m zeigt die entsprechende Hemmung einer Anzahl von Hefen und Pilzen, die bezüglich des menschlichen Körpers pathogen sind.
Tabelle II
EMI3.1
<tb>
<tb> Testorganismus <SEP> Konzentration <SEP> von <SEP> Pimaricin <SEP> in <SEP> y/ml,
<tb> die <SEP> das <SEP> Wachstum <SEP> hemmt
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae-H <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> - <SEP> KLL <SEP> 0, <SEP> 9
<tb> Pichia <SEP> membranifaciens <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Cladosporium <SEP> cucumerinum <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Verticillium <SEP> dahliae <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Fusarium <SEP> spec. <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Trichoderma <SEP> spec.
<SEP> 1, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Tabelle III
EMI3.2
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> von <SEP> Pimaricin <SEP> in <SEP> y/ml <SEP>
<tb> Testorganismus <SEP> (auf <SEP> Sabouraud <SEP> Agar),
<tb> die <SEP> das <SEP> Wachstum <SEP> hemmt
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> (3 <SEP> strains) <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 12 <SEP>
<tb> Candida <SEP> tropicalis <SEP> 1) <SEP> (2 <SEP> strains) <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 12 <SEP>
<tb> Trichosporon <SEP> cutaneum <SEP> 1) <SEP> 12 <SEP>
<tb> Pityrosporum <SEP> spec.
<SEP> 1) <SEP> 12 <SEP>
<tb> Candida <SEP> parapsilosisl) <SEP> 12
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> 3 <SEP>
<tb> Sporotrichum <SEP> Schenckil <SEP> 6 <SEP>
<tb> Trichophyton <SEP> sulfuricum <SEP> 3 <SEP>
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes
<tb> (3 <SEP> strains) <SEP> 50
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP> 6
<tb> Trichophyton <SEP> rosaceum <SEP> 12,5
<tb> Trichophyton <SEP> Schön1einii <SEP> 6 <SEP>
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> 12,5
<tb> Trichophyton <SEP> interdigitale <SEP> 25
<tb> Microsporum <SEP> lanosum <SEP> 12,5
<tb> Epidermophyton <SEP> floccosum <SEP> 12,5
<tb> Hormodendrum <SEP> compactum <SEP> 6
<tb>
1) Diese Hefe wird als nicht pathogen angesehen, sie wurde jedoch aus medizinischem Material isoliert.
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Aus den obigen Tabellen wird unter anderem eine klare, eindeutige und wesentliche Wirkung gegen pathogene Pilze, wie Verticillium, Cladosporium und Fusarium, deutlich. Auch ist die Hemmung bei
Candida albicans sehr stark.
Ein weiterer wesentlicher Gegenstand bzw. Vorteil des neuen Antibiotikums ist der sehr geringe phytotoxische Effekt des Pimaricins im Gegensatz zu den meisten bisher gefundenen fungiciden Anti- biotika. Infolgedessen ist das neue Antibiotikum auch in der Landwirtschaft und im Gartenbau sehr ge- eignet als Mittel zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, umso mehr als es sich leicht ausbreitet und systemisch wirkt. So dringt Pimaricin z. B. in Erbsen (Pisum sativum) bei dem Eintauchen in eine ver- dünnte wässerige Lösung ein. Dies ergibt sich aus der Möglichkeit der Extraktion von Pimaricin aus den ) Keimblättem und Keimen von behandelter Saat.
Die Tabellen IVa und b zeigen die innere desinfizierende Wirkung. Das Pilzmyzel (u. a. Ascochyta pisi) wird in der Saat vernichtet.
Tabelle IVa
EMI4.1
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> von <SEP> Pimaricin <SEP> ufo <SEP> Saat <SEP> mit <SEP> Myzel2)
<tb> in <SEP> p. <SEP> p. <SEP> m. <SEP> l) <SEP> (Teile/Million)
<tb> 150 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 75 <SEP> 3 <SEP>
<tb> 37, <SEP> 5 <SEP> 11 <SEP>
<tb> 18, <SEP> 7 <SEP> 25 <SEP>
<tb> unbehandelt <SEP> 80
<tb>
Tabelle IVb
EMI4.2
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> von <SEP> Pimaricin <SEP> ufo <SEP> kranker <SEP> Pflanzen
<tb> in <SEP> p.p.m.1) <SEP> Test <SEP> I <SEP> Test <SEP> II
<tb> 150 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 75 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 37, <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> 18, <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 6 <SEP>
<tb> unbehandelt <SEP> 15 <SEP> 24
<tb>
1) wässerige Lösung, in die die Saat
24 Stunden bei 200 eingelegt wurde. entwicklung des Myzels auf Filterpapier.
Eingehende Versuche zeigten, dass Pimaricin in einer Konzentration von 75 p. p. m., die wirksam fungicid ist, die Keimung bzw. Keimfähigkeit von Erbsen und das Wachstum der Pflanzen nicht ungünstig beeinflusst (zum Vergleich Tabellen IVc und IVd).
Tabelle IVc
EMI4.3
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> von <SEP> %gekeimter <SEP> Saat <SEP> 2) <SEP> Länge <SEP> der <SEP> Wurzeln
<tb> Pimaricin <SEP> in <SEP> p. <SEP> p. <SEP> m. <SEP> in <SEP> mm <SEP> nach <SEP> 3 <SEP> Tagend
<tb> blank <SEP> 100 <SEP> 23 <SEP>
<tb> 25 <SEP> 100 <SEP> 24 <SEP>
<tb> 50 <SEP> 100 <SEP> 22 <SEP>
<tb> 75 <SEP> 100 <SEP> 22 <SEP>
<tb> 100 <SEP> 100 <SEP> 23 <SEP>
<tb> 125 <SEP> 100 <SEP> 22 <SEP>
<tb> 150 <SEP> 96 <SEP> 29 <SEP>
<tb> 200 <SEP> 98 <SEP> 14
<tb>
1) wässerige Lösung, in die die Saat 24 Stunden bei 200 eingelegt wurde.
2) Saat auf einem feuchten Filterpapier.
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Tabelle IVd
EMI5.1
<tb>
<tb> Erbsen <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> getaucht <SEP> In <SEP> Konzentration <SEP> von
<tb> Pimaricin <SEP> 75 <SEP> p. <SEP> p. <SEP> m. <SEP> l)
<tb> Keime <SEP> (Zahl) <SEP> 126 <SEP> 128
<tb> Länge <SEP> der <SEP> Pflanze <SEP> in <SEP> cm
<tb> nach <SEP> 2 <SEP> Monaten <SEP> 31, <SEP> 8 <SEP> 33, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Zahl <SEP> der <SEP> Schoten
<tb> pro <SEP> Pflanze <SEP> 2,8 <SEP> 2,8
<tb>
1) wässerige Lösung, in die die Erbsen
24 Stunden bei 200 eingelegt wurden.
Die Daten der obigen Tabellen beziehen sich auf die Erbse Eminent, die extrem anfällig für Ascochyta pisi ist.
Versuche mit Ratten und Mäusen zeigten eine sehr niedrige Toxizität. Zur Bestimmung der akuten Albinoratten-Toxizität von Pimaricin wurde ein Material entsprechend 985 y/mg Ratten gegeben, die dann sieben Tage gehalten und untersucht wurden.
Mit der Pimaricin-Suspension in Wasser wurden die folgenden Resultate (Durchschnittswerte von Versuchen mit 40 Ratten) erhalten :
EMI5.2
<tb>
<tb> LD50 <SEP> oral <SEP> 1500 <SEP> mg/kg
<tb> LDgo <SEP> intramuskulär <SEP> > <SEP> 2000 <SEP> mg/kg
<tb> Lu50 <SEP> subkutan <SEP> > <SEP> 5000 <SEP> mg/kg
<tb> LD50 <SEP> intraperitoneal <SEP> 250 <SEP> mg/kg
<tb>
Pimaricin hat keine Reizwirkung auf die Haut und Schleimhäute.
Im reinen Zustand ist Pimaricin eine weisse, kristalline Verbindung von amphoterem Charakter, deren Salze auf übliche Weise erzeugt werden können. Es gibt mit FeClg keine Farbreaktion ; mit konzentrierter Phosphorsäure eine rosa, unstabile Färbung. Konzentrierte Salzsäure und Schwefelsäure ergeben eine blaue bzw. olivgrüne Verfärbung. Das Antibiotikum entfärbt Bromwasser. Diese Tatsache und das Infrarot- sowie das Ultraviolett-Spektrum (über die weiter unten berichtet wird) zeigten, dass Pimaricin ein sogenanntes Polyen-Antibiotikum Ist.
Die Löslichkeit in Wasser Ist sehr gering und beträgt 8 mg in 100 ml bei 200. In organischen Lösungmitteln, z. B. Alkoholen, Glykolen und Ketonen, Ist das Antibiotikum besser löslich, insbesondere in Alkoholen mit 1-6 Kohlenstoffatomen, z. B. In Methylalkohol und n-Butylalkohol und In den sogenannten cellosolves. Weiter ist es löslich in Pyridin, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Eisessig und Alkalihydroxyd. In aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wie Pentan, Hexan, Cyclohexan u. dgl. Ist die Substanz praktisch unlöslich.
Bei Raumtemperatur ist Pimaricin eine sehr stabile Verbindung. Eine Lösung in Wasser (5 mg in 100 ml) behält ihre volle Aktivität während 7 Tagen bei einem PH- Wert von 7 bei 25 . Bei PH 2 verliert die Lösung in drei Tagen bei dieser Temperatur 501o ihrer Aktivität. Bei PH 10 ist die Halbwertzeit bei 250 sechs Tage. Bei erhöhten Temperaturen ist die Lösung weniger stabil. Eine Lösung der angegebenen Konzentration von Pimaricin in Wasser vom PH 2 verliert bei 900 in 15 Minuten 90% ihrer Aktivität ; beim PH 6, 5 15"/0 und beim pu 9 501o der Aktivität. In methylalkoholischer Lösung ist Pimaricin bei höheren Temperaturen (25-60 ) beständig.
Die antibiotische Aktivität des Pimaricins wurde mikrobiologisch mit Saccharomyces cerevisiae-Holland-Stamm als Testorganismen im Vergleich zu einem reinen Standardpräparat geprüft.
Pimaricin weist keinen Schmelzpunkt auf, sondern beginnt sich bei etwa 1500 zu zersetzen. Die
EMI5.3
der Substanz ist etwa 727. Die vermutliche empirische Formel ist C33-uH. U-50 NOy. Die Elementaranalyse ergab folgende Werte : C 57,77%, H 7, 27%, N 19,95% und 0 (berechnet) 33. 01%.
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Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Pimaricin weist Maxima bei 290,304 und 318 mi mit einer Spitze bei etwa 280 und einem Minimum bei etwa 250 mll (C = 3, 93 y/ml in Methanol) auf.
EMI6.1
ist die Absorption stark bis sehr stark.)
Die Fig. l. zeigt eine graphische Darstellung des Infrarotspektrums von Pimaricin in einer Kaliumbromidplatte.
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rüstet mit Rühreinrichtungen, denen zur Belüftung steriler Sauerstoff oder sterile Luft während des Züchtens zugeführt werden kann, gezüchtet.
Die Dauer des Züchten, die Temperatur und die andern zu guten Ausbeuten von Pimaricin führenden Bedingungen sind leicht durch einfache Versuche zu bestimmen. Sie werden unten im einzelnen dargelegt.
Das Nährmedium kann aus den üblichen Stoffen bestehen ; es soll eine Kohlenstoffquelle und eine Quelle von fermentierbaren organischem und/oder anorganischem Stickstoff enthalten, wobei ferner vorzugsweise Mineralsalze, wie Phosphate, Kaliumsalze und Natriumsalze und Spuren verschiedener Metalle zugegen sind. Die in der Praxis verwendeten Ausgangsstoffe sind im übrigen oft hinreichend mit diesen Mineralsalzen verunreinigt, so dass sich eine besondere Zugabe erübrigt.
Als Kohlenstoffquelle können lösliche und unlösliche Kohlehydrate, z. B. Glukose, Saccharose, Laktose oder Stärke, verwendet werden. Zuckeralkohole, wie z. B. Glycerin, sind geeignet. Die Menge der Kohlenstoffquelle in dem Medium kann in weiten Grenzen variieren, abhängig von der Natur des verwendeten Kohlehydrats und von der übrigen Zusammensetzung des Mediums ; im allgemeinen beträgt sie zwischen 0, 5 und 5 Gew.- % des Mediums.
Als Stickstoffquelle kommt eine grosse Anzahl von Substanzen in Frage, erwähnt sei hydrolysiertes oder nichthydrolysiertes Kasein, Maische bzw. Getreidequellflüssigkeit, Pepton, Fleischextrakt, entfettete oder nichtentfettetes Soyamehl, Erdnussmehl, Fischmehl, Nitrate. Die Wahl der Stickstoffquelle hängt für gewöhnlich von der übrigen Zusammensetzung des Mediums ab, die ihrerseits derart gewählt wird, dass das Antibiotikum auf möglichst wirtschaftliche Weise hergestellt wird. In dieser Verbindung mag erwähnt werden, dass, geringe Mengen von stickstoffhaltigen Materialien, wie z. B. Hefeextrakt, Destillationslösungen, lösliche Fischsubstanzen usw., die Ausbeute an Pimaricin in bestimmten Medien beträchtlich erhöhen. Auch Lipoid-Substanzen, wie z.
B. fette Öle vegetabilischen und tierischen Ursprungs (z. B.
Soyaöl und Fischöl) vermögen die Ausbeute in einem wesentlichen Masse zu steigern.
Die Dauer der Fermentation hängt in hohem Masse von der Zusammensetzung des Nährmediums ab.
Für gewöhnlich variiert sie zwischen 48 und 120 Stunden, jedoch kann mit der Fermentierung auch während einer längeren Zeit fortgefahren werden, z. B. bis zu 14 Tagen, wenn die erhöhte Ausbeute an dem so erhaltenen Antibiotikum die grösseren Kosten einer längeren Fermentationsdauer rechtfertigt.
Die Temperatur der Fermentation kann zwischen 15 und 300 liegen ; bevorzugt sind Temperaturen von etwa 26 bis 280.
Mit dem optimalen Wachstum der Mikroorganismen und der Ausbeute von Pimaricin kann der pH-Wert variieren, insbesondere während der ersten Phase der Fermentation, z. B. zwischen 5 und 8. Nach dem Sterilisieren des Nährmediums wird der PH-Wert vorzugsweise auf zwischen 6 und 7 eingestellt. Die Fermentation wird vorzugsweise ausgeführt bei einem PH-Wert zwischen 6, 5 und 8, da in diesem Falle die höchsten Ausbeuten erhalten werden. Der pH-Wert kann während der Fermentation durch Zusetzen von Alkalihydroxyd oder Säure in regelmässigen Intervallen unter sterilen Bedingungen konstant gehalten werden. Üblicherweise jedoch wird Calciumcarbonat als eine Art Puffersubstanz in Mengen von 0,2 bis 1 Gew.-% des Mediums verwendet.
Die Menge der in das Medium während der Fermentierung unter sterilen Bedingungen eingeführten Luft hängt in hohem Masse von der Gestalt des Gefässes, der Geschwindigkeit und der Form des Rührers ab. Im allgemeinen variiert diese Menge zwischen 0, 1 und 4 1 pro Liter Nährmedium pro Minute.
Als Animpfungsmaterial in dem Hauptfermentierungsgefäss werden vorzugsweise 48-72 Stunden alte Vorkulturen von Streptomyces natalensis verwendet. Zur Erzielung guter Ausbeuten und zur Verhinderung von Schwankungen der Ergebnisse wird das Animpfen vorzugsweise mit Kulturmengen von 1 bis 7 Vol.-% des Nährmediums im Hauptfermentationsgefäss durchgeführt. Es leuchtet ein, dass bei grossen Fermentationsgefässen einige Portionen von Vorkulturen verwendet werden müssen. Es ist jedoch auch möglich,
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die Vorkultur als eine einzige Portion, z. B. in einer Menge von 10%, in das Hauptfermentationsgefäss zwecks Erzeugen einer neuen Kultur einzugeben. Die gesamte Fermentierung kann auch kontinuierlich durchgeführt werden.
Das Pimaricin kann aus der flüssigen Kultur auf verschiedene Weise gewonnen werden. Gemäss der Erfindung wird zur Gewinnung die Löslichkeit des Antibiotikums in organischen Lösungsmitteln ausgenutzt, die mit Wasser in einem beschränkten Masse mischbar sind, z. B. Butanol. Das Verfahren kann z. B. folgendermassen durchgeführt werden :
Nach Erhalten einer hinreichend aktiven Flüssigkeit wird sie auf einen PH-Wert von etwa 10 ein- gestellt, um die aktive Substanz aus dem sogenannten Myzel freizumachen, wonach es abfiltriert wird.
Die Flüssigkeit kann dann mit z. B. n-Butanol extrahiert werden bei einem PH-Wert zwischen 3 und 10.
Wird die Flüssigkeit angesäuert, so wird vorzugsweise mit Phosphorsäure gearbeitet ; etwa gebildete Aus- fällungen können entfernt und nötigenfalls ebenfalls extrahiert werden. Der n-Butanolextrakt wird durch azeotrope Destillation konzentriert ; die rohe aktive Substanz kristallisiert dabei. Dieselbe kann durch selektive Fällung, z. B. aus Eisessig, Pyridin, Dimethylformamid u. dgl., gereinigt werden. Bei Fermen- tierungen mit Ausbeuten über 700 y/ml kann die Ausbeute an Pimaricin sehr erheblich durch Extrahieren der Myzels erhöht werden. In dieser Beziehung ist die Verwendung von Methylalkohol, dessen Lösefähig- durch Zusatz von 1 bis 3% Calciumchlorid erhöht sein kann, als Extraktionsmittel von Vorteil.
Beispiel 1 : (Herstellung der Impfkultur) %. us einem Röhrchen mit einer Kultur von Streptomyces natalensis nov. spec. auf z. B. Hafermehl-
Agar, bei der eine gute Sporenbildung stattgefunden hat, werden kleine Mengen Conidium unter sterilen
Bedingungen in Schüttelflaschen von etwa 2 l Fassungsvermögen, in die 500 ml eines flüssigen Nähr- mediums eingefüllt sind, übertragen. Das Nährmedium besteht aus :
EMI7.1
<tb>
<tb> Pepton <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> auf <SEP> 50% <SEP> Trockensubstanz <SEP> eingedicktes <SEP> Maisquellwasser <SEP> O, <SEP> 6o. <SEP> to <SEP>
<tb> Glukose <SEP> 1, <SEP> 0%
<tb> Kochsalz <SEP> 1, <SEP> 0%
<tb> auf <SEP> pu <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> mit <SEP> Alkalihydroxyd <SEP> eingestellt.
<tb>
Nach der Inkubation unter dauerndem Schütteln bei 260 während 48 Stunden ist die Kultur für das Animpfen in dem Hauptfermentationsmedium fertig.
Beispiel 2 : (Herstellung der Kultur)
1 l der Animpfkultur, hergestellt gemäss Beispiel 1, wird unter sterilen Bedingungen in ein mit Rührer und Einblasvorrichtung für sterile Luft ausgerüstetes Fermentierungsgefäss, das 15 1 eines Kulturmediums folgender Zusammensetzung enthält, eingefüllt :
EMI7.2
<tb>
<tb> Glukose <SEP> 3, <SEP> a1o
<tb> auf <SEP> 50% <SEP> Trockensubstanz <SEP> eingedicktes <SEP> Maisquellwasser <SEP> 0, <SEP> 2% <SEP>
<tb> Ammonsulfat <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 0, <SEP> 4%
<tb> primäres <SEP> Kaliumphosphat <SEP> O, <SEP> O'2f1/o <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 8%
<tb>
DiesesKulturmedium wird mit Alkalihydroxyd auf einen PH-Wert von 6 bis 9 eingestellt.
Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden bei 270 unter dauernder Belüftung und dauerndem Rühren enthält die Kultur 610 y Pimaricin pro ml.
Andere Kulturmedien, mit denen Ausbeuten derselben Grössenordnung erhalten werden können, können die folgende Zusammensetzung haben :
EMI7.3
<tb>
<tb> A) <SEP> Erdnussmehl <SEP> 2 <SEP> %
<tb> Kartoffelstärke <SEP> 1 <SEP> %
<tb> auf <SEP> 50% <SEP> Trockensubstanz <SEP> eingedicktes <SEP> Maisquellwasser <SEP> 2 <SEP> %
<tb> Kochsalz <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 1%
<tb> primäres <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 0, <SEP> 05%
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0,6%
<tb> Kaliumhydroxyd <SEP> bis <SEP> pH <SEP> 6, <SEP> 5
<tb>
Mit diesem Medium wurden nach dem Animpfen mit 4% Animpfkultur nach 72 Stunden Inkubation und Belüftung bei 260 590 y Pimaricin pro ml Fermentationsflüssigkeit erhalten.
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EMI8.1
<tb>
<tb> B) <SEP> Zuckerrübenmelasse <SEP> (Zuckergehalt <SEP> etwa <SEP> 500/0) <SEP> 4 <SEP> 1
<tb> Laktose <SEP> 1 <SEP> %
<tb> eingedicktes <SEP> Maisquellwasser <SEP> 2 <SEP> %
<tb> Natriumsulfat <SEP> 10 <SEP> aq. <SEP> 0,1%
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> Kaliumhydroxyd <SEP> bis <SEP> PH'7, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Mit diesem Medium wurden nach dem Animpfen mit 5% Animpfkultur und 120 Stunden Inkubation und Belüftung bei 270 640 y Pimaricin pro ml Fermentationsflüssigkeit erhalten.
EMI8.2
<tb>
<tb> C) <SEP> Pepton <SEP> ("Difco") <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP>
<tb> Fleischextrakt <SEP> ("Difco") <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP>
<tb> Glukose
<tb> Kochsalz
<tb>
In diesem Medium bildeten sich nach Animpfen mit :
110 Animpfkultur und 148 Stunden Inkubation und Belüftung bei 260 535 y Pimaricin pro ml Fermentationsflüssigkeit.
EMI8.3
<tb>
<tb> D) <SEP> Soyamehl <SEP> (grob) <SEP> 5 <SEP> 0/0
<tb> Soyaöl <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> auf <SEP> 50% <SEP> Trockensubstanz <SEP> eingedicktes <SEP> Maisquellwasser <SEP> 0,'2fro
<tb> Glukose <SEP> 1 <SEP> 0/0
<tb> primäres <SEP> Kaliumphosphat <SEP> O, <SEP> O'2f1/o <SEP>
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 1 <SEP> 0/0
<tb>
Mit diesem Medium wurden nach dem Animpfen mit 3% Animpfkultur in einemlS 1-Fermentierungs-. gefäss und Inkubation und Belüftung während 168 Stunden bei 280 690 y Pimaricin pro ml Fermentierungsflüssigkeit gebildet.
Nach dem Behandeln des Myzels, das ausgepresst und in einer reichlichen Menge Wasser mit verdünntem Alkalihydroxyd vom pH-Wert 10 gerührt worden war, konnten in dem Filtrat des Myzels 20, 4 g Pimaricin festgestellt werden.
Beispiel 3 : (Isolierung des rohen Pimaricins)
4 1 der Kulturflüssigkeit wurden nach vollendeter Fermentierung-Gehalt an Pimaricin 590 y/ml- mit 10% igem Natriumhydroxyd auf PH 10 eingestellt, dann von dem Myzel durch Filtrieren mittels Kieselgur als Filtriermittel (2%) befreit. Das Filtrat der Kultur betrug 3, 71 ; die Aktivität betrug 570y/ml ; das Filtrat wurde mit Phosphorsäure zu PH 3 angesäuert. Dieses angesäuerte Filtrat wurde nacheinander mit 750, 350 bzw. 350 ml n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wurde dann dreimal mit je 120 ml einer 4%igen Boraxlösung und dann zweimal mit je 120 ml Wasser gewaschen.
Der Butanolextrakt enthielt dann 1400 y/ml. Nach dem azeotropischen Eindampfen auf 100 ml trennten sich 0, 64 g von nicht völlig reinem Pimaricin in kristallinem Zustand ab (Aktivität 900 y/mg). Aus dem Rest des Extraktes konnte eine Gesamtmenge von 1, 42 g unreinem Pimaricin durch weiteres Eindampfen (Aktivität 395 y/mg) erhalten werden. Die Ausbeute, bezogen auf die Gesamtaktivität der vollkommen fermentierten Flüssigkeit betrug 48,3%.
Beispiel 4 : (Isolierung von rohem Pimaricin)
15 1 einer Kulturflüssigkeit nach vollendeter Fermentierung, die 610 y/ml Pimaricin enthielt, wurde auf PH 10, 3 mit 35% igem Kaliumhydroxyd eingestellt und dann von dem Myzel mittels 50 g Hyflo als Filtriermittel befreit. Das Filtrat wurde dann mit Phosphorsäure auf PH 2, 8 angesäuert. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert, u. zw. mittels 10 g Hyflo. Die Fällung wurde dann eine halbe Stunde mit 100 ml n-Butanol gerührt. Nach dem Absetzen wurde der Butanolextrakt abgezogen und der Rückstand mit 100 ml Wasser gewaschen. Der gesamte Butanolextrakt wurde dreimal mit je 10 ml einer 4% eigen Boraxlösung und danach dreimal mit je 10 ml Wasser gewaschen. Er wurde dann im Vakuum bei 440 auf 40 ml eingedampft.
Nach dem Kühlen auf 0 , Absaugen und Trocknen wurden 0, 51 g mattgelbes, kristallines Pimaricin mit einer Aktivität von 850 y/mg erhalten. Das filtrierte Kulturfiltrat wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise weiterbehandelt. Erhalten wurden zwei Fraktionen : 3, 21 g (Aktivität 890 γ/mg) und 6, 8 g (Aktivität 223 y/mg). Die Gesamtausbeute betrug 51, 5%.
Beispiel 5 : (Isolierung von rohem Pimaricin)
10 1 eines vollständig fermentierten Kulturmediums (Aktivität 640 y/ml) wurden auf PH 10 mit 15%igem Kaliumhydroxyd eingestellt. Danach wurde das Myzel zentrifugiert ; das klare Zentrifugal wurde mit 10 n Salzsäure auf PH 6, 9 eingestellt. Danach wurde nacheinander mit 2000,1000 und 1000 ml Isoamylalkohol extrahiert. Die vereinigten Isoamylalkoholextrakte wurden nacheinander dreimal mit
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je 300 ml einer 4% gen Natriumcarbonatlösung und dann zweimal mit je 300 ml Wasser gewaschen. Der so behandelte Extrakt wurde azeotrop auf 100 ml eingedampft ; dabei trennten sich 2, 62 g eines mattgelben kristallinen Pimaricins mit einer Aktivität von 900 y /mg ab. Ausbeute 36, 8%.
Beispiel 6 : (Isolierung von rohem Pimaricin)
20 1 einer vollständig fermentierten Kultur von Akt. 700 y/ml wurden mit 20% gem Natriumhydroxyd auf PH 10 eingestellt. Das Myzel wurde danach mittels Hyflo (200 g) abfiltriert. Das klare Kulturfiltrat wurde nacheinander mit 4000,2000 und 1000 ml n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte wurden zweimal mit je 500 ml 4% iger Boraxlösung und dann zweimal mit je 500 ml Wasser gewaschen. Danach wurde der pH-Wert des Butanolextraktes mit lOn-Salzsäure auf 6, 8 eingestellt ; der Extrakt wurde azeotrop im Vakuum auf 250 ml eingedampft. Dabei trennten sich 9, 85 g mattgelben, kristallinen Pimaricins (Aktivität 913 y/mg) ab. Ausbeute 60, 80/o.
Beispiel 7 : (Isolierung von rohem Pimaricin aus Myzel)
15 l einer vollständig fermentierten Kultur von Streptomyces natalensis nov. spec. wurden mit Eisessig auf einen PH-Wert von 4, 1 eingestellt. Danach wurden 200 g Hyflo als Filtriermittel zugegeben, mit dem die Lösung gerührt wurde. Das Myzel wurde dann so trocken wie möglich ausgepresst bis zu einem Gesamtgewicht von 1700 g (1 g dieses Myzels wurde in diesem Zustand während einer Stunde mit 40 ml Methylalkohol extrahiert, um die Zahl der y Pimaricin zu bestimmen. Der Methanolextrakt wurde auf 100 ml aufgefüllt und spektrophotometrisch gemessen. Der Gehalt der Methanollösung an Pimaricin betrug 120 y/ml).
Der Pimaricingehalt des gesamten Myzels betrug 20, 4 g. Das abgepresste Myzel wurde während einer halben Stunde bei Raumtemperatur mit 8 l Methanol, in dem 21o Calciumchlorid gelöst waren,
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Wasser und Trocknen im Vakuum 14, 73 g wog und eine Aktivität von 900 y/mg besass (65% der theoretischen Ausbeute).
Beispiel 8 : (Reinigung von Pimaricin)
10 g unreines Pimaricin (Aktivität 890 y/mg) wurden unter gelindem Erwärmen in 80 ml Eisessig gelöst und dann so rasch wie möglich durch Filtrieren von ungelösten Verunreinigungen befreit. Das klare, gelbbraune Filtrat wurde mit 1500 ml Wasser verdünnt ; der PH-Wert dieser Lösung wurde mit 33% igem Natriumhydroxyd auf 6, 3 eingestellt. Nach dem Kühlen wurde die gebildete kristalline Fällung zentrifugiert und zweimal mit einer Gesamtmenge von 500 ml Wasser gewaschen und abgesaugt. Die kristalline Masse auf dem Filter wurde wieder mit 200 ml Wasser gewaschen, danach im Vakuum über Phosphorpentaoxyd getrocknet. Das Gewicht des so erhaltenen sehr blassgelben Produktes betrug 7, 07 g ; seine Aktivität betrug 960 y/mg.
Die oben mitgeteilte Behandlung wurde mit 60 ml Eisessig und 1000 ml Wasser wiederholt. Die Substanz wurde dreimal mit je 200 ml Wasser gewaschen. Das so erhaltene Produkt wog 5, 35 g und besass eine Aktivität von 995 y/mg. Gesamtausbeute : 59, 8%.
Beispiel 9 : (Reinigung von Pimaricin)
10 g unreines Pimaricin (Aktivität 890 y/mg) wurden unter gelindem Erwärmen in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wurde abfiltriert zur Entfernung ungelöster Verunreinigungen, das Filter wurde wieder mit 30 ml Dimethylformamid gewaschen. Zu dem braungefärbten klaren Filtrat wurden 250 ml Wasser zugegeben, wonach das Antibiotikum im kristallinen Zustand ausfiel. Das Produkt wurde abgesaugt, das Filter wieder mit 100 ml Wasser gewaschen. Die kristalline Masse wurde danach im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene Produkt wog 9, 24 g. Nach Wiederholung der oben beschriebenen Behandlung wurde schliesslich ein mattgelbes kristallines Produkt von einem Gewicht von 7, 9 g mit einer Aktivität von 985 y/mg erhalten. Gesamtausbeute : 87, 5%.
Beispiel 10 : (Herstellung des Natriumsalzes)
2, 5 g Pimaricin (Aktivität 985 y/mg) wurden unter mechanischem Rühren in 20 ml Methanol suspendiert. Danach wurden 0, 145 g Natriumhydroxyd, gelöst in 0, 3 ml Wasser, zu dieser Suspension zugegeben.
Das sich zunächst lösende Pimaricin kristallisierte nach wenigen Minuten als Natriumsalz aus. Nach weiteren 30 Minuten Rühren und 24stündigem Stehenlassen bei 00 wurde die kristalline Masse abgesaugt und mit 5 ml Äthylalkohol und 10 ml Diäthyläther gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum betrug das Gewicht des weissen, nadelförmig kristallinen Natriumsalzes 2, 16 g (Gehalt 995 y/mg = 87, 3% der berechneten Aktivität). Andere Salze können in entsprechender Weise hergestellt werden.
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Die obigen Beispiele veranschaulichen die Erfindung und zeigen bevorzugte Ausführungsbeispiele, jedoch können verschiedene Änderungen und Abwandlungen vorgenommen werden, ohne den Bereich der in den folgenden Ansprüchen definierten Erfindung zu verlassen.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung eines neuen Antibiotikums (Pimaricin) durch aerobe Züchtung neuer Streptomyces-Stämme in einer wässerigen Nährlösung, die anorganische Salze, Stickstoff- und Kohlenstoffverbindungen enthält, und darauf folgende Abtrennung der antibiotisch wirksamen Substanz aus dem Kulturfiltrat, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Streptomyces-Stamm, der unter der Bezeichnung "Streptomyces natalensis" beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn hinterlegt ist, aerob züchtet, u. zw. vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 5, 6 und 8 und einer Temperatur von etwa
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der fermentierten Flüssigkeit nach an sich bekannten Methoden isoliert.