-
Verfahren zur Herstellung eines antibiotisdi wirksamen Stoffes Es
wurde gefunden, daß man ein neues, hochwirksames Antibiotikum, welches wir Picromycin
genannt haben, erhält, wenn man auf geeigneten Nährniedien Actinomycetenstämme wachsen
läßt, welche einen Stoff mit folgenden Eigenschaften bilden: [a124 Fp. etwa 169
bis 170', D in Chloroform -5o', [a] 23 in Alkohol + 8', Stickstoffgehalt
etwa 3 0/0,
frei von Methoxyl.
-
Das Antibiotikum übt eine sehr starke Hemmungswirkung auf Staphylococcus
aureus und Bacillus substilis aus. Es ist in einer Verdünnung von i : i ooo
ooo noch wirksam.
-
Als geeignet zur Herstellung des neuen Wirksteffes wurde der Stamm
Actinomyces Bo io5 gefunden. Dieser Stamm wurde aus Brachlanderde isoliert, er wächst
unter aeroben Bedingungen bei einem Ternperaturoptimum von 27'. Er bildet
ein vegetatives Mycel ohne besonders charakteristische Merkmale. Das Luftmycel besteht
aus unverzweigten, dickeren Hyphen, die in rundlich ovale Sporen zerfallen. Bei
der Kultur von Gelatine wird die Gelatine verflüssigt. Das Wachstum des Stammes
ist sehr gering, feinkörnig, farblos an der Oberfläche der verflüssigten Gelatine.
Der Stamm bildet kein Luftmycel. Auf Agarkulturen, die mit synthetischen Nährlösungen
bereitet sind, wächst der Stamm sehr gut und bildet ein stark gekräuseltes, weiches,
bräunlichgelbes Mycel, jedoch nur -ein sehr geringes, grauweißes Luftmycel. Der
Agar selbst wird schwach bräunlich gefärbt. Auf Stärkeagar zeigt sich ein gutes,
sehr flaches, häutiges Wachstum. Auch hier ist das Mycel schwach bräunlich.
Die
Luftmycelbildung ist gering und sehr fein von bräunlich weißer Farbe. Stärkeagar
selbst wird schwach bräunlich gefärbt. Nach übergießen mit Lugolscher Lösung ergibt
sich eine große farblose Zone. Die Stärke wird h#drolysiert. Auf Glucoseagar wächst
der Stamm sehr gut, mit bräunlich-ern, weichem, stark gekräuseltem Mycel. Luftmycel
bildet sich auf diesem Luftboden nicht. Der Agar selbst wird bräunlich gefärbt.
Auf Lackmusmilch zeigt sich gutes Randwachstum, das Mycel ist bräunlich. Die Milch
wird durch alkalische Reaktion völlig blau. Kasei#n wird nicht ausgeflockt, sondern
die Milch wird völlig klar, woraus sich ergibt, daß dass Kasein abgebaut wird. Auf
Kartoffeln zeigt sich ein gutes, aber sehr feines Wachstum. Das Mycel ist weich,
leicht gekräuselt und farblos bis schwach bräunlich. Luftmycel wird nicht beobachtet.
Das Wachstum des Stammes in Celluloseagar ist stark gehemmt. Es bilden sich große,
hauchfeine Kolonien und kein Luftmycel. Die Cellulose wird nicht abgebaut. In Cellulosebrühe
wird kein sichtbares Wachstum beobachtet. Die Kulturflüssigkeit reduziert Nitrate
nicht. Schwefelwasserstoffbildung tritt nicht auf. Das Kulturfiltrat dieses Mikro#-organismus
hemmt Staphylococcus aureus und Bar-illus subtilis und ist praktisch nicht verfärbt.
Die Aufarbeitung des Kulturfiltrates erfolgt durch Abdampfen der Flüssigkeit bei
niederer Temperatur, Einstellen auf ein alkalisches pli und Ausäthern des hasischen
Antibiotikums. Aus der ätherischen Lösung wird das Antibiotikum mit Säure ausgeschüttelt,
wobei es ein Salz bildet, welches in Wasser löslich ist. Nachdem diese Operation
mehrmals wiederholt wurde, wird aus der ätherischen Lösung das Antibiotikum zweckmäßig
als Salz gefällt, gegebenenfalls aus dem Salz nach üblichem Verfahren das freie
Picromycin gewonnen und aus Methanol umkristallisiert. Dieses hat nach unseren Messungen
folgende Konstanten: Der korrigierte Schmelzpunkt liegt nach dem Trocknen an der
Luft bei 169 bis 170", [a]'4 in Chloroform -50,2',
D
[a123 Alkohol
+ 8,2'. Def Stickstoffgehalt be-D trägt 2,940/0, Methoxylgruppen sind nicht
vorhanden. Die Molekulargewichtsbestimmung nach Rast im Kampher ergibt einen Wert
von 46o bis 470. Bei der Zinkstaubdestillation tritt ein Geruch nach Aminen auf.
In konzentrierter Schwefelsäure löst sich das Picromycin mit orangeroter Farbe.
Beim Verdünnen mit Wasser verschwindet die Farbe wieder, und es fällt ein flockiger
Niederschlag aus. Picronlycin-schn-leckt bitter.
-
An Stelle des oben kurz beschriebenen Aufarbeitungsverfahrens kann
die Reinigung des Picromycins auch in an sich bekannter Wei6e durch Adsorptionsverfahren
durchgeführt werden. Auch durch Anlagerung an Basenaustauscher kann das Picromycin
angereichert werden. ,Beispiel i. Stammkultur Der Stamm Actinomyces Bo io5 wird
auf einem Nährboden gezüchtet, der außer der unten beschriebenen Nährlösung 68 3%
Agar enthält. 2. Vorkultur Für die Vorkultur werden 300 ccm Erlenmeyer mit
je 5o ccm Nährlösung 68 beschickt, sterilisiert und mit Impfmaterial,
das von der Stammkultur gewonnen wurde, beimpft. Die Kölbchen werden etwa
5 Tage bei 3o' auf einer Schüttelmaschine geschüttelt, wobei sich das Mycel
vermehrt. Die Nährlösung hemmt das Wachstum von Staphylococcus aureus in einer Verdünnung
von i :5o bis 1 : 100.
3. Hauptansatz (Nährlösung 68)
Leitungswasser
5oo kg, Glycerin io kg, GlykokOll 0,75 kg, Maisquellwasser
i kg, Kaliumphosphat sek. 0,75 kg, Natriumchlori-d o,5 kg,
Magnesiumsulfat 25 g, Ferrosulfat 5 9, Calciumcarbonat gefällt
5 g.
-
Die Nährlösung wird in einern iooo-I-Kessel, der mit einer Rührvorrichtung
und einer Belüftungsvorrichtung versehen ist, i Stunde bei 120' sterilisiert. Dann
wird der Kessel auf 3o' heruntergekühlt und unter sterilen Bedingungen mit etwa
1 1 der obigen Vorkultur beimpft. Dann wird der Hauptansatz unter Rühren
und Belüften 6 bis 8 Tage bei 29 bis 3o1, bebrütet. Der Luftdurchsatz
beträgt im Anfang 5001 je Minute, bei starkem Schäumen wird die Belüf tung
schwächer eingestellt oder ein Antischaummittel zugegeben. Das PH der Nährlösung
ist im Anfang 6,8 bis 7,2;
es steigt während der Bebrütung auf 7,4
bis 8,1 an. Die schon vor dem Beimpfen schwachbräunlich gefärbte Nährlösung ändert
sich beim Wachstum der eingeimpften Mikroorganismen in ihrer Färbung praktisch nicht,
die Kulturflüssigkeit trübt sich durch die wachsenden Mikroorganismen. Das Kulturfiltrat
hemmt Staphylococcus aur#eus und Bacillus subtilis in Verdünnungen von i
: ioo bis i : -2oo. 4. Aufarbeitung des Kulturfiltrats Nach Beendigung
des Pilzwachsturns wird die aus dem Submerskessel abgezogene Flüssigkeit zweckmäßigerweise
über eine Absetzschleuder von dem ausgeschiedenen Pilzmycel befreit. Das Mycel wiegt
im feuchten Zustande etwa io kg und im lufttrockenen Zustande etwa 2
kg. Für die Aufarbeitung des geklärten Kulturfiltrats ergeben sich verschiedene
Möglichkeiten: a) Zunächst wird das Kulturfiltrat unter vermindertem Druck und bei
niederer Temperatur auf 1/2o seines Volumens eingeengt. Das so gewonnene Konzentrat
wird mit verdünnter Natronlauge auf pH 8,o eingestellt und mit Äther ausgerührt,
wobei das Antibiotikum in den Äther übergeht. Der Äther wird sodann mit n-ioo-Salzsäure
ausgeschüttelt, wobei sich das Antibiotikum in dem säurehaltigen Wasser löst. Alsdann
wird die saure Lösung nochmals auf pH o,8 eingestellt und wieder mit Äther ausgeschüttelt.
Dieser Vorgang wird noch einige Male wiederholt, dann wird der Äther verdampft und
der trockene Ätherrückstand in absolutem Äther aufgenommen. Beim Einleiten von gasförmigern
Chlorwasserstoff fällt das Hydrochlorid des
Antibiotikums aus und
wird nach dem Abfiltrieren in absolutem Äther gewaschen. Das so erhaltene Hydrochlorid
wird in Wasser gelöst, die Lösung mit 2 n-Natriumcarbonatlöstrng alkalisch gemacht
und ausgeäthert. Beim Verdampfen des Äthers, der nicht besonders getrocknet zu werden
braucht, scheidet sich das Picromycin in farblosen Kristallen ab.
-
b) Man kann auch so aufarbeiten, daß man das zentrifugierte
Kulturfiltrat zunächst mit Äthylacelat oder Amylacetat extrahiert und auf die Verdampfungsrückstände
dieser Lösungen den für das Konzentrat der Kulturflüssigkeit unter a) beschriebenen
Reinigungsgang anwendet.
-
c) Ein dritter Weg, das Kulturfiltrat aufzuarbeiten, ist dadurch gekennzeichnet,
daß man das Kulturfiltrat einengt und das so gewonnene Konzentrat, das durch noch
vorhandenes Mycel, abgeschiedenes Eiweiß und undefinierbare Trubstoffe stark viskos
geworden ist, mit starkem Alkohol behandelt und dabei eine gut filtrierbare Lösung
erhält, die sich von unwirksamen Nebenprodukten durch Abfiltriercn leicht befreien
läßt. Das alkoholische Filtrat wird eingeengt und liefert einen blanken Sirup, der
wie unter a) nach dem Alkalisieren mit Äther aufgearbeitet wird.
-
Die Ausbeute an Picromycin beträgt bei 5oo 1
Nährlösung etwa
25 g.