Verfahren zur Herstellung von Erythromycin Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung eines neuen Antibiotikums, das als Erythromycin be zeichnet werden soll.
Dieses Verfahren ist da durch gekennzeichnet, dass man einen diesen Stoff erzeugenden Stamm von Streptomyces erythreus in einem Kulturmedium, das assi- milierbare Kohlenhydrate, assimilierba.ren Stickstoff und anorganische Nährsalze ent hält, kultiviert und das gebildete Erythromy- cin aus dem Kulturmedium isoliert..
Das Erythromycin, eine Stickstoffbase, sowie auch seine Salze mit Säuren sind durch eine beträchtliche antibakterielle Wirkungs breite ausgezeichnet. Sie besitzen eine anti biotische Aktivität gegenüber vielen Mikro organismen, und zwar sowohl Gram-positiven als auch Gram-negativen. Eine weitere wich tige antibiotische Eigenschaft der neuen Verbindung und ihrer Salze liegt in ihrer Fähigkeit, das Wachstum und die Entwick lung gewisser Rickettsien und grosser Viren, z. B. des epidemischen Typhus und der Me- ningopneumonie, sowie einiger Spirochäten wirksam zu unterbinden.
Die antibiotischen Eigenschaften von Erythromycin im Verein mit seiner geringen Giftigkeit machen es zu einem wertvollen Heilmittel. Die antibiotische Aktivität des Erythro- mycins gegenüber Testorganismen wird in Tabelle I gezeigt. Die antibiotischen Aktivi täten wurden entweder mit dem Agarverdün- nungs- oder Bouillonverdünnungstest be stimmt.
Im ersteren Test wurden die Test organismen auf einer Reihe von Agarplatten ausgestrichen, die verschiedene Konzentratio nen des Antibiotikums enthielten, um die Mindestkonzentration des Erythromycins in y (Mikrogramm) pro cm3 Substrat zu bestim men, die das Wachstum über einen Zeitraum von 40 Stunden hemmt. Im letzteren Test wurden die Testorganismen in Nährbouillon mit verschiedenen Mengen Erythromycin auf gezogen. Die Anwesenheit von etwa 10 Pferdeserum im Medium hatte keine wahr nehmbare Wirkung auf die antibakterielle Aktivität des Antibiotikums.
In der Tabelle bedeuten die Buchstaben (a.) und (b) nach der hemmenden Konzen tration die Testmethode (Agarverdünnungs- test bzw. Bouillonverdünnungstest). Die Ery- thromycinsalze besitzen antibiotische Aktivi täten, die den in der Tabelle angegebenen Werten entsprechen, wenn man die erhöhten Molekulargewichte der Salze berücksichtigt.
EMI0002.0001
<I>Tabelle <SEP> I <SEP> -</I>
<tb> Hemmende
<tb> Testorganismus <SEP> Konzentration
<tb> <U>(7lcm$)</U>
<tb> Mierococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,8 <SEP> (a)
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> (penicillinresistent) <SEP> . <SEP> 0,4 <SEP> (a)
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> (streptomycinresistent) <SEP> 0,8 <SEP> (a)
<tb> Listeria <SEP> monocytogenes <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,31 <SEP> (b)
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> (a.)
<tb> Vibrio <SEP> Cholera <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,63 <SEP> (b)
<tb> Mycobacterium <SEP> sp. <SEP> (607) <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,2 <SEP> (a)
<tb> Mycobaeterium <SEP> phlei <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,8 <SEP> (a)
<tb> Haemophilus <SEP> pertussis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,31 <SEP> (b)
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,6 <SEP> (a)
<tb> Mycobaeterium <SEP> smegmatis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 6,2 <SEP> (a)
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,2 <SEP> (a)
<tb> Brucella <SEP> melitensis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,56 <SEP> (b)
<tb> Brucella <SEP> suis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,56 <SEP> (b)
<tb> Neisseria <SEP> intracellularis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5,0 <SEP> (b)
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> (sulfaresistenter <SEP> Stamm) <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,02
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> 0,02 <SEP> (b)
<tb> Haemophilus <SEP> influenzae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,25 <SEP> (b)
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,16 <SEP> (b)
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,02 <SEP> (b)
<tb> Vibrio <SEP> comma <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 6,25 <SEP> (b) Die im folgenden beschriebenen Versuche wurden ausschliesslich mit einem bestimmten Stamm von Streptomy Ces erythreus durch geführt. Streptomy Ces ery threus gehört zu der Gruppe der Actino@myeetales, gemäss der Klassifizierung in Bergeys Manual of Deter- minative Bacteriology (6th edition), Seite 938.
In seinen morphologischenKennzeichenscheint der in Frage stehende Stamm nahe verwandt zu sein mit dem von Waksma.n zuerst als Actinomyces 161 [Soil Sci.ence 8, 71-214 (1919] und später als S.treptomyces ery- threus bezeichneten Mikroorganismus.
Wie hier später noch erläutert werden wird, bestehen gewisse Unterschiede zwischen den Eigen schaften der Kulturen des von Waksman be schriebenen Organismus und denen des hier verwendeten, Erythromycin bildenden Orga nismus, so dass die Richtigkeit der Bezeieli- nung Streptomyces erythreus unter Um ständen bezweifelt werden kann.
Jedenfalls wird der in Frage stehende neue Organismus einstweilen als Streptomyces erythreus, Stamm M5-12559, bezeichnet.
Der Mikroorganismus wurde aus einer aus Iloilo City, Iloilo, Phillippinen, erhaltenen Bodenprobe isoliert, wobei folgendes Isolier- verfahren angewandt wurde: Eine Probe des Bodens wurde in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, die, Suspension stark ver dünnt und eine kleine Probe hiervon auf Nähragar plattiert. Die Platte wurde bei etwa 30 C eine "#%Toche bebrütet.
Die winzi gen, harten, zerstreuten Kolonien von Strepto- myces ery threus wurden mit einer Platinöse abgenommen und zur Impfung von Agarböden benutzt, um grössere Mengen des Organismus zu erzeugen.
An sich können natürlich auch andere erythromycinerzeugende Stämme von Strepto- myces erythreus angewendet werden, die durch Routineisolierungs- und Stammodifi- kationsmethoden leicht gewonnen werden kön nen, wobei man eine Selektionszüchtung oder eine Behandlung mit mutierenden Mitteln, z. B. Röntgenstrahlen, ultraviolettem Licht und chemischen Mitteln, wie Stickstofflost- verbindungen, vornehmen kann.
Beispiele für andere erythromycinerzeugende Stämme sind Streptomyces erythreus, Stamm M5-14641, M5-14642 und M5-14643. Die Nummern M5-12559, M5-14641, M5-14642 und M5-14643 der Stämme von Streptomyces erythreus wurden bei der Kulturensammlung der Northern Regional Research Labora.to- ries, Peoria. (Illinois),
hinterlegt und erhiel ten in dieser Sammlung die Nummern NRRL 2338, NRRL 2359, NRRL 2360 und NRRL 2361.
Zur Charakterisierung von Streptomyees erythreus, Stamm M5-12559, wurden zahl reiche physikalische, züchterische und physio logische Teste durchgeführt, worüber in den folgenden Abschnitten berichtet. wird. Die Farben sind meistens nach dem System von Ridgway, Color Standards and Nomenclature (1912), bezeichnet; bei Bezeichnungen nach diesem System werden die Anfangsbuchstaben gross geschrieben.
Beim Wachsen auf Nähragar bildet Strep- tomyces erythreus ein verzweigtes 3lyceliiim mit Sporenreihen in geraden oder unregel mässig sich windenden Ketten, die aber . im allgemeinen nicht ausgesprochen spiralförmig angeordnet sind. Das Wachstum ist ausge sprochen langsam und kärglich, wobei das Ausmass des vegetativen und des Reihen- Wachstums mit. dem jeweils benutzten Nähr medium variiert.
Auf einfachen synthetischen Aga.rmedien entwickelt sich das vegetative Mycelium be sonders kärglich und flach. Das Luftmycelium ist, staubig weiss und in mässiger Menge vor handen. Mit reifender Kultur wird das in Luft wachsende 1Iycel blass rosafarben. Es bildet sieh ein lösliches, Russet-Vinaceous - Pigment, das mit älter werdender Kultur nachdunkelt.
Wenn der Organismus auf Agarmedien gezüchtet wird, die komplexe Stickstoff quellen enthalten, ist das vegetative Myeeliuin im Verhältnis reichlicher vorhanden als das an der Luft gewachsene. Das vegetative Wachstum wird charakteristisch verstärkt und neigt dazu, in das Agar einzudringen. Das Luftmycel in solchen Kulturen ist im allgemeinen dünn zerstreut und. weiss. Ausser dem löslichen Russet-Vinaeeous -Pigment wird ein gewisses braunes Pigment auf vielen komplexen Medien gebildet.
Der Organismus ist physiologisch sehr aktiv. Stärke und Gelatine werden leicht hy- drolysiert, Casein jedoch in La,ckmusmilchkul- turen nicht angegriffen. Die meisten gewöhn lichen Kohlenstoffquellen sind für das Wachs tum gut verwendbar. Temperaturen von etwa 30-37 C scheinen für das Wachstum und die Sporenbildung optimal zu sein.
<I>Mikroskopische</I> illorphologie Morphologie von Streptomyces erythreus, Stamm M5--12559, beim Wachstum auf syn thetischem Agar und Calciummalat-Agar: Synthetisches Agar Hier entsteht ein mässig verzweigtes Luft- mycelium, bei dem die Sporen auf den Koni- diophoren in Form von kurzen, geraden oder unregelmässig sich windenden und biegenden Ketten, aber nicht in typischen Spiralen ent stehen.
Die Sporen sind eiförmig und etwa 0,5 X 0,8,u bis 0,8 X 1,0 ,,c gross. Die Farb- reaktion nach Gram ist positiv.
Calciummalat-Agar Die beobachtete mikroskopische Morpho logie ist die gleiche wie bei dem auf synthe tischem Aga.r gezüchteten Organismus, nur sind die Sporenketten in noch stärkerem Masse haken- und schlangenförmig, wenn auch nicht regelmässig spiralig.
Züchterische ?Merkmale Synthetisches Agar Mässiges vegetatives Wachstum, schwach cremefarben, durch die starke Farbe des lösli- chen Pigmentes dunkler werdend; beschränk tes Wachstum des weissen Luftmycels, das mit reifer werdender Kultur eine Pale Vina- ceous-Fa\vn -Fä.rbung annimmt; mikrosko pisch wird mässige Sporenbildung beobachtet.;
die Erzeugung des löslichen Pigmentes ist ausgesprochener als auf andern Medien; die Russet: Vinaceous -Färbung in jungen Kul turen wird später Dark Vinaceous-Brown und nach langer Impfung fast. schwarz; die Kolonien messen 4-6 mm im Durchmesser bei erhöhten Zentren -und flachen, welligen Rändern; das Luftmycelium ist dünn, weit und fadenförmig.
Glucose--4sparagin- < lgar Kärgliches farbloses vegetatives Wachs tum mit schwachem Wachstum von weissem bis Light. Pinkish-Cinnamon -Luftmyce- lium, das sich nur nach langer Bebrütung bil dete; bei mikrosko:pisehen Beobachtungen spärliche Sporenbildung; etwas lösliches, Light Oehraceous-Salmon -Pigment; Kolo nien mit 2-3 mm Durchmesser, unregel mässig konvex mit . welligem oder unversehr tem Rand;
Oberfläche glatt oder runzelig, voa pulverartiger Beschaffenheit. Eme-rsons Agar Gutes vegetatives Wachstum, schwach cremefarben, nach 14tägiger Impfung Cames Brown , nach 28 Tagen Hays Russet , dünnes Wachstum des weissen Luftmy celiums; starkes, lösliches Hazel -farbenes Pigment; Kolonien mit 3-5 mm Durchmesser mit. runz liger und zusammengerollter Oberfläche, er höhten oder eingesunkenen Zentren und un regelmässig welligen Rändern;
die Morpholo- gYie der einzelnen Kolonien ist verschieden artig , bei einzelnen fehlt das Luftmyeelium, während andere mit einer pulverartigen Sporenkruste bedeckt. sind.
Calciitmmalat < 4gtti- Kärgliches, farbloses vegetatives Wa.chs- tiim mit wenig Pale Pinkish-Cinna.mon - Luftmyceliiun; bei mikroskopischer Beobach tung geringe Sporenbildung; lösliches Russet- Vinaeeoits -Pigment, das nach verlängerter Bebrütung Army Brown nachdunkelt;
Ko lonien mit 1-3 mm Durchmesser mit erhöh ten Zentren und fadenförmigen Rändern; die Oberfläche der Sporenkruste ist von feiner, pulverförmiger Beschaffenheit; mikroskopisch kleiner Kornkreis von sehr kärglichem Luft wachstum ganz an der Aussenseite der Ko lonie.
Gliccose-Agar Mässiges vegetatives Wachstum, schwach Deep Olive Buff über Roods Brown nach Tawny wechselnd; Luftmycelium in der Menge mässig; weisses, lösliches Roods Brown -Pigment, das dem auf Emersons Agar gebildeten ähnelte, aber schwächer war;
Kolonien mit \?--4 mm Durchmesser, erhöht, unregelmässig zusammengerollt, mit welligem Rand; Oberfläche pulverförmig.
Nähragar Kärgliches vegetatives Mycelium, schwach Chamois ; mässig weisses Luftmycelium, ohne lösliches Pigment; Kolonien klein, be schränkt, 2-3 mm im Durchmesser, unregel mässig konvex mit, ganzem Rand und pulver förmiger Oberfläche. Grössere Kolonien haben oft in der Mitte eine sternförmige Einsen kung.
<I>Kartoffelpfropf</I> Reichliches vegetatives l@Zycelium mit reich liehem Drab-Gray -Luftmycelium unter Bil dung eines Pfropfes, der an der Spitze fast schwarz war und zur Grundfläehe hin all mählich in Braun und Rötlichbraun überging. <I>Gelatine</I> Mässiges weisses Wachstum in Kolonien mit in 14 Tagen fast vollständiger und in 20 Tagen bei @25 C vollständiger Hydrolyse; hell braunes, lösliches Pigment.
Glucosebouillon Schweres Wachstumshäutchen mit spät sich bildendem, mässigem, weissem Luftmyce- lium; lösliches, ungefähr Ocher Red -Pig- ment. Nährbouillon Spärliches Wachstum, das die Form eini ger weniger schwimmender Kolonien an nimmt, einige davon mit weissem Luftmyce- lium; wenig tropfenförmiges Sediment und kein lösliches Piment.
<I>Physiologische Merkmale</I> Lackmusmilch In Lackmusmilch ist das Wachstum bei 30 C spärlich, es erscheint nur in einem Ring an der Wand der Röhre. Hydrolyse oder Peptisierung findet nicht statt, aber es ent wickelt sieh langsam eine alkalische Reaktion (14 Tage).
Bei 37 C ist das Wachsdun ähnlich dem bei 30 C, nur sind Wachstum und übergänge weniger deutlich.
EMI0005.0015
<I>Verwertung <SEP> von <SEP> Kohlenstoffquellen</I>
<tb> a) <SEP> gut <SEP> verwertbar:
<tb> 1.j <SEP> (+ <SEP> )-Arabinose <SEP> D <SEP> (+ <SEP> )-Raffinose <SEP> Stärke
<tb> L(+)-Rhamnose <SEP> Inulin <SEP> Na.triumacetat
<tb> D <SEP> (-)-Fructose <SEP> Mannit <SEP> Natriumcitrat
<tb> D <SEP> (+ <SEP> )-Galaktose <SEP> D <SEP> (-) <SEP> -Sorbit <SEP> Natriummalat
<tb> D <SEP> (-) <SEP> -Glucase <SEP> Mesoinosit <SEP> Natriumsuceinat
<tb> D(+)-Maltose <SEP> Dextrin <SEP> Asparagin
<tb> Sa.ccharose
<tb> b) <SEP> schlecht <SEP> verwertbar:
<SEP> c) <SEP> wenig <SEP> oder <SEP> gar <SEP> nicht <SEP> verwertbar:
<tb> D <SEP> (+) <SEP> -Xylose <SEP> und <SEP> Salicin. <SEP> . <SEP> D <SEP> (+) <SEP> -Lactose, <SEP> Dulcit, <SEP> Natriumformiat,
<tb> Natriumtartrat. Verwertung <I>von</I> anorganischen <I>Stickstoffquellen</I> a) gut verwertbar: Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat. b) Natriumnitrit ist nicht verwertbar. Selbstverständlich sind die obigen Teste bezüglich der Verwertung von Energiequellen unter besonderen Wachstumsbedingungen ausgeführt worden.
Wenn die Aktinomycete Pyrosinbouillon Spärliches, flockiges Wachstum unter der Oberfläche mit Spuren von tropfenförmigem Wachstum an der Oberfläche und keinem löslichen Pigment. Stärkeagar Die Stärke wird stark hydrolysiert.
Cellulose <I>(Filterpapierstreifen)</I> Weder bei Ammonium- noch bei Nitrat Ionen als Stickstoffquelle findet Wachstum statt.
Die folgenden Kohlenstoff- und Stickstoff Verwertungsteste wurden nach einer Methode ausgeführt, die Pridham und Gottlieb, J. Bac- teriology 56, 107.-144 (1948), beschrieben haben. gewisse Energiequellen unter den Testbedin gungen nicht verwertet hat, schliesst dies nicht aus, da.ss diese Energiequellen unter andern Bedingungen verwertet werden.
Tabelle II zeigt einige Unterschiede zwi schen Aetinomyces 161, den Waksman be schrieb, und Streptomyces erythreus, Stamm M5-12559.
EMI0006.0001
<I>Tabelle <SEP> 1-I</I>
<tb> Medium <SEP> M5-12559 <SEP> Actinomyces <SEP> 161
<tb> <I>Mikroskopische <SEP> Morphologie</I>
<tb> Mässige <SEP> Anzahl <SEP> von <SEP> Sporen., <SEP> die <SEP> auf <SEP> den <SEP> Zahlreiche <SEP> offene <SEP> Spiralen
<tb> Konidiophoren <SEP> in <SEP> Form <SEP> von <SEP> kurzen, <SEP> ge raden <SEP> oder <SEP> unregelmässig <SEP> sich <SEP> biegenden
<tb> oder <SEP> windenden <SEP> Ketten, <SEP> nicht <SEP> in <SEP> typi schen <SEP> Spiralen <SEP> (14 <SEP> Tage), <SEP> entstehen.
<tb> <I>Ziichtungsme-rkmale</I>
<tb> Synthetisches <SEP> 1NIässiges <SEP> bis <SEP> gutes <SEP> vegetatives <SEP> und <SEP> Luft- <SEP> Vegetatives <SEP> Wachstum, <SEP> sich <SEP> ver Igar <SEP> wachstum.
<SEP> Luftmycelium <SEP> weiss, <SEP> mit <SEP> der <SEP> breitend <SEP> und <SEP> tief <SEP> in <SEP> das <SEP> Medium
<tb> Reifung <SEP> teilweise <SEP> rosafarben <SEP> werdend; <SEP> hinein <SEP> entwickelnd. <SEP> Luftmyce die <SEP> Farbe <SEP> reicht <SEP> anscheinend. <SEP> von <SEP> Pate <SEP> lium <SEP> dick, <SEP> fest, <SEP> weiss. <SEP> Lösliches
<tb> Vinaceous <SEP> Fawn <SEP> bis <SEP> Light <SEP> Ochraceous <SEP> Pigment, <SEP> Pomegranate-Purple ,
<tb> Sa.lmon . <SEP> Bei <SEP> langer <SEP> Bebrütung <SEP> wird <SEP> später <SEP> in <SEP> Bordeaux <SEP> überwech das <SEP> lösliche <SEP> Russet-Vinaceous -Piainent <SEP> selnd. <SEP> Bei <SEP> wiederholten <SEP> Über <SEP> Dark <SEP> Vina.ceous-brown <SEP> <SEP> oder <SEP> fast <SEP> gängen <SEP> wird <SEP> das <SEP> Pigment <SEP> wein schwarz.
<SEP> farben.
<tb> Gelatine <SEP> Kärglich <SEP> braunes <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> Kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Calciummalat- <SEP> Lösliches., <SEP> Russet <SEP> - <SEP> Vinaceous <SEP> - <SEP> Pigment, <SEP> Kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Agar <SEP> das <SEP> bei <SEP> langer <SEP> Bebrütung <SEP> Army <SEP> Brown
<tb> wird.
<tb> Lackmusmilch <SEP> Spärliches <SEP> Wachstum; <SEP> keine <SEP> Hydrolyse <SEP> Wachstum <SEP> in <SEP> der <SEP> gelblichen
<tb> oder <SEP> Peptisierung. <SEP> Langsame <SEP> Entwick- <SEP> Oberflächenzone; <SEP> sehr <SEP> langsame
<tb> hing <SEP> einer <SEP> alkalischen <SEP> Reaktion. <SEP> Koagulation <SEP> (in <SEP> 50 <SEP> Tagen <SEP> nicht
<tb> -vollständig).
Zur Kultivierung von Streptomyees ery- threus, Stamm M5-12559, können recht ver schieden zusammengesetzte Nährmedien Ver wendung finden. Aus Gründen der Wirt schaftlichkeit, der Höchstausbeute an Anti biotikum und der Leichtigkeit der Isolierung des Erythromycins verdienen gewisse Kultur medien den Vorzug. Als Kohlenhydrate kom men vor allem Stärke und Glucose in Be tracht, dann aber auch Saccharose, Dextrin, Melasse und dergleichen.
Besonders geeignete Stickstoffquellen sind Maisweichwasser, Soja bohnengrob- oder -feinmehl und lösliche Brauereirückstände, ferner auch Casein, _'NIi- schungen von Aminosäuren, Peptone (Fleisch- oder Soja.peptone) und dergleichen. Auch anorganische Stickstoffquellen, wie z. B. Ni- trate oder Ammoniumsalze, können verwendet werden.
Als anorganische Nährsalze kommen die gewöhnlichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid-, Sulfat- und dergleichen -Ionen zu liefern vermögen, in Betracht.
Wie zum Wachstum und zur Entwicklung anderer Mikroorganismen erforderlich, soll ten auch für das Wachstum der in der in Be tracht stehenden Aktinomycetes Spurenele mente in das Kulturmedium gegeben werden. Solche Spurenelemente gelangen gewöhnlich in genügender Menge als Verunreinigungen mit den andern Bestandteilen, die dem Me dium zugesetzt werden, in das Nährmedium. Um Höchstwachstum und -entwicklung des Streptomyces erythreus, Stamm M5-12559, zu erreichen, wird das Kulturmedium vor der Beimpfung mit dem Organismus auf ein pH zwischen 6,0 und 7,5, vorzugsweise auf etwa 6,5, eingestellt..
Es wurde beobachtet, dass das Medium während der Wachstumsperiode des Organismus und er Erzeugung des Anti biotikums allmählich alkalisch wird und eine Alkalitä,t von etwa. pH 7,2-8,5 oder darüber erreicht, wobei das endgültige pi, wenigstens zum Teil vom Anfangs-pH des Mediums, den im Medium anwesenden Puffersubstanzen und der Dauer der Kultur abhängt.
Wie bei der Erzeugung anderer Anti biotika in grossen Mengen bevorzugt man aerobe Kulturen unter der Oberfläche. Zur Herstellung begrenzter Mengen können auch Schüttelkolben- und Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden. Ferner bevor zugt man, wie geit bekannt ist, bei Kultivie rung in grossen Tanks die Verwendung der vegetativen Form des Organismus zur Be- impfung der Erzeugertanks, um eine Ver7ö- gerung der Erzeugung des Antibiotikums und die damit zusammenhängende mangelhafte Ausnutzung der Anlage zu vermeiden.
Es ist demgemäss zweckmässig, zuerst einen vegeta tiven Impfkeim des Organismus herzustellen, indem man eine verhältnismässig kleine 1VIenge des Kulturmediums mit. der Sporenform des Organismus impft, und dann den aktiven vegetativen Impfkeim aseptisch in die grossen Tanks überzuführen. Das zur Erzeugung des vegetativen Impfkeims dienende Medium kann das gleiche oder aber auch ein anderes Medium sein als das zur Erzeugung -des Anti biotikums benutzte.
Streptomyces erythreus, Stamml115-12559, wächst gut bei Temperaturen zwischen etwa. 25 und 37 C. Die Höchstausbeute scheint sieh bei 26-30 C zu ergeben.
Wie gewöhnlich bei der Erzeugung von Antibiotika durch Kultur unter der Ober fläche wird zweckmässig sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Ein gutes Wachstum des Organismus und eine gute Er- zeugung :
des Antibiotikums wird erreicht, wenn das bei der Tankerzeugung von Erythro- mycin verwendete Luftvolumen ansteigend bis zu 0,1 Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kulturmedium beträgt,. Noch besse res Wachstum des Organismus und eine noch höhere Erzeugung an Antibiotikum wird er reicht, wenn das Luftvolumen wenigstens 0,4 Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kul turbrühe ausmacht.
Die Geschwindigkeit der Erzeugung des Antibiotikums und die Konzentration der antibiotischen Substanz im Kulturmedium können während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus leicht verfolgt werden, wenn man Proben des Kulturmediums auf ihre antibiotische Aktivität gegenüber Organismen testet, von denen bekannt ist, da.ss sie auf das Antibiotikum reagieren, z.
B. Staphylococcus aureus und Mycobacterium tuberculosis. .Am einfachsten stellt man eine Reihe von Ver dünnungen der Kulturproben her, gibt Teile der verdünnten Proben zu verflüssigtem Nä,hragar zu, verfestigt das Agar in einer Pe- trischale, impft mit einer jungen Kultur von S. aureus oder M.
tuberculosis und bestimmt die grösste Verdünnung des Kulturmediums, die vollständige Wa.chstiimshemmung des Or ganismus auf dem Nähragar bewirkt.
Die Erzeugung des Antibiotikums kann ferner auch durch turbimetrische Test verfahren verfolgt werden.
Im allgemeinen tritt die Höchsterzeugung des Antibiotikums innerhalb von 2-5 Tagen nach der Beimpfung des Kulturmediums ein, wenn eine aerobe Kultur unter der Ober fläche benutzt wird, und innerhalb von 5 bis 10 Tagen, wenn eine Oberflächen- oder Schüt- telkolbenkultur verwendet wird.
Das Antibiotikum kann aus dem Kultur medium z. B. durch Extraktion oder Adsorp- tion gewonnen werden. Man bevorzugt bei der technischen Erzeugung die erstere Methode, weil sie weniger zeitraubend und kostspielig ist. Zur Extraktion der antibiotischen Ver bindung aus den Kulturmedium werden mit Wasser nicht mischbare, polare, organische Lösungsmittel bevorzugt.; als solche sind unter anderem geeignet:<B>Alk</B> ylester von Fett säuren, z. B. Äthylacetat und Amylacetat, chlorierte Kohlenwasserstoffe, z. B.
Chloro form und Äthylendichlorid, in Wasser leicht lösliche Alkohole, z. B. Butanol und Amrl- alkohol, in Wasser leicht lösliche Ketone, z.1 B. Methylamylketon, und Äther, z. B. Äthyl- ä.ther und Dibutyläther. Der organische Ex trakt kann, vorzugsweise im Vakuum, zur Trockne eingedampft werden, wobei das Anti biotikum in roher Form erhalten wird.
Zur Isolierung des Antibiotikums durch Adsorp- tion sowie auch zu seiner Reinigung durch Chroma.togra.phie haben sich als Adsorptions- mittel z. B. aktivierte Tonerde, Silicagel, Ma- gnesiumaluminiumsilica.t und dergleichen be währt. Die Elution des Antibiotikums aus dem Adsorptionsmittel lässt sich leicht mit Hilfe eines polaren organischen Lösungsmit tels bewirken, in dem die antibiotische Ver bindung löslich ist.
Aktivkohle ist für die ehromatographische Reinigung des rollen Antibiotikums weniger geeignet, weil Kohle das Antibiotikum stark adsorbiert, so da.ss die adsorbierte Substanz nur unter Schwierig keiten eluiert werden kann. Aktivkohle kann jedoch mit Erfolg benutzt werden, um das Antibiotikum unmittelbar aus der Kultur brühe zu adsorbieren, wenn die Kohle vorher z. B. mit Essigsäure behandelt wird, um die Affinität der Kohle zum Antibiotikum herabzusetzen.
Wenn das Antibiotikum der Kulturfliis- sigkeit durch Extraktion entzogen wird, so wird der Extrakt am besten auf ein verhält nismässig kleines Volumen eingedampft und das Antibiotikum alsdann durch Zusatz eines Lösungsmittels ausgefällt, in welchem das Antibiotikum nur wenig löslich ist. Die antibiotische Substanz, die in roher, aber fester, zuweilen sogar kristalliner, Form aus fällt, kann dann durch Umkristallisation aus einem oder mehreren Lösungsmitteln oder deren Mischungen gereinigt werden. Geeignete Lösungsmittel zum Umkristallisieren sind u. a.
wässriges Aceton, wässriges Methanol, wäss- riges Äthanol und dergleichen. Eine besonders zweckmässige Art der Iso lierung des Erythromycins besteht darin, dass man die filtrierte Kulturbrühe auf etwa PH 9-10, vorzugsweise etwa 9,5, einstellt und .die alkalische Brühe alsdann mit einem Alkylacetat, z, B. Amylaeetat, extrahiert.
Die Erythromycinbase, die sich im Amyl- acetat löst, kann dann mit Wasser, das auf ein pH unter 6,5, vorzugsweise etwa PH 5, eingestellt ist, extrahiert werden. Der wässrige Extrakt wird dann zweckmässig durch Ein dampfen im Vakuum eingeengt., um die Fäl lung einzuleiten, und dann bis auf etwa PH 9,5 alkalisch gestellt, worauf sich die Erythro- mycinbase in fester, gewöhnlich kristalliner, Form abscheidet. Die Base kann durch Fil trieren oder Zentrifugieren isoliert und durch Umkristallisieren gereinigt werden.
Das Ervthromvcin kann in seine Salze übergeführt werden, indem man eine wässrige Lösung der Erythroniy cinbase mit einer äqui valenten Menge Säure behandelt und die Lö sung im Vakuum zur Trockne eindampft. Oder man behandelt die Lösung des Erythro- mycins in einem organischen Lösungsmittel mit einer Säure oder deren verdünnter Lö sung, wodurch das Erythromycinsa.lz unmit telbar aus der Lösung ausgefällt wird.
Wenn saure Salze starker Säuren hergestellt werden, muss während des Säurezusatzes zum Anti biotikum darauf geachtet werden, dass örtlich hohe Konzentrationen der Säure vermieden werden, weil Erythromyein in Lösungen mit niedrigem pH verhältnismässig unbeständig ist.
Wenn die Kulturbrühe bei einem PH-Wert unter 9 extrahiert oder mit einem Adsorp- tionsmittel behandelt wird, so liegt das Ery- thromycin im Extrakt oder Adsorba,t in der Regel in Form einer Komplexverbindung vor. Dieser Komplex zeigt die antibiotischen Eigenschaften der Erythromycinbase, weist aber eine stark verringerte Wasserlöslichkeit und im allgemeinen auch eine geringere Lös lichkeit in organischen Lösungsmitteln auf..
Aus dem Komplex kann die Erythromycin- base freigesetzt werden, indem man den Komplex in Wasser löst oder suspendiert, das PH der wässrigen Mischung auf etwa 9,8 ein stellt und die alkalische Mischung mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Erythromycinbase, die aus dem Wasser in das organische Lösungsmittel übergeht, wird alsdann zweckmässig durch Umkristallisation gereinigt.
Das Erythromycin .besitzt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaf ten: Erythromycin kristallisiert in weissen Na deln, die auf einem Kofler-Mikroschmeiz- punktsblock unter vorherigem Erweichen, bei etwa 136-140 C schmelzen. Es ist bis zu etwa 2 mg pro cm3 in Wasser löslich und leicht löslich in Alkohol, Aceton, Chloroform, Acetonitril und Äthy lacetat. Es ist schwach löslich in Äther, Äthylendichlorid und Amyl- acetat.
Eine elektrometrische Titration in Di- methylformamid-Wasser-Lösung (2: 1 Voluiri- teile) zeigt die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe von pKa' = 8,8 an.
Aus den Titra.tionswerten kann man auf ein Molekulargewicht von etwa. 725 schliessen. Erythromycin kristallisiert aus wässrigein Aceton in Form von Nadeln und kurzen Stäb- chen, die positive Elongation und gerade Auslöschung zeigen. Bei Raumtemperatur im.
Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknete Kristallproben zeigten in Natriumlicht bei 27 C die folgenden Brechungszahlen: n, = 1,452 n2 = 1,473 Spezifische Drehung einer bei Raum temperatur im Vakuum über Phosphor- pentoxyd 4 Stunden lang getrockneten Probe:
c = 1,99 % (Cxewicht/Volumen) in Äthanol. [a]25 - - 78 <B>D</B> Ein Durchschnitt von mehreren Elemen taranalysen von Proben, die vor der Analyse bei 60 C im Vakuum 3 Stunden über Phos- phorpentoxyd getrocknet worden waren, er gab folgende Werte:
EMI0009.0049
Kohlenstoff <SEP> 60,40%
<tb> Wasserstoff <SEP> 9,26%
<tb> Stickstoff <SEP> <B>2,070/9</B>
<tb> Sauerstoff <SEP> (aus <SEP> der <SEP> Differenz) <SEP> 28,27 <SEP> 0/0 Eine Probe der Substanz, die zu etwa 3,14 % in Chloroform (Gewieht/Volumen) ge- löst worden war, ergab in einem Infra,rot- spektrum über den Bereich 2,4,u-12,O,a die folgenden ausgezeichneten Banden:
2,82 3,32, 5,77, 5,91, 6,86, 7,13, 7,25, 7,42, 7,78, 8,02, 8,54, 8,98, 9,16, 9,32, 9,49, 9,86, 10,23, 10,42, 10,9, 11,17,<B>1</B>1,55 und 11,9.
Eine Untersuchung mit Röntgenstrahlen unter Verwendung ungefilterter Chrom strahlung und einer Wellenlänge von 2,2896 A zur Berechnung der Netzebenenabstände er gibt die folgenden Werte:
EMI0009.0065
d (Netzebenenabstand) <SEP> I/I'(RelativeIntensität)
<tb> 14,5 <SEP> 0,.63
<tb> 13,3 <SEP> 1,00
<tb> 10,9 <SEP> 0,06
<tb> 9,9 <SEP> 0,38
<tb> 8,65 <SEP> 0,25
<tb> 7,70 <SEP> 0,38
<tb> 7,10 <SEP> 0,13
<tb> 6,65 <SEP> 0,13
<tb> 5,80 <SEP> 0,25
<tb> 4,95 <SEP> 0,13
<tb> 4,65 <SEP> 0,06 Das Ultraviolettabsorptionsspektrum ist durch eine einzige breite Spitze von schwacher Intensität gekennzeichnet, die ein Maximum bei 280 m,a (a = 50) bei pA 6,3 aufweist:
Wenn Erythromycin aus Petroläther .oder einer Mischung von Wasser und Aceton um= kristallisiert wird, liefert es feine Nadeln, die zum hexagonalen System gehören. - - Ery-thromycinhydrochlorid kristallisier-äüs wässrigen Lösungsmitteln in @ weissen Nadeln, die auf einem Kofler-Mikroscliinelzpunktblöck bei etwa 170-173 C schmelzen.
Der bereits erwähnte Erythromycinkom- plex wird durch die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften charakterisiert Der Komplex kristallisiert in weissen Na deln, die auf einem Fisher-Johns-Schmelz- punktsappa.rat bei etwa. 82-83,5 C (unkorr.) schmelzen. Er ist in Aceton, den niedrigen Alkoholen, Chloroform und Äthylendichlorid völlig löslich, aber in den höheren Ketonen und Äthern nur wenig löslich.
Die elektrochemische Titration der Base in einer Dimethylformamid-Wasserlösung (2 :1 Volumteile) ergab die Anwesenheit zweier ionisierbarer Gruppen von pKci 7,6 und pKa' <I>8,4.</I>
Das Molekulargewicht, wie es aus den mit Röntgenstrahlen erhaltenen kristallographi- schen Daten an einer bei Raumtemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrockneten Probe bestimmt wurde, errechnet sich zu etwa 1130.
Das Erythromycin und seine Salze sind bei Raumtemperatur innerhalb des pH- Bereiches von. etwa 5,0-8,5 ziemlich bestän dig. Bei einem pH ausserhalb dieses Bereiches verschwindet die antibiotische Kraft bald. Stärkere Säure bewirkt einen schnellen Ver lust an antibiotischer Kraft, und stärkere ba.- sische Lösungen wirken ebenso, wenn auch weniger schnell. Die höchste Beständigkeit von Lösungen der antibiotischen Verbindun gen wird erreicht, wenn das pH der Lösungen zwischen pH 6 und 8 gehalten wird.
Erythromycin und seine Salze enthalten im allgemeinen Wasser, wenn sie aus wasser haltigen Lösungsmitteln kristallisiert wurden; sie können Alkohole und ähnliche Lösungs mittel enthalten, wenn sie aus solche Lösungs mittel enthaltenden Lösungen kristallisiert wurden. Der Gehalt an Wasser oder andern Lösungsmitteln scheint wenigstens zum Teil -on den Bedingungen abzuhängen, unter denen die Kristallisation erfolgte, des wei teren vom Grad der Trocknung, welchem die Substanz unterworfen wurde. Die Gehalte können zwischen einer kleinen Menge und bis hinauf zu mehreren Prozenten schwanken.
<I>Beispiel 1</I> Es wird eine Impfkeimbrühe hergestellt, die folgende Zusammensetzung hat:
EMI0010.0034
Stärke <SEP> 14,5 <SEP> kg
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 14,5 <SEP> kg
<tb> Maisweichwasser-Festkörper <SEP> 4,5 <SEP> kg
<tb> Natriumchlorid <SEP> 4,5 <SEP> kg
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2,7 <SEP> kg
<tb> Wasser <SEP> 950 <SEP> Liter Die Brühe wird in einen eisernen Tank von etwa. 1300 Liter Fassungsvermögen ein gebracht und durch 30minütiges Erhitzen unter Druck auf etwa 120 C sterilisiert. Die sterilisierte Brühe wird abgekühlt und asep tisch mit Sporen von Streptomyces erythreus, Stamm M5-12559, beimpft..
Der Organismus wird bei etwa 26 C in der Brühe während 45 Stunden wachsen gelassen. Während der Wachstumszeit wird die Brühe gerührt und mit steriler Luft in Mengen von etwa 0,5 Vo lumen Teuft pro Volumen Kulturbrühe pro Minute belüftet. In einen etwa 6000 Liter fassenden eiser nen Tank wird eine Gärbrühe eingebracht, die folgende Zusammensetzung hat:
EMI0010.0041
Stärke <SEP> 69,4 <SEP> kg
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 69,4 <SEP> kg
<tb> Ma,isweichwasser-Festkörper <SEP> 23,1 <SEP> kg
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 14,96 <SEP> kg
<tb> Natriumchlorid <SEP> 23,1 <SEP> kg
<tb> Wasser <SEP> etwa <SEP> 4500 <SEP> Liter Die Kulturbrühe wird durch etwa 30 .Mi nuten während des Erhitzens unter Druck auf etwa 120 C sterilisiert.
Die Brühe wird abgekühlt und die obige Impfkeimkultur aseptisch zugegeben. Der Organismus wird in der Brühe 4 Tage lang bei einer Temperatur von 26 C wachsen gelassen. Während der Wachstumszeit wird die Brühe gerührt, und es wird sterile Luft mit einer Geschwindig keit von etwa. 0,5 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute hindurchgeblasen. Am Ende der Wachstumszeit zeigt die Brühe eine antibiotische Aktivität von etwa 150 Erythromycin pro cm3 Brühe.
Die Kultur brühe (etwa 4000 Liter) wird mit 40 o/oiger Natriumhydroxydlösung auf ein PH von 9,5 eingestellt und zur Entfernung des Myceliums filtriert, wobei die Filtration durch Verwen- Jung von 3 Q/o Hyflo Super-Cel (Marken produkt) unterstützt wird. Das klare Filtrat wird in einer Podbielniak-Extraktionsa.ppa- ratur mit Amylacetat unter Anwendung von 1 Volumen Amylaceta.t auf 6 Volumen ge klärter Brühe extrahiert.
Der Amylacetat- Extrakt wird seinerseits schubweise mit Wasser extrahiert, das durch Schwefelsäure zusatz auf ein pH von etwa 5 gebracht wor den ist. Es werden zwei Extraktionen durch- neführt, die erste mit 1/2 Volumen und die zweite mit 1/1 Volumen des mit Schwefelsäure auf pH 5 eingestellten Wassers. Die wässrigen Extrakte werden vereinigt und mit Natrium hydroxydlösung auf PH 8,0 eingestellt.
Die alkalische Lösung wird im Vakuum auf ein Volumen von etwa 110 Liter eingedampft, dann durch Zusatz von Natriumhydroxy d- lösung auf PH 9,5 eingestellt und stehen gelassen. Das Erythromycin seheidet sich als kristalline Substanz aus. Die Kristalle wer den abfiltriert, die Mutterlauge durch Zusatz verdünnter Schwefelsäure auf ein PH von etwa 8,0 eingestellt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 75 Liter eingeengt. Die Lösung wird auf etwa PH 9,5 eingestellt und stehengelassen, worauf sich eine zusätzliche Menge Erythromyein in kristalliner Form ab scheidet.
Die erhaltene Gesamtmenge Erythro- mycin beträgt etwa 256 g.
Das Erythromy ein wird durch mehr-- nia.liges Umkristallisieren aus wä,ssrigem Ace ton (2:1-1Alischung) gereinigt.
<I>Beispiel 2</I> Herstellung des Erythromycins in Schüt telkolben.
Das Erythromycin wird aus der Kultur brühe wie folgt gewonnen: Die Brühe wird durch Natriumhydroxyd- zusatz bis etwa PH 9,8 alkalisch gemacht. und zweimal mit. 1/ -Volumteilen Äthylaceta.t ex trahiert.- Die vereinigten Äthylacetatextrakte, die das Erythromycin enthalten, werden mit 2 volumgleichen Anteilen. Nasser extrahiert, das mit Schwefelsäure auf etwa PH 5,0 an gesäuert worden ist.
Die wässrigen Extrakte werden vereinigt und mit Natriumhydrox,y d- lösung auf etwa PH 7,0 eingestellt. Die neu tralisierte Lösung wird auf etwa 1/1o ihres ursprünglichen Volumens eingeengt, an wel chem Punkt die Fällung einzutreten beginnt. Die wässrige Mischung wird mit Na.trium- hydroxydlösung auf etwa pn 9,5 gebracht und in der Kälte mehrere Stunden stehengelassen.
Das sich abscheidende Erythromyein wird ab filtriert und aus wässrigem Äthanol um- kristallisiert.
<I>Beispiel 3</I> Reinigung des Erythromyceins durch Chro- matographie.
Eine wässrige, Erythroinycin enthaltende Lösung, wie sie nach Beispiel 1 durch Extrak tion der filtrierten Kulturbrühe mit Amyl- a.eetat und durch Extraktion des Amylacetat- extraktes mit Wasser erhalten wurde, wird mit. wässrigem Alkali auf PH 9,5 eingestellt und mit Benzol extrahiert.
100 cms des Benzolextraktes,der eine anti biotische Aktivität entsprechend 10 mg Ery- thromycin pro em3 Benzol aufweist, wird über eine Säule aus Florisil (Markenprodukt, ein lVIg-Al-Silikat) geschickt, die 2,5 cm im Durchmesser misst und etwa 30 ein lang ist. Die Säule wird mit einer 5 ohigen Metha,nol lösung in Benzol gewaschen, um ein in der Säule erscheinendes braunes Band zu ent fernen, bis das Eluat im wesentlichen farblos durchläuft.
Das in der Säule adsorbierte Antibiotikum wird durch Elution mit einer 50 o/oigen Metha.nollösung in Benzol entfernt. Das Eluat wird im Vakuum zur Trockne verdampft und Glas zurückbleibende Erythro- mycin aus wässrigem Aceton umkristallisiert. Beispiel Herstellung von Erythromy ein über den oben erwähnten Komplex.
1 g Erythromycinkomplex, erhalten wie oben angegeben, wird in 100 cm3 Wasser suspendiert und die Suspension durch Zusatz verdünnter Salzsäure auf PH 6,3 eingestellt. Die wässrige Mischung wird mit verdünntem Chloroform extrahiert und die extrahierte wässrige Lösung mit Natriiunhy droxydlösung auf etwa. pH 9,8 eingestellt.
Die alkalische Lö- sing wird zweimal mit gleichen Volumteilen Amylaeetat extrahiert, die Amylacetatextrakte vereinigt und im Vakuiun zur Trockene ver dampft. Die zurückbleibende Erythromycin- base wird aus wiissrigem Äthanol umkristalli- sier t..