DE920934C - Verfahren zur Erzeugung eines Antibiotikums und dessen Salzen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Erzeugung eines Antibiotikums und dessen Salzen Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung neuer Verbindungen mit antibiotischen Eigenschaften.
• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Antibiotikums und dessen Salzen, das darin besteht, daß man einen Stamm von Streptomyces erythreus in einem Kulturmedium züchtet, das assimilierbare Kohlenhydrate, Stickstoffverbindungen und anorganische Salze enthält, bis der Organismus in diesem Kulturmedium starke antibiotische Aktivität entwickelt, und daß man das Antibiotikum Erythromycin aus diesem Kulturmedium durch Extraktion gewinnt und, gegebenenfalls mit einer geeigneten Säure, zum entsprechenden Salz umsetzt.
• Hinsichtlich der neuen Verbindung umfaßt die Erfindung eine Stickstoffbase, die hier durch den willkürlichen Namen Erythromycin gekennzeichnet ist, und die sauren Salze dieser Base. Die letzteren umfassen eine Verbindung, die der Einfachheit halber hier als Erythromycinkomplex bezeichnet ist, wobei ein saures Salz aus Erythromycin und einer nicht bezeichneten organischen Säure besteht.
• Erythromycin und seine sauren Salze sind durch eine beträchtliche antibakterielle Wirkungsbreite ausgezeichnet. Sie besitzen eine antibiotische Aktivität gegenüber vielen Mikroorganismen, und zwar sowohl grampositiven als auch gramnegativen. Eine weitere wichtige antibiotische Eigenschaft der Verbindungen liegt in ihrer Fähigkeit, das Wachstum und die Entwicklung gewisser Rickettsien und großer Viren, z. B. des epidemischen Typhus und der Meningopneumonitis, zu verhindern und das Wachstum und die Entwicklung einiger Spirochäten wirksam zu unterbinden. Die antibiotischen Eigenschaften der Verbindungen im Verein mit ihrer geringen Giftigkeit machen sie zu viel benutzten Heilmitteln bei der Behandlung vieler Krankheiten. Die antibiotische Aktivität des Erythromycins gegenüber Testorganismen wird in Tabelle I gezeigt. Die antibiotischen Aktivitäten wurden entweder durch Strichverdünnungs- oder durch Bouillonverdünnungsteste bestimmt. Im ersteren Test wurden die Testorganismen auf einer Reihe von Agarplatten ausgestrichen, die verschiedene Konzentrationen des Antibiotikums enthielten, um die Mindestkonzentration des Erythromycins in Mikrogramm (pg) pro Milliliter Substrat zu bestimmen, die das Wachstum über einen Zeitraum von 4o Stunden hemmte. Im letzteren Test wurden die Testorganismen in einer Nährbouillon aufgezogen, die verschiedene Mengen Erythromycin enthielt. Die Anwesenheit von etwa io °/o Pferdeserum im Medium hatte keine wahrnehmbare Wirkung auf die antibakterielle Aktivität des Antibiotikums.
• In der Tabelle bedeuten die Buchstaben (ag) und (bd) nach der hemmenden Konzentration die Testmethode (agar-dilution bzw. broth-dilution test), die angewendet wurde. Erythromycinsalze besitzen antibiotische Aktivitäten, die den in der Tabelle angegebenen Werten entsprechen, wobei die erhöhten Molekulargewichte der Salze berücksichtigt sind.

  Tabelle I

  Hemmende

  Testorganismus Konzentration

  (mg/m1)

  I

  Micrococcus pyogenes var. aureus . . o,8 (ag)

  Microcossus pyogenes var. aureus

  (penicillinresistent) . . . . . . . . . . . . . 0,4 (ag)

  Micrococcus pyogenes var. aureus

  (streptomycinresistent) ..... . .. o,8 (ag)

  Listeria monocytogenes .......... 0,31 (bd)

  Bacillus subtilis . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 (ag)

  Vibrio cholera ................. o,63 (bd)

  Mycobacterium sp. (6o7) . . . . . . . . 6,2 (ag)

  Mycobacterium phlei ........... o,8 (ag)

  Hämophilus pertussis . . . . . . . . . . . . o,31 (bd)

  Mycobacterium avium . . ...... ... 1,6 (ag)

  Mycobacterium smegmatis........ 6,2 (ag)

  Klebsiella pneumoniae . . . . . . . . . . . 6,2 (ag)

  Brucella melitensis ...... . ....... 1,56 (bd)

  Brucella suis . ..... .. ... . ...... 1,56 (bd)

  Neisseria intracellularis ..... . . .. 5,o (bd)

  Diplococcus pneumoniae

  (sulfaresistenter Stamm) ...... o,o2 (bd)

  Streptococcus pyogenes .......... o,o2 (bd)

  Hämophilus influenzae ......... 1,25 (bd)

  Streptococcus viridans . . . . . . . . . . . o,16 (bd)

  Corynebacterium diphtheriae ..... 0,02 (bd)

  Vibrio comma ................. 6,25 (bd)

  Hinsichtlich der neuen Verfahren umfaßt die Erfindung fermentative Verfahren, die das Wachsen einer Aktinomycete in einem Kulturmedium zum Ziele haben, das assimilierbare Kohlenhydrate, Stickstoffverbindungen und anorganische Salze enthält.
• Die in den fermentativen Verfahren der Erfindung benutzte Aktinomycete gehört zur Gattung Streptomyces der Gruppe Actinomycetales, gemäß der Klassifizierung in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (6th edition), S. 938. In seinen morphologischen Kennzeichen scheint der Organismus nahe verwandt mit dem von Waksman als Actinomyces i61 (Soil Science 8, S. 71 bis 214 [igig]) beschriebenen und später von ihm als Streptomyces erythreus identifizierten zu sein. Wie hier später noch erläutert werden wird, bestehen gewisse Unterschiede zwischen den Eigenschaften der Kulturen des von Waksman beschriebenen Organismus und denen des in der Erfindung beschriebenen, so daß ein gewisser Zweifel an der richtigen Identifizierung des neuen Organismus besteht. Vorläufig jedoch haben wir den neuen Organismus der Erfindung als einen Stamm des Streptomyces erythreus klassifiziert und demgemäß den Organismus als Streptomyces erythreus, Stamm M 5-1255g, bezeichnet.
• Der Mikroorganismus wurde aus einer aus Iloilo City, Iloilo, Phillippine Islands, erhaltenen Bodenprobe isoliert, wobei folgendes Isolierverfahren angewandt wurde: Eine Probe des Bodens wurde in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, die Suspension stark verdünnt und eine kleine Probe hiervon auf Nähragar plattiert. Die Platte wurde bei etwa 30° 1 Woche bebrütet. Die winzigen, harten, zerstreuten Kolonien von Streptomyces erythreus wurden mit einer Platinöse abgenommen und zur Impfung von Agarhängen benutzt, um größere Mengen des Organismus zu erzeugen.
• Die Erfindung wird unter besonderer Bezugnahme auf-den vorstehend genannten Stamm des Organismus beschrieben, aber natürlich können die fermentativen Verfahren der Erfindung nicht allein auf Streptomyces erythreus, Stamm M5-12559, sondern auch auf andere Erythromycin erzeugende Stämme von Streptomyces erythreus angewendet werden, die durch Routineisolierungs- und Stammodifikationsmethoden leicht erzeugt und isoliert werden können, wozu Selektion gezüchteter Organismen und Beeinflussung durch modifizierende Mittel gehören, indem man sie z. B. Röntgenstrahlen, ultraviolettem Licht und chemischen Mitteln, z. B. Stickstofflostverbindungen, aussetzt. BeispielefürandereErythromycinerzeugende Stämme sind Streptomyces erythreus, Stamm M5-14641, M 5-14642 und M 5-i4643 Die Stämme M 5-i2559, M 5-14641, M 5-14642 und M 5-14643 von Streptomyces erythreus sind in der Kulturensammlung der Northern Regional Research Laboratories in Peoria, Illinois, V. St. A., hinterlegt worden und haben die Nummern NRRL 2338, NRRL 2359, NRRL 236o und NRRL 2361 der Kulturensammlung erhalten.
• Streptomyces erythreus, Stamm M 5-z2559 ist durch zahlreiche physikalische, züchterische und physiologische Teste gekennzeichnet, die in den folgenden Abschnitten aufgezeigt werden. Zur Benennung der meisten Farben ist das System von Ridgway, Color Standards and Nomenclature [igia], verwendet worden; unter Verwendung dieses Systems wird der Anfangsbuchstabe der Farbe groß geschrieben.
• Beim Wachsen auf Nähragarmedien bildet Streptomyces erythreus ein verzweigtes Mycelium mit Sporenreihen in geraden oder unregelmäßig sich windenden Ketten, die aber im allgemeinen nicht ausgesprochen spiralförmig angeordnet sind. Das Wachstum ist ein typisch langsames, beschränktes und kärgliches, das sich mengenmäßig auf den meisten Medien ändert, indem das jeweilige Ausmaß an vegetativem und Reihenwachstum sich mit dem jeweils benutzten Nährmedium ändert.
• Auf einfachen synthetischen Agarmedien entwickelt sich das vegetative Mycelium kärglich und flach. Das Luftmycelium ist staubig weiß und in mäßiger Menge vorhanden. Mit reifender Kultur wird das in Luft wachsende Mycel blaß rosafarbener. Es bildet sich ein lösliches Russet-Vinaceous-farbenes Pigment, daß mit älter werdender Kultur nachdunkelt.
• Wenn der Organismus auf Agarmedien gezüchtet wird, die komplexe Stickstoffquellen enthalten, ist das vegetative Mycelium im Verhältnis reichlicher vorhanden als das an der Luft gewachsene. Das vegetative Wachstum wird charakteristisch verstärkt und neigt dazu, in das Agar einzudringen. Das Luftmycel in solchen Kulturen ist im allgemeinen dünn zerstreut und weiß. Außer dem löslichen Russet-Vinaceous-farbenen Pigment wird ein gewisses braunes Pigment auf vielen komplexen Medien gebildet.
• Der Organismus ist physiologisch sehr aktiv. Stärke und Gelantine werden leicht hydrolysiert, obwohl Casein in Lackmusmilchkulturen nicht angegriffen wird. Die meisten gewöhnlichen Kohlenstoffquellen sind für das Wachstum gut verwendbar. Temperaturen von etwa 3o bis 37° scheinen für Wachstum und Sporenbildung optimal zu sein.
• Mikroskopische Morphologie Die Morphologie von Streptomyces erythreus, Stamm M 5-12559 beimWachstum auf synthetischem Agar und Calciummalat-Agar ist folgende Synthetisches Agar. Hier entsteht ein mäßig verzweigtes Luftmycelium, bei dem die Sporen auf den Konidiophoren in Form von kurzen, geraden oder unregelmäßig sich windenden und biegenden Ketten, aber nicht in typischen Spiralen entstehen. Die Sporen sind eiförmig und etwa o,5 X o,8,u bis o,8 X i,oy groß. Die Farbreaktion nach Gram ist positiv.
• Calciummalat-Agar. Die beobachtete mikroskopische Morphologie ist die gleiche wie bei dem auf synthetischem Agar gezüchteten Organismus, nur sind 'die Sporenketten in noch stärkerem Maße haken- und schlangenförmig, wenn auch nicht regelmäßig spiralig. Züchterische Merkmale In den folgenden Abschnitten sind die Züchtungsmerkmale des Organismus in einer Anzahl von Standardmedien ausgeführt.
• Synthetisches Agar. Mäßiges vegetatives Wachstum, schwach cremefarben, durch die starke Farbe des löslichen Pigments dunkler werdend, beschränktes Wachstum des weißen Luftmycels, das mit reifer werdender Kultur eine Pale-Vineceous-Fawn-Färbung annimmt; mikroskopisch wird mäßige Sporenbildung beobachtet; die Erzeugung des löslichen Pigments ist ausgesprochener als auf anderen Medien; die Russet-Vinaceous-Färbung in jungen Kulturen wird Dark-Vinaceous-Brown und nach langer Impfung fast schwarz; die Kolonien messen 4 bis 6 mm im Durchmesser bei erhöhten Zentren und flachen, welligen Rändern; das Luftmycelium ist dünn, weit und fadenförmig.
• Glucose-Asparagin-Agar. Kärgliches, farbloses vegetatives Wachstum mit schwachem Wachstum von weißem bis Light-Pinkish-Cinnamon-farbenem Luftmycelium, das sich nur nach langer Bebrütung bildet; bei mikroskopischen Beobachtungen spärliche Sporenbildung; etwas lösliches, Light-Ochraceous-Salmonfarbenes Pigment; Kolonien mit 2 bis 3 mm Durchmesser, unregelmäßig konvex mit welligem oder unversehrtem Rand; Oberfläche glatt oder runzlig, von staubiger Gestalt.
• Emerson's Agar. Gutes vegetatives Wachstum, schwach cremefarben, nach 14tägiger Impfung Cameo-Brown-farben, nach 28 Tagen Hay's-Russet-farben werdend; dünnesWachstum desweißenLuftmyceliums; starkes, lösliches Hazel-farbenes Pigment; Kolonien mit 3 bis 5 mm Durchmesser mit runzliger und zusammengerollter Oberfläche, erhöhten oder eingesunkenen Zentren und unregelmäßig welligen Rändern; die Morphologie der einzelnen Kolonien ist verschiedenartig, bei einzelnen fehlt das Luftmycelium, während andere mit einer staubigen Sporenkruste bedeckt sind.
• Calciummalat-Agar. Kärgliches, farbloses vegetatives Wachstum mit wenig Pale-Pinkish-Cinnamonfarbenem Luftmycelium; bei mikroskopischer Beobachtung geringe Sporenbildung; lösliches Russet-Vinaceous-farbenes Pigment, das nach verlängerter Bebrütung Army-Brown-farben nachdunkelt; Kolonien mit i bis 3 mm Durchmesser mit erhöhten Zentren und fadenförmigen Rändern; die Oberfläche der Sporenkruste ist von feiner, staubförmiger Gestalt; mikroskopisch kleiner Kornkreis von sehr kärglichem Luftwachstum ganz an der Außenseite der Kolonie.
• Glucose Agar. Mäßiges vegetatives Wachstum, schwach Deep-Olive-Buff-farben, über Rood's-Brownnach Tawny-farben wechselnd; Luftmycelium in der Menge mäßig; weißes, lösliches Rood's-Brown-farbenes Pigment, das dem auf Emerson's Agar gebildeten ähnelte, aber schwächer war; Kolonien mit 2 bis 4 mm Durchmesser, erhöht, unregelmäßig zusammengerollt, mit welligem Rand; Oberfläche staubförmig.
• Nähragar. Kärgliches vegetatives Mycelium, schwach Chamois-farben; mäßig weißes Luftmycelium, ohne lösliches Pigment; Kolonien klein, beschränkt, 2 bis 3 mm im Durchmesser, unregelmäßig konvex mit ganzem Rand und staubartiger Oberfläche. Größere Kolonien haben oft in der Mitte eine sternförmige Einsenkung.
• Kartoffelpfropf. Reichliches vegetatives Mycelium mit reichlichem Drab-Gray-farbenem Luftmycelium unter Bildung eines Pfropfs, der an der Spitze fast schwarz war und zur Grundfläche hin allmählich in Braun und Rötlichbraun überging.
• Gelatine. Mäßiges weißes Wachstum in Kolonien mit in 14 Tagen fast vollständiger und in 2o Tagen bei 25' vollständiger Hydrolyse; hellbraunes, lösliches Pigment.
• Glucosebouillon. Schweres Wachstumshäutchen mit spät sich bildendem, mäßigem, weißem Luftmycelium; lösliches, ungefähr Ocher-Red-farbenes Pigment.
• Nährbouillon. Spärliches Wachstum, das die Form einiger weniger schwimmender Kolonien annimmt, einige davon mit weißem Luftmycelium; wenig tropfenförmiges Sediment und kein lösliches Pigment.
• Tyrosinbouillon. Spärliches, flockiges Wachstum unter der Oberfläche mit Spuren von tropfenförmigem Wachstum an der Oberfläche und keinem löslichen Pigment.
• Physiologische Merkmale Lackmusmilch. In Lackmusmilch ist das Wachstum bei 30' spärlich, es erscheint nur in einem Ring an der Wand der Röhre. Hydrolyse oder Peptisierung findet nicht statt, aber es entwickelt sich langsam eine alkalische Reaktion (14 Tage).
• Bei 37' ist das Wachstum'@ähnlich dem bei 30', nur sind Wachstum und Übergänge weniger deutlich. Stärkeagar. Die Stärke wird stark hydrolysiert. Cellulose (Filterpapierstreifen). Weder bei Ammonium- noch bei Nitrationen als Stickstoffquelle findet Wachstum statt.
• Die folgenden Kohlenstoff- und Stickstoffverwertungsteste wurden nach der Methode ausgeführt, die Pridham und Gottlieb, J. Bacteriology 56, S. 107 bis 114 (Z948), beschrieben haben. Verwertung von Kohlenstoffquellen zum Wachstum a) Zu gut verwertbaren Substraten gehören die folgenden L (@-) Arabinose D (-j-) Raffinose Stärke L (-f-) Rhamnose Inulin Natriumacetat D (-) Fructose Mannit Natriumcitrat D (-@-) Galaktose D (-) Sorbit Natriummalat D (-) Glucose i (-) Inosit Natriumsuccinat D (-@-) Maltose Dextrin Asparagin Sucrose b) Zu schlecht verwertbaren Substraten gehören D (-f-) Xylose und Salicin.
• Wenig oder gar nicht verwertbar scheinen D (-@-)-Lactose, Dulcit, Natriumformiat oder Natriumtartrat zu sein.
• Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen zum Wachstum a) Zu gut verwertbaren Substraten gehören Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat. b) Natriumnitrit ist nicht verwertbar. = Selbstverständlich sind die obigen Teste zur Verwertung von Energiequellen unter besonderen Wachstumsbedingungen ausgeführt worden. Wenn die Aktinomycete gewisse Energiequellen unter den Testbedingungen nicht verwertet hat, schließt dies nicht aus, daß diese Energiequellen unter anderen Bedingungen verwertet werden.
• Tabelle II bringt einige der Unterschiede zwischen Actinomyces Z6Z, den Waksman beschrieb, und Streptomyces erythreus, Stamm M 5-12559.

  Tabelle II

  Medium m5-12559 Actinomyces 161

  Mikroskopische Morphologie

  Mäßige Anzahl von Sporen, die auf den Zahlreiche offene Spiralen.

  Konidiophoren in Form von kurzen, ge-

  raden oder unregelmäßig sich biegenden

  oder windenden Ketten, nicht in typischen

  Spiralen (14 Tage), entstehen.

  Züchtungsmerkmale

  Synthetisches Agar Mäßiges bis gutes vegetatives und Luft- Vegetatives Wachstum sich verbreitend

  wachstum. Luftmycelium weiß, mit der und tief in das Medium hinein ent-

  Reifung teilweise rosafarben werdend; die wickelnd. Luftmycelium dick, fest,

  Farbe reicht anscheinend von Pale-Vina- weiß. Lösliches Pigment Pomegranate

  ceous-Fawn bis Light-Ochraceous-Salmon. Purple-farben, später in Bordeaux-

  Bei langer Bebrütung wird das lösliche Farben überwechselnd. Bei wieder-

  Russet-Vinaceous-farbene Pigment Dark- holten Übergängen wird das Pigment

  Vinaceous-Brown oder fast schwarz. weinfarben.

  Gelatine Kärglich braunes lösliches Pigment. Kein lösliches Pigment.

  Calciummalat-Agar Lösliches, Russet-Vinaceous-farbenes Pig- Kein lösliches Pigment.

  ment, das bei langer Bebrütung Army-

  Brown-farben wird.

  Lackmusmilch Spärliches Wachstum; keine Hydrolyse oder Wachstum in der gelblichen Oberflächen-

  Peptisierung. Langsame Entwicklung einer zone; sehr langsame Koagulation (in

  alkalischen Reaktion. 5o Tagen nicht vollständig).

  Wie oben festgestellt, kann Streptomyces erythreus, Stamm M 5-x2559 in einem Kulturmedium aufgezogen werden, um ein wirksames antibiotisches Agens zu erzeugen. Das Kulturmedium kann eines der zahlreichen Medien sein, da der Organismus, wie aus den oben beschriebenen Verwertungstesten hervorgeht, fähig ist, viele Energiequellen zu verwerten. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit in der Erzeugung, der Höchstausbeute an Antibiotikum und der Leichtigkeit der Isolierung des Erythromycins verdienen gewisse Kulturmedien den Vorzug. So sind z. B. die gegenwärtig bevorzugten Kohlenhydratquellen im Kulturmedium Stärke und Glucose. Andere in Frage kommende Quellen sind Sucrose, Dextrin, Melasse u. dgl. Die bevorzugten Stickstoffquellen sind Kornweichwasser, Sojabohnengrob- oder -feinmehl und lösliche Brauereirückstände, aber man verwertet auch andere Quellen; zu ihnen gehören Casein, Mischungen von Aminosäuren, Peptone (Fleisch- oder Soj apeptone) u. dgl. Auch anorganische Stickstoffquellen, wie z. B. Nitrate oder Ammoniumsalze, können verwendet werden.
• Die anorganischen Nährsalze, die dem Medium einverleibt werden, umfassen die gewöhnlichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid-, Sulfat- u. dgl. Ionen zu liefern vermögen.
• Wie zum Wachstum und zur Entwicklung anderer Mikroorganismen erforderlich, sollten auch hier für das Wachstum der in der Erfindung benutzten Aktinomycete wesentliche Spurenelemente in das Kulturmedium gegeben werden. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich zufällig als Verunreinigungen mit den anderen Bestandteilen, die dem Medium zugesetzt werden, hineingebracht.
• Um Höchstwachstum und -entwicklung des Streptomyces erythreus, Stamm M 5-i2559 zu erreichen, muß das Kulturmedium vor der Beimpfung mit dem Organismus auf ein pa zwischen 6 und 7,5 vorzugsweise auf etwa 6,5, eingestellt werden. Es wurde beobachtet, daß das Medium während der Wachstumsperiode des Organismus und der Erzeugung des Antibiotikums allmählich alkalisch wird und eine Alkalität von etwa p$ 7,2 bis 8,5 oder darüber erreicht, wobei das endgültige ps wenigstens zum Teil von dem Anfangs-px des Mediums, den im Medium anwesenden Puffersubstanzen und der Zeitdauer abhängt, in der der Organismus wachsen kann.
• Wie bei der Erzeugung anderer Antibiotika in großen Mengen, bevorzugt man aerobe Züchtungsbedingungen unter der Oberfläche als Bedingungen der Wahl bei der Erzeugung großer Mengen von Erythromycin. Zur Herstellung begrenzter Mengen können Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden. Ferner bevorzugt man, wie gut bekannt ist, bei Durchführung des Wachstums in großen Tanks die Verwendung der vegetativen Form des Organismus zur Beimpfung der Erzeugertanks, um eine deutliche Verzögerung in der Erzeugung des Antibiotikums und die damit zusammenhängende mangelhafte Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Es ist demgemäß erwünscht, daß zuerst ein vegetativer Impfkeim des Organismus hergestellt wird, indem man eine verhältnismäßig kleine Menge des Kulturmediums mit der Sporenform des Organismus impft, und, wenn ein junger, aktiver vegetativer Impfkeim hergestellt worden ist, daß man diesen aseptisch in die großen Tanks überführt. Das zur Erzeugung des vegetativen Impfkeims dienende Medium kann das gleiche oder aber auch ein anderes Medium sein als das zur Erzeugung des Antibiotikums benutzte.
• Streptomyces erythreus, Stamm M 5-i2559 wächst gut bei Temperaturen zwischen etwa 25 und 37°. Die Höchstausbeute scheint sich zu ergeben, wenn man das Kulturmedium auf etwa 26 bis 30° hält.
• Wie gewöhnlich bei der Erzeugung von Antibioticis nach den Züchtungsverfahren unter der Oberfläche wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Um gutes Wachstum des Organismus und eine gute Erzeugung des Antibiotikums zu erreichen, liegt das in der Tankerzeugung von Erythromycin verwendete Luftvolumen ansteigend bis zu o,i Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kulturmedium. Noch besseres Wachstum des Organismus und eine noch höhere Erzeugung an Antibiotikum wird erreicht, wenn das verwendete Luftvolumen wenigstens 0,4 Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kulturbrühe ausmacht.
• Die Geschwindigkeit der Erzeugung des Antibiotikums und die Konzentration der antibiotischen Aktivität im Kulturmedium können während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus leicht verfolgt werden, wenn man Proben des Kulturmediums auf ihre antibiotische Aktivität gegenüber Organismen testet, von denen bekannt ist, daß sie für das Antibiotikum empfänglich sind, z. B. Staphylococcus aureus und Mycobacterium tuberculosis. Bei solchen Bestimmungen wendet man am einfachsten einen Test an, bei dem man eine Reihe von Verdünnungen der Kulturproben herstellt, Teile der verdünnten Proben zu zergangenem Nähragar gibt, das Agar in einer Petrischale verfestigt, die Platte mit einer jungen Kultur von S. aureus oder M. tuberculosis impft und die größte Verdünnung des Kulturmediums bestimmt, die vollständige Wachstumshemmung des Organismus auf dem Nähragar bewirkt.
• Die Erzeugung des Antibiotikums kann auch durch turbidimetrische Testverfahren verfolgt werden, wie sie gewöhnlich auch in Verbindung mit der Erzeugung anderer Antibiotika verwendet werden.
• Im allgemeinen tritt die Höchsterzeugung des Antibiotikums innerhalb von 2 bis 5 Tagen nach der Beimpfung des Kulturmediums ein, wenn eine aerobe Kultur unter der Oberfläche benutzt wird, und innerhalb von 5 bis io Tagen, wenn eine Oberflächen- oder Schüttelkolbenkultur verwendet wird.
• Die antibiotischen Verbindungen der Erfindung können aus dem Kulturmedium durch Extraktion oder Adsorption gewonnen werden. Man bevorzugt bei der technischen Erzeugung die erstere Methode, weil sie weniger zeitraubend und kostspielig ist. Zur Extraktion der antibiotischen Verbindung aus dem Kulturmedium werden mit Wasser nicht mischbare, polare organische Lösungsmittel bevorzugt, zu denen Alkylester von Fettsäuren, z. B. Äthylacetat und Amylacetat, chlorierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Chloroform und Äthylendichlorid, in Wasser leichtlösliche Alkohole, z. B. Butanol und Amylalkohol, in Wasser leichtlösliche Ketone, z. B. Methylamylketon, und Äther, z. B. Äthyläther und Dibutyläther, gehören. Andere Lösungsmittel von ähnlichem Charakter können ebenfalls verwendet werden.
• Die antibiotische Substanz in dem organischen Lösungsmittelauszug der Kulturbrühe kann, vorzugsweise im Vakuum, zur Trockne verdampft werden, um das Antibiotikum in roher Form zu erhalten. Auf andere Weise kann man die antibiotische Substanz von der Kulturbrühe trennen, wenn man die filtrierte Brühe mit einem Adsorptionsmittel in Berührung bringt. Adsorptionsmittel können auch wirksam bei der Reinigung durch Chromatographie benutzt werden, bei der z. B. aktivierte Tonerde, Silicagel, Magnesiumaliminiumsilicat u. dgl. bewährt sind. Die Elution des Antibiotikums aus dem Adsorptionsmittel wird leicht mit Hilfe eines polaren, organischen Lösungsmittels bewirkt, indem die antibiotische Verbindung löslich ist. Aktivkohle ist nicht besonders gut zur Verwendung in einer chromatographischen Säule geeignet, weil Kohle das Antibiotikum stark adsorbiert, so daß die adsorbierte Substanz nur unter Schwierigkeiten eluiert werden kann. Aktivkohle kann jedoch mit Erfolg benutzt werden, um das Antibiotikum unmittelbar aus der Kulturbrühe zu adsorbieren, wenn die Kohle vorher mit einem Mittel, z. B. Essigsäure, überzogen wird, um die Affinität der Kohle zum Antibiotikum herabzusetzen.
• Wenn ein Extraktionsverfahren allein zur Gewinnung des Antibiotikums benutzt wird, besteht eine geeignete Methode zur Gewinnung des Antibiotikums aus dem Extraktionsmittel darin, das Lösungsmittel auf ein verhältnismäßig kleines Volumen zu verdampfen und das Antibiotikum durch Zusatz eines mischbaren Lösungsmittels zu fällen, in welchem das Antibiotikum nur wenig löslich ist. Die antibiotische Substanz, die in roher, aber fester und zuweilen sogar kristalliner Form ausfällt, wird dann durch Umkristallisation aus einem oder mehreren Lösungsmitteln oder deren Mischungen gereinigt. Geeignete Lösungsmittel zum Umkristallisieren sind unter anderem wäßriges Aceton, wäßriges Methanol, wäßriges Äthanol u. dgl.
• Eine gegenwärtig bevorzugte Art der Isolierung von Erythromycin in Form seiner Base besteht darin, daß man die filtrierte Kulturbrühe auf etwa px 9 bis io, vorzugsweise etwa 9,5, alkalisch macht und die eingestellte Brühe mit einem Alkylacetat, z. B. Amylacetat, extrahiert. Die Erythromycinbase, die sich im Amylacetat löst, wird dann mit Wasser, das auf unter pH 6,5, vorzugsweise etwa px 5, eingestellt ist, extrahiert. Das Volumen des wäßrigen Extraktes wird dann durch Eindampfen im Vakuum eingeengt, um die Fällung einzuleiten, und dann bis auf etwa PH 9,5 alkalisch gemacht, worauf sich die Erythromycinbase in fester, gewöhnlich kristalliner Form abscheidet. Die Base wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren isoliert und durch Umkristallisieren gereinigt.
• Die sauren Salze des Erythromycins können erhalten werden, indem man eine wäßrige Lösung der Erythromycinbase mit einer äquivalenten Menge Säure behandelt und die Lösung im Vakuum zur Trockne dampft, oder man behandelt die Lösung der Erythromycinbase in einem organischen Lösungsmittel mit der Säure oder deren verdünnter Lösung, wodurch das Erythromycinsalz unmittelbar aus der Lösung ausgefällt wird. Wenn saure Salze stärker Säuren hergestellt werden, muß während des Säurezusatzes zum Antibiotikum darauf geachtet werden, daß örtlich hohe Konzentrationen der Säure vermieden werden, weil Erythromycin in Lösungen mit niedrigem pH verhältnismäßig unbeständig ist. Beispiele von Salzen, die hergestellt worden sind, sind das Hydrochlorid, Sulfat, Citrat, Mandelat, Oleat, Palmitat, Myristat, Stearat und Oxalat. Andere ähnliche Salze können leicht nach den obenerwähnten Methoden hergestellt werden. Für therapeutische Zwecke ausgewählte Salze sollten verhältnismäßig ungiftige Salze ein.
• Wenn die Kulturbrühe extrahiert oder mit einem Adsorptionsmittel bei einer Alkalität behandelt wird, die unter etwa pH 9 liegt, ist die im allgemeinen isolierte antibiotische Verbindung ein Erythromycinkomplex. Der Komplex zeigt die antibiotischen Eigenschaftsmerkmale der Erythromycinbase, weist aber eine stark verringerte Wasserlöslichkeit und im allgemeinen eine geringere Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln auf. Aus dem Komplex kann die Erythromycinbase erhalten werden, indem man den Komplex in Wasser löst oder suspendiert, das pH der wäßrigen Mischung auf etwa 9,8 einstellt, um die Erythromycinbase aus dem Komplex in Freiheit zu setzen, und die alkalische Mischung mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Erythromycinbase, die aus dem Wasser in das organische Lösungsmittel übergeht, wird isoliert und durch Umkristallisation gereinigt.
• Die Base, Erythromycin, besitzt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften. Erythromycin kristallisiert in weißen Nadeln, die auf einem Kofler-Mikroschmelzpunktsblock unter vorherigem Erweichen bei etwa 136 bis 14o° schmelzen. Es ist bis zu etwa 2 mg/ml in Wasser löslich, und leicht löslich in Alkohol, Aceton, Chloroform, Acetonitril und Äthylacetat. Es ist schwach löslich in Äther, Äthylendichlorid und Amylacetat.
• Eine elektrometrische Titration in Dimethylformamid-Wasser-Lösung (2: i Volumteile) zeigt die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe von pK a' _ 8,8 an.
• Das durch die Titrationswerte bestimmte Molekulargewicht scheint etwa 725 zu sein.
• Erythromycin kristallisiert aus wäßrigem Aceton in Form von Nadeln und kurzen Stäbchen, die positive Elongation (positive elongation) und parallele Auslöschung zeigen. Bei Raumtemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknete Kristallproben zeigten in Natriumlicht bei 27° die folgendenBrechungszahlen: n1 = 1,452, n2 = 1,473.
• Die spezifische Drehung einer bei Raumtemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd 4 Stunden lang getrockneten Probe war [a] D = - 78°, c = i,99o/o (Gewicht/Volumen) in Äthanol.
• Ein Durchschnitt von mehreren Elementaranalysen von Proben, die vor der Analyse bei 6o° im Vakuum 3 Stunden über Phosphorpentoxyd getrocknet worden waren, ergab folgende Werte:

  Kohlenstoff ........................ 60,400/0

  Wasserstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9,260/,

  Stickstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,070/.

  Sauerstoff (aus der Differenz) . . . . . . . . 28,27%

  Eine Probe der Substanz, die zu etwa 3,14% in Chloroform (Gewicht/Volumen) gelöst worden war, ergab in einem Infrarotspektrum über den Bereich von 2,4 bis 12,0,u die folgenden ausgezeichneten Banden: 2,82, 3,32, 5,77, 5,91, 6,86, 7,13, 7,25, 7,42, 7,78, 8,02, 854, 8,98, 9.i6, 9,32, 9,49, 9,86, 10,23, 10,42 10,9, 11,17, 11,55 und ii,9.
• Eine Untersuchung mit Röntgenstrahlen unter Verwendung ungefilterter Chromstrahlung und einer Wellenlänge von 2,2896 Ä zur Berechnung der Netzebenenabstände ergibt die folgenden Werte

  d (Netzebenenabstand) I-I' (relative Intensität)
  14,5 o,63
  13,3 1,00
  i0,9 0,o6
  9,9 0,38
  8,65 0,25
  7,70 0,38
  7,10 0,13
  6,65 0,13
  5,8o 0,25
  4,95 0,13
  4,65 0,06

  Das Ultraviolettabsorptionsspektrum ist durch eine einzige breite Spitze von schwacher Intensität gekennzeichnet, die ein Maximum bei 28o mu bei PH mit E, der molaren Auslöschung, von etwa 5o hat.
• Wenn Erythromycin aus Petroläther oder einer Mischung von Wasser und Aceton umkristallisiert wird, liefert es feine Nadeln, die zum hexagonalen System gehören.
• Erythromycinhydrochlorid besitzt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften.
• Es kristallisiert aus wäßrigen Lösungsmitteln in weißen Nadeln, die auf einem Kofler-Mikroschmelzpunktblock bei etwa 17o bis 173° schmelzen. In Wasser und den niedrigen Alkoholen ist es sehr und in Äthylacetat wenig löslich. In Lösungsmitteln, wie Äther, Amylacetat, Chloroform u. dgl., ist es nur sehr wenig löslich.
• Ein Durchschnitt von mehreren Elementaranalysen von Proben des Erythromycinhydrochlorids, die vor der Analyse 3 Stünden bei 78° im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet worden waren, ergab folgende Werte

  Kohlenstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 58,74 %

  Wasserstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8,890/0

  Stickstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,89 0/

  0

  Chlor ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,58%

  Sauerstoff (aus der Differenz) . . . . . . . . 25,90'/o

  Eine Probe des Erythromycinhydrochlorids, in Petroläther unter Erwärmen gelöst, gibt im Infrarotspektrum über einen Bereich von 2,4 bis i2,oy die folgenden ausgezeichneten Banden: 2,94, 3,38, 5,79, 5,88, 6,85, 7,26, 7,43, 7,78, 7,88, 8,01, 8,55, 9,03, 9,24, 9,46, 9,92, 10,47, 11,15, 11,5 und i2,0.
• Der Erythromycinkomplex wird durch die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften charakterisiert.
• Der Komplex kristallisiert in weißen Nadeln, die auf einem Fisher- Johns-Schmelzpunktsapparat bei etwa 82 bis 83,5° (unkorr.) schmelzen. Er ist in Aceton, den niedrigen Alkoholen, Chloroform und Äthylendichlorid völlig löslich, aber in den höheren Ketonen und Äthern nur wenig löslich.
• Eine elektrochemische Titration der Base in einer Dimethylformamid-Wasser-Lösung (2:1 Volumteile) ergab die Anwesenheit zweier ionisierbarer Gruppen von pK ä 7,6 und pK a' 8,4.
• Das Molekulargewicht, wie es aus den mit Röntgenstrahlen erhaltenen kristallographischen Daten an einer bei Raumtemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrockneten Probe bestimmt wurde, errechnet sich zu etwa 1130.
• Die spezifische Drehung einer bei Raumtemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrockneten Probe ist folgende: [a] ö = - 47°, c = 2% (Gewicht/ Volumen) in Äthanol.
• Ein Durchschnitt von mehreren Elementaranalysen von Proben des Erythromycinkomplexes, die vor der Analyse bei Raumtemperatur im Vakuum 12 Stunden über Phosphorpentoxyd getrocknet waren, ergab die folzenden Werte

  Kohlenstoff ........................ 64,710/0

  Wasserstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I0,23 %

  Stickstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I,35 %

  Sauerstoff (aus der Differenz) ........ 23,710/0

  Eine Probe des Komplexes, die im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet und in einer Konzentration von etwa 5,53% in Chloroform (Gewicht/ Volumen) gelöst war, ergab im Infrarotspektrum über den Bereich von 2,8 bis i2,oy die folgenden ausgezeichneten Banden: 2,85, 3,40, 3,49, 5,79, 6,25, 6,86, 7,14, 7,26, 7,44, 7,8o, 8,05, 8,54, 8,98, 9,21., 9,49, 9,88, IOJ8, 10,43, 11,04, 11,16, 11,52 und :[i,9.
• Eine Röntgenstrahlenaufnahme unter Verwendung ungefilterter Chromstrahlung und einer Wellenlänge von 2,2896 Ä zur Berechnung der Netzebenenabstände ergibt die folgenden Werte:

  d (Netzebenenabstand) I-I' (relative Intensität)
  21,2 0,13
  i9,0 I,00
  16,7 0,03
  15,3 0J3
  11,0 0,05
  10,4 0,13
  10,1 0,13
  9,53 0,11
  8,25 0,ö8
  7,86 0,03
  7,57 0,13
  7,18 0,13

  d (Netzebenenabstand) I-I' (relative Intensität)
  6,92 0.13
  6,56 0,03
  6,30 0,03
  6,2o 0,21
  5,89 0,03
  5,65 0,05
  5,36 0,05
  5,17 0,11
  5,00 vw
  4,86 0,21
  4,74 0,05
  4,69 0,05
  4,52 0,05
  4,42 0,21
  4,28 vw
  4,11 o,08
  4,01 vw
  3,87 vw
  3,77
  3,71 vw
  3,58 0,03
  3,45 0,03
  3,28 vw
  3,19 vw
  3,1o vw
  2,73 vv'
  2,63 vw
  2,59 vw
  2,52 vVV
  2,49 vw
  2,34 vw
  vw bedeutet sehr schwach (very weak)

  Das T;ltraviolettabsorptionsspektrum einer äthanolischen Lösung des Komplexes zeigt ein Maximum bei 274 mu, E; cm = 1,07.
• Bei der Kristallisation aus Petroläther oder einer Mischung von Wasser und Aceton liefert der Komplex feine Nadeln des hexagonalen Systems, die eine parallele Auslöschung und eine positive Elongation zeigen, wobei die Elongation parallel zur cAchse verläuft. Bei 25° in Natriumlicht sind die Brechungszahlen der Kristalle folgende: e = 1,509, o9 = 1,499 Das Vorzeichen der Doppelbrechung ist positiv.
• Wäßrige Lösungen oder Suspensionen der antibiotischen Verbindungen der Erfindung sind bei Raumtemperatur innerhalb des pA-Bereiches von etwa 5 bis 8,5 ziemlich beständig. Bei einem pu außerhalb des obengenannten Bereiches verschwindet die antibiotische Kraft bald. Stärkere Säurelösungen bewirken einen schnellen Verlust an antibiotischer Kraft, und stärkere basische Lösungen wirken ebenso, wenn auch weniger schnell. Die höchste Beständigkeit von Lösungen der antibiotischen Verbindungen wird erreicht, wenn das pH der Lösungen zwischen pu 6 und 8 gehalten wird.
• Erythromycin und seine Salze enthalten im allgemeinen Wasser, wenn sie aus wasserhaltigen Lösungsmitteln kristallisiert wurden; sie können Alkohole und ähnliche Lösungsmittel enthalten, wenn sie aus solche Lösungsmittel enthaltenden Lösungen kristallisiert wurden. Der Gehalt an Wasser oder einem anderen Lösungsmittel scheint wenigstens zum Teil von den Bedingungen abzuhängen, unter denen die Kristallisation erfolgte, des weiteren vom Grad der Trocknung, welchem die Substanz unterworfen wurde. Die Gehalte können zwischen einer kleinen Menge und einer Menge bis hinauf zu mehreren Prozent schwanken.
• Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele erläutert: Beispiel I Herstellung des Erythromycins Es wird eine Impfkeimbrühe hergestellt, die folgende Zusammensetzung hat:

  Stärke ......................... 32 Pfund

  Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Pfund

  Kornweichwässer-Festkörper....... 1o Pfund

  Natriumchlorid . . . . . . . .. . . . . . . . . . 1o Pfund

  Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Pfund

  Wasser.......................... 9501

  Die Brühe wird in einen eisernen Tank von etwa 13001 Fassungsvermögen eingebracht und durch 3ominütiges Erhitzen unter Druck auf etwa 12o° sterilisiert. Die sterilisierte Brühe wird abgekühlt und aseptisch mit Sporen von Streptomyces erythreus, Stamm M5-12559, beimpft. Der Organismus wird bei etwa 26° in der Brühe während 45 Stunden wachsen gelassen. Während der Wachstumszeit wird die Brühe gerührt und mit steriler Luft in Mengen von etwa 0,5 Volumen Luft pro Volumen Kulturbrühe pro Minute belüftet.
• In einen etwa 6ooo 1 fassenden eisernen Tank wird eine Gärbrühe eingebracht, die folgende Zusammensetzung hat:

  Stärke ......................... 153 Pfund

  Sojabohnenmehl ................. 153 Pfund

  Kornweichwasser-Festkörper ...... 51 Pfund

  Calciumcarbonat .. . . . . . . . . . . . .. . . 33 Pfund

  Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Pfund

  Wasser .................... etwa 4500 1

  Die Kulturbrühe wird durch etwa 3o Minuten währendes Erhitzen unter Druck auf etwa 12o° sterilisiert. Die Brühe wird abgekühlt und die obige Impfkeimkultur aseptisch zugegeben. Der Organismus wird in der Brühe 4 Tage lang bei einer Temperatur von 26° wachsen gelassen. Während der Wachstumszeit wird die Brühe gerührt, und es wird sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa o,5 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute hindurchgeblasen. Am Ende der Wachstumszeit zeigt die Brühe eine antibiotische Aktivität von etwa I5o,ug Erythromycin pro Millimeter Brühe. Die Kulturbrühe (etwa 4ooo 1) wird mit 4o°/oiger Natriumhydroxydlösung auf ein pH von 9,5 eingestellt und zur Entfernung des Myceliums filtriert, wobei die Filtration durch Verwendung von 3 % vHy$o Super-Cel« (einer von der johns Manville Company in den Handel gebrachten Filterhilfe) unterstützt wird. Das klare Filtrat wird in einer Podbielniak-Extraktionsapparatur rnit Amylacetat unter Anwendung von i Volumen Amylacetat auf 6 Volumen geklärter Brühe extrahiert. Der Amylacetatextrakt wird seinerseits schubweise mit Wasser extrahiert, das durch Schwefelsäurezusatz auf ein pH von etwa 5 gebracht worden ist. Es werden zwei Extraktionen durchgeführt, die erste mit 1/2 Volumen und Idie zweite mit 1/4 Volumen des mit Schwefelsäure auf PH eingestellten Wassers. Die wäßrigen Extrakte werden vereinigt und mit Natriumhydroxydlösung auf PH 8 eingestellt. Die alkalische Lösung wird im Vakuum auf ein Volumen von etwa iio 1 eingedampft, dann durch Zusatz von Natriumhydroxydlösung auf pH 9,5 eingestellt und stehengelassen. Erythromycin scheidet sich als kristalline Substanz aus. Die Kristalle werden abfiltriert, die Mutterlauge wird durch Zusatz verdünnter Schwefelsäure auf ein pH von etwa 8 eingestellt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 751 eingestellt. Die Lösung wird auf etwa PH 9,5 eingestellt und stehengelassen, worauf sich eine zusätzliche Menge Erythromycin in kristalliner Form abscheidet. Die erhaltene Gesamtmenge Erythromycin beträgt etwa 256 g.
• Das Erythromycin wird durch mehrmaliges Umkristallisieren aus wäßrigem Aceton (2: i-Mischung) gereinigt.
• Beispiel 2 Herstellung von Erythromycinhydrochlorid i g Erythromycin wird in io ml Wasser suspendiert. Es wird verdünnte Salzsäure zugegeben, um das pH der Mischung auf 6,5 zu bringen. Die wäßrige Lösung wird im Vakuum auf etwa 1/1o ihres ursprünglichen Volumens konzentriert und in einer Kühlvorrichtung gekühlt, worauf Erythromycin-hydrochlorid in kristalliner Form ausfällt. Das salzsaure Salz wird aus einer Mischung von Äthanol und Äther durch Umkristallisieren gereinigt.
• Beispiel 3 Herstellung des Erythromycinkomplexes Es wurde eine Impfkeimbrühe hergestellt, die folgende Zusammensetzung hatte

  Stärke ......................... 30 Pfund

  Sojabohnenmehl ................. 30 Pfund

  Kornweichwasser-Festkörper ...... io Pfund

  Natriumchlorid . . . . . . . . . . . ....... io Pfund

  Calciumcarbonat . . . . . . .. . . . . . . . . . 6 Pfund

  Wasser ......................... 9501

  Die in einem eisernen Tank von etwa 13001 Fassungsvermögen befindliche Brühe wird durch 30 Minuten währendes Erhitzen unter Druck auf etwa 12o° sterilisiert. Die sterilisierte Brühe wird abgekühlt und unter aseptischen Bedingungen mit den Sporen von Streptomyces erythreus, Stamm M5-I2559, beimpft. Der Organismus wird bei etwa 26° in der Brühe während 45 Stunden wachsen gelassen. Während der Wachstumszeit wird die Brühe gerührt und mit steriler Luft in Mengen von etwa 1/2 Volumen Luft pro Volumen Kulturbrühe pro Minute belüftet. Am Ende der Wachstumsperiode wird ein gutes Wachstum der vegetativen Form des Organismus beobachtet.
• In einem etwa 6ooo 1 fassenden eisernen Tank wird ein Gärmedium eingebracht, das folgende Zusammensetzung hat

  Glucose......................... 25o Pfund

  Stärke.......................... 25o Pfund

  Sojabohnenmehl ................. 470 Pfund

  Kornweichwasser-Festkörper ...... 92 Pfund

  Brauereihefe .................... 5o Pfund

  Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . 2o Pfund

  Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5o Pfund

  Kobaltchlorid . . . . . . . . . . . . . . etwa 115 g

  Wasser .................... etwa 45001

  Die Kulturbrühe wird durch Erhitzen unter Druck in der gleichen Art wie die Impfkeimbrühe sterilisiert. Die abgekühlte Gärbrühe wird dann unter aseptischen Bedingungen mit etwa 475 1 der oben beschriebenen vegetativen Impfkulturbrühe beimpft und der Organismus in der Brühe 4 Tage lang bei einer Temperatur von 26° wachsen gelassen. Während der Wachstumszeit wird die Brühe gerührt; in die Brühe wird sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute eingeblasen. Während der Wachstumsperiode wird in Zwischenräumen die Menge an in der Kulturbrühe enthaltenem Antibiotikum mittels der Agarverdünnungsmethode bestimmt, bis die in der Brühe enthaltene Menge an Antibiotikum am Ende der 4tägigen Wachstumsperiode eine Aktivität erreicht hat, die etwa 250,ug Erythromycin pro Milliliter Brühe entspricht. Während der Wachstumsperiode ändert sich das pa der Brühe von seinem ursprünglichen Wert von PH 6,2 auf einen Wert von etwa B.
• Aus der Kulturbrühe wird das Antibiotikum in Form des Erythromycinkomplexes wie folgt isoliert: Die Kulturbrühe wird mit Hilfe von 3 °% »Hyflo Super-Cela durch eine 36zöllige Sperry-Presse filtriert. Das Filtrat wird durch Extraktion mit etwa 4001 Petroläther entfettet. Das extrahierte Filtrat wird durch Zusatz von Natriumhydroxydlösung auf etwa PH 8,5 eingestellt und mit zwei iooo-l-Anteilen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei sie 661 g eines dunkelbraunen Körpers ergeben. Die feste Substanz wird mit Petroläther zerrieben, wodurch der Erythromycinkomplex in Form eines hellgelbbraunen Festkörpers erhalten wird. Der Körper wird in einer Mindestmenge Äthanol gelöst und die Lösung mit Wasser versetzt, bis sie trübe wird. Die trübe Lösung wird in einer Kühlvorrichtung etwa 48 Stunden abgekühlt, wodurch der Komplex in Kristallform erhalten wird. Die rohen Kristalle werden aus einer Mischung von Alkohol und Wasser, wie oben beschrieben, kristallisiert und dann zweimal aus wäßrigem Aceton umkristallisiert. Die so erhaltene Substanz besteht im wesentlichen aus reinem Erythromycinkomplex, der bei etwa 82 bis 83° schmilzt. Beispiel 4 Reinigung des Erythromycinkomplexes durch Adsorption an Kohle i 1 der nach dem Schüttelkolbenverfahren des Beispiels 4 erhaltenen filtrierten Kulturbrühe wird mit 29 säurebehandeltem »Norit SG« (einer Aktivkohle) behandelt, die man durch 15 Minuten langes Verrühren der Kohle in dem Fünffachen ihres Volumens an 50,/oiger Essigsäure, Abfiltrieren der Kohle und Waschen mit dem 25fachen ihres Gewichts (trocken) an Wasser herstellt. Die Mischung aus Kohle und Brühe wird etwa :'/,Stunde gerührt, die Kohle abfiltriert und mit 5oo Milliliter Wasser gewaschen. Die Aktivkohle wird mit 50o Milliliter Butanol gerührt, um den Erythromycinkomplex zu eluieren. Die Mischung wird filtriert, um die Kohle zu entfernen, und das Butanolfiltrat, das dem Komplex enthält, azeotropisch zur Trockne verdampft. Der zurückbleibende Erythromycinkomplex wird durch Umkristallisation aus wäßrigem Äthanol gereinigt.
• Beispiel 5 Reinigung des Erythromycinkomplexes durch Cromatographie Rohes Erythromycin, wie es mit Hilfe der im Beispie13 beschriebenen Äthylacetatextraktion der Kulturbrühe erhalten wurde, wird in Benzol in einem Mengenverhältnis von etwa Zoo mg Rohkomplex pro 5 Milliliter Benzol gelöst.
• Die Benzollösung wird über eine Silicagelsäule geleitet, die etwa 2 X 30 cm groß ist. Die Säule wird mit einer Mischung von 15 % Methanol in Benzol gewaschen, um eine inaktive braungefärbte Substanz zu entfernen. Der Komplex wird aus der Säule durch Methanolwäsche eluiert. Das Methanoleluat wird im Vakuum zur Trockne verdampft. Der zurückbleibende Erythromycinkomplex, der bis zu go °Jo rein ist, wird durch Umkristallisation aus wäßrigem Aceton gereinigt.
• Beispiel 6 Reinigung des Erythromycins durch Chromatographie Eine wäßrige, Erythromycin enthaltende Lösung, wie sie nach dem Verfahren des Beispiels i durch Extraktion der filtrierten .Kulturbrühe mit Amylacetat und durch Extraktion des letzteren mit Wasser erhalten wurde, wird mit wäßrigem Alkali auf pH 9,5 eingestellt und mit Benzol extrahiert.
• Ein ioo-ml-Teil des Benzolextrakts, der eine antibiotische Aktivität entsprechend io mg Erythromycin pro Milliliter Benzol enthält, wird über eine Magnesium Aluminium-Silikat-(Florisil)-Säule geschickt, die 2,5 cm im Durchmesser mißt und etwa 30 cm lang ist. Die Säule wird mit einer 5°/oigen Methanollösung in Benzol gewaschen, um ein in der Säule erscheinendes braunes Band zu entfernen und bis das Eluat im wesentlichen farblos durchläuft. Das in der Säule adsorbierte Antibiotikum wird durch Elution mit einer 5o°/oigen Methanollösung in Benzol entfernt. Das Eluat wird im Vakuum zur Trockne verdampft und das zurückbleibende Erythromycin aus wäßrigem Aceton umkristallisiert.
• Beispiel Herstellung von Erythromycin aus dem Erythromycinkomplex i g Erythromycinkomplex wird in ioo Millilitei Wasser suspendiert und die Suspension durch Zusatz verdünnter Salzsäure auf pH 6,3 eingestellt. Die wäßrige Mischung wird mit verdünntem Chloroform extrahiert und die extrahierte wäßrige Lösung mii Natriumhydroxydlösung auf etwa pn 9,8 eingestellt Die alkalische Lösung wird zweimal mit gleicher Volumenteilen Amylacetat extrahiert, die Amylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne verdampft. Die zurückbleibende Erythromycinbase wird aus wäßrigem Äthanol umkristallisiert.

Claims (3)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Erzeugung eines Antibiotikums und dessen Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces erythreus in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen submers züchtet, das assimilierbare Kohlenhydrate, Stickstoffverbindungen und anorganische Salze enthält, bis der Organismus in diesem Kulturmedium starke antibiotische Aktivität entwickelt, und daß man das Antibiotikum Erythromycin aus diesem Kulturmedium durch Extraktion gewinnt und, gegebenenfalls mit einer geeigneten Säure, zum entsprechenden Salz umsetzt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturflüssigkeit bei einem p.u von etwa g bis io mit einem mit Wasser nicht mischbaren, polaren organischen Lösungsmittel extrahiert wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch i oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus Streptomyces erythreus, Stamm M5-12559, ist.