DE1492035C3 - Josamycin und dessen pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze und Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums - Google Patents
Josamycin und dessen pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze und Verfahren zur Herstellung dieses AntibiotikumsInfo
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Description
CHO
,/chj
dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces narbonensis var. josamyceticus ATCC 17 835 in einem
üblichen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 25 bis 3OC C züchtet und
anschließend das gebildete Antibiotikum nach üblichen Methoden aus der Gärflüssigkeit abtrennt.
Die Erfindung betrifft das neue Antibiotikum Josamycin der folgenden allgemeinen Formel
HO
CHO
^CH
und dessen pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze sowie ein Verfahren zur Herstellung von
Josamycin.
Es wurde gefunden, daß sich dieses neue Macrolid-Antibiotikum in den Eigenschaften von anderen bekannten
Macrolid-Antibiotika unterscheidet, wie Erythromycin, Oleandomycin, Leukomycin, Spiramycin.
Tylosin.Angolamycin.Albomycetin.Tertiomycin, Methymycin.
Picromycin.
Josamycin inhibiert das Wachstum von gramposi-
O CH3
liven Bakterien, wie Staphylokokken, bei einer Kon-6o.
zentration von 0,2 bis 1,5 μg/ml und inhibiert auch das
Wachstum von Staphylokokken, die gegen Streptomycin. Telomycin, Streptothricin, Chloramphenicol
oder Penicillin resistent sind, und besitz.! geringe
Toxizität.
In einigen Versuchen wurde die Wirkung von Josamycin und die von Josamycintartrat geprüft.
Die hierbei erhaltenen Ergebnisse werden nachstehend beschrieben.
Antibakterielles Spektrum von Josamycin
Organismus
Inhibierungskonzentration (!ig/ml)
Josamycin
Bacillus megatherium 10 778 Bacillus megatherium APF Bacillus cereus
Bacillus agri
Bacillus agri
Bacillus subtilis PCI 219 S. lutea PCI 1001
Micrococcus flavus
Staph. aureus Terajima Staph. aureus Smith
Staph. aureus FDA 209 P (ATCC 6538 P)
Micrococcus flavus
Staph. aureus Terajima Staph. aureus Smith
Staph. aureus FDA 209 P (ATCC 6538 P)
Mycobacterium 607
Mycobacterium phlei
Staph. citreus
E. coli 0-1
Mycobacterium phlei
Staph. citreus
E. coli 0-1
S. cholerae-suis S-34
S.typhi H 901 W
S.typhi H 901 W
S. enteritidis S-64
Sh. flexneri Ew-10
Sh. sonnei Ew-34
Sh. flexneri Ew-10
Sh. sonnei Ew-34
Staphylococcen, resistent gegen:
Streptothricin
Amphomycin
Penicillin
Actinomycin
Erythromycin
Carbomycin
Telomycin
Streptomycin
Chloramphenicol
0,39 0,39 0,39 unter 0,01 0,19 0,02 0,05 0,78 0,78 0,39
3,1
3,1
0,39 über 50
6,3 über 50 über 50 über 50 über 50
0,78 0,39 0,39 0,39
25
über
50 0,39 0,63 1,56
Josamycintartrat
0,39 0,39
0,02 0,04 0,78 0,78 0,78
1,56 1,56 0,39 über 1,00
über 1,00
Josamycin ist wirksam bei Infektion von Tieren mit Staphylokokken. Eine Maus (ddN, Körpergewicht
20 g) wird von Staphylokokkeninfektion (Stamm Smith) vollständig durch zwei intraperitoneale Injektionen
von 0,25 mg je Maus (Pulver von 90% Reinheit gemäß Beispiel 1) geschützt. Josamycin ist auch wirksam
gegen Infektion von Tieren mit Diplokokkus pneumoneae. Die Infektion einer Maus (ddN. Körpergewicht
20g) mit Diplokokkus pneumoneae (Typ III)
wird vollständig durch drei intraperitoneale Injektionen von 0,25 mg je Maus verhindert.
Bei intravenöser Injektion von 250 mg Josamycin/kg Maus überlebten Mäuse ohne jede Nebenreaktion.
Eine therapeutische Wirkung bei der Infektion von Menschen, insbesondere mit resistenten Staphylokokken,
wurde festgestellt.
Das Josamycin ist in Wasser schwach löslich, leicht löslich in Methanol, Chloroform, Äthylacetat und
Aceton und löslich in Benzol, Äther und Tetrachlorkohlenstoff; schwach löslich in Petroläther, Ligroin
und η-Hexan, zeigt ein Absorptionsmaximum bei 232 π\μ (E-*m = 320) in methanolischer Lösung und
ein Absorptionsmaximum bei 232 m;j. (Ej*m = 325)
in 0,001 n-HCl-Lösung. Es besitzt, wenn es mit Kaliumbromid vermischt ist, Banden bei den folgenden
ίο Wellenzahlen: 3480, 2960, 2930, 2880 (Schulter), 1734,
1627, 1452, 1374, 1297, 1234, 1165, 1120, 1080, 1050,
1020, 995, 936, 916, 855 und 837Cm"1. Ferner besitzt
es eine optische Drehung von [«]J D 5 = —70° in l%iger
Äthanollösung und hat einen pK-Wert von 7,1 bei elektrometrischer Titration in einem Methanol-Wassergemisch
(Volumenverhältnis 4:6). Die qualitative Prüfung auf Halogen, Schwefel und Phosphor ist
negativ. Bei einer Erythromycin-Prüfung mit Schwefelsäure ergibt die Verbindung eine purpurrote Färbung,
die sich beim Erhitzen nach tiefpurpur ändert.
Das UV-Absorptionsspektrum von Josamycin ist in F i g. 1 wiedergegeben, die F i g. 2 zeigt das IR-Absorptionsspektrum
und F i g. 3 das N.M.R.-Spektrum des neuen Antibiotikums.
Bei der Phloroglycin-Salzsäure-Reaktion ergibt die Verbindung eine orangegelbe Färbung, eine negative
Fuchsin-Sulfit-Reaktion, Ferrichlorid-Reaktion, alkalische Silbernitrat-Reaktion, Fehlingsche Reaktion,
Ninhydrin-Reaktion, Millon-Reaktion, Biuret-Reaktion, Molisch-Reaktion und Elson-Morgan-Reaktion.
Sie zeigt einen RF-Wert von 0,49 bei der Papierchromatographie unter Verwendung von Benzol—Chloroform
(Volumenverhältnis = 1:1), einen RF-Wert von 0,64 bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung
von Silicagel G und Entwicklung mit n-Butylalkohol—Essigsäure—Wasser
(Volumenverhältnis = 3:1:1).
Wie sich aus dem pK-Wert ergibt, stellt das Josamycin eine basische Substanz dar und bildet ein wasserlösliches
Hydrochlorid, Sulfat und Tartrat.
Das Antibiotikum Josamycin der oben angegebenen Formel wird erfindungsgemäß dadurch hergestellt,
daß man Streptomyces narbonensis var. josamyceticus ATCC 17 835 in einem üblichen Nährmedium
unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 25 bis 30° C züchtet und anschließend
das gebildete Antibiotikum nach üblichen Methoden aus der Gärflüssigkeit abtrennt.
Der das Josamycin liefernde Mikroorganismus, Stamm A 204-P2 wurde erstmals aus einer Bodenprobe
bei Motoymma, Nagaoka-gun, Kochi-ken, in Japan isoliert.
Der Organismus wurde beim »Department of Antibiotics, The National Institut of Health« und bei
der »American Type Culture Collection« unter den Kulturnummern NIHJ 440 bzw. ATCC 17 835 uneingeschränkt
hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wird als »Streptomyces narbonensis var. josamyceticus« bezeichnet
und besitzt folgende biologische Eigenschaften:
Die mikroskopische Beobachtung ergibt, daß der Mikroorganismus zu einer Genus von Streptomyces
gehört, welche das Luftmycel vom Substratmycel von etwa 1 μ. Breite ausstreckt und Ketten von Sporen
an der Spitze des Luftmycels bildet. Es wurden weder Wirbel noch Spiralen beobachtet.
Der neugefundene Stamm zeigt auf verschiedenen Kulturmedien die folgenden Merkmale:
1. Auf einem Glycerin-Nitrat-Agarmedium (Glycerin-Czapek-Agarmedium)
bei 27° C zeigt der Stamm ein cremefarbenes oder schwachgelbbraungefärbtes
Wachstum, und man beobachtet ein pulvriges hellbräunlichgraues Luftmycel. Kein lösliches Pigment.
2. Auf einem Dextrose-Asparagin-Agarmedium (Krainsky - Dextrose - Asparagin - Agarmedium) bei
27° C zeigt der Stamm ein dünnes, gelblichbraunes Wachstum. Die anderen Merkmale sind dieselben
wie bei 1.
3. Auf einem Calciummalat-Agarmedium bei 27° C zeigt der Stamm ein dünnes, gelblichbraunes Wachstum,
jedoch weder Luftmycel noch lösliche Pigmente, Calciummalat wird um das Wachstum herum gelöst.
4. In Peptonwasser, das 0,2% Natriumnitrat enthält, wird bei 37° C ein farbloses Mycel, jedoch weder
Luftmycel noch lösliches Pigment gebildet. Nitrat wird nicht reduziert.
5. Auf einem Stärke-Agarmedium bei 27° C zeigt der Stamm ein gräulichgelbbraunes Wachstum, und es
werden kaum Luftmycel und Pigment gebildet. Stärke wird nach 7tägiger Züchtung hydrolysiert, und es zeigt
sich ein hydrolisierter Ring von 10 mm Durchmesser bei der Jodalkali-Stärkereaktion.
6. Auf einem Tyrosin-Agarmedium bei 27° C zeigt der Stamm ein farbloses Wachstum, doch werden
kaum Luftmycel und lösliche Pigmente gebildet.
7. Auf einem Kartoffelstopfmedium bei 27° C zeigt der Stamm ein gelblichbraunes Wachstum und bildet in
schwachem Ausmaß weißes Luftmycel. Das Medium ändert sich oft nach gelblichbraun.
8. Auf einem Karottenstopfmedium bei 27° C zeigt der Stamm ein gelblichbraunes Wachstum, und es
werden kaum Luftmycel und lösliches Pigment gebildet.
9. Auf einem Eierkulturmedium bei 37° C zeigt der Stamm ein farbloses Wachstum, und es sind weder
Luftmycel noch lösliches Pigment zu beobachten.
10. Auf einem BIut-Agarmedium bei 37° C zeigt der
Stamm ein farbloses Wachstum, und es werden weder Luftmycel noch lösliches Pigment gebildet. Es wird
keine Haemolyse beobachtet.
11. Auf einem koagulierten Serummedium nach
L ο e f f I e η bei 37° C zeigt der Stamm ein farbloses
Wachstum, und es werden weder Luftmycel noch lösliches Pigment gebildet. Es wird keine Verflüssigung
beobachtet.
12. Auf einem Gelatinemedium bei 18 bis 20° C
zeigt der Stamm ein cremegefärbtes Wachstum, und es ist kein Luftmycel zu beobachten. Manchmal wird
eine geringe Menge an löslichem gelbem Pigment gebildet. Die Verflüssigung der Gelatine ist stark.
13. Auf einem Magermilchmedium bei 37° C wird ein cremefarbenes Ringwachstum auf der Oberfläche
gebildet, doch ist kein Luftmycel und kein lösliches Pigment zu beobachten. Koagulierung und Peptonisierung
sind zu beobachten.
14. Auf einem Cellulosemedium (Filterpapier) bei
27 C zeigt der Stamm ein farbloses Wachstum, und es werden weder Luftmycel noch lösliches Pigment
gebildet. Die Cellulose wird nicht zersetzt.
15. Auf einem Nähragarmedium bei 37" C bildet der Stamm gclblichbrauncs schwaches Wachstum,
und es werden weder Luftmycel noch lösliches Pigment gebildet.
16. Die beobachtete Verwertung von KohlenstofT-quellen
war wie folgt: Bei der Prüfung in einem Pridham-Gottlieb- Kulturmedium werden Raffinose,
Stärke, Dextrose, Dextrin, Xylose, Maltose, Saccharose, Galactose, Laevulose, Arabinose, Inulin und
Glycerin verwertet, nicht jedoch Inosit, Mannit, Rhamnose, Sorbit, Dulcit, Lactose und Mannose.
Der neue Mikroorganismus mit den oben angegebenen Eigenschaften ist ein nicht chromogener
Typ. Er zeigt proteolytische Wirkung in einem Gelatinemedium und in einem Milchmedium, zeigt
keine Tyrosinasereaktion, reduziert Nitrat nicht, zersetzt Cellulose nicht, zeigt eine stärkehydrolisierende
Wirkung und zeigt keine Haemolyse und keine Verflüssigung von koaguliertem Serum.
Es ist bekannt, daß zum Genus Streptomyces gehörige bekannte Stämme, weiche ähnliche Merkmale
wie der neue Stamm zeigen, wie Streptomyces felleus und Streptomyces narbonensis Makrolid-Antibiotika
bilden. Streptomyces felleus unterscheidet sich jedoch von dem das .Iosamycin bildenden Stamm darin, daß
Streptomyces felleus gut auf einem Cellulosemedium wächst und Nitrate reduziert. Bezüglich Streptomyces
narbonensis ist es bekannt, daß der Stamm ein blaugraues oder rotgraues Wachstum auf einem Kartoffelmedium
zeigt. Der das Josamycin bildende Stamm unterscheidet sich von Streptomyces narbonensis
weiter darin, daß Streptomyces narbonensis bekanntlich Antibiotika liefert, welche zur Methymycin-Narbomycin-Picromycin-Gruppe
gehören, die alle ein Maximum der U.V.-Absorption bei 223 bis224m(i
zeigen, während das von dem neuen Stamm gebildete Josamycin zu einer Gruppe von Makroliden gehört,
die sich von der obigen Gruppe unterscheidet, und zu denen das Spiramycin, Tertiomycin und Leukomycin
gehört und die ein Maximum der U.V.-Absorption bei 231 bis 233 ΐημ besitzen.
Das in Antibiotika (1961), S. 165 bis 170, von Korzybski und Kurylowski beschriebene
Narbomycin und Picromycin besitzen andere Eigenschaften und Strukturen als das erfindungsgemäße
Josamycin.
Josamycin zeigt außerdem im N. M.R.-Spektrum ein sehr deutliches Signal Tür CH3O bei 3,43 ppm
(3 Protonen) und ebenfalls ein sehr deutliches Signal für —CHO bei 9,55 ppm (1 Proton). Diese Gruppen
weisen Picromycin und Narbomycin nicht auf.
Der das Josamycin liefernde Stamm unterscheidet sich daher von Streptomyces narbonensis und gehört
zu einer neuen Varietät von Streptomyces narbonensis, die als Streptomyces narbonensis var. josamyceticus
mit der angegebenen Nummer bezeichnet wird.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt wie nachstehend beschrieben.
Die Züchtung der das Josamycin liefernden Stammes erfolgt nach bekannten Methoden durch Impfen
der Sporen oder des Mycels des betreffenden Stammes in einem üblichen Kulturmedium und Kultivierung
unter aeroben Bedingungen. Es kann eine Festkulturzüchtung angewandt werden, jedoch wird zur Bildung
einer großen Menge an Josamycin eine Flüssigkultur bevorzugt. Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen
bei 25 bis 30°C durchgeführt. Als Kohlenstoffquellen können Glycerin, Dextrose, Laevulose, Maltose,
Saccharose, Dextrin, Stärke, öle und Fette in reinem oder rohem Zustand verwendet werden. Als
Stickstoffquclle können Sojabohnenmehl. Distillers Solubles. F.rdnußmehl, Baumwollsamenmehl. Fleischextrakt.
Pcplon. Fischmehl. Hefeextrakl. Maisquellwasser.
Kasein. Kascinhydrolisat verwendet werden.
Erforderlichenfalls können anorganische Stickstoffquellcn.
Nitrate oder Ammoniumsalze zugegeben werden sowie Natriumchlorid, Phosphat, Magnesiumsalze,
Pufferungsmittel, wie Calciumcarbonat. Weiter kann erforderlichenfalls eine kleine Menge an Schwermetallsalzen
zugegeben werden. Es können auch die in der kanadischen Patentschrift 5 13 324, den britischen
Patentschriften 7 30 341 und 7 36 325 und den U SA.-Patentschriften 26 91618, 26 58 018,
26 53 899, 25 86 762, 25 16 080, 24 83 892, 26 09 329 und 27 09 672 beschriebenen Kulturmedien sowie
Medien, die für die Züchtung von Aktinomyceten bekannt sind, angewandt werden.
Ein bekannter Schaumbrecher, wie flüssiges Paraffin, öle und Fette und Siliconharze können verwendet
werden. Die Züchtung wird so lange fortgesetzt, bis eine genügende Menge von Josamycin gebildet
ist, gewöhnlich 2 bis 5 Tage.
Es wurden folgende Züchtungs- und Prüfmethoden
angewandt: „,..,, ,
Schuttelkulturmethode
100 ml eines in einen 500-ml-Kolben eingebrachten
entsprechenden Kulturmediums werden nach 20minütiger Sterilisation bei 12O0C mit den Sporen oder
dem Mycel des Josamycin produzierenden Stammes beimpft, und die Schüttelkultur (130 Hübe je Minute,
Amplitude = 8 cm) wird bei 27 bis 29° C durchgeführt.
Tankkulturmethode
Nachdem 50 l/Min, eines entsprechenden Kulturmediums,
die in einen 100-1-Behälter aus rostfreiem
Stahl eingebracht sind, 20 Minuten bei 12O0C sterilisiert
wurden, wird das Kulturmedium (50 1 pro Minute) belüftet und mit 200 Umdrehungen pro Minute gerührt,
wobei als Schaumbrecher ein Siliconharz und ein Sesamöl verwendet werden.
Prüfung auf Josamycin
Es wird eine Zylinderplattenmethode angewandt, wobei die Arbeitsweise die gleiche ist wie zur Bestimmung
von Penicillin. Der das Josamycin produzierende Stamm wird zuerst einer Schüttelkultur unter
Verwendung eines Kulturmediums unterzogen, das 1,5% Sojabohnenmehl, 1,0% Glukose, 1,0% Stärke,
0,3% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat enthält (pH = 6,4,
nicht eingestellt, bei 28° C für 4 Tage). Bei Prüfung der bei dreitägiger Züchtung erhaltenen Kulturflüssigkeit
wurde eine Inhibierungszone von 22 mm beobachtet.
Die Ergebnisse der Versuche zur Prüfung der Bildung von Josamycin durch den betreffenden Stamm
in verschiedenen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in verschiedenen Kulturmedien bei Schüttelkultur
sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Itärke | lucose | C | ! | ,5 | ssei | Kulturbestandteile | :hextr; | epton | ,HPOj | co CJJ |
Cn | CJ | o" U |
Züchtung | Inhibi | Züchtung | Inhibi | Züchtung | PH | Tage | |
in | Ü | ihnenr | ,5 | uellwa | Uh | CL | i*H | h iischer |
O | 3 Tage | tions- zone |
4 Tage | tions- zone |
5 | Inhibi | ||||||
iiaisq | :miscl orgar |
(mm) | (mm) | 7.0 | tions- zone |
||||||||||||||||
Z JZ. O |
1 | 1 | ld. | 0,1 | 0.05 | O S. | 0.3 | PH | 23.4 | PH | 24.3 | 6,6 | (mm) | ||||||||
Vers | 2 | I | ,5 | 0,1 | 0.05 | 0,3 | 23.5 | 23,8 | 6.8 | 24,6 | |||||||||||
2 | 1 | 0,2 | 0.05 | 0,3 | 6,4 | 23,0 | 7.0 | 23,7 | 6.2 | 24,5 | |||||||||||
I | 2 | 2 | ,5 | 0,2 | 0.3 | 6.8 | 22,3 | 7,0 | 24,0 | 5.8 | 24,0 | ||||||||||
2 | 2 | 2 | 0,2 | 0.2 | 0.3 | 5.8 | 23,2 | 7,0 | 25,0 | 6.4 | 25.1 | ||||||||||
3 | 2 | 2 | 0,2 | 0.2 | 0.3 | 5,8 | 22.0 | 6.2 | 23,1 | 7.4 | 26.1 | ||||||||||
4 | 1 | I | 0,1 | 0.2 | 0.3 | <5,8 | 24,1 | 6,2 | 24,7 | 5.8 | 24.4 | ||||||||||
5 | 2 | 2 | 0,2 | 0.05 | 0.2 | 0.3 | <5,8 | 23,7 | <5,8 | 23,9 | 6,8 | 24.3 | |||||||||
6 | ! | 1 | 0,25 | 0,1 | 0,05 | 0.3 | 6,4 | 22,1 | 7,4 | 23,6 | 6,6 | 26.1 | |||||||||
7 | 2 | 1 | 0,25 | 0,1 | 0,05 | 0.3 | <5,8 | 22,8 | 6.2 | 23,8 | <5,8 | 23,7 | |||||||||
8 | 2 | 2 | 0,25 | 0,1 | 0,05 | 0.3 | <5.8 | 21,7 | 6,6 | 23,2 | 5.8 | 24.5 | |||||||||
9 | 2 | 2 | 0,25 | 0.2 | 0,05 | 0.3 | <5,8 | 22.1 | 6.8 | 23,7 | 5,8 | 24.6 | |||||||||
10 | 2 | 2 | 0,25 | 0,1 | 0.3 | <5.8 | 21,3 | <5,8 | 23,3 | 5.8 | 24,1 | ||||||||||
11 | 2 | 2 | 1.5 | 0,5 | 0,2 | 0.2 | 0.3 | 6,2 | 21,4 | 6,2 | 23,6 | 6.6 | 24.5 | ||||||||
12 | 1 | 1 | 0.5 | 0,5 | 0,1 | 0,05 | 0.4 | 0.3 | <5,8 | 22,4 | <5.8 | 21,8 | 6.4 | 26.2 | |||||||
13 | 2 | 1 | ,5 | 1,5 | 0,5 | 0,5 | 0,1 | 0,05 | 0,3 | <5,8 | 22,7 | 6,2 | 22,4 | <5.8 | 23.1 | ||||||
14 | 2 | 2 | ,5 | I | I | 0,2 | 0,05 | 0,3 | 6.2 | 22,1 | 6.4 | 22,4 | 5.8 | 23,1 | |||||||
15 | 2 | 2 | ,5 | I | I | 0.2 | 0,3 | <5,8 | 18,0 | 6.6 | 21,8 | 6.2 | 24,1 | ||||||||
16 | 2 | 2 | ,5 | I | 1 | 0,3 | 0.2 | 0.3 | <5,8 | 15.4 | <5.8 | 21.5 | 6.6 | 23,6 | |||||||
17 | 2 | I | ,5 | 0.5 | 0,5 | 0,2 | 0.05 | 0.2 | 0.3 | <5.8 | 20,4 | <5.8 | 22.3 | 6.4 | 23.8 | ||||||
18 | 2 | 2 | I | I | 0,05 | 0.3 | 0.2 | <5.X | 24,2 | <5.8 | 21.8 | 6.X | 22.3 | ||||||||
19 | 2 | 2 | 2 | 0,05 | 0.3 | 0.2 | <5.8 | 20,4 | 7.0 | 21.8 | 6.6 | 23.9 | |||||||||
20 | 2 | 2 | 0,05 | 0.3 | 0.2 | 6.2 | 24.x | 6,2 | 23.3 | 6.6 | 23.1 | ||||||||||
21 | 2 | 2 | 2 | 1 | 0,05 | 0,3 | 0.2 | 6.0 | 21.7 | 6.4 | 22.8 | 6.6 | 26.0 | ||||||||
22 | 2 | 2 | I | 1 | 0.05 | 0.3 | 0.2 | 6.4 | 22.3 | 6.2 | 22.3 | 6.x | 24.9 | ||||||||
23 | 2 | 2 | 0,5 | 0.3 | 0.2 | 6.6 | 22.7 | 6.4 | 21.6 | 6.6 | 25.0 | ||||||||||
24 | 2 | 2 | I | 0.2 | 0.3 | 0.2 | 6.2 | 22.6 | 5.8 | 6.2 | 23.1 | ||||||||||
25 | 2 | 2 | 2 | 0.2 | 0.3 | 0.2 | 6.6 | 16.6 | 6.6 | 24.0 | - 5.x | 24.7 | |||||||||
26 | 2 | T | 0.5 | 0.2 | 0.3 | 0.2 | 6.4 | 1X.6 | 6.4 | 17.0 | 6.X | 26.4 | |||||||||
27 | 2 | 2 | I | I | 0.2 | 0.3 | 0.2 | 6.2 | 21.'J | 6.2 | 23.9 | 5.x | 19.5 | ||||||||
28 | 2 | 2 | 0.25 | 0.2 | (1.3 | 0.2 | •-5.X | 21.2 | - 5.X | 23.x | 23.9 | ||||||||||
29 | I | 6.2 | 6.4 | 24.4 | |||||||||||||||||
30 | - 5.x | 5.x | |||||||||||||||||||
31 | |||||||||||||||||||||
509 525/125
(Das Gemisch anorganischer Salze in der vorstehenden Tabelle enthält die folgenden Bestandteile:
MgSO4 100g. CuSO4-SH,O 0,5 a, FeSO4 -7H-,O
20 g, MnSO4-5 H,O 0,4 g, ZnSO4 -7 H,O l,0"g,
CoCl2-OH2O 0,1g, cone. HCl 1,0ml, destilliertes
Wasser 1000 ml.)
Aus der obigen Tabelle ist ersichtlich, daß Stärke und Glukose Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen
und Fleischextrakt, Pepton und Sojabohnenmehl, Beispiele geeigneter Stickstoffquellen sind. Ein Kulturmedium,
das 1,5% Sojabohnenmehl, 1,0% Stärke, 1,0% Glukose, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrophosphat
und 0,05% Magnesiumsulfat enthält (pH nicht eingestellt), stellt beispielsweise ein
zur Bildung von Josamycin geeignetes Kulturmedium dar. Wenn die Züchtung in einem 100-1-Tank unter
Verwendung des obigen Kulturmediums 40 Stunden durchgeführt wurde, war der pH-Wert des Mediums
6,4, und bei der Zylinderplattenmethode unter Verwendung von Bazillus subtilis wurde beim Filtrat
der Züchtung ein Inhibierungsdurchmesser von 25 mm beobachtet. Der pH-Wert für eine maximale Bildung
an Josamycin wird durch die Zusammensetzung des verwendeten Kulturmediums beeinflußt.
Das Josamycin ist in der Kulturbrühe sowohl im flüssigen Teil als auch im festen, Mycel enthaltenen
Teil vorhanden. Bei hoher Produktionskraft und wenn der pH-Wert der Kulturflüssigkeit neutral oder alkalisch
ist liegt Josamycin auch in festen Anteilen vor, während in Fällen, wo die Kulturflüssigkeit sauer ist,
Josamycin vor allem in flüssigem Anteil vorliegt.
Um das Josamycin aus dem flüssigen Anteil zu isolieren, wird die Kulturflüssigkeit in einen flüssigen
Teil und einen festen Teil in üblicher Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, getrennt.
Das in der wäßrigen Lösung befindliche Josamycin kann bei neutraler oder schwach alkalischer Reaktion
mit einem organischen Lösungsmittel, wie Butylacetat.
Äthylacetat, Chloroform, Methylisobutylketon, Butylalkohol oder anderen, mit Wasser nicht mischbaren
Lösungsmitteln und in denen Josamycin löslicher ist als in Wasser, extrahiert werden. Josamycin
kann direkt aus der mycelhaltigen Kulturbrühe mit einem organischen Lösungsmittel ohne Abtrennung
des festen Anteils vom flüssigen Anteil extrahiert werden. Aus dem mycelhaltigen festen Anteil kann das
Josamycin mit einer sauren wäßrigen Lösung oder einem Lösungsmittel, in dem Josamyci" oder deren
Säuresalze löslich sind, extrahiert werden. Das mit einem organischen Lösungsmittel extrahierte Josamyein
wird dann in saures Wasser gegeben. Weiterhin kann das Josamycin aus einer wäßrigen Lösung eines
Säuresalzes durch Neutralisation oder schwaches Alkalisieren ausgefällt werden.
Josamycin kann auch an Aktivkohle aus einer waßrigen Lösung, beispielsweise aus der Kulturbrühc,
adsorbiert werden. Das adsorbierte Josamycin kann dann mit saurem Wasser oder mit Alkoholen. Aceton
oder anderen entsprechenden organischen Lösungsmitteln, eluiert werden. Josamycin hat schwach basisehen
Charakter und wird an Ionenaustauschern, wie lonenaustauscherharzcn und Celluloscionenaustauschern.
adsorbiert, wenn die wäßrige Lösung von Josamycin mit einem solchen Ionenaustauscher behandelt
wird.
Das beispielsweise mit Allylacetat. Chloroform,
Butylalkohol. Aceton oder Methylalkohol extrahierte .Iosamycin kann aus der organischen Lösung durch
Verdampfen im Vakuum konzentriert werden. In diesem Fall wird der pH-Wert des Systems vorzugsweise
neutral oder schwach sauer gehalten, wobei Josamycin stabil ist. Gegebenenfalls kann auch eine
Schnellverdampfung oder Sprühtrocknung angewandt werden.
Verunreinigungen, die in rohem Josamycin enthalten sind, können durch Auflösen des Rohproduktes
in einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylalkohol, Äthylacetat oder Benzol, oder durch Waschen des
Rohproduktes mit einem Josamycin unlöslichen organischen Lösungsmittel, wie Petroläther oder n-Hexan,
entfernt werden. Außerdem kann die Entfernung von Verunreinigungen durch Ausfällen von Josamycin
aus einer josamycinhaltigen, organischen Lösung durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels, wie
Petroläther oder η-Hexan, in welchem Josamycin nicht löslich ist, begünstigt werden. Weiterhin kann
das Josamycin aus einer organischen Lösung von Verunreinigungen dadurch getrennt werden, daß man
den Unterschied der Adsorptionsfähigkeit an verschiedenen Adsorbentien ausnutzt. So kann beispielsweise
durch Adsorbieren von Josamycin an Aluminiumoxyd und anschließendes Eluieren mit Aceton
oder Äthylacetat hochreines Josamycin erhalten werden.
Zur weiteren Reinigungen von Josamycin können Gegenstromverteilungsmethoden und chromatographische
Methoden angewandt werden. So kann beispielsweise nach einer Adsorption an Aluminiumoxyd
das Josamycin mit Äthylacetat eluiert werden. Auch nach einer Adsorption von Josamycin an einem
schwach sauren Ionenaustauscherharz oder an SiIikagel
kann das Josamycin eluiert und gereinigt werden. Reines Josamycin kann aus dem Eluat durch
Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum und Umkristallisation aus Benzol oder Toluol erhalten werden.
Wenn die Ausbeute an Josamycin in der Kulturflüssigkeit hoch ist, kann Josamycin in Kristallform
ohne Anwendung solcher Arbeitsweisen, wie chromatographische Methoden und Gegenstromverteilung,
gewonnen werden.
100 ml eines Kulturmediums, das aus 1,5% Sojabohnenmehl, 1% Stärke, 1% Glukose, 0,3% Natriumchlorid,
0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat bestand, wurden in einen 500-ml-Kolben
eingebracht und 20 Minuten bei 120"C sterilisiert. Nach Abkühlen wurde das Kulturmedium mit
dem Stamm Streptomyces narbonensis yar. josamyceticus, ATCC 17 835, beimpft, und der Stamm wurde
einer Schüttelkultur bei 27 bis 29°C und 130 Hüben je Minute, Amplitude = 8 cm, unterworfen. Nach
dreitägiger Züchtung wurden dann die Kulturflüssigkeiten von 100 solchen Kolben vereinigt und filtriert,
wobei 8700 ml Filtrat erhalten wurden. Der pH-Wert des Filtrates betrug 6,4, und das Filtrat zeigte eine
Inhibierungszone von 25 mm gegenüber B. subtilis (Stamm PCI 219). Das Filtrat wurde mit 8700 ml
Äthylacetat extrahiert. Der erhaltene Extrakt (7300 ml) wurde dann unter Vakuum bei einer Temperatur unter
50" C auf 730 ml eingeengt, mit 360 ml Wasser versetzt und dann mit konzentrierter Salzsäure versetzt, so
daß der pH-Wert des Hxlraktes 2,0 betrug und das Josamycin in die wäßrige Schicht übergeführt wurde.
Dann wurde der pH-Wert der wäßrigen Schicht durch Zugabe von n/10 Natriumhydroxidlösung auf 7,5
eingestellt und das Josamycin mit 180 ml Äthylacetat extrahiert. Dieser Extrakt wurde nun in 90 ml Wasser,
das mit Salzsäure auf einen pH 2,0 angesäuert war, gegeben, das organische Lösungsmittel abgetrennt
und die wäßrige Lösung nach dem Alkalischstellen wie oben wieder mit 45 ml Äthylacetat extrahiert.
Die erhaltene Äthylacetatlösung wurde anschließend unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit,
wobei ein festes Produkt erhalten wurde, das man in 5 ml Benzol löste. Hierauf wurde das Benzol unter
vermindertem Druck verdampft, der zurückbleibende, feste Rückstand in einer kleineren Menge Äthylacetat
gelöst und der Chromatographie an Aluminiumoxid (Brockmann-Aluminiumoxid) unterworfen. Das Aluminiumoxid
wurde vorher mit Salzsäure behandelt, mit ausreichend Wasser gespült und durch 5stündiges
Erhitzen bei 150° C aktiviert. 50 g des so behandelten
Aluminiumoxides wurden in ein Glasrohr von 1,6 cm Innendurchmesser unter Verwendung von Äthylacetat
gegeben. Nun wurde die oben erhaltene Äthylacetatlösung mit Josamycin auf die Aluminiumoxidsäule
aufgegeben und das Produkt mittels 200 ml Äthylacetat eluiert. Das erhaltene Eluat wurde dann unter
vermindertem Druck eingeengt und das zurückbleibende feste Produkt in 5 ml Benzol gelöst und mit
50 ml η-Hexan versetzt, wobei 0,18 g amorphes Josamycin mit einer Reinheit von über 90% erhalten
wurde.
180 mg des obigen amorphen Josamycins wurden in 1,5 bis 2 ml Benzol gelöst und stehengelassen. Man
erhielt 89 mg nadeiförmige Kristalle von Josamycin. Durch Umkristallisation aus heißem Benzol wurden
farblose Nadelkristalle vom F. 108 bis 113° C (unkorrigiert)
erhalten. Diese wurden unter vermindertem Druck in einer Abderhalden-Apparatur getrocknet,
wobei man das Josamycin in Form weißer nadeiförmiger Kristalle vom F. 130 bis 1330C (unkorrigiert)
erhielt und das die weiter oben beschriebenen Eigenschäften aufwies.
Die Aufarbeitung einer wie oben beschrieben erhaltenen Kulturbrühe wurde in anderer Weise wie folgt
vorgenommen:
40 000 ml einer gemäß in Abs. 1 erhaltenen Kulturbrühe wurde durch Zugabe von Salzsäure auf einen
pH-Wert von 3 eingestellt, und die Kulturbrühe wurde unter Rühren und Zugabe von 800 g Diatomeenerde
filtriert. Dann wurde das Filtrat mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, mit einer Geschwindigkeit
von etwa 50 ml/Minute durch eine Säule von 48 mm Durchmesser geleitet, die mit 2000 ml
des Kationenäustauscherharzes Amberlite IRC-50
(Η-Form) gefüllt war, um das Josamycin am Harz zu adsorbieren. Die durch das Harz geleitete Lösung
zeigte keine Inhibierungszone gegen B. subtilis bei der Zylinderplattenprüfung. Das Harz wurde mit 30000 ml
destilliertem Wasser gewaschen und hierauf das Josamycin durch Hindurchleiten von 4500 ml einer
0,6-m wäßrigen Essigsäure-Methylalkohol-Lösung (Volumenverhältnis = 3:7) mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von etwa 8 ml/Minute eluiert. Das Eluat wurde mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von
5,5 eingestellt, dann unter vermindertem Druck auf 1400 ml eingeengt, hierauf mittels Natriumhydroxid
auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, und anschließend wurde die Lösung unter Zugabe von 1000 ml
Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde abgetrennt, unter vermindertem Druck eingedampft,
die zurückbleibende Festsubstanz in Benzol gelöst und die Lösung mit η-Hexan versetzt. Der ausgefallene
Niederschlag ergab nach dem Trocknen 1,42 g eines Josamycins mit einer Reinheit von 60% in Form eines
weißen Pulvers.
Nach 20minütigem Sterilisieren bei 120°C wurden 501 eines Kulturmediums, das aus 1,5% Sojabohnenmehl,
0,5% Maisquellwasser, 1% Stärke, 1% Glukose, 0,5% Natriumchlorid und 0,3% Calciumkarbonat
bestand (pH auf 7 eingestellt) und in einen 100-1-Behälter aus rostfreiem Stahl eingebracht war, mit
dem Stamm Streptomyces narbonensis var. josamyceticus, ATCC 17 835, beimpft, und die Züchtung wurde
bei 27 bis 29° C 40 Stunden bei 210 Umdrehungen pro Minute und bei einer Belüftung von 40 bis 50 l/Min,
durchgeführt. Nach Beendigung der Züchtung betrug der pH-Wert 6,2. Der Inhibierungsdurchmesser einer
Kulturbrühenprobe gegen B. subtilis PCI 219 betrug 25 mm bei einer Zylinderplattenmethode. Die Kulturbrühe
wurde dann zur Abtrennung fester Bestandteile einer Zentrifugaltrennung unterworfen, wobei man
42 1 Kulturfiltrat erhielt. Das Filtrat wurde mit 42 1 Butylacetat extrahiert und der Extrakt analog Beispiel
1 behandelt und aufgearbeitet und der Chromatographie an Aluminiumoxid unterworfen, wobei man
1,374 g eines rohen Pulvers erhielt. Das rohe Pulver wurde aus Toluol umkristallisiert und wie im Beispiel 1
angegeben getrocknet. Man erhielt 479 mg kristallines Josamycin vom F. 130 bis 133° C.
500 mg des im Beispiel 1 erhaltenen Josamycins mit 90%iger Reinheit wurde in 50 ml Äther gelöst.
Zu dieser Lösung wurde tropfenweise eine mit Weinsäure gesättigte Ätherlösung zugegeben, bis kein
weiterer Niederschlag mehr gebildet wurde. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet.
Man erhielt 450 mg Josamycintartrat. Ein Teil des Niederschlages wurde aus Äther umkristallisiert, wobei
man farblose nadeiförmige Kristalle an Josamycintartrat vom F. 125 bis 127° C erhielt.
Es wurden gemäß Beispiel 1 durch anaerobe Züchtung 2000 ml einer Kulturbrühe hergestellt, diese
wurde mittels NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, und die Brühe mit 1000 ml Äthylacetat extrahiert.
Der Äthylacetatextrakt wurde vom System abgetrennt, unter vermindertem Druck auf 100 ml eingeengt,
mit 40 ml Wasser versetzt, und dann wurde der pH-Wert durch Zugabe von Salzsäure auf 2,0 eingestellt,
wobei das Verfahrensprodukt in die wäßrige Schicht überging. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt
und dann mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Die wäßrige Lösung wurde
nun mit 50 ml Äthylacetat vermischt, die organische Schicht abgetrennt, mit Salzsäure auf einen pH-Wert
von 2,0eingestellt und dann mit 30 ml Wasser gemischt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und unter Zugabe
von 0,5 g Aktivkohle filtriert, und das Filtrat wurde gefriergetrocknet. Man erhielt 210 mg eines
.schwachbraunen Pulvers von Josamycinhydrochlorid mit einer Reinheit von 40%.
100 mg der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Josamycinkristalle
vom F. 130 bis 133° C wurden in 20 ml Methanol—Wasser (Volumenverhältnis = 4:6) suspendiert,
und die Suspension wurde langsam unter mechanischem Rühren mit n/10 wäßrige Salzsäure
versetzt, bis der pH-Wert der Lösung 5,03 war und die Festsubstanz in der Lösung vollständig gelöst war.
Die erhaltene Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei man ein amorphes Pulver von Josamycinhydrochlorid
erhielt, das bei 139,5 bis 14PC in einer Schmelzpunktapparatur nach Fischer—Johns schmolz.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (2)
1. Josamycin der Formel
HO
HO
Patentansprüche:
CHO
H^/CH,
und dessen pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Josamycin der Formel
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3240064 | 1964-06-09 | ||
JP3240064 | 1964-06-09 | ||
DEM0065467 | 1965-06-03 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1492035A1 DE1492035A1 (de) | 1969-11-27 |
DE1492035B2 DE1492035B2 (de) | 1975-06-19 |
DE1492035C3 true DE1492035C3 (de) | 1976-02-05 |
Family
ID=
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