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Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Anthelvencin
EMI1.1
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willkürliche Bezeichnung"Anthelvencin"erhalten hat ; die ErfindungEin Durchschnitt mehrerer Mkroanalysen von Anthelvenein-2-naphthalinsulfonat ergibt die folgende ungefähre prozentuelle Zusammensetzung :
C = 54, 78% ; H = 5, 23ja ;
EMI2.1
ergibt.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat in einer Verreibung in Mineralöl ist in Fig. 1 dargestellt. Die unterscheidungskräftigen Banden in der Infrarotabsorptionskurve innerhalb des Bereiches von 2, 0 bis 15, 0 sind wie folgt :
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79 : 3, 04 : 3, 20 ; 3, 41 (Mineralöl) : 3, 48 (Mineralöl) ; 5, 86 ; 5, 91 (Schulter) ; 6, 08 : 6, 26 ; 6, 47 ; 6, 60(schwach) ; 10, 58 ; 10, 95 ; 11, 11 ; 11, 25 ; 11, 52 ; 12, 16 ; 12, 39 ;. 12, 98 ; 13, 17 ; 13, 38 ; 13, 89 und 14, 78 jan.
Die spezifische Drehung von Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat-getrocknet bei Raumtemperatur in einem Vakuumexsikkator über Phosphorpentoxyd - beträt +11,7 C. wenn die Bestimmung bei einer Temperatur von 250C in einer Lösung in 95loigem wässerigem Äthanol durchgeführt wird, in der die Konzentration des Salzes des Antibiotikums 1% (Gew.-Vol.) beträgt.
Das Ultraviolettabsortionsspektrum einer wässerigen Lösung von Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat zeigt ein Maximum bei 225 mu mit einer Absorption von E1% = 2180 sowie ein weiteres Maximum
EMI2.3
der Zwischenebenenabstände liefert folgende Werte :
EMI2.4
<tb>
<tb> (d) <SEP> (I/I <SEP> 1) <SEP>
<tb> 11, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> 10,71 <SEP> 0,02
<tb> 9, <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> 8, <SEP> 33 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP>
<tb> 8, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> 7, <SEP> 40 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> 7, <SEP> 07 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> 6, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP>
<tb> 6, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP>
<tb> 6, <SEP> 06 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP>
<tb> 5. <SEP> 86 <SEP> 0".
<SEP> 27 <SEP>
<tb> 5, <SEP> 56 <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP>
<tb> 5, <SEP> 23 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 95 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 63 <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 36 <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 99 <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP>
<tb>
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Fortsetzung
EMI3.1
<tb>
<tb> (d) <SEP> (I/I1)
<tb> 3, <SEP> 79 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 65 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 45 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 33 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 28 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 11 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 90 <SEP> 0, <SEP> 03
<tb> 2, <SEP> 82 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 68 <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 59 <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 47 <SEP> 0,
<SEP> 07 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 46 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 18 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 09 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 977 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 870 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> 1,809 <SEP> 0,03
<tb> 1, <SEP> 747 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 717 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 657 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 552 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb>
Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat liefert ein positives Ergebnis beim Ehrlich-Test und negative Ergebnisse beim Ninhydrin-Test auf a-Aminosäuren und beim Sakaguchi-Test auf Guanidinogruppen.
Das Salicylsäuresalz von Anthelvencin ist eine weisse, kristalline Festsubstanz, die bei etwa 153 bis 1550C schmilzt. Die Löslichkeitseigenschaften dieses Salzes sind ähnlich wie diejenigen des 2-Naphthalinsulfonats, mit Ausnahme einer etwas höheren Löslichkeit in kaltem Wasser.
Die elektrometrische Titration von Anthelvencinsalicylat in 66% igem wässerigem Dimethylformamid zeigt das Vorliegen von titrierbaren Gruppen mit pKa-Werten von 9, 75 und 11, 98 und ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 726. Das IR-Absorptionsspektrum von Anthelvencinsalicylat, das in Fig. 2 gezeigt ist, besitzt innerhalb des Bereiches von 2, 0 bis 15, 0 t die folgenden unterscheidungskräf- tigen Banden :
EMI3.2
05 ; 3, 42 (Mineralöl) ; 3, 48 (Mineralöl) ; 3, 65 (Schultet) ; 3, 73 (Schulter) ; 4, 00 ; 4, 25 (schwach) ;12, 44 ; 13, 22 ; 13, 90 ; 14, 27 und etwa 15, 10 .
In einer wässerigen Lösung von Anthelvencinsalicylat zeigen sich zwei Maxima im UV-Absorptions-
EMI3.3
EMI3.4
zentuelle Zusammensetzung aufweist :
C = 56, 27lu ;
H=5,62% ;
N = 17, 97% ;
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Die auf Grund dieser Werte berechnete empirische Formel für das Salz lautet
C33 H40 Ng 09, woraus sich für die freie Base Anthelvencin wieder die Formel Ci9 H28 Ng 03 ergibt.
Anthelvencinsalicylat weist eine spezifische Drehung von +7, 90 auf, bestimmt bei 250C an Hand einer 10/0gen Lösung des Salzes in 950/obigem wässerigem Äthanol.
Andere Säuren, u. zw. sowohl organische, als auch anorganische, können ebenfalls zur Herstellung von Additionssalzen des Anthelvencins verwendet werden. Zu verwendbaren anorganischen Säuren gehören Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure u. dgl.
Als Beispiele organischer Säuren, die zur Salzbildung verwendet werden können, seien erwähnt :
Citronensäure, Ameisensäure, Essigsäure, Weinsäure, p-Bromsalicylsäure, Pikrinsäure, m-Nitrobenzoesäure, Flaviansäure, p-Nitrophthalsäure, p- (2-Hydroxy-l-naphthylazo)-benzolsulfonsäure (Orange II) u. dgl. Säuren.
Im allgemeinen werden die Additionssalze des Anthelvencins mit organischen Säuren, vorzugsweise aus einem Salz mit einer anorganischen Säure, hergestellt, wie z. B. aus dem Hydrochlorid.
Die vollständige Strukturformel von Anthelvencin konnte bis jetzt noch nicht bestimmt werden.
Hydrolytische Abbauuntersuchungen zeigen jedoch, dass Anthelvencin einen oder mehrere Pyrrolreste und eine Vielzahl von Peptidbindungen aufweist. Die Abbauuntersuchungen zeigen weiterhin, dass das Anthelvencinmolekül eine oder mehrere Einheiten von ss -Alanin sowie entweder Glutaminsäure oder ein Bruchstück aufweist, das unter den Abbaubedingungen in Glutaminsäure umgewandelt wird. Wie es bei Peptidantibiotika häufig der Fall ist, besteht das Anthelvencin, wie es normalerweise bei der fermentativen Herstellung erhalten wird, aus mindestens zwei eng verwandten Verbindungen, die im Anschluss hieran als "Anthelvencin A" und "Anthelvencin B" bezeichnet werden.
Die Bezeichnung "Anthelvencirl', wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf das Antibiotikum in der Form, wie es bei der Fermentation erhalten wird.
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A"und"Anthelvencin B"sindsehen Systemen. Ein besonders brauchbares Verfahren zur Unterscheidung der beiden Antibiotika besteht in einer Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel mit einem Lösungsmittelsystem, das aus 15 Teilen n-Butanol, 10 Teilen Pyridin, 1 Teil Eisessig und 12 Teilen Wasser besteht. In einem solchen System beträgt der Rf-Wert für : " Anthelvencin A" 0, 5, während er für "Anthelvencin B" 0, 3 beträgt.
Anthelvencin übt eine Hemmwirkung gegen das Wachstum bestimmter Mikroorga. iismenstämme, einschliesslich bakterieller Krankheitserreger und pilz-bzw. schwammartiger Pflanzenkrankheitserreger aus. Qualitativ sind die mikrobiologischen Wirksamkeiten von"Anthelvencin A"und"Anthelvencin B" praktisch identisch. Auf der Grundlage gleicher Gewichtsmengen ist jedoch die mikrobiologische Wirksamkeit von Anthelvencin A-naphthalinsulfonat etwa zweimal so gross wie diejenige des entsprechenden Salzes von" Anthelvencin B". Die Konzentrationen an Anthelvencin, bei denen eine Hemmung des Wachstums verschiedener beispielhafter Organismen festzustellen ist, werden zahlenmässig in Tabelle l angegeben.
Die Mindesthemmkonzentrationen wurden mit Hilfe des Agarverdünnungs-Testes oder mit Hilfe des Nährbrühen-Verdünnungs-Testes bestimmt. Die Hemmkonzentrationen für die bakteriellen
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EMI5.2
<tb>
<tb> eintrTestorganismus <SEP> :
<SEP> Mindesthemmkonzentration
<tb> mcg/cm, <SEP> 24 <SEP> h <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Myco. <SEP> tuberculosis <SEP> (607) <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Myco. <SEP> avium <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Klebsiellapneumoniae <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Shigella <SEP> paradysenteriae <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Vibrio <SEP> metschnikovii <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Saccharomyces <SEP> pastorianus <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 100.
<SEP> 0 <SEP>
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> 3, <SEP> 13a <SEP>
<tb> Trichophyton <SEP> interdigitale <SEP> 3, <SEP> 13a <SEP>
<tb> Argobacterium <SEP> tumefaciens <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Corynebacterium <SEP> michiganense <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Erwinia <SEP> amylovora <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> solanacearum <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Xanthomonas <SEP> phaseoli <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Alternaria <SEP> solani <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Botrytis <SEP> cinerea <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Caratostomellaulmi <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Colletotrichum <SEP> pisi <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Endoconidiophora <SEP> fagacearum <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Fusarium <SEP> moniliforme <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Glomerello <SEP> cingulata <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Helminthosporium <SEP> sativum <SEP> 12,
<SEP> 5 <SEP>
<tb> Penicillium <SEP> expansum <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Phoma <SEP> pigmentovora <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Polyporus <SEP> ostreatus <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP>
<tb> Pullularia <SEP> sp. <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Verticillium <SEP> albo-atrum <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
a = bestimmt über 48 h
Mit dem Salicylsäuresalz des Anthelvencins werden identische Werte erhalten. Aus diesen Daten ist ersichtlich, dass Anthelvencin in Form seiner Säureadditionssalze zur Unterdrückung des Wachstums der verschiedensten pathogenen Organismen brauchbar ist.
Die Säureadditionssalze des Anthelvencins sind weiterhin zur Bekämpfung von Eingeweidewürmern und verschiedenen andern Typen von parasitären Organismen brauchbar. So hat sich z. B. eine Wirksamkeit gegenüber beiden Arten des Mäusemadenwurmes, Syphaciaobvelata und Aspiculuris tetraptera, und gegenüber den Schweinewürmern Ascaria summ., Oeseophagostumum spp. und Trichuris suis gezeigt.
Bei Einverleibung in die tägliche Futterration von Schweinen für einen Zeitraum von mindestens 35 Tagen erweisen sich die Anthelvencinsalze bei einer Konzentration von nur 12 g je Tonne Futter als wirksam, den Wurmbefall der Tiere zu verringern. Kombinationen von Anthelvencin mit andern Substanzen mit Anthelminticumeigenschaften, wie z. B. mit Piperazin, Hygromycin B u. dgl., können ebenfalls verwendet werden. Weitere Organismen, die mit Hilfe von Anthelvencin bekämpft werden können, sind unter anderem Escherichia coli, Proteus vulgaris, Entamoeba histolytica u. dgl.
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Die akute Toxizität von Anthelvencinsalicylat ist an der Maus bestimmt worden. Oral beträgt der LD-Wert dieses Salzes mehr als 500 mg (kg, wenn das Arzneimittel intraperitoneal injiziert wird.
Anthelvencin kann durch Züchten von bisher unbekannten Stämmen von Streptomyces venezuelae unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium erhalten werden, das assimilierbare Quellen für
Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salze enthält. Die Organismen wurden zuerst aus Boden- proben isoliert. Anteile der Bodenproben wurden in sterilem, destilliertem Wasser suspendiert und die
Suspensionen auf Nähragarplatten gestrichen. Die beimpften Nähragarplatten wurden mehrere Tage bei etwa 25 bis 350C bebrütet. Am Ende der Bebrütungszeit wurden die Kolonien der Anthelvencin bilden- den Organismen mit Hilfe einer sterilen Platinöse auf Schrägagarmedien übertragen. Die beimpften
Schrägagarmedien wurden bebrütet, um grössere Mengen an Impfkultur zur Herstellung von Anthelvencin zu erhalten.
Die neuartigen Organismen, die zur Bildung von Anthelvencin befähigt sind, sind bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C., USA, hinterlegt worden und stehen der Öffentlichkeit unter den ATCC-Hinterlegungsnummern 14583,14584 und 14585 zur Verfügung.
Wegen der Unsicherheit, die bei klassifizierenden Untersuchungen bei der Streptomycesgruppe der Mikroorganismen besteht, ist die Klassifizierung eines neu entdeckten Organismus stets mit gewissen Zweifeln behaftet. Die Anthelvencin bildenden Organismen scheinen jedoch in ihren wichtigsten Eigenschaften den Beschreibungen am nächsten zu kommen, die für die Organismen S. cinnamonensis, S. roseoflavus und S. venezuelae (NRRL 902) gegeben worden sind, die sämtlich bestimmten Stämmen von S. lavendulae mit geraden Sporenketten ähneln. Trotz gewisser Ähnlichkeiten bestehen jedoch ausreichende Unterschiede, um die neuartigen Organismen, die erfindungsgemäss verwendet werden, von sämtlichen bisher beschriebenen Organismen zu unterscheiden.
Die erfindungsgemäss verwendeten Organismen kommen den oben genannten S. venezuelae (NRRL 902) in ihren Eigenschaften näher als irgendeinem andern bisher beschriebenen Organismus. Zwischen den erfindungsgemässen Kulturen und S. venezuelae (NRRL 902) bestehen jedoch zahlreiche Unterschiede. Die neuartigen Organismen der Erfindung sind daher als neue Stämme von S. venezuelae anzusehen.
Die folgende ausführliche Beschreibung bezieht sich insbesondere auf die neu aufgefundenen Organismen ATCC 14583,14584 und 14585. Es versteht sich jedoch, dass die Herstellung von Anthelvenein durch Züchten von Mutanten dieser Anthelvencin bildenden Organismen ebenfalls innerhalb des Erfindungsbereiches liegt. Derartige andere Mutanten können nach bekannten Verfahren erhalten werden, wie z. B. dadurch, dass man einen der obigen Stämme mit Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen oder mit chemischen Mitteln, wie z. B. mit Stickstofflostverbindungen, behandelt.
Bei den Klassifizierungsuntersuchungen der Anthelvencin bildenden Stämme von S. venezuelae ATCC 14583,14584 und 14585 wurden Verfahren angewandt, wie sie bei der Klassifizierung von Actinomyceten üblich sind. Die Kohlenstoffverwertungs-Prüfversuche wurden nach dem VerfahrerrvonPridham und Gottlieb, J. Bact. 56, Seite 107 (1948), durchgeführt. Die bei den klassifizierenden Untersuchungen erhaltenen Daten werden im folgenden in Tabellenform angegeben. Die in Klammern angegebenen Zahlen beziehen sich auf die Farbtafeln von Maers und Paul, Dictionary of Color (1950). Die Kulturen wurden bei 300C gezüchtet. Die morphologischen, physiologischen und Kulturmerkmale wurden nach 14tägiger Bebrütung bestimmt. Die Kohlenstoffverwertung wurde nach 10 Tagen Bebrütung bestimmt.
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Tabelle 2 Beschreibung der Kulturen ATCC 14583, 14584 und 14585
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<tb>
<tb> Verglichene
<tb> Eigenschaften <SEP> : <SEP> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 14584 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> Morphologie <SEP> Sporenketten <SEP> gerade <SEP> oder <SEP> Sporenketten <SEP> gerade <SEP> oder <SEP> Sporenketten <SEP> gerade <SEP> oder
<tb> gekrümmt <SEP> ; <SEP> Sporen <SEP> gekrümmt; <SEP> Sporen <SEP> gekrümmt; <SEP> Sporen
<tb> 0, <SEP> 7-1,0 <SEP> <SEP> x <SEP> 1,0-1,8 <SEP> , <SEP> 0,7-1,0 x <SEP> 1,0-1,8 , <SEP> 0,7-1,0 x1,2-1,8 ,
<tb> oval <SEP> bis <SEP> zylindrisch <SEP> oval <SEP> bis <SEP> zylindrisch <SEP> zylindrisch
<tb> Kolönieeigenschaften
<tb> auf <SEP> : <SEP>
<tb> Tomatenpaste- <SEP> Wechstum <SEP> reichlich; <SEP> Luft- <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Wachstum <SEP> reichlich <SEP> ;
<SEP> LuftHafermehl <SEP> mycel <SEP> reichlich, <SEP> rosa-grau <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> mycel <SEP> reichlich, <SEP> rosa-grau
<tb> (43-1B); <SEP> Rückseite <SEP> rot-braun <SEP> hellgrau <SEP> (35-A1); <SEP> Rück- <SEP> (51-2A); <SEP> Rückseite <SEP> dunkel
<tb> (16-11A); <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> seite <SEP> braun <SEP> (15-E7) <SEP> ; <SEP> kein <SEP> rot-braun <SEP> (8-9H) <SEP> ; <SEP> lösliches
<tb> Pigment <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> Pigment <SEP> dunkel <SEP> rot-braun
<tb> Nähragar <SEP> Wachstum <SEP> befriedigend <SEP> ; <SEP> Wachstum <SEP> befriedigend <SEP> ; <SEP> Wachstum <SEP> befriedigend <SEP> ; <SEP>
<tb> kein <SEP> Luftmycel <SEP> ; <SEP> Rückseite <SEP> kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Rück- <SEP> kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Rückgelb <SEP> (10-1E); <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> seite <SEP> gelb <SEP> (l1-L7) <SEP> :
<SEP> kein <SEP> seite <SEP> gelb <SEP> (10-3H) <SEP> ; <SEP> kein
<tb> Pigment <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Hefe <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Luft- <SEP> Wachstum <SEP> mässig; <SEP> Luft- <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> hellgrau <SEP> mycel <SEP> mässig, <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> mycel <SEP> spärlich, <SEP> weiss
<tb> (20-1A) <SEP> ; <SEP> Rückseite <SEP> hell <SEP> rot-hellbraun <SEP> (4-A8) <SEP> ; <SEP> Rück- <SEP> (l-1B) <SEP> ; <SEP> Rückseite <SEP> rotbraun <SEP> ; <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pig- <SEP> seite <SEP> braun <SEP> (14-J8) <SEP> ; <SEP> kein <SEP> braun <SEP> ;
<SEP> kein <SEP> lösliches
<tb> ment <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> Pigment
<tb>
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Tabelle 2 (Fortsetzung) Beschreibung der Kulturen ATCC 14583,14584 und 14585
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<tb>
<tb> Verglichene
<tb> Eigenschaften <SEP> : <SEP> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 14584 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> Salze-Stärke-Agar <SEP> Wachstum <SEP> reichlich <SEP> ; <SEP> Luft-Wachstum <SEP> reichlich <SEP> ; <SEP> Luft-Wachstum <SEP> reichlich <SEP> ; <SEP> Luftmycel <SEP> grau-weiss <SEP> (12-1A) <SEP> ; <SEP> mycel <SEP> reichlich. <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> mycel <SEP> reichlich, <SEP> hell <SEP> oran- <SEP>
<tb> Rückseite <SEP> braun <SEP> (14-llG) <SEP> ; <SEP> hellbraun <SEP> (10-A2); <SEP> Rück- <SEP> ge-gelb <SEP> (9-2A); <SEP> Rückseite
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> seite <SEP> braun <SEP> (14-A5) <SEP> ;
<SEP> kein <SEP> braun <SEP> (8-loi); <SEP> sehr <SEP> helllösliches <SEP> Pigment <SEP> braunes <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Czapek's <SEP> Agar <SEP> Wachstum <SEP> mässig; <SEP> Luft- <SEP> Wachstum <SEP> mässig; <SEP> Luft- <SEP> Wachstum <SEP> mässig; <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> nahezu <SEP> mycel <SEP> mässig, <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> mycel <SEP> mässig, <SEP> weiss,
<tb> weiss <SEP> (2-7A) <SEP> ; <SEP> Rückseite <SEP> hellbraun <SEP> (3-B7, <SEP> 3-A8) <SEP> ; <SEP> Rückseite <SEP> rot-braun
<tb> gelb <SEP> (11-4J); <SEP> kein <SEP> laos- <SEP> Rückseite <SEP> rot-braun <SEP> (7-H9); <SEP> (5-9G);
<SEP> kein <SEP> lösliches
<tb> liches <SEP> Pigment <SEP> schwach <SEP> rotes <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Pigment
<tb> Einwirkung <SEP> auf <SEP> Milch <SEP> Koagulierung, <SEP> Reichliches, <SEP> bräunlich- <SEP> Koagulation,
<tb> Peptonisierung <SEP> gelbes <SEP> Oberflächenwachs-Peptonisierung
<tb> turn, <SEP> Koagulierung, <SEP> teilweise <SEP> P.
<SEP> eptonisierung <SEP>
<tb> Nährgelatine <SEP> vollständige <SEP> Verflüssigung <SEP> 500/oigne <SEP> Verflüssigung <SEP> vollständige <SEP> Verflüssigung
<tb> nach <SEP> 19 <SEP> Tagen <SEP> nach <SEP> 19 <SEP> Tagen <SEP> nach <SEP> 19 <SEP> Tagen
<tb> Nitratreduktion <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> H <SEP> S-Bildung-- <SEP>
<tb>
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In der folgenden Tabelle 3 sind die Ergebnisse der an den Organismen ATCC 14583,14584 und 14585 durchgeführten Kohlenstoffverwertungs-Prüfversuche wiedergegeben. In der Tabelle wurden die folgenden Symbole verwendet : + = Wachstum und Verwertung - = Wachstum oder Verwertung nicht erkennbar.
Tabelle 3
Kohlenstoffverwertung von Anthelvencin bildenden Organismen
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<tb>
<tb> Substrat <SEP> : <SEP> Wachstum <SEP>
<tb> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 14584 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> L <SEP> (+)-Arabinose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> L <SEP> (+)-Rhamnose--- <SEP>
<tb> D-Ribose
<tb> D-Xylose <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> Dextrose-t <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> D <SEP> (-)-Fructose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Lactose
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> Saccharose--D <SEP> (+)-Trehalose
<tb> Inulin
<tb> D <SEP> (+)
-Raffinose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> i-Inosit <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP>
<tb> Mannit <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> Sorbit
<tb> Cellulose
<tb> Salicin <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
Bei der Herstellung von Anthelvencin durch Züchten der oben beschriebenen Organismen können die verschiedensten Kulturmedien verwendet werden, da aus den Ergebnissen der oben beschriebenen
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Kulturmedien vorzuziehen,cose, Fructose, Maltose, Mannose, lösliche Stärke, Melassen, Dextrin, brauner Zucker, Maisquellfeststoffe u. dgl. Eine bevorzugte Quelle für Kohlenstoff ist Glucose. Zusätzlich enthalten die verwendbaren Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, wie z. B. Hafermehl, Rindfleischextrakt, Peptone (aus Fleisch oder Sojabohnen), hydrolysiertes Casein, Hefe, Aminosäuregemische u. dgl.
Zur Zeit bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, hydrolysiertes Casein und Rindfleischextrakte.
Mineralsalze, wie z. B. solche, die Calcium-, Magnesium-, Natrium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat- und Carbonationen liefern, sowie eine Quelle für Wachstumfaktoren, wie z. B. Hefe oder Hefeextrakt, können in die Medien mit günstigen Ergebnissen einverleibt werden.
Wie bei vielen Mikroorganismen ist es als wünschenswert anzusehen, dem für die Züchtung der erfindungsgemäss verwendeten Actinomyceten benutzten Kulturmedien die sogenanten "Spurenelemente" zuzusetzen. Diese Spurenelemente werden gewöhnlich als Verunreinigungen zwangsläufig mit der Zugabe der andern Bestandteile des Mediums zugeführt.
Der Anfangs-PH-Wert des Kulturmediums kann innerhalb breiter Grenzen variiert werden. Es hat sich jedoch als wünschenswert erwiesen, den Anfangs-PH-Wert des Mediums zwischen etwa 6, 0 und etwa 7, 5 und vorzugsweise zwischen etwa 6, 5 und etwa 7, 3 einzustellen. Wie es bei andernActinomyceten beobachtet worden ist, erhöht sich der PH-Wert des Mediums allmählich während der ganzen
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Wachstumsperiode des Organismus, während Anthelvencin gebildet wird, und kann eine Höhe von etwa
7, 0 bis etwa 8, 0 oder darüber erreichen. Der End-pH-Wert ist mindestens zum Teil vom Anfangs-pH-
Wert des Mediums, den im Medium vorhandenen Puffersubstanzen und der Zeitdauer abhängig, die der
Organismus wachsen gelassen wird.
Aerobe Submerskulturbedingungen sind die Bedingungen der Wahlzur. Herstellung von Anthelvencin.
Zur Herstellung verhältnismässig kleiner Mengen können Schüttelflaschen und Oberflächenkulturen in
Flaschen verwendet werden ; für die Herstellung grosser Mengen ist jedoch die aerobe Submerskultur in
Steriltanks vorzuziehen. Das in dem Steriltank befindliche Medium kann mit einer Sporensuspension be- impft werden ; wegen der Wachstumsverzögerung, die bei Verwendung einer Sporensuspension als Impf- material beobachtet wird, ist jedoch die vegetative Form der Kultur zu bevorzugen. Indem man auf diese Weise die Wachstumsverzögerung vermeidet, erreicht man eine wirksamere Ausnutzung der Fer- mentationsanlagen.
Dementsprechend ist es wünschenswert, zunächst eine vegetative Impfkultur des
Organismus herzustellen, indem man eine verhältnismässig geringe Menge Kulturmedium mit der Sporenform des Organismus beimpft; wenn eine junge, aktive vegetative Impfkultur erhalten worden ist, wird die vegetative Impfkultur unter aseptischen Bedingungen auf den grossen Fermentationstank übertragen. Das Medium, in dem die vegetative Impfkultur hergestellt wird, kann entweder das gleiche oder ein anderes als das Medium sein, das für die im grossen Massstab erfolgende Herstellung von Anthelvencin verwendet wird.
Die Organismen wachsen am besten bei Temperaturen im Bereich von etwa 26 bis 330C. Eine optimale Anthelvencinbildung scheint bei Temperaturen von etwa 26 bis 300C stattzufinden.
Wie es bei unter aeroben Bedingungen durchgeführten Submerskulturverfahren üblich ist, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Zur Erzielung eines wirksamen Wachstums des Organismus und einer wirksamen Anthelvencinbildung beträgt das bei der im Tank erfolgenden Herstellung von Anthelvencin verwendete Luftvolumen vorzugsweise mindestens 0, 1 Vol.-Teil Luft je Minute und je Volumenteil Kulturmedium.
Die Zunahme der Anthelvencinaktivität in dem Kulturmedium kann während der Fermentationsdauer leicht verfolgt werden, indem man aus dem Kulturmedium entnommene Proben auf ihre Hemmwirksamkeit gegenüber dem Wachstum eines Organismus, von dem bekannt ist, dass sein Wachstum in Gegenwart von Anthelvencin gehemmt wird, prüft. Die Verwendung des Organismus Bacillus subtilis hat sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Die Prüfung kann unter Anwendung bekannter Trübungsmessungsverfahren oder Becher-Platten-Verfahren erfolgen.
Im allgemeinen findet eine maximale Bildung des Antibiotikums innerhalb von etwa 4 bis 7 Tagen nach der Beimpfung des Kulturmediums statt, wenn eine aerobe Submerskultur oder eine Schüttelflaschenkultur angewandt wird, sowie innerhalb von etwa 5 bis 10 Tagen, wenn eine Oberflächenkultur durchgeführt wird.
Das Mycel und die ungelösten Feststoffe werden aus der Fermentationsbrühe mit Hilfe bekannter Mittel, wie z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, entfernt, gewöhnlich nach Einstellung des PHWertes auf etwa 3, 5. Die antibiotische Wirksamkeit ist in der filtrierten Brühe enthalten und kann aus ihr unter Anwendung der üblichen Adsorptionsverfahren entfernt werden. Es können die verschiedensten Adsorptionsmittel verwendet werden, jedoch werden im allgemeinen Ionenaustauscherharze von saurem Charakter bevorzugt. Ein besonders bevorzugtes Harz ist"IRC-50", ein schwach kationisches Carbonsäureharz, das von der Rohm and Haas Company auf den Markt gebracht wird.
Bei Anwendung des Säulenadsorptionsverfahrens kann das Anthelvencin isoliert werden, indem man die filtrierte Brühe durch eine Säule gibt, die mit einem geeigneten Ionenaustauscherharz, wie z. B. "IRC-50", beschickt ist. Wenn ein Teil Harz je 30 bis 35 Teile filtrierter Brühe verwendet wird, wird üblicherweise eine praktisch vollständige Entfernung des Anthelvencins aus der Fermentationsbrühe erreicht, wenn die Fliessgeschwindigkeit durch eine Säule mit einem Durchmesser von 7, 62 cm bei etwa 5 bis 10 cms/min gehalten wird.
Die Säule wird dann gründlich mit Wasser gewaschen, bis das Eluat farblos ist und die antibiotische Wirksamkeit aus der Säule unter Verwendung einesLösungsmittelseluiert, das eine verdünnte wässerige Säure und ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthält.
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Zur Entfernung gewisser begleitender Verunreinigungen wird der PH-Wert des Eluats mit einer Base auf etwa 5, 5 eingestellt, das Eluat auf etwa 3/4 seines ursprünglichen Volumens eingeengt, das eingeengte Eluat mit etwa 3 Volumina Aceton unter Rühren versetzt und der p--Wert des erhaltenen Gemisches erneut auf etwa 8, 5 eingestellt. Das Gemisch wird dann durch eine Säule gegeben, die mit einem
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Magnesiumsilikat-Adsorptionsmittel mit einer Teilchengrösse entsprechend 0, 149 bis 0, 250 mm lichter Siebmaschenweite ("Florisil"der Floridin Company) gefüllt ist, um färbende Substanzen und teerartige Stoffe zu entfernen.
Die Säule wird mit 75loigem wässerigem Aceton gewaschen, bis sich das Eluat gegenüber Ehrlich'schem Reagenz negativ verhält, worauf man das ursprüngliche Eluat und die Waschflüs- sigkeitenvereinigtund einengt. Zu dem Konzentrat wird Natriumchlorid in einer Menge von etwa 250 g/l Konzentrat gegeben. Der sich abscheidende dunkle, ölige Rückstand wird entfernt, das Gemisch filtriert und das klare Filtrat mit Benzylalkohol extrahiert. Das Wasser wird aus den Benzylalkoholextrakten im Vakuum entfernt und die erhaltene trockene Lösung in Benzylalkohol langsam zu etwa 9 Volumina Aceton gegeben. Beim Kühlen des erhaltenen Gemisches scheidet sich das Hydrochlorid des Anthelvencins ab.
Das auf diese Weise erhaltene Produkt besteht in der Hauptsache aus dem Hydrochlorid von"Anthel-
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ten werden, indem man das wie oben beschrieben erhaltene Präparat einer weiteren Behandlung unterwirft. So kann z. B. das Gemisch der Anthelvencinhydrochloride in einem Lösungsmittelsystem, das nButanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser enthält, gelöst und die erhaltene Lösung durch eine Säule gegeben werden, die mit vorbehandeltem Cellulosepulver beschickt ist. Das Cellulosepulver ist in Wasser zu einer Ausschlämmung suspendiert, sodann abfiltriert und erneut nacheinander in 0, 2n-wässeriger Salzsäure, Wasser und einem aus n-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 15 : 10 : 1 : 12 bestehenden Lösungsmittelsystem. suspendiert worden.
Das aus der Säule fliessende Eluat wird in regelmässigen Zeitabständen fraktioniert aufgefangen und der Verlauf der chromatographischen Fraktionierung durch Prüfung der Fraktionen mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie überwacht. Die zuerst aufgefangenen Fraktionen enthalten lediglich Anthelvencin A-Hydrochlorid. Es folgen Zwischenfraktionen, die die Salze beider Anthelvencine enthalten. In den zuletzt aufgefangenen Fraktionen ist reines Anthelvencin B-Hydrochlorid enthalten. Diejenigen Fraktionen, die reines Anthelvencin A-Hydrochlorid bzw. Anthelvencin B-Hydrochlorid enthalten, werden vereinigt und zur Trockne eingedampft, wobei reine Abscheidungen des Hydrochlorids von"Anthelvencin A"bzw."AnthelvencinB"ërhalten werden.
Zur Trennung des Gemisches von"Anthelvencin A"und B in seine Einzelbestandteile können auch andere Salze als die Hydrochloride benutzt werden. So kann man z. B. das Gemisch der Hydrochloride in ein Gemisch umwandeln, das die Naphthalinsulfonat- oder Salicylatsalze enthält und sodann dieses Gemisch in ähnlicher Weise chromatographisch fraktionieren, um das entsprechende Salz von"Anthel-
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Eine Kultur von Streptomyces venezuelae ATCC 14584 wird hergestellt, indem man den Organismus auf einem Schrägnähragar wachsen lässt. Der Nähragar wird aus 65 g Hafermehl hergestellt, das zu einer Aufschlämmung verkocht, durchgeseiht und mit 20 g Agar und genügend Wasser vermischt wird, um ein Gesamtvolumen von 11 zu erhalten.
Das Schrägnährmedium wird mit Sporen von S. venezuelae ATCC 14584 beimpft und 5 Tage bei 30 C bebrütet. Das auf dem Schrägnährmedium befindliche Kulturwachstum wird mit etwa 6 cm3 destilliertem Wasser bedeckt und das Schrägnährmedium wird vorsichtig abgekratzt, um eine wässerige Suspension der Organismen zu erhalten. l cm3 der auf diese Weise erhaltenen Suspension wird verwendet, um unter aseptischen Bedingungen 100 cm3 eines sterilen vegetativen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung anzuimpfen :
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<tb>
<tb> Glucose <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Maiquellfeststoffe <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> auf <SEP> ein <SEP> Gesamtvolumen <SEP> von <SEP> 11
<tb>
Das angeimpfte vegetative Medium wird 48 h bei etwa 300C bebrütet. Innerhalb dieser Zeit werden die Kolben auf einer Schüttelmaschine mit einem Hub von 5 cm bei 108 Schüttelbewegungen/min geschüttelt.
5 cm3 der vegetativen Impfkultur werden zum aseptischen Beimpfen von 100., cm3 -Anteilen eines in 500 cm3 -Erlenmeyerkolben enthaltenen Mediums verwendet, das 30 min bei 1200C sterilisiert worden ist und die folgende Zusammensetzung aufweist :
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<tb>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Casein <SEP> Ig
<tb> Natriumnitrat <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
<tb> Roher <SEP> Glucosesirup <SEP> 20 <SEP> cm3
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> auf <SEP> ein <SEP> Gesamtvolumen <SEP> von <SEP> 11
<tb>
Die beimpfte Kultur wird 5 Tage bei etwa 300C bebrütet, wobei, wie oben beschrieben, auf einer Schüttelmaschine geschüttelt wird. Der pH-Wert des Ausgangsmediums beträgt etwa 6, 9.
Am Ende der Bebrütungszeit hat sich der pH-Wert des Mediums auf etwa 7, 3 erhöht.
Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe wird zur Entfernung des Mycels und der ungelösten Fest- stoffe filtriert. Die filtrierte Brühe enthält das von den Organismen gebildete Anthelvencin.
Beispiel 2 : Herstellung von Anthelvencinhydrochlorid.
Eine Kultur von Streptomyces venezuelae ATCC 14584 wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung eines Nährmediums hergestellt, das 20 g Stärke, 3 g Rindfleischextrakt, l g Asparagin, 20 g Agar und Wasser in einer solchen Menge, wie zum Auffüllen bis auf ein Gesamtvolumen von 11 erforderlich ist, enthält. Die Schrägkulturen werden 5 bis 7 Tage bei einer Temperatur von etwa 300C wachsen gelassen.
Das auf der Schrägkultur befindliche Wachstum wird dann wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert und 1 cm3 der auf diese Weise erhaltenen Suspension wird zum aseptischen Beimpfen von 100 cm 3 eines sterilisierten vegetativen Kulturmediums verwendet, das sich in einem 500 cm3 -Erlenmeyerkolben befindet und die folgende Zusammensetzung aufweist :
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<tb>
<tb> Dextrose, <SEP> technisch <SEP> rein <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Sojabohnenölmehl <SEP> mit <SEP> Lösungsmitteln <SEP> extrahiert <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> auf <SEP> ein <SEP> Gesamtvolumen <SEP> von <SEP> 11.
<tb>
Das beimpfte Medium wird 24 h bei 300C bebrütet. wobei auf einer Drehschüttelmaschine, die Schüttelbewegungen von 5 cm bewirkt, mit 250 Schüttelbewegungen/min geschüttelt wird. Etwa 25 cm3 der erhaltenen vegetativen Kultur werden dann mit Hilfe einer sterilen Pipette in einen abgeänderten 4 1-Erlenmeyerkolben eingeführt, der 1 l eines Mediums der gleichen Zusammensetzung aufweist. Die Bebrütung wird 48 h unter den beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Der gesamte Inhalt des Kolbens, der die vegetative Kultur enthält, wird in einen mit Prallplatten versehenen 45 1-Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl überführt, der mit zwei mit je zwei Rührblättern ausgestatteten Turbinenrührern von 12, 7 cm Durchmesser versehen ist und 28 1 eines Produktionsmediums der folgendenzusam- mensetzung enthält :
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<tb>
<tb> Dextrose, <SEP> technisch <SEP> rein <SEP> 30 <SEP> g
<tb> Sojabohnenölmehl, <SEP> mit <SEP> Lösungsmitteln <SEP> extrahiert <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Baumwollsamenöl <SEP> 2 <SEP> cms
<tb> Casein <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> auf <SEP> ein <SEP> Gesamtvolumen <SEP> von <SEP> 11.
<tb>
Die Fermentation wird bei 300C während 4 Tagen unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 400 bis 450 Umdr/min durchgeführt. Das Schäumen wird, falls erforderlich, durch Zugabe von Sojabohnenöl geregelt. Während der ganzen Dauer der Fermentation wird das Medium durch Einführung von steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 30 l/min belüftet. Am Ende der Fermentationsdauer wird die gesamte Brühe mit 5n-Schwefelsäure auf etwa PH 3, 5 eingestellt, worauf etwa 30/0 (Gew.-Vol.) eines handelsüblichen Filtrierhilfsmittels zugegeben werden. Nach dem Filtrieren liegen etwa 22 l filtrierte Fermentationsbrühe vor.
Die aus vier Tankfermentationen vereinigten Fermentationsbrühen werden durch eine Säule mit 7, 62 cm Durchmesser gegeben, die etwa 2 650 ems feuchtes"IRC-50"-Harz in derSäureform enthält.
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Wenn die Fliessgeschwindigkeit auf etwa 6 cm3/min eingestellt wird, weist die aus der Säule herausflie- ssende Flüssigkeit keine biologische Aktivität auf, was anzeigt, dass die Adsorption des Antibiotikums am Harz praktisch vollständig ist. Wenn die gesamte Menge der filtrierten Fermentationsbrühe, insge- samt etwa 881. durch die Säule gegeben worden ist, wird die Säule wiederholt mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser farblos ist.
Das Anthelvencin wird aus der Säule wie folgt isoliert :
Die Säule wird ununterbrochen mit einem Gemisch aus 30 Vol. alto Aceton und 70 Vol. "'/0 O, 5n-wäs- seriger Salzsäure so lange eluiert. wie das Eluat auf Ehrlich'sches Reagenz positiv reagiert. Eine Gesamt- menge von etwa 10. 41 Eluatwird aufgefangen. Das Eluat wird mit l Öliger wasseriger Natriumhydroxyd- lösung auf etwa PH 5,5 eingestellt und auf ein Volumen von etwa 8. 5 I eingeengt. Zu dem eingeengten
Eluat werden unter Rühren 3 Volumina Aceton gegeben und der pH-Wert des erhaltenen Gemisches wird weiter bis auf etwa 8, 5 eingestellt.
Das Gemisch wird durch eine Säule gegeben, die mit etwa 1750 cm 3 feuchtem"Florisir mit einer Teilchengrösse entsprechend 0, 149 bis 0, 250 mm lichter Siebmaschen- weite gefüllt ist, um-färbende und teerartige Substanzen zu entfernen. Die Säule wird dann mit 7'obigem wässerigem Aceton gewaschen, bis die Waschflüssigkeit gegenüber Ehrlich'schem Reagenz negativ rea- giert. Das ursprüngliche Eluat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und auf ein Volumen von etwa 9 l eingeengt, worauf 2 250 g Natriumchlorid zugegeben werden. Der sich bildende dunkle, teer- artige Rückstand wird abfiltriert und das erhaltene Filtrat dreimal mit je 90 crns Benzylalkoholextra- hiert.
Das restliche Wasser wird aus den vereinigten Extrakten unter Vakuum entfernt und die erhaltene benzylalkoholische Lösung langsam unter raschem Rühren zu 9 Volumina Aceton gegeben. Nachdem über
Nacht bei etwa 30C stehengelassen worden ist, wird die abgeschiedene Festsubstanz abfiltriert, gründlich mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene Anthelvencinhydrochlorid kann der weiteren Reinigung unterworfen oder in ein anderes Salz umgewandelt werden, wie es in den folgenden Beispielen beschrieben wird.
Beispiel3 :HerstellungvonAnthelvencin-2-naphthalinsulfonat.
Zu einer Lösung von 1 g nach Beispiel 2 hergestelltem Anthe1vencinhydrochlorid werden 40 cm3 einer 5%igen wässerigen Lösung von Natrium-2-naphthalinsulfonat gegeben. Das Gemisch wird zur Erzielung einer vollständigen Auflösung erwärmt und sodann langsam abkühlen gelassen. Ein dunkles Öl, das sich abzuscheiden beginnt, wenn die Temperatur der Lösung etwa 200C erreicht, wird durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Lösung gekühlt, um das Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat zur Kristallisation zu bringen.
Beispiel 4 : Herstellung von Anthelvencinsalicylat.
Zu 30 cm3 einer 5%igen wässerigenLösung vonNatriumsalicylat wird 1 gAnthelvencinhydrochlorid, hergestellt nach Beispiel 2, abgegeben. Das Gemisch wird etwa 10 min auf einem Wasserdampfbad erhitzt und in heissem Zustand filtriert, um ungelöste Festsubstanzen zu entfernen. Das klare Filtrat wird auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und die Kristallisation durch Kratzen der Seitenwände des Kolbens mit einem Glasstab eingeleitet. Beim ersten Anzeichen einer Kristallisation wird das Gemisch auf etwa 30C abgekühlt. um eine vollständige Kristallisation zu ermöglichen. Das kristalline Anthelvencinsalicylat wird abfiltriert, zweimal auf dem Filter mit je 10 cms Eiswasser gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd bei Raumtemperatur getrocknet.
Die Umkristallisation erfolgt aus einer Zeigen wässerigen Natriumsalicy1atlösung.
Beispiel 5: Herstellung von"Anthelvencin A", das von"Anthelvencin B"frei ist.
Eine Chromatographiesäule, die einen Durchmesser von 3. 17 cm und eine Länge von 43, 2 cm aufweist, wird mit einem in der folgenden Weise vorbehandelten Cellulosepulver beschickt : Eine Suspension von 100 g Whatman-Cellulosepulver (CM 70) wird hergestellt und etwa 30 min gut gerührt. Die Cellulosewird abfiltriert und sodann erneut nacheinander in 0, 2n-Salzsäure, Wasser und einem Lösungsmittelgemisch suspendiert, das aus n-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 15 : 10 : 1 : 12 besteht.
Eine Lösung aus 5 g Anthelvencinhydrochlorid, hergestellt nach Beispiel 2, in 40 cm3 des oben beschriebenen Lösungsmittelsystems, wird durch die Säule gegeben. Die Säule ist mit einem automatischen Fraktionssammler ausgestattet, der auf Zeitabstände von 30 min eingestellt ist. Die Fliessgeschwindigkeit aus der Säule wird so eingestellt, dass innerhalb dieses Zeitintervalls etwa 5 bis 7 cm3 Eluat ausfliessen. Der Verlauf der chromatographischen Fraktionierung wird durch Prüfung des Eluats in jedem fünften Rohr mit Hilfe einer Dünnschichtchromatographie auf Kieselsäuregel verfolgt. Die beiden
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"Anthelvencins B".
Die Rf-Werte betragen in diesem System 0, 5 bzw. 0, 3. Die Fraktionen, die nach Bestimmung durch dieses Verfahren lediglich"Anthelvencin A"enthalten, werden zusammengefasst und zur Trockne eingedampft. Das auf diese Weise erhaltene feste Anthelvencin A-Hydrochlorid kann wei-
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unterworfen werden, um zusätzliche Mengen der reinen Einzelverbindungen zu erhalten.
PATENTANSPRÜCHE : l. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Anthelvencin und seiner therapeutisch verwendbaren Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass rnan Streptomyces venezuelae ATCC 14583, Streptomyces venezuelae ATCC 14584 oder Streptomyces venezuelae ATCC 14585 in einem Kulturmedium, das assimilierbareQuellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salze enthält, unter aeroben Submerskulturbedingungen züchtet, bis durch den Organismus in dem Kulturmedium eine wesentliche Menge an Anthelvencin gebildet worden ist, gewünschtenfalls das Anthelvencin aus dem Kulturmedium gewinnt und gegebenenfalls das Anthelvencin in ein therapeutisch verwendbares Säureadditionssalz desselben umwandelt.
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