DE1793766C3

DE1793766C3 - Antibiotikum A 3823

Info

Publication number: DE1793766C3
Application number: DE19651793766
Authority: DE
Inventors: Michael Edward Haney Jun.; Marvin Martin Hoehn; James Myrlin Mcguire
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1964-09-28
Filing date: 1965-09-28
Publication date: 1978-11-02
Also published as: FR1588155A; DE1467883B2; CH457720A; GB1127224A; DE1793766B2; NL139557B; NL6512545A; ES317908A1; BR6573551D0; DK115244B; DE1467883C3; DE1467883A1; BE670210A; DE1793766A1

Description

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch angegebene Antibiotikum A 3823.

Die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe von pK'., = 6,65 steht in Übereinstimmung mit einer einzigen Carboxylgruppe.

Das Ultrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A 3823 in Chloroformlösung bei 0,1 mm Schichtdicke ist in der Fig. 1 dargestellt. Dieses deutet auf folgendes hin: Die bei 2,73, 2,98 und 3,05 Mikron auftretenden Maxima bzw. Schultern der Absorption sind Hydroxylgruppen und einer Carboxylgruppe zuzuschreiben. Die Bande bei 5,86 Mikron ist einer Carboxylgruppe zuzuschreiben. Die multiplen Banden in der Gegend zwischen etwa 8 und etwa 10 Mikron stimmen mit einer Absorption für mehrfache C-O-Bindungen überein. In diesem Bereich des Spektrums zeigen sich Ätherabsorption und Absorption durch Hydroxylgruppen.

Das neue Antibiotikum ist als Zusatz zu Tierfutter geeignet.

13,01
11,88
9,70
9,39
8,68
8,20
7,93
7,50
7.21
7,01
6,39
5,47
536
5,19
4,93
4,65
4,47
4,26
3,97
3,77
3,58
3,53
3,44
3,32
3,17

0,05 0,10 0,80 0,90 0,50 0,20 0,20 0,20 0,80 1,00 0,90 0,90 0,05 0,70 0,60 0,50 0.10 0.60 0,10 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

Die berechnete empirische Formel von A 3823 ist Cj₆Hb₆Oi₂. Jedoch läßt das Verhalten der Verbindung unter scharfen Trocknungsbedingungen vermuten, daß das Antibiotikum mit einem Mol Kristallwasser kristallisiert und die empirische Formel des AntibiotikumsC36HMOii lautet.

Qualitative Versuche mit der Verbindung A 3823 lassen vermuten, daß keine reduzierten oder Aminozukker vorhanden sind. Die Steroid- und Gluconsäureteste sind ebenfalls negativ.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum A 3823 besitzt eine Hemmwirkung des Wachstums von Bakterien und Pilzen, welche pathogen gegenüber dem tierischen und pflanzlichen Leben sind. Die Hemmkonzentrationen für eine Anzahl von Organismen, bestimmt durch dii: Agar-Reihenverdünnungsmethode, sind in der nachfolgenden Tabelle I gezeigt.

}7 93

Tabelle I

Testorganismus

Mindestbemmkonzentraiion (y/ml)

Stunden 48 Stunden 72 Stunden

Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Mycobacterium avium
Streptococcus faecalis
Lactobacillus casei
Leuconostoc citrovorum
Proteus sp. No. 1
Vibrio metschnikovii
Alternaria solani
Botrytis cinerea
Colietotrichum pisi
Glomerella cingulate
Helminthosporium sativum
Polyporus osteatus
Penicillium expansum
Pullularia sp.
Sclerotinia fructicoia
Verticillium albo-atrum
Spicaria divaricata

Eine andere wichtige Eigenschaft von A 3823 ist seine Fähigkeit, die Entwicklung der Coccidiose bei Geflügel zu verhindern. So verhindert beispielsweise A 3823, das im Futter von jungen Hühnern vorhanden ist, in Mengen von nur 0,02% sehr wirksam die Mortalität und

<O,78	<O,78	6.25
1,56	1,56	3,13
—	<0,78	12,5
3,13	12,5	100
<0,78	<0,78	50
<O,78	3,13	25
50	>100	12,5
50	50	1,56
		3,13
		100
		100

vermindert bei Hühnern die Zahl der Schaden, weiche durch verschiedene Arten von Coccidien hervorgerufen werden. Die Ergebnisse, die bei vier Species beobachtet worden sind, werden in der Tabelle 11 gezeigt.

Tabelle II

Antibiotische Aktivität des Antibiotikums A 3823 gegenüber vier Coccidienarten

Infizierender Organismus	Antibiotikum	Anzahl der	Mortalität	Gewichts
	gehalt im Futter	Hühner		zunahme
	(Gew.-%)		(%)	(g)
Eimeria tenella	0,02	19	0	1778
	Kontrolle	50	36	133
Eimeria necatrix	0,02	30	0	4128
	Kontrolle	^ς0	48	-98
Eimeria maxima	0,02	50	0	8500
	Kontrolle	50	0	7100
Eimeria Brunetti	0,02	20	0	1498
	Kontrolle	20	0	935

Die akute Toxizität des Antibiotikums A 3823 bei Mäusen, ausgedrückt als LD₅O, beträgt etwa 43,8 ± 5,2 mg/kg Körpergewicht, wenn man das Antibiotikum oral gibt. Intraperitoneal betragt die LD50 etwa 16,8 ± 1,7 mg/kg Körpergewicht. Das Antibiotikum scheint bei Geflügel senr viel weniger toxisch zu sein, da die akute orale Toxizität bei Geflügel, wiederum ausgedrückt als LD50, etwa 284,45 ± 47,22 mg/kg Körpergewicht beträgt.

Das Antibiotikum A 3823 ist bekannten Coccidiostatika bei der Bekämpfung von Coccidien überlegen, die resistent gegen Coccidiostatika, wie Amprolium oder

so 3.5-Dinitro-2-methylbenzamid, sind, wie aus nachstehender Tabelle hervorgeht. Bei einer Abnahme der coccidiostatischen Wirkung eines untersuchten Mittels um mindestens 50 Prozent wird der entsprechende Stamm ils resistent bezeichnet. In der Tabelle geben die Werte vor dem Schrägstrich die Gesamtzahl der resistenten Isolate und die Werte nach dom Schrägstrich die Gesamtzahl der untersuchten Isolate wieder.

Resistenz von Eimeria acervulina gegenüber Antibiotikum A 3823 und verschiedenen bekannten Coccidiostatika

Coccidiostatikum

Anzahl der Resistenz gegen: untersuchten

Isolate Buquinolat A-3823 Meticlor-

pindol Decoquinat Nicarbazin Robtniden

Amprolium & Ethopabat	53	23/29	0/7	10/53	25/53	0/4	0/2
Buquinolat	13	13/13")	—	5/13	10/13»)	—	—
Antibiotikum A 3823	47	0/1	0/46»)	U/47	23/47		0/9
MeticlorDtndol	104	41/59	0/27	82/104»)	55/104	1/2	0/4

Fortsetzung

Coccidiostalikiini

Anzahl der Resistenz gegen: untersuchten

Isolate ßiiqiiinoliit A-3823 Metidol- Deioqiiinal Nicarbazin Kobeniilen

pindnl

Decoquinat

Nicarbazin

Nihydrazon

3,5-Dinitro-2-methylbenzamid 30

Nitromid & Sulfanitran

Robeniden

02	38/44·')	0/20	37/102	95/102»)	2/8
4	0/4	—	2/4	0/4	—
2	1/2	—	1/2	0/2	—
30	6/7	0/9	15/30	11/30	1/1
25	12/14	0/1	11/25	14/25	_
3		0/3	0/3	2/3

0/2

0/3·'

Diese Werte bedeuten das Auftreten von Resistenz gegen Ciiccidiosiatika /um Zeitpunkt der Probcngewinming.

Die Herstellung des Antibiotikums Λ 3823 erfolgt dadurch, daß man Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Sticksloffquellen und anorganische Salze enthalt, unter submersen, aeroben Bedingungen kultiviert, anschließend die Fermentationsbrühe filtriert, das Filtrai und den Mycclkuchen mit einem niedermolekularen Alkohol, niedermolekularen Ester, einem Keton. Chloroform. Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid extrahiert und das Antibiotikum aus dem Extrakt nach an sich bekannten Methoden abtrennt.

Wegen der Unsicherheit der Klassifizicrungsuntersuchungen bei Streptomyces-Organismen bestehen stets Zweifel bei der Klassifizierung eines neu aufgefundenen Organismus. Jedoch scheint der Organismus, welcher das Antibiotikum A 3823 bildet, in seinen wichtigsten Eigenschaften am meisten dem Streptomyces cinnamonensis Okaini (NRRL B I 588) zu ähneln. Er ist jedoch als ein neuer Stamm dieses Streptomyces anzusehen, da ausreichende Unterschiede zwischen dem neu aufgefundenen Stamm von Strepiomyces cinnamonensis und dem bekannten Stamm bestehen. Die zwei Stämme ähneln einander in der Sporenkette und in der Sporenmorphologie, in der Färbung des hergestellten Luft- und vegetativen Mycels und im Vorhandensein eines löslichen Pigments. Jedoch unterscheiden sich die beiden Stämme in der Verwertung von neun Kohlenstoffqucllen. in der Herstellung von Schwefelwasserstoff durch Streptomyces cinnamonensis (NRRL B 1588). dagegen Fehlen der Herstellung von Schwefelwasserstoff durch den neu aufgefundenen Stamm. Insbesondere unterscheiden sich die zwei Stämme aber stark in ihren Temperaturerfordernissen. So erfolgen beispielsweise bei Streptomyces cinnamonensis (NRRL B 1588) maximales Wachstum und maximale Sporenbildung bei 26" C. Bei 30" C erfoigt nur eine mittelmäßige Sporenbildung. Ein Wachstum erfolgt, jedoch ohne Sporenbildung, bei 37^GC. während bei 43° C das Wachstum vollständig unterdrückt wird. Im Gegensatz hierzu wächst der neu aufgefundene Stamm von Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 bei 30 bis 37°C maximal unter maximaler Sporenbildung. Bei 43°C tritt noch mittelmäßiges Wachstum, obgleich mit spärlicher Sporenbildung, auf. das ist bei einer Temperatur, bei welcher der bekannte Stamm überhaupt nicht mehr wächst.

Der Organismus, welcher das Antibiotikum A 3823 produziert, wurde aus einer in Phoenix, Arizona, entnommenen Bodenprobe isoliert. Dabei wurde die Bodenprobe in sterilem, destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension auf Nähragar aufgetragen. Die beimpften Agarplatten wurden bei 25 bis 35°C bebrütet.

bis man sichtbare Kolonien beobachtete. Nach der Inkubationszeit wurden Kolonien der Antibiotika erzeugenden Organismen mit einer sterilen Platinöse iiui Schrägagar übertragen, Die Schragugiir Ansätze wurden dann bebrütet, um geeignete Mengen an Impfmaterial für die Herstellung von A 3823 zu gewinnen.

Die für die Klassifizierungsuntersuchungcn des A 3823 produzierenden Stammes von S. cinnamonensis ATCC 15413 verwendeten Methoden sind diejenigen, welche man üblicherweise zur Klassifizierung son Actinomycctcn verwendet. Die Kohlenstoffverwertungstcste wurden ausgeführt in Übereinstimmung mit der Methode von P r i d h a m und Gottlieb (J. Bact. 5b [1948]. S. 107). In den nachfolgenden Absätzen sind die Ergebnisse der Klassifizicrungsuntcrsuchungen zusammengefaßt. Die in Klammer gesetzten Ziffern beziehen sich auf Farbgruppen im Dictionary of Color von M a e r ζ und Paul (1950). Alle Kulturen wurden bei 30* C gezüchtet. Morphologische und Kulturcharakteristiken wurden nach 14 Tagen Inkubationszeit bestimmt. Zum Studium der Morphologie der Kulturen wurden Tomatenpastcn-Hafermehl-Agar und Czapek-Agar verwendet. Nitratreduktion und Gelatine-Verflüssigung wurden nach 7 und 14 Tagen bestimmt, während Beobachtungen über die Schwefelwasscrstoffbildung nach 24 und 48 Stunden erfolgten. Wie üblich wurde die Kohlenstoffverwertung nach 10 Tagen Inkubationszeit bestimmt.

Mikroskopische Morphologie

Morphologie der Sporenkette

Sporophoren und Sporenketten sind gerade bis gekrümmt; Spiralen und Haken sind nicht vorhanden. Die Sporen sind oval bis kurze Zylinder mit Abmessungen von 0,7 bis 11.1 πιμ zu 1,4 bis 2,2 ιτιμ Elektronenmikroskopische Aufnahmen von mil Platin kontratstierten Kohleabdrücken der Sporer zeigen eine verhältnismäßig glatte Sporenoberfläche, welche mit einem Netzwerk von ineinandei verschlungenen, feinfaserigen Bündeln bedeckt ist.

Kultureigenschaften

Tomatenpasten-Hafermehl-Agar

Das Wachstum ist reinlich mit einem starkei blaßroten (3-D7) Luftmycel, die Rückseite is rotbraun (8-H3). Es ist ein lösliches, rotbraune Pigment vorhanden.

Nähragar

Das Wachstum ist gering ohne Luflmycel. Die Rückseite ist gelb (I0-F3). Lösliches Pigment ist nicht vorhanden.

Czapek-Agar

Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen, hellrosafarbenen (2-Bl) Luftmycel. Die Rückseite ist i'.dlgelbbraun (I1-F5). Man beobachtet eine geringe Menge eines braunen, löslichen Pigments.

Glucose-Asparagin-Agar

Das Wachstum ist spärlich ohne Luftmycel. Die Rückseite ist hellgelb-grün (19-Bl).

Stärke-Agar mit anorganischen Salzen

Das Wachstum ist reichlich mit einem reichlichen, mäßig blaßroten Luftmycel; die Rückseite ist mäßig braun (I4-A10). Es ist eine geringe Menge eines braunen, löslichen Pigments vorhanden.

Heieextrakt-Agar

Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen Luflmycel. welches weiß ist mit einem bräunlichblaßroten Rand. Die Rückseite ist ein dunkles, graustichiges Braun (15-A2): wenig braunes, lösliches Pigment.

Bennet-Agar

Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen, graustichigen. gelb-blaßroten (4-B7) Luftmycel. Die Rückseile ist mäßig braun (I4-A10): wenig braunes, lösliches Pigment.

F.mersoii-Agar

Das Wachstum ist mäßig, jedoch ohne Luftmycel. Die Rückseite ist mäßig orangefarben (10-17). Lösliches Pigment nicht festgestellt.

Calciummalat-Agar

Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen gclb-blaßroten (3-D7) Luftmycel. Die Rückseite ist graubraun: wenig braunes, lösliches Pigment.

Tyrosin-Agar

Das Wachstum ist nur mittelmäßig ohne Luftmycel. Die Rückseite ist ein graustichiges Gelb (I2-B2). Lösliches Pigment wurde nicht festgestellt.

Physiologische Eigenschaften

Magermilch

Koagulation und Peptonisierung wurde beobachtet.

Gelatineverflüssigung
Wechselnd

Nitratreduktion
Negativ

Temperaturbedingungen

Maximales Wachstum und maximale Sporenbildung werden zwischen 30 und 37° C beobachtet. Bei 43° C finden mittelmäßiges Wachstum und mittelmäßige Sporenbildung statt. Bei 50° C beobachtet man kein Wachstum.

Die Ergebnisse der Teste der Kohlenstoffverwertung, die mit dem A 3823 produzierenden Stamm von S. cinnamonensis ATCC 15413 durchgeführt wurden, sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben. Die Bedeutung der in der Tabelle verwendeten Symbole zur Kennzeichnung des Wachstums sind wie folgt:

Kohlenstoff-Quelle

Reaktion

D( + )-Xylose
-, L^ + )-Ribose

L( + )-Rhamnose

Dextrose +

Fructose +

Saccharose (-)

in Lactose ( —)

D( + )-Raffinose +

i-lnosit +

Inulin (-)

Maltose +

ι-, Mannit +

Salicin +

d-Sorbit (-)

D-Ribose +

D{ + )-Trehalose +

2(i D( + )-Mannose +

+ = Verwertung.
( + ) = Verwertung wahrscheinlich.
(-)= Verwertung fraglich.

- = keine Verwertung.

Zur Herstellung des Antibiotikums A 3823 durch Strepiomyces cinnamonensis ATCC 15413 eignet sich ein übliches Kulturmedium aus assimilierbaren Kohlen-

iii stoff- und Stickstoffquellen. Eine bevorzugte Carbohydratquelle ist beispielsweise Melasse, obgleich auch Glucose. Fructose. Maltose. Stärke oder Inosit verwendet werden können. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Sojabohnenmehl oder Mischungen von Amin-

Γι säuren. Anorganische Nährsalze, welche dem Kulturmedium einverleibt werden können, sind die üblichen Salze, die Natrium-. Kalium-, Ammonium-, Calcium-. Phosphat-, Chlorid-oder Carbonat-Ionen liefern können.
Spurenelemente, welche für das Wachstum und die

4M Entwicklung des Organismus Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 notwendig sind, sollen auch im Kulturmedium vorhanden sein. Solche Spurenelemente kommen üblicherweise als Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor. die

4i ausreichen, um den Wachstumsbedingungen des Organismus zu entsprechen.

Der zur Herstellung von A 3823 verwendete Organismus kann beträchtlichen Änderungen in den Wachstunisbedingungen unterworfen werden. So wächst der

in Organismus beispielsweise in einer Vielfalt von Medien, in welchen der anfängliche pH-Wert sehr stark schwankt. Vor der Beimpfung des Mediums mit dem Organismus ist es jedoch erwünscht, den pH-Wert des Nährmediums auf einen Wert zwischen etwa 6,5 und etwa 7.5 einzustellen, was von dem im Einzelfall verwendeten Medium abhängt. Ebenso wie bei anderen Actinomyceten wird mit fortschreitender Fermentation das Medium allmählich alkalischer und kann während der Wachstumsperiode des Organismus einen pH-Wert zwischen etwa 7 und etwa 8 oder höher erreichen. Der End-pH-Wert wird wenigstens teilweise bestimmt durch den anfänglichen pH-Wert des Mediums, die im Medium vorhandenen Pufferstoffe und die Zeitdauer des Wachstums.

Ebenso wie für die Herstellung anderer Antibiotika werden für die Herstellung von wesentlichen Mengen des Antibiotikums A 3823 vorzugsweise aerobe Submerskulturen in großen Tanks verwendet. Kleine

Mengen des Antibiotikums erhält man zweckmäßig in .Schüttelkolben und durch Obcrflächenkulturen in Flaschen. Das Fermentationsmediuni im sterilen Tank kann zur Einleitung der Fermentation mit einer Suspension, die Sporen gebildet hat, beimpft werden. Da jedoch die Erfahrung gemacht wurde, daß bei Verwendung einer Suspension, die Sporen gebildet hat. als Impfmaterial eine Wachstumsverzögerung eintritt, verwendet man bevorzugt die vegetative Form der betreffenden Kultur. Durch Vermeidung der Wachstumsver/ögeriing in dieser Weise realisiert man eine wirksamere Ausnutzung der Fermentationsvorrichtung. Fs ist daher erwünscht, zunächst ein vegetatives Impfmaterial der Organismus dadurch herzustellen, dal) man eine verhältnismäßig kleine Menge eines Kulturmediums mit einer Sporenform des Organismus beimpft und. wenn man ein junges, aktives, vegetatives Impfmaterial hergestellt hat, dieses aseptisch in einen giuijen Gäiiiiiik /.u üuci irugi-n. Das medium, in welchem das vegetative Impfmaterial hergestellt wird, kann entweder dasselbe oder ein anderes Medium als dasjenige sein, das man für die großtechnische I lerstellung von A 3823 verwendet.

Der das Antibiotikum A 3823 produzierende Organismus wächst innerhalb eines weiten Temperaturbereichs zwischen etwa 25 und etwa 45ⁿC. Maximales Wachstum und maximale Sporenbildung treten jedoch zwischen etwa 27 und etwa 37°C ein. Bevorzugt wird die Fermentation bei einer Temperatur zwischen etwa 27 und 30⁰C durchgeführt.

Wie bei aeroben, submerscn Züchtigungsverfahren üblich, wird sterile Luft durch das Kulturmedium während der Fermentation geblasen. Für ein wirksames Wachstum des Organismus und entsprechend gute Erzeugung von A 3823 in der Tankherstellung des Antibiotikums beträgt das verwendete l.uftvolumen vorzugsweise wenigstens etwa 0,1 Raumteile I.uft/Minute/Raumteil Kulturmedium. Das beste Wachstum und die besten Ausbeuten an A 3823 erhält man. wenn das verwendete Luftvolumen wenigstens 0,5 Raumteile Luft/Minute/Raumteil Kulturmedium, vorzugsweise wesentlich mehr, beträgt.

Die Konzentration des gebildeten Antibiotikums im Kulturmedium kann man während der Fermentation leicht dadurch verfolgen, daß man Proben des Kulturmediums auf ihre Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum eines Organismus prüft, von dem bekannt ist. daß sein Wachstum in Gegenwart dieses Antibiotikums gehemmt ist. Für diesen Zweck sind die Organismen Mycobacterium avium und Bacillus subtilis geeignet. Die Prüfung der Proben kann man in bekannter Weise turbidimetrisch oder mit der Zylinder-Plattenmethode durchführen.

Im allgemeinen erfolgt die Höchstproduktion an A 3823 innerhalb von etwa 2 bis 5 Tagen nach Beimpfung des Nährmediums, wenn man eine aerobe Submerskultur oder Schüttelkolbenkultur verwendet, und innerhalb etwa 5 bis 10 Tagen, wenn man eine Oberflächenkultur verwendet.

Das während der Fermentation erzeugte Antibiotikum A 3823 kann sich entweder in der Nährbrühe oder im Mycel oder an beiden Orten bilden. Demzufolge werden die Isolierungsverfahren so gewählt, daß eine Höchstgewinnung des Antibiotikums entweder von einer oder von beiden Quellen ermöglicht wird. Beispielsweise kann man die erhaltene Nährbrühe filtern und das Filtrat mit dem betreffenden Lösungsmittel extrahieren, um das nicht im Mycelkuchen

zurückgehaltene Antibiotikum zu gewinnen. Das im Mycelkuchen vorhandene Antibiotikum wird durch gründliche Extraktion des Mycelkuchens mit dem betreffenden Lösungsmittel gewonnen. In beiden Fällen kann das Antibiotikum aus dem Extraktionslösungsmittel durch allgemein übliche Methoden erhalten werden.

Beispiel I

Herstellung des Antibiotikums A 3823 in Schiit telkolbenkulturen

Man beimpft einen Nähr-Schrägugar. welcher aus 5 g Casaminsäure, 5 g Glycerin, 5 g Dextrin, 10 g Endmelasse des Zuckerrohrs (»Black-strap-Melassc«). 5 g Hefe 2019, I g K₂HPO₄. 5 ml einer Mineralsahrlösung, 20 g Agar und Leitungswasser bis auf c.n Gesamtvolumen von I I besteht, mit Sporen von Strcptomyces cinnamoncnsis. Stamm ATCC 15413. (Die rviiiR-iiilscir/lüSÜMg iriiiliüli Ϊ 00 g KCi. 100 g MgSo₄ · 7 H₂O, 2 g FOSO4 und 2 ml konzentrierter Salzsäure je Liter Lösung.) Der pH-Wert des Sporen-Impfmediums wird auf einem pH-Wert von 7,6 bis 7,8 eingestellt. Der beimpfte Schrägagar wird etwa 5 Tage bei etwa 3O⁰C bebrütet, dann mit einer geringen Menge sterilem Wasser bedeckt und leicht abgeschabt, um die Organismen abzulösen und eine wäßrige Suspension der Organismen zu gewinnen.

1 ml der so erhaltenen Suspension verwendet man zum Beimpfen von 100 ml eines Mediums für vegetatives Wachstum, welches die folgende Zusammensetzunghat:

Cerelose	15g
Sojabohnenmehl	15g
Maisquellwasser- Feststoffe	5g
Natriumchlorid	5g
Calciumcarbonat	2g
Wasser auf	I I

Das Medium dieser Zusammensetzung wird bei etwa 120°C und etwa 1,06 at etwa 30 Minuten sterilisiert, bevor es geimpft wird. Das geimpfte Medium für vegetatives Wachstum wird etwa 48 Stunden bei etwa 30⁰C auf einer Amplitudenschütielmaschine mit einer Amplitude von etwa 5,1 cm und 108 Bewegungen je Minute geschüttelt.

5-ml-Anteile des erhaltenen Mediums mit vegetativem Wachstum verwendet man zur Beimpfung von 100-ml-Anteilen eines sterilen Produktionsmediums, welches in 500-ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist. Das verwendete Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung je Liter:

Cerelose	10g
Brer-Rabbit-Melasse	20 g
Pepton	5g
Calciumcarbonat	2g
Wasser auf	1 I

Die beimpfte Produktionskultur schüttelt man etwa 5 Tage bei etwa 26 bis 30⁰C auf einer wie oben

to beschriebenen Ampiitudenschüttelmaschine. Danach gibt man den Inhalt einer Anzahl von Schüttelkolben zusammen, filtriert die Brühe durch eine Buchner-Nutsche mit Hilfe einer handelsüblichen Filterhilfe. Die filtrierte Brühe stellt man auf einen pH-Wert von etwa 3

e: mit 5 η-Salzsäure ein und extrahiert dann zweimal mit Chloroform. Man engt die vereinigten Chloroformextrakte zur Trockne ein, löst den Rückstand in Chloroform und filtriert die Lösung. Man leitet das

Filtrat durch eine Kolonne mit den Abmessungen 2 cm χ 48 cm. die mit 0.42 χ 1,68 mm großen Aktivkohlcstücken gefüllt ist und welche vorher mit Chloroform gewaschen worden ist. Nach dem Antibiotikumfiltrat leitet man 1 I Chloroform durch die Kolonne. Die aus der Kolonne ablaufenden Fraktionen, die in der Prüfung antibiotische Aktivität zeigen, vereinigt man und verdampft zur Tockne. Man löst den Rückstand in einem Lösungsgemisch, welches 10 Teile Methanol auf I Teil Wasser enthält. Die erhaltene, das Antibiotikum enthaltende Lösung wird erwärmt und dann in einem Kühlraum beiseite gestellt. Die Kristallisation des Antibiotikums erfolgt langsam, wenn etwas von dem Methanol verdampft. Man trennt die Kristalle in einer Zentrifuge ab. wäscht sie mit kaltem Wasser und trocknet sie in einem Vakuumofen. Das erhaltene Antibiotikum wird aus Ather/Pctroläther umkristailisicrt und im Vakuum getrocknet. Das Antibiotikum besitzt die im Anspruch angegebenen Eigenschaften.

Beispiel 2

Herstellung des Antibiotikums A 3823 in
halbtechnischem Maßstabe

Fin 2-l-Kolben mit 800 ml eines Mediums für vegetatives Wachstum, das 1% Maisstärke. 0.5% Natriumchlorid. 0.5% Pepton, 0.5% Rindfleischextrakt und 0.25% Hefeextrakt in destillierum Wasser enthält, wird geimpft mit einer Suspension, die man aus einer Nähr-Schrägagarkultur, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten hat. Das geimpfte Medium für vegetatives Wachstum wird 29 Stunden bei etwa 28° auf einer Rotationsschüttelmaschinc mit 6.4 cm Ausschlag bei 250 Umdrehungen/Minute bebrütet. 50 ml der so erhaltenen vegetativen Kultur verwendet man zum Beimpfen eines 44-l-lmpfkulturbehälters. welcher ein Medium enthält, das 30 Minuten bei 120' C sterilisiert worden ist. und 1% lösliche Stärke. 0.5% Hefeextrakt. 0.5% Pepton. 0.5% Natriumchlorid und 0.5% Rindflcischextrakt in Wasser enthält. Man hält den Impfkulturbehälter nach der Impfung 24 Stunden bei 28°C. Das Bewegen beginnt nach 8 Stunden mit einer Geschwindigkeit von 370 Umdrehungen/Min. In den ersten 8 Stunden belüftet man mit 0.0113 m³ Luft/Min, und erhöht dann auf eine Menge von 0.0396 mVMin. Man verwendet die Impftankkultur zum Beimpfen eines 946-l-Fermenters. welcher ein sterilisiertes wäßriges Fermentationsmedium enthält, das aus 1% Cerelose, 1% Zuckerrohrmelasse, 0,5% Sojabohnenschrot. 0.2% Calciumcarbonat und 0,02% eines Antischaummittel besteht. Die Temperatur des Fermentationstanks hält man bei etwa 3O⁰C während der ganzen Fermentation. Die Belüftung während der Fermentation beträgt 0.482 rnVMin. Man beginnt das Bewegen nach 6 Stunden mit 175 Umdrehungen/Min, und setzt die Fermentation fort.

Dann werden zu 825 1 der erhaltenen Gesamtfermentationsbrühe 21 kg einer handelsüblichen Filterhilfe gegeben. Man mischt die Brühe gründlich mi: der Filter'iilfe und filtriert dann durch ein 61-cm-Platten- und Rahmenfilter. Man wäscht den Filtei kuchen auf dem Filter mit einer ausreichenden Menge destiilieriem Wasser, um zusätzlichem Filtratvolumen auf 825 i zu bringen. Den Filterkuchen hebt man für die weitere Verarbeitung zur Gewinnung von zusätzlichen Antibiotikum auf.

Man fügt zu dem Filtral etwa 5501 Chloroform und senkt den pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von 5 η-Salzsäure auf etwa 3. Man mischt die wäßrige und flie organische Phase gründlich etwa 30 Minuten und trennt dann durch Zentrifugieren. Die verbrauchte Brühenphase wird verworfen. Die Chloroformphase konzentriert man im Vakuum auf ein Volumen von etwa 9450 ml. Dann leitet man das Chloroformkon/entrat -'» durch eine Glaskolonne eines Durchmessers von 10.2 cm, welche bis zu einer Höhe von 168 cm beschickt ist mit 1,68 χ 0.42-mm-Aktivkohle der Handelssorte Pittsburgh Cdi carbon, die in der Kolonne vorgewaschen worden ist. indem man 50 I Chloroform durch die _'") Kolonne mit einer Menge von 500 ml/Min, durchgelcitet hat. Man leitet das Chloroformkonzentrat, welches das Antibiotikum enthält, durch die Kolonne in einer Menge von etwa 200 ml/Min. Die von der Kolonne abfließenden ersten vier Liter, welche das in der Kolonne festgehaltene Flüssigkeitsvolumcn darstellen, werden verworfen. Nach dem Chloroformkon/entrai leitet man Chloroform als Waschflüssigkeit durch die Kolonne. Man gewinn! etwa 50 Liter Kolonnenchiat. in dem das Antibiotikum enthalten ist, und konzentriert dieses Eluat im Vakuum auf ein Volumen von etwa 370 ml.

Zusätzliches Antibiotikum erhält man aus den; Filterkuchen, indem man zweimal 70 1 Methanol durch die Filterpresse leitet. Den verbrauchten Filterkuchen verwirft man. Die vereinigten Mcthanolcluate kon/en triert man im Vakuum am ein Volumen von etwa 13 Liter. Man gibt etwa 8.7 1 Chloroform zu den· Konzentrat, erniedrigt den pH-Wert durch Zugabe von 5 η-Salzsäure auf etwa pH 3. mischt die zu ei Phasen gründlich etwa 30 Minuten und trennt dam; durch Zentrifugieren Die verbrauchte Wasserphase wird verworfen. Die Chloroformphase konzentriert man in Vakuum auf ein Volumen von etwa 420 ml. Das erhaltene Konzentrat wird mit dem obigen aus dem Filtrat der Brühe erhaltenen Konzentrat vereinigt. Dieses Konzentrat wird dann zu kristallinem Antibiotikum A 3823 analog dem in Beispiel 1 beschriebener, Verfahren aufgearbeitet. Das erhaltene Antibiotikum besitzt die im Anspruch angegebenen Charakteristiken.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Antibiotikum A 3823 mit folgenden Charakteristiken: Weiße, feste, kristalline Substanz vom F, etwa 103 bis 106°C, löslich in niedermolekularen Alkoholen, niedermolekularen Estern, Ketonen, Chloroform, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid und unlöslich in Wasser. Die Substanz hat eine titrierbare Gruppe von pK'_a = 6,65 in 66%igem, wäßrigem Dimethylformamid, eine optische Drehung [a] J⁵ von +47,7" als l%ige Lösung in Methanol. Die Elementaranalyse ergibt nach 2 Stunden Trocknen im Vakuum über Phosphorpentoxid bei etwa 60° C eine angenäherte Zusammensetzung von 62,78% Kohlenstoff, 9,43% Wasserstoff und 26,61% Sauerstoff und nach dem Trocknen in einer Block-Schmelzpunktsvorrichtung eine angenäherte Zusammensetzung von 64,66% Kohlenstoff, 9,58% Wasserstoff und 25,41% Sauerstoff. Das Molekulargewicht beträgt etwa 677, berechnet aus Titrationswerten. Die Lösung des Antibiotikums in Chloroform zeigt das in der Figur dargestellte Ultrarotabsorptionsspektrum mit den folgenden unterscheidbaren Banden bei 2,73,2,98 (Schulter), 3,05,338,3,47, 5,86,6,23,6,83,7,02,7,26,7,56,7,66,7,76,8,04,9,02,9,17, 9,47, 9,78, 9,91, 10,06, 10,25, 10,53, 10,82, 10,98, 11,21, 11,44,11,64,11,82 und 11,97 Mikron. Im Ultraviolettbereich besitzt es keine merkliche Absorption. Die Substanz ist erhältlich durch Kultivieren von Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und unorganische Salze enthält, unter submersen, aerobjn Bedingungen mit anschließender Filtration der Fernv iitationsbrühe und Extraktion des Filtrats und Mycelkuchens mit einem niedermolekularen Alkohol, niedermolekularen Ester, einem Keton, Chloroform, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid und Abtrennung des Antibiotikums aus dem Extrakt nach an sich bekannten Methoden.

Das Antibiotikum A 3823 unterliegt einer raschen Veränderung in saurer Lösung unter Aktivitätsverlust. In basischer Lösung dagegen ist das Antibiotikum merklich beständig. So unterliegt beispielsweise eine Probe des Antibiotikums, das man bei einem pH-Wert von 11 60 Stunden unter Rückfluß erhitzt, keiner sichtbaren Änderung, abgesehen von der Bildung des Salzes der Säure. Wenn man das Antibiotikum aus trockenes, kristallines Material lagen, so bleibt A 3823

ίο lange Zeit beständig.

Auch das Kernmagnetresonanzspektrum zeigt, daß das Molekül eine Carboxylgruppe, 3 bis 4 Hydroxylgruppen und eine Ätherbindung aufweist. Der Rest des Moleküls scheint aus Methylen- und Methyl-Gruppierungen zu bestehen.

Ein Röntgenpulverdiagramm des Antibiotikums unter Verwendung einer Cr-Strahlung mit einem Vanadiumfilter zur Berechnung der Schichtlinienabstände ergibt folgende Werte: