DE1467757A1 - Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums - Google Patents

Description

No. 50-6, 6-chome, Nogata-machi , Nakano-ku, Tokyo, Japan

"Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums"

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, das fungizide Wirkungen hat und als Gopiamycin bezeichnet und von Streptomyces hygroscopicus var. Crystallogenes abgeleitet ist.

CO OO O

O CO -3 OO

Es besteht ein starker Bedarf an chemischen Mitteln zur Verhinderung des durch Einwirkung von Pilzen hervorgerufenen Verschimmelns von Nahrungsmitteln und zur Behebung von Pilzkrankheiten, die Pflanzen, Tiere and Menschen befallen. Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von verbesserten Mitteln gegen Pilzwachstum zu schaffen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man unter kontrollierten aeroben Bedingungen

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in einem wässrigen Kulturmedium, das kohlenstoffhaltige und stickstoffhaltige Bestandteile und die üblichen wichtigen Spurenmineralien enthält, den Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes züchtet. Die Ausgangskultur des Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die aus einem Garten in Horyuji Temple, Nara prefecture, Japan, genommen worden war. Die Isolierung wurde mittels des üblichen Verdünnungsverfahrens unter Verwendung eines Kulturmediums, das selektiv für Streptomyces ist, durchgeführt. Der Stamm Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes ist eine neue Variante von Mikroorganismen, die bisher nicht bekannt war und gehört zur Gruppe der S. hygroscopicus gemäß der Klassifikation von Waksman (The Actonimycetes Vol. II, Seiten 143-144, 1961). Ein sorgfältiges Studium der Morphologie und Physiologie des Stammes Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes zeigt, daß dieser Stamm sich deutlich unterscheidet von irgendeiner bekannten Art und Variante des S. hygroscopicus und demzufolge ist dieser Stamm eine neue Variante der Gruppe der Streptomyces. Der Ausdruck "crystallogenes¹¹ besagt, daß sich in dem festen Medium, das den wachsenden Stamm umgibt, eine Anzahl kleiner Kristalle von nicht identifizierter Art gebildet haben. Man erkennt aus dem Studium der Eigenschaften der Streptomyces-Arten, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (6. Edition, 1948), "Guide to the identification of the Actinometycetes and their Antibiotics", Waksman und Leohevalier, 1953 beschrieben sind, und aus "The Actinomycetes",

Vol. II, Waksman, 909807/0Ö78 _ ₃ _

ORIGINAL INSPECTED

1961, daß der Stamm zur Gruppe der Hygroscopicus gehört. Eine Kultur von Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes wurde bei der Sammlung "American Type Culture Collection Rockuille, Maryland, unter der Nummer ATCC No. 19040 hinterlegt.

Beschreibung des Streptomyces hygroscopicus var« crystallogeneB

Morphologie: >

Auf Glycerin-Asparagin-Agar; Sporophoren monopodisch verzweigt mit zahlreichen geschlossenen Spiralen in Gruppen angeordnet. Die Spiralen sind in 4 "bis 6 Bogen mit 20^u im Durchmesser hergestellt. Die Sporen, die kurz und zylindrisch sind, haben die Abmessungen 1,0 bis 2,0 χ 1,0 bis 1,2^/U, und haben eine nichtglatte Oberflächenstruktur.

Auf Saccharosenitrat-Agar: Das Gewächs ist hellgelb (PL10-c-2)⁺ bis zimtbraun (PI12-D-8).- Reichlich Luftmycelium, pulverförmig, weiß mit grauen Flecken (PL31-A-1), die dunkelgrau werden. Keine löslichen Pigmente oder leichtbraun.

Glucose-Asparagin-Agar: Gewächs ausbreitend, Zitronenfarben bis orange (PI10-i'-3) später bräunlich. Reichlich Luftmycelium, pulverförmig, leicht gelblichweiß mit bräunlichgrauen Teilchen, die später feucht und schwarz werden. Keine löslichen Pigmente.

Nähr-Agar: Gewächs ausbreitend, kleine Kolonien mit"erhöhten Punkten, leicht grau bis gelblichbraun. Kärgliches Luftmycelium, weiß. Einige Teile der Kolonien bleiben ohne Mycelium. Keine löslichen Pigmente. - , ·

Ca-Malat-Glycerin-Agar: Gewächs ausbreitend, starke Kolonien» kanariengelb (PL11-1-3) bis rötlichgelb (PL-11-K-7). Reichlich Luftmycelium, weiß bis grünlichgelb (PL18-J-1). Leicht grünlichgelbliches lösliches Pigment.

Hefeextrakt-Agar: Gewächs ausbreitend, starke Kolonien mit eingedrückten Mittelpunkten, bräunlich. Reichlich Luftmycelium, mattweiß bis aschgrau. Keine löslichen Pigmente.

Ta?yrosin-Agar: Erhöhte Kolonien, rötlich braun bis dunkelbraun. Reichlich Luftmycelium, leicht grünlich gelb. Blaßrosa lösliche Pigmente, die mit der Zeit rötlich braun werden.

Kartoffelpflock: Erhöhte Gewächse, braun bis dunkelbraun; weißes Luftmycelium mit grauen Anfärbungen, die später mausgrau werden. Die Farbe des Pflocks bleibt unverändert.

Möhrenpflock: Reichliches Wachstum, anwachsend, leicht rötlich gelb. Reichlich Luftmycelium, cremefarben bis aschgrau, mit der Zeit schwarz werdend. Keine löslichen Pigmente.

Milch: Cremefarbener Ring. Starke Peptonisation ohne Koagulation.

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H67757

Gelatine: Gewächs cremefarben fels "braun, starke Verflüssigung, keine löslichen Pigmente.

Blutagarr Bunde erhöhte Kolonien, grünlich braun mit glatter Oberfläche und runzligen peripheren Teilen. Kein Luftmycelium, keine löslichen Pigmente.

HgS-Produktion: negativ

IFitrat-Reduktion: negativ

Stärke wird mäßig hydrousiert

Cellulose wird nicht abgebaut.

Die Farben sind bezeichnet gemäß "Dictionary of Color" Maery

and Paul. McGraw-Hill Bock Co., Inc. New York, 1950.

Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes hat die Fähigkeit, verschiedene im Handel erhältliche Zohlenstoffquellen zu verwerten und zwar folgende: Glucose, Arabinose, Fructose, Lactose, Maltose, Saccharin, Inositol, Baffinose, Galactose, Bhamnose, Xylose, Inulin, Adnitol, Dulcitol, Mannitol, Sorbitol, Natriumsuccinat und Natriumeitrat. Auf Natriumacetat wächst der Stamm nicht. Die Untersuchungen zur Verwertung des Kohlenstoffes wurden entsprechend dem von T.C. Pridham und D. Gottlieb beschriebenen Verfahren durchgeführt (The Utility of Carbon Compounds by some Actinomyeetes as an Aid to Species Determination, Journal of Bacteriology, 56, 107-114, 1948). Der Stamm Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes kann innerhalb eines Tempera-

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turbereiches von 2O⁰C oder weniger bis zu 40⁰G wachsen, ist jedoch nicht mehr aktiv bei 45°C und darüber. Die Hauptkennzeichen von S. hygroscopicus var. crystallogenes sind:

1. Bildung von engen Spiralen im Luftmycelium;

2. Nichtglatte Struktur der Sporenoberfläche;

3. Nicht farbstoffbildend;

4. Es fehlt eine merkliche Produktion von löslichen Pigmenten in irgendeinem Medium;

5. In den meisten Medien Graufärbung des Luftmyceliums, daa wenn der Feuchtigkeitsgehalt entsprechend ist, stets schwarz wird, ein deutliches Anzeichen dafür, daß der Stamm zur Gruppe der Streptomyces hygroscopicus gehört (Tresner and Backus) A bradened concept of the characteristics of Streptomyces hygroscopicus, Appl. Microbiol., 4, 243-250, 1956).

Wenn man jedoch den Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes vergleicht mit Streptomyces hygroscopicus CBS (Westerdijk) und S.endus, Gottlieb's Stamm, dann werden Unterschiede in den Kulturbedingungen und den physiologischen Eigenschaften ersichtlich, die nachfolgend zusammengefaßt sind.

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Saccharosenitrat-Agart

Gewächs

Ca~malat-glycerinagar;

S.hygroscopicus var. crystal-Iogenes

leicht gelblich "bis zimtbraun

S.hygroscopicus

weiß bis hellbraun

S.endus

hellbraun, dunkel werdend

G-ewächs	kanariengelb	graubraun	hellcremefarben
lösliches Pigment	leicht grünlich gelb	keines	keines
Hefeextrakt-Agar:
lösliches Pigment	keines	keines	leicht braun
Möhrenpflock
Luftmycelium	cremefarben	mausgrau	mausgrau
Tyrο s in-Agar:
lösliches Pigment	blaßrosa	keines	keines
Haemolyse	positiv	negativ	negativ
Morphologie
Spiralen	4-6 Spiral schleifen	4-6 Spiral schleifen	"10 Spiral schleifen

Solche Unterschiede werden auch beobachtet, wenn man die Eigenschaften von Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes
vergleicht mit der Beschreibung von Streptomyces platensis oder Streptomyces humidus, die ebenfalls zur Gruppe der S.hygroscopicus gehören. Weiterhin bildet Streptomyces hygroscopicus var.
crystallogenes in dem das G-ewächs umgebenden Medium reichlich
Mikrokristalle aus, wenn auf Hefeextrakt-Agar oder Malzextrakt-

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Agar als Nährlösung gezüchtet wird. Der Staam let dadurch gekennzeichnet, daß er eine neue Art von Antibiotika, Copiamycin, produziert, wie man sie bisher nicht kannte.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Copiaaycin läßt sich mit dem zuvor genannten Mikroorganismus Streptoayces hygroseopicus var. crystallogenes und mit dessen Mutanten und Varianten durchführen. Man kann für das erfindungsgemäße Verfahren Mutanten einsetzen, die von dem beschriebenen Stamm durch verschiedene Methoden, beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung oder Stickstoffmittel (nitrogen mustards) oder sonstige abgeänderten Mikroorganismen dieser Gruppe, gleichgültig wie sie im einzelnen entstanden sind. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden diese Mikroorganismen Streptomyces hygroseopicus var. crystallogenes und die zuvor genannten Mikroorganismen gezüchtet. Man nimmt die Züchtung in einem wäesrigen Nänmedium bei Temperaturen zwischen 24 und 35°C und unter submeasen Bedingungen sowie unter Rühren und Belüftung vor. Die Fährmedien, die man für das erfindungsgemäße Verfahren einsetzen kann, müssen eine Kohlenstoffquelle, beispielsweise Zucker, Stärke, Dextrin, Glycerin, eine Qfiuelle für anorganischen oder organischen Stickstoff, wie beispielsweise Ammoniuasulfat, natriumnitrat, Ammoniumchlorid, Kasein, Maismehl, Sojabohnen&ehl, Erdnußmehl, Weizenkleie, Baumwollsaatmehl, Lactalbumin, enzymatieehe Abbauprodukte von Kasein und krypton, enthalten. Man kann außerdem auch wachs turns fördernde Substanzen, wie Hefeextrakt, Rückstände aus der Melassefermentation, sowie

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Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Natriumnitrat, Magnesiumsulfat und Spuren Mineralien wie Kupfer, Zink, Eisen und Mangan mit gutem*Erfolg beim' erXindungs gemäß en Verf ahreia 'Verwenden. Wenn während des Förmentationsvorganges ein starkes Schäumen entsteht, dann icainn man auch noch an die Schaummittel, wie beispielsweise pflanzliche öle, dem Nährmedium beigeben. Ferner kann ein Tufferungsmittel," wie beispielsweise Kalziumcarbonat dem Medium zugesetzt werden. Das impfmaterial zur erfindungsgemäßen Hersteilung"'von Copiamycin durch Vermehren von Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes erhält man zweckmäßig aus einem schrägliegend gezüchteten Gewächs eines solchen Mediums wie Emerson's Agar oder Glucose-Asparagin-Agar. Man kann mit dieser Züchtung entweder "in Schüttelflaschen beimpfen oder Impfbehäiter, die für Unterwasserzüchtung vorgesehen sind, oder andere Impfbehälter mit der beimpften Substanz aus der Schüttelflasche versetzen. Das Wachstum der Mikroorganismen erreicht im allgemeinen sein Maximum in etwa 2 bis 3 Tagen, jedoch wird die Geschwindigkeit, mit der die maximale Aktivität erreicht wird, durch verschiedene yerfahrensumstände beispielsweise das Ausmaß der Belüftung, die Bührgeschwindigkeit und dergleichen beeinflußt. Im allgemeinen fermentiert man solange, bis sich gewisse Mengen an Copiamycin in dem Mycelium gesammelt haben. Die Belüftung des Mediums in für Unterwasserzüchtnng bestimmten Behältern wird in einer Menge von etwa 1/2 bis 2-fachen Volumen an freier Luft je Volumen der Gärmasse je Minute gehalten.

Aus dem Kulturmedium gewinnt man das Copiamycin in der Weise* daß man die Gärflüasigkeit zunächst filtriert und dann den

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Myceliumkuchen sammelt. Der meiste Teil des Antibiotikas verbleibt in dem Myceliumkuchen, man kann das Antibiotikum daraus beispielsweise durch. Extraktion mit Alkoholen, die 1 bis 5 C-Atome enthalten, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol oder Pentanol, extrahieren. Bin für die Extraktion besonders geeignetes lösungsmittel ist Methanol. Der Alkoholextrakt wird im Vakuum eingedampft, und während des Eindampfens scheidet sich ein amorphes Produkt allmählich ab. Die Ausfällung nimmt zu, wenn man den pH-Wert des Konzentrats verringert. Auf diese Weise erhält man einen leicht bräunlich gefärbten Niederschlag, den man wiederholt mit Wasser wäsfat, wobei etwa 50 % des ursprünglich vorhandenen Materials entfernt werden und ein fast weißes Produkt zurückbleibt. Die Ausfällung wird mit Aceton gewaschen, und der Niederschlag wird in einer geriqen Menge von Methanol aufgelöst. Die aktive Substanz wird dann durch fraktionierte Ausfällung mittels Aceton erhalten. Das resultierende rohe , Copramycin läßt sich weiter durch Chromatorgraphie an einer mit Kieselsäuregel gefüllten Säule reinigen. Die Säule wird mit einem Lösungsmittelgemisch von Chloroform und Methanol (3:1) und (1:1) eluiert. Die aktiven Fraktionen werden unter Verwendung des Dragendorff Reagenz, das mit Copiamycin eine positive , Färbung zeigt, bestimmt. Die biologische Aktivität im Verlauf der Fermentation und Extraktion läßt sich mittels der Agarverdünnungatechnik unter Verwendung von Candida albicans als Test-Organismus bestimmen. Die aktiven Fraktionen werden kombiniert und im Vakuum getrocknet. Der verbleibende Feststoff wird -au« wässrigem Methanol und dann aus Methanol umkristallisiert.

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Copiamycin kristallisiert in Form von farblosen Plättchen. Es zersetzt sich bei 144⁰C. Copiamycin ist in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Pyridin,' Dimethylformamid, Eisessig löslich, jedoch fast unlöslich in Aceton, Dioxan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Estern, Petroläthern, Benzol, Methylisobutylketon und Wasser. Die durchschnittliche Elementaranalyse von Copiamycin, das über ?p^5 ^ ^Vaicuum getrocknet worden ist, ist folgende: C = 58,30 #, H = 8,90 $> und Ii = 3,94 $>. Man findet kein Halogen oder Schwefel. Die optische Drehung beträgt/ocjf d ^{= + 1}^* ^ (Konzentration 4»15# in Methanol). Das Ultraviolettabsorptions-

19& spektrum zeigt in Methanol nur steigende Endabsorption (E ν bei 230 ia/i) (Fig. 1). Das ültrarotabsorptionsspektrum von Copiamycin in Kaliumbromid zeigt folgende Absorption: 3360, 2925,

1375,
1725, 1660, 1580, 1450,^1355, 1325, 1270, 1240, 1195, 1160, 1140, 1070, 1025, 1010, 980, 940, 920, 855, 835, 790, 715 cm"¹ (Pig. 2).

In Figur 1 ist, wie bereits angedeutet, auf der Abszisse die Wellenlänge in Mikron und auf der Ordinate die Extinktion von Copiamycin in 1?6-iger Lösung in Methanol aufgetragen, und in Figur 2 ist auf der Ordinate die prozentuale Durchlässigkeit und auf der Abszisse die Wellenlänge für Copiaraycin, untersucht in einem KBr^-Pressliiig, im UV-G-ebiet wiedergegeben.

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Ein gereinigtes Präparat aus Copiamycin gibt beim Chromatographieren auf Filterpapier in verschiedenen Lösungsmittelsystemen und beim Bioautographieren gegen Candida albicans nur eine markierte Stelle. Die Rf-Werte und die eingesetzten Lösungsmittelsysteme sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Lösungsmittelsystem Rf

n-Butanol-Methanol-H₂0 (4:1:2) 0,76

n-Butanol-Pyridin-H₂0 (3:4:7) 0,96

50% Aceton 0,83

Benzol-Methanol (4:1) 0,28

75% Phenol 0,95

3% NH₄Cl 0,06

Wasser mit n-Butanol gesättigt 0,03

n-Butanol, gesättigt mit Wasser 0,52

t-Butanol-H₂0 (4:1) 0,65

Einzelne markiert e Stellen werden auch immer dann erhalten, wenn das Antibiotikum mittels Dünnschichtchromatographie untersucht wird. Rf-Werte, bestimmt mittels Dragendorff Reagenz oder Schwefelsäure Reagenz, betragen 0,4 und 0,5 an Kieselsäuregel G-ScbLchten mit Lösungsmittelsystemen aus Eisessig-n-Butanol-Wasser (6:25:25) bzw. n-Butanol-Methanol-Wasser (4:1:2). Rf-Werte von 0,7 und 0,3 wurden erhalten an Aluminiumoxyd-Schichten mit Lösungsmittelsystemen von Pyridin-n-Butanol-Wasser (4:6:3) bzw. Benzol-Methanol (4:1). Das Antibiotikum gibt gegenüber

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Biuret, Ninhydrin, Molisch, Ferrichlorid, Liebermann-Burchard und 2,4-Dinitrophenylhydrazin negative Reaktionen, jedoch reagiert es positiv auf Fehling'sche Lösung, Dragendorff-Reagenz und Platiniodid. Ferner gibt es eine rötliche Färbung mit konzentrierter H₂SO., die mit der Zeit braun wird. Das Antibiotikum entfärbt Bronv· und Kaliumpermanganat-Lösungen. Die Aktivität läßt nicht nach, wenn eine methanolische Lösung in einem verschlossenen Rohr 60 Minuten lang auf 60° C erhitzt wird. Jedoch sinkt die Aktivität bei 100° C nach 10 Minuten auf die Hälfte des ursprünglichen Wertes und nach 60 Minuten auf ein Achtel des ursprünglichen Wertes.

In der folgenden Tabelle ist das antimikrobiale Spektrum von Copiamycin veranschaulicht. Das Spektrum wurde mit Bakterien und Pilzstämmen bestimmt, unter Benutzung der Agar-Streifen-Methode. Es wurden Antibiotika-Lösungen verschiedener Konzentrationen in Dimethylsulfoxyd hergestellt und in 1% dem Medium zugegeben. Die für die Bestimmung und Inkubationsperiode eingesetzten Medien sind in den Tabellen benannt.

Tabelle 2 Antimikrobiales Spektrum von Copiamycin

Stamm Medium Minimale inhibitierende

Dosis (mcg/ml)

Bacillus subtilis PCI Nähragar 100

219
Bacillus cereus ⁿ 100

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Nähragar	100
η	100
η	100
Il	100
η	100
η	100
η	100
Il	100
η	100
η	100

Staphylococcus aureus 209P Staphylococcus albus Sarcina lutea Mycobaterium 607 Escherichia coli Fl

Escherichia coli SM beständig Aerobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa

Inkubation: 48 Stunden bei 37⁰C für Mycobact. 607, 24 Stunden für andere

Tabelle 3 Antifungales Spektrum von Oopiamycin

Minimale inhibierende Dosis (mcg/ml)

Stamm Medium

Saccharomyces Glucose cerevisiae Czapek Agar

Saccharomyces carlsbergensis "

Zygosaccharomyces Sanken "

Torula rubra

Saito "

Mycoderma sp. Takahashi "

Willia anomala " Aspergillus niger

ATCC 6275 " 10,0 10,0

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48 Stunden	72 Stunden
2,5	2,5
5,0	5,0
10,0	10,0
2,5	2,5
1,0	2,5
10,0	25,0

Aspergillus oryzae

Penicillium glauoum Mucor mucedo Phizopus nigrioane

Candida albicrans IFM Stamm

Candida_albicana ATCC 5170

Candida albicans ATCC 3036

Candida albicana Shinkai

Candida albicans Nakagawa

Candida albicans Saito

Candida albicans YU 1200

Candida guilliermondi Candida tropicalis Candida krusei Candida parakurusei Candida stellate»idea

Glucose- Czapek Agar	7,5	10,0
η	10,0	10,0
Il	2,5	2,5
Il	2,5	5,0
Sabouraud Agar	2,5	2,5
η	5,0	5,0
η	5,0	5,0
ti	5,0	5,0
η	2,5	5,0
η	5,0	5,0
Il	1,0	1,0
Il	5,0	5,0
ti	2,5	2,5
η	2,5	2,5
It	5,0	5,0
Il	2,5	5,0

Inkubation:

bei 37 C für Candida, bei 27° C für die anderen.

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Tabelle 4 Antifungales Spektrum von Oopamycln

Stamm

OryptococcuB neoformans A704 Oryptococcus neoformans A759 Picnla membranaefaclens 0460 Debaryomyces hansenii IPO 0023 Debaryomyces kloeckeri 1I¹O 0015 MicroBporum gypseum 706 MicroBporum canie 701 Sporotrlchum schenckli 602

Sporoboromyces ealmonlcolor IiO 0374

Blaetomyces dermatltldls MonoBporliua aplospermum Hormodendrtun compactum 517 Hletoplasma eapsulatum 570 Epldermophyton floccosum 1 Trlchosporon cutaneum IFO 0116 Trichophyton Interdigitale Trichophyton rubrua

Trichophyton concentriHcum IPO 0116

Trlchophyton oraterlforme Trlohophyton tonsurans Trichophyton eabouraudi

Inkubation: bei 37° C

	O	MIC	(mcR/ml)	120 Std.
48	O	Std.	72 Std.	1,0
1	,5	0,5	0,75
2	,5	0,5	2,5
2	,0	1,0	2,5
1	,5	2,5	2,5
-	,5	2,5	1,0
-	,0	1,0	1,0
O		0,5	2,5
-		2,5	0,5
O	,5	0,5	0,5
O		-	2,5
O	,5	1,0	2,5
O	,75	1,0	0,25
O	,25	0,25	0,5
-	,5	0,5	0,75
-	,1	0,5	2,5
-		-	0,75
-		—	0,5
-		-	10,0
		• -	1,0
	—	1,0
	_

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Es ist ersichtlich, daß Copiamycin inaktiv ist gegen grampositive und negative Bakterien, einschließlich Mycobakterium 607. Andererseits ist dieses Antibiotikum aktiv gegenüber vielen Pilzsorten. Die meisten Stämme werden in einer Konzentration unter 10 mcg/ml inhibiert, und es besteht kein erkennbarer Unterschied hinsichtlich der minimalen inhibierenden Konzentrationen zwischen fadenförmigen und hefeartigen Formen von Pilzen. Bis zu 100 mcg/ml an Copiamycin wurde keine Hämolyse an roten Blutkörperchen von Schafen beobachtet.

Die akute Toxizität von Copiamycin wurde an Mäusen, die ein Gewicht von 19 bis 22 g hatten, untersucht. Pein pulverisiertes Copiamycin wurde dazu in einer 0,5#igen Carboxymethylcellulose-Salzlösung suspendiert und intraperitoneal, subcutan und oral verabreicht, und dabei wurde ermittelt, daß die Mäuse das Antibiotikum 14 Tage lang in einer Menge von 1,000 mg/kg ohne jegliche Anzeigen von Toxizität vertragen konnten.

Es ergibt sich aus den zuvor beschriebenen biologischen Kennmerkmalen, daß Copiamycin ein Antibiotikum mit antifungalen Eigenschaften darstellt. Bekannte Antibiotika, die antifungale Mittel darstellen und aus Kulturen von S. hygroscopicus oder mit diesen verwandten Stämmen isoliert werden können, sind beispielsweise Ascomycin, Azalomycine, Endomycin, Hygroscopin A, Hygrostatin, Phytostreptin, Phytoactin, Nigericin und Stendomycine, Ascomycin konnte bisher nicht in reinem Zustand erhalten werden,

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aber dieses Antibiotikum ist in der Hauptsache aktiv gegen fadenförmige Pilze und seine physikochemischen Eigenschaften sind ebenfalls sehr verschieden von denjenigen des erfindungsgemäß hergestellten Gopiamycins. Phytostreptin, Phytoactin und Stendomycine haben zwar kein charakteristisches Absorptionsmaximum im Ultraviolett-Bereich, aber sie sind, wie entsprechende Farbreaktionen, IR-Spektraluntersuchungen und die Abbauprodukte ergeben haben, Polypeptide. Das erfindungsgemäß hergestellte Copiamycin ist recht verschieden von antifungalen Antibiotika, die mit anderen Stämmen als solchen der Streptomyces hygroscopicus Art gewonnen werden. Antifungale Antibiotika anderer Herkunft, die nicht aus Streptomyces hygroscopicus-Stämmen gewonnen werden, sind beispielsweise Nitromycin, Streptovitacine und Cerevioccidin, und diese ergeben kein Absorptionsmaximum in ihrem Ultraviolettspektrum. Diese drei Antibiotika sind nicht aktiv auf Candida albicans und unterscheiden sich auch deutlich von dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Copramycin.

Beispiel 1

Herstellung von Copiamycin in Schüttelflaschen auf einem So^abohnenmehl-Grlucose-Medium:

Mikroorganismen der Art Streptomyces hygroscopicus var.

crystallogenes wurden auf einem schräggestellten Nährboden aus folgenden Bestandteilen gezüchtet:

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Lösliche Stärke	10 g
Polypepton	5 g
Bacto-Fleisch-Extrakt	3 g
Glukose	2 g
K2HPO4 *	0,8 g
EeSO4	0,1 g

Kartoffel-Extrakt zu 1,000 ml (pH 7,0)

Der Kartoffel-Extrakt wurde durch Auskochen von 100 g weißer Kartoffelschnitzel 40 Minuten lang in 1,000 ml Wasser hergestellt.

Zur Gewinnung der schräggestellten Agarkultur wurden 2,5 g Agar zu dem zuvor beschriebenen Medium hinzugefügt und 30 Minuten lang unter 6,8 kg Dampfdruck sterilisiert. Eine gut sporolierende schräggestellte Kultur wurde zum Beimpfen von 100 ml einer wie folgt zusammengesetzten Nährlösung eingesetzt:

So^abohnenmehl 20 g

getrocknete Hefe 5 g

lösliche Stärke 25 g

MnCl₂.4H₂O 0,007 g

CuSO₄.5H₂O 0,007 g

ZnSO₄.7H₂O 0,03 g

CaCO₃ 3,5 g

destilliertes Wasser 1,000 ml.

Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt und es wurde 30 Minuten lang unter einem Wasserdampfdruck von 6,8 kg im Autoklaven behandelt .

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150 Stück Schüttelflaschen mit einem Inhalt von 500 ml, die 100 ml des zuvor "beschriebenen Mediums, das mit der schräggestellten Agarkultur beimpft war, enthielten, wurden 90 Stunden lang bei 25⁰O in einer hin und hergehenden Schüttelmaschine (150 TJ.p.M.) behandelt. Danach wurden die Kulturen zusammengegeben und der Myceliumkuchen durch Filtration abgetrennt. Der Myceliumkuchen wurde wiederholt mit Wasser gewaschen, und es resultierten 1,7 kg eines feuchten Kuchens, der mit der zweifachen Menge seines Volumens an Methanol extrahiert wurde. Der Extrakt wurde filtriert und der Rückstand wurde nochmals mit der gleichen Volumenmenge an Methanol extrahiert. Die beiden Extrakte, die grünlich bräunlich gefärbt waren, wurden kombiniert, und es wurde gefunden, daß sie 5120 Verdünnungseinheiten gegen Candida albicans enthielten. Der kombinierte Extrakt wurde im Vakuum bei einer Temperatur unter 60⁰C auf ein Zehntel seines ursprünglichen Volumens eingedampft. Durch Abzentrifugieren wurden 65 g an feuchtem Rohrpräparat gewonnen, die wiederholt mit Wasser gewaschen wurden und danach 30,9 g eines fast weißen Materials ergaben. Dieses Präparat wurde mit 200 ml Aceton extrahiert und der Rückstand wurde in einer geringen Menge Methanol gelöst. Dazu wurde das Fünffache des Volumens an Aceton hinzugegeben, und die aktive Fraktion, die dabei sich abschied, wurde durch Zentrifugieren gesammelt. Das Roh-Copiamycin, das man auf diese Weise erhielt, wurde getrocknet, und es resultierte eine Menge von 5,9 g. Das Roh-Copiamycin wurde in einer geringen Menge eines Lösungsmittel-Gemisches aus

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Chloroform und Methanol (3:1) gelöst, und auf eine mit Kieselsäuregel G gefüllte Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit der gleichen Lösungsmittelmischung getränkt, und die Dragendorff positive Fraktionen wurden kombiniert und im Vakuum eingedampft. Das CopJs&ycin, das dabei ausfiel, wurde aus wässrigem Methanol und danach aus Methanol umkristallisiert. Es resultierten farblose plattenförmige Kristalle von Copiamycin in einer Menge von 1,92 g.

Beispiel 2;

Gewinnung des Copiamycins in einem 200 1 Behälter:

150 Stück Schüttelflaschen mit einem Gesamtinhalt von 500 ml, die 100 ml einer Nährlösung folgender Zusammensetzung enthielten, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit einer schräggeneigten Agarkultur beimpft:

Fleischextrakt	5 g
Polypepton	10 g
lösliche Stärke	5 g
Glukose	5 g
NaCl	1,5 g
destilliertes Wasser	1,000 ml

Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt, und es wurde 30 Minuten lang unter einem Dampfdruck von 6,8 kg im Autoklaven behandelt.

Die Inkubation erfolgte bei 25⁰C 2 Tage lang auf einer rotieren-

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den Schütteleinrichtung (280 U.p.M.). Danach wurde aus dem zuvor beschriebenen Gemisch ein 1Obiges Inoculum hergestellt und in einen 100 ml des Sojabohnenmehl enthaltenden Mediums, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, eingefüllt. Es wurde belüftet mit einer gegenüber dem Medium halb so grossen Menge an Luft und es wurde mit 250 U.P.M. berührt; die Inkubation wurde 90 Stunden lang bei 25⁰C fortgeführt.

Nach der Inkubation wurden 8 kg feuchtes Mycelium von 95 Litern des Nährmediums erhalten. Der Myceliumkuchen wurde durch Zentrifugieren mit 6 Litern Wasser gewaschen. Der Myceliumkuchen wurde zweimal mit 16 Litern bzw. 8 Litern Methanol extrahiert. Die Methanol-Extrakte wurden kombiniert und im Vakuum auf 3 Liter eingedampft und dann filtriert. Es wurde ein brauner Niederschlag in einer Menge von 122 g gewonnen, der mit einem Liter Wasser gewaschen und dann mit einem Liter Aceton extrahiert wurde. Der Rückstand wurde in einem Liter Methanol aufgelöst, und dazu wurden 5 Liter Aceton hinzugegeben. Das Antibiotikum, das dabei ausfiel, wurde weiter gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben, und es wurden 40 g reines Copramycin erhalten.

Beispiel 3

Extraktion des Copiamycins aus der gesamten Kulturlösung:

Eine Kulturlösung, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war, wurde mit einem Halben und einem Viertel ihres Volumens an n*Butanol extrahiert. Die Butanol-Extrakte wurden kombi-

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OBfQfNAL INSPECTED

niert und im Vakuum eingedampft. Der verbleibende Sirup wurde in einer geringen Menge Methanol gelöst und wie in Beispiel 1 ■beschrieben an einer Kieselgel-Säule chromatographiert. Die aktiven Fraktionen wurden kombiniert, konzentriert, und dann wurde Wasser zugegeben. Die Abscheidung von Copramycin - Kristallen setzte sofort ein und wurde beim Stehenlassen stärker. Aus 10 1 KulturflUssigkeit wurde ein Gramm des gereinigten Präparates erhalten.

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Claims (3)

\J\J J U67757 Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herateilung eines Antibiotikums, "bezeichnet als Copramycin, das in Form farbloser Plättchen gewonnen werden kann und bei Elementaranalyse folgende Werte ergibt: 0 = 58,30; H = 8,90; N = 3,94; und das eine spezifische Drehung /.^5Cj ■*'^ = + 14,4, sowie einen Schmelzpunkt von 144⁰O (unter

, D

Zersetzung) hat und gut löslich ist in Pyridin, Dimethylformamid und Eisessig, mäßig löslich in Methanol, Äthanol und n-Butanol sowie unlöslich in Aceton, Dioxan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Estern, Petroläthern, Benzol, Methylisobutylketon und Wasser ist und keine spezifische Absorption im Ultraviolett oberhalb 210 mju, jedoch das in der beiliegenden Fig. 2 aufgezeichnete Infrarotabsorptionsspektrum in Kaliumbromid aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces hygroscopicus var. crystallogenes unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare und fermentierbare Kohlenhydrate und assimilierbare organische oder anorganische Stickstoff-Verbindungen enthält, 2 bis 5 Tage lang züchtet und das resultierende Copiamycin aus dem Kulturmedium isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomdyes hygroscopicus var. crystallogenes ATCC Er. 19040 einsetzt.

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3. Antibiotikum Copiamycin, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2 hergestellt worden ist.

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