AT249265B - Verfahren zur Gewinnung des neuen Antibiotikums Danomycin - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Gewinnung des neuen Antibiotikums Danomycin 
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums mit der Bezeichnung Danomycin und insbesondere auf dessen Herstellung durch Fermentation sowie auf die Abscheidung und Reinigung der Substanz. Das Antibiotikum kann nach dem erfindungsgemässen Verfahren in Form von verdünnten Lösungen, Rohkonzentraten, gereinigten Feststoffen, und in reiner, kristalliner Form erhalten werden. Danomycin hemmt das Wachstum grampositiver Bakterien einschliesslich besonders der Staphylokokken, die gegenüber andern Antibiotika resistent sind. Danomycin ist ungiftig und gegenüber mit grampositiven Bakterien infizierten Mäusen therapeutisch wirksam. Es ist auch bei der Behandlung von mit grampositiven Bakterien infizierten Menschen, beispielsweise bei Lungenentzündung, wertvoll.

   Danomycin gehört zur Gruppe der Eisen enthaltenden Antibiotika ; es wurde ursprünglich als Antibiotikum Nr. 425 bezeichnet. 



   Das Antibiotikum Danomycin ist in Wasser löslich und in Aceton unlöslich, besitzt eine orangerötli- 
 EMI1.1 
 
 EMI1.2 
 
 EMI1.3 
 

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 und3.   Glycerin-Czapek-Agar :   Die Kultur ist klein und   blass-gelbbraun ;   sie dringt in den Agar ein. 



   Das weisse Luft-Mycel ist dürftig und es bildet blass-gelbbraune, lösliche Pigmente. 



   4. Glycerin-Ammoniumsalz-Agar : Die Kultur ist klein und gelblich-weiss und es wird weder ein
Luft-Mycel noch ein lösliches Pigment gebildet. 



    ! 5. Glucose-Asparagin-Agar :   Die   blass-gelb-olivbraune   Kultur ist glänzend und dringt in den Agar ein. Das weisse Luft-Mycel ist pulverig und ein aprikosengelbes lösliches Pigment wird gebildet. 



   6. Stärke-Agar : Die dunkel-graubraune Kultur ist glänzend und dringt in den Agar ein ; es tritt weder ein Luft-Mycel noch ein lösliches Pigment auf. Die Stärke wird stark hydrolysiert. 



   7. Nähragar. Die blassgelbe Kultur ist klein und dringt in den Agar ein. Weder ein Luft-Mycel noch ein lösliches Pigment tritt auf. 



   8.   Bennett-Agar :   Die gelblich-olivbraune Kultur ist mässig, das pulverige oder samtartige   Luft-My--   cel ist weiss oder leicht braun   überzogen ;   es wird ein gelblich-olivbraunes Pigment gebildet. 



   9.   Hafermehl-Soyton-Agar :   Die gelblich-olivbraune Kultur ist mässig, das   weisse Luft-Mycel   ist pul- verig oder samtartig ; es wird ein gelblich-olivbraunes lösliches Pigment gebildet. 



   10. Kartoffelpropf : Die blass-gelbbraune Kultur ist glänzend, aber klein, und es wird weder ein Luft-
Mycel noch ein lösliches Pigment gebildet. 



   11. Gelatinestich : Eine weisse Kolonie wächst auf der Oberfläche, und es wird weder ein Luft - My- cel noch ein lösliches Pigment gebildet ; die Verflüssigung der Gelatine ist mässig. 



   12. Tyrosin-Hefe-Gelatine-Stich : Blassgelbe, runzlige Kolonie, dürftiges Luft-Mycel und gelbes lös- liches Pigment wurden beobachtet. 



   13. Milch : Blass-braunes Ringwachstum, kein Luft-Mycel und kein Pigment wurden beobachtet ;
Milch wird nicht verdaut. 



   14. Nitratlösung : Eine kugelige, farblose Masse wächst an der Oberfläche, und es wird weder ein
Luft-Mycel noch ein lösliches Pigment gebildet. Die Reduktion von Nitrat zu Nitrit ist negativ. 



     A 15. Melaninmedium :   Das blass-gelbe Wachstum ist dürftig und dringt in den Agar   ein : ein   Luft-My- cel oder ein lösliches Pigment werden nicht gebildet. 



   16. Die Assimilation von Kohlenstoffverbindungen wurde nach dem Verfahren von Pridham   geprüft ;   folgende Ergebnisse wurden erhalten :
Gute Kohlenstoffverwertung wurde beobachtet bei Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Fructose,
Cellobiose, Lactose, Maltose, Raffinose, Sorbito, Inositol, Mannitol, Rhamnose, Natriumcitrat und Natriumsuccinat. Die Verwertung von Sorbose, Sucrose und Inulin war zweifelhaft oder negativ. 



   Beim Vergleich mit einer Anzahl von Streptomyces-Arten ähneln einige dem S. albaduncus in mancher Beziehung, so beispielsweise   S. alboflavus, S. pseudogriseolus und S. griseolus. Diese Arten können   jedoch von dem vorliegenden Stamm durch die Morphologie der Sporenträger auf Grund der Oberflächenstruktur der Sporen, der Wachstumsstellen der Kulturen und der physiologischen oder biochemischen Eigenschaften unterschieden werden, wie nachstehend genauer beschrieben wird. 



   Der S. alboflavus zeigt gerades und verzweigtes Luft-Mycel und bildet kaum Spiralen ; die Farbe des Luft-Mycels auf Czapek's Agar ist gelblich-weiss, während auf Glucose-Asparagus-Agar kein Luft-Mycel gefunden wurde. Er reduziert Nitrat zu Nitrit und die Peptonisation der Milch ist positiv ohne Koagulation. Diese Eigenschaften unterscheiden ihn von dem vorliegenden Stamm. 



   S. pseudogriseolus weist zahlreiche Spiralen in den Sporenträgern auf, die Farbe des Luft-Mycels ist mit Grau überzogenes dumpfes Gelb. Sowohl die Koagulation als auch die Peptonisation sind bei Milch positiv. Ausserdem wurden Unterschiede in der Verwertung von Natriumcitrat, Raffinose und Sorbitol festgestellt. S. griseolus zeigt kurze gerade Sporenträger mit welligen Verzweigungen und weist keine typischen, dem vorliegenden Stamm ähnliche Spiralen auf ; Unterschiede sind in der glatten Sporenoberfläche, der grauen oder dunkelgrauen Farbe des Luft-Mycels auf   Czapek- und   Glucose-Asparagin-Agar und besonders bei der Bildung eines braunen, löslichen Pigments beim Wachstum auf organischen Medien festzustellen. 



   Es ist eine allgemeine Eigenschaft der Streptomyceten, dass ihr Verhalten auf dem Kulturmedium sich plötzlich ändert oder künstlich verändert werden kann. Deshalb werden manchmal Mutanten oder Varianten aus dem Boden oder durch Konservierung erhalten, die beträchtlich vom ursprünglichen Stamm abweichen. Diese Eigenschaften wurden gleichfalls bei den Stämmen gemäss der Erfindung gefunden. 



   Beim Hervorrufen künstlicher Mutationen im ursprünglichen Stamm zur Verbesserung der Produktivität treten wesentliche Veränderungen in den Eigenschaften der Kulturen und in der Farbe des Luft - Mycels auf, wobei die Mutanten gleichfalls Danomycin bilden. Zur Erzeugung künstlicher Mutationen gibt es zahlreiche physikalische oder chemische Möglichkeiten, wie die Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder 

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   U. V.-Strahlen   oder die Behandlung mit Chemikalien wie Dichlordiäthylsulfid. Die folgenden beiden Stämme sind Beispiele für durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder U.

   V.-Strahlen hervorgerufene Mu-   tationen   : 
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<tb> 
<tb> Stamm <SEP> Nr. <SEP> 13 <SEP> 246-29 <SEP> Stamm <SEP> Nr. <SEP> 13 <SEP> 246-28-4-27
<tb> Mutationsverfahren
<tb> U. <SEP> V.-Strahlen <SEP> Röntgenstrahlen
<tb> Mikroskopische <SEP> Beobachtung
<tb> (wie <SEP> beim <SEP> ursprünglichen <SEP> Stamm)
<tb> Glucose-Asparagin-Agar
<tb> gelblich-braune <SEP> Kultur, <SEP> weisses <SEP> Luft- <SEP> altgoldfarbene <SEP> Kultur, <SEP> braun-weisses
<tb> Mycel, <SEP> blass-gelblich-braunes <SEP> Luft-Mycel, <SEP> altgoldfarbenes,
<tb> lösliches <SEP> Pigment <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Stärke-Agar
<tb> dunkelgraue <SEP> Kultur, <SEP> hell-olivfarbene <SEP> Kultur,
<tb> weisses <SEP> Luft-Mycel, <SEP> hellgraues <SEP> Luft-Mycel,
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> hell-olivfarbenes,

   <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Bennett-Agar
<tb> dunkle, <SEP> gelb-graubraune <SEP> Kultur, <SEP> gelbbraune <SEP> Kultur,
<tb> graues <SEP> Luft-Mycel, <SEP> hell-graubraunes <SEP> Luft-Mycel,
<tb> gelbbraunes, <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> gelbbraunes, <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Kartoffel-Glucose-Agar
<tb> gelb-graubraune <SEP> Kultur, <SEP> gelb-olivbraune <SEP> Kultur,
<tb> graues <SEP> Luft-Mycel, <SEP> weisses <SEP> Luft-Mycel,
<tb> hell-gelbbraunes, <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> altgoldfarbenes, <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> 
 
Somit sind beim Verfahren der Erfindung auch die Varianten und die durch Mutationsagentien, wie Röntgenstrahlen, U.   V.-Strahlen, Chemikalienusw.,   hervorgerufenen Mutanten des   Streptomyces alba-   duncus ATCC 14698 zur Gewinnung des neuen Antibiotikums Danomycin anwendbar.

   



   Danomycin ist ein Antibiotikum, das Eisen im Molekül enthält, wie oben beschrieben wurde. Deshalb wurde der Danomycin erzeugende Stamm mit verschiedenen Streptomycetenstämmen verglichen, die ebenfalls eisenhaltige Antibiotika,   wieGrisein, Albomycin, ETH-'22'765undFerrimycin,   bilden. 



   Der Grisein erzeugende S. griseus unterscheidet sich deutlich vom vorliegenden Stamm, da das LuftMycel eine charakteristisch wassergrüne Farbe aufweist, die Sporenträger gerade sind und Haarbüschel besitzen und keine typischen Spiralen gebildet werden. 



   Verschiedene Streptomyces-Arten, wie   S. griseoflavus, S. galilaeus,   S. lavendulae,   S. pilosus, S.   viridochromogenes,   S. olivaceus, S. aureofaciens und S.   polychromogenes, bilden eisenhaltige Antibiotika und diezeinzelnen Arten unterscheiden sich wie folgt :
S. griseoflavus zeigt gerade und monopodial verzweigte Sporenträger und bildet keine typischen Spiralen. Die Farbe der Kultur ist rötlichbraun auf Czapek-Agar und zitronengelb auf Glucose-AsparaginAgar. 



     S. galilaeus   besitzt monopodial verzweigte Sporenträger mit unregelmässigen offenen Spiralen. Die Oberfläche der Sporen ist glatt, und die Kultur ist auf Glycerol-Czapek-Agar karminrot. 



   S. lavendulae weist lange, monopodial verzweigte Sporenträger mit kurzen, kompakten, rechts gerichteten Spiralen auf, und das Luft-Mycel ist auf den meisten Medien lavendelfarben. 



     S. pilous   besitzt eine haarige Sporenoberfläche und bildet   einc. braunes,   lösliches Pigment. 



   S. viridochromogenes hat zahlreiche Spiralen und bildet ein braunes, lösliches Pigment. 

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   S. olivaceus besitzt lange Spiralen und bildet ein aschgraues bis hell-olivgraues Luft-Mycel auf
Czapek-Agar. 



   S. polychromogenes weist ein hell-karminfarbenes bis karminrotes Luft-Mycel auf. 



   Wie oben beschrieben, wurde der Danomycin erzeugende Stamm mit verwandten Arten vom Standi punkt der Taxonamie oder der erzeugten Antibiotika verglichen, und es wurde festgestellt, dass der vor- liegende Stamm eine neue Streptomycetenart darstellt, die als Streptomyces albaduncus   nov. sp.   be- zeichnet wurde. 



   Streptomyces albaduncus erzeugt bei Züchtung unter geeigneten Bedingungen Danomycin. 



   Eine Danomycin enthaltende Fermentationsbrühe wird durch Impfen eines geeigneten Mediums mit
Sporen oder demMycel   desDanomycin erzeugendenorganismus   und anschliessender Züchtung unter aero- ben Bedingungen hergestellt. Zur Herstellung von Danomycin ist die Züchtung auf einem festen Medium möglich, für die Herstellung grösserer Mengen ist jedoch die Züchtung in einem flüssigen Medium vor- zuziehen. 



   Die Bebrütungstemperatur liegt vorzugsweise zwischen 25 - 300C bei neutralem PH. Bei der submer- sen aeroben Fermentation des Organismus zur Gewinnung von Danomycin enthält das Medium als Koh- lenstoffquelle Glycerinöl oder ein Kohlenhydrat wie Glycerin, Glucose, Maltose, Sucrose, Lactose, Dex- trin, Stärke usw. in reinem oder rohem Zustand und als Stickstoffquelle eine organische Substanz wie
Sojabohnenmehl, Distillers'Solubles, Erdnussmehl, Hefeextrakt, Maisquellwasser usw. und, falls er- wünscht, anorganische Stickstoffquellen wie Nitrate oder Ammoniumsalze sowie Mineralsalze wie Na- triumchlorid, Kaliumchlorid und- Magnesiumsulfat und Puffermittel wie Calciumcarbonat oder Phosphate und Spuren von Schwermetallsalzen ; diese Zusätze sind in der kanadischen Patentschrift   Nr. 513324,   in 
 EMI4.1 
 
730, 341raffin, Fettöl oder Silicon verwendet. 



   Es kann auch mehr als   eineArt   von Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle oder Antischaummittel bei der
Gewinnung des Danomycins verwendet werden. Im allgemeinen wird die Bebrütung fortgesetzt, bis sich mindestens einige hundert   li   g/ml Danomycin im Medium angesammelt haben. 



   Zur Isolierung und Reinigung von geringen Mengen der aktiven Verbindung aus der Fermentationsflüssigkeit können die üblichen Verfahren angewendet werden. Beispielsweise kann Danomycin unter Verwendung eines verschiedenen Absorptions-,   Löslichkeits-und Verteilungskoeffizienten   zwischen der aktiven Verbindung und den vorhandenen Verunreinigungen isoliert werden. Das im Filtrat der Brühe enthaltene Danomycin wird   z. B.   durch Aktivkohle adsorbiert, mit Wasser, wässerigem Methanol oder wässerigem Äthanol gewaschen und anschliessend mit wässerigem Butanol oder wässerigem Aceton eluiert. Die Eluate werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, worauf das rohe Pulver erhalten wird. Bei Verwendung der Chromatographie an Aktivkohle und eines Fraktionssammlers kann die aktive Verbindung weiter gereinigt werden.

   Durch Zusatz einer grossen Menge eines geeigneten organischen Lösungsmittels wie Aceton zu dem wässerigen Konzentrat der aktiven Fraktionen kann Danomycin ausgefällt und abgetrennt werden. Die vorhandenen Verunreinigungen werden durch Zufügen eines organischen Lösungsmittels wie Methanol zu dem wässerigen Konzentrat ausgefällt und entfernt. 



   Die Extraktion durch organische Lösungsmittel kann gleichfalls zur Reinigung des Danomycins dienen. 



   Beispielsweise kann die aktive Verbindung durch Mischungen geeigneter Lösungsmittel wie PhenolChloroform oder Benzylalkohol-Butanol extrahiert werden. Die Extrakte können nach dem Waschen mit angesäuertem Wasser, alkalischem Wasser und reinem Wasser in das Wasser unter Zusatz geeigneter nicht polarer organischer Lösungsmittel wie Äther oder Kohlenwasserstoffe übergeführt werden. 



   Auch die Methode der Gegenstromverteilung kann zur Reinigung des Danomycins angewendet werden ; beispielsweise wird durch Verteilung in dem System Phenol-Chloroform-pH 6, 0-Puffer (1 : 9 : 10) oder   Benzylalkohol-Butanol-n/100-HCl-20%   Salzwasser (20 : 10 : 3 : 30) Danomycin hoher Reinheit erhalten. 



   Beim Vergleichen der oben erwähnten physikochemischen und biologischen Eigenschaften des Danomycins mit denen anderer bekannter Antibiotika erweist sich Danomycin als ein neues Antibiotikum. 



  Danomycin ähnelt Grisein, Albomycin, Ferrimycin, LA-5352 und andern eisenhaltigen Antibiotika in seinen Eigenschaften bezüglich der Löslichkeit in Wasser und der orangeroten Farbe. Vergleicht man jedoch das antibakterielle Spektrum mit dem der andern, so unterscheidet sich Danomycin von Grisein und Albomycin in seiner Aktivität gegen gramnegative Bakterien, vom Ferrimycin gegen Bacillus sphericus und vom LA-5352 gegenüber Hemolytic streptococci. 

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   Da Danomycin hauptsächlich gegen grampositive Bakterien wirksam ist, wurde es papierchromatographisch mit andern eisenhaltigen Antibiotika wie Ferrimycin und LA-5352 verglichen, die gleichfalls hauptsächlich gegen grampositive Bakterien wirksam sind. Wie nachstehend gezeigt wird, unterscheidet sich Danomycin von diesen Antibiotika. 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Rf-Werte
<tb> Lösungssystem <SEP> Danomycin <SEP> Ferrimycin <SEP> LA-5352
<tb> tige <SEP> NH4Cl-Lösung <SEP> 0,95 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> 0, <SEP> 00-0, <SEP> 35 <SEP> 
<tb> 50%iges <SEP> wässeriges <SEP> Aceton <SEP> 0,85 <SEP> 0,65 <SEP> 0,60
<tb> Wasser <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> 0,05 <SEP> 0,05
<tb> Butanol-Essigsäure-H2O <SEP> (4:1: <SEP> 5) <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP> 0,40 <SEP> 0,40
<tb> Butanol-Essigsäure-H2O <SEP> (2 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> 0,50 <SEP> 0,73 <SEP> 0,75
<tb> äthanol-hop <SEP> (3 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> mit <SEP> 2% <SEP> NaCl <SEP> 0,65 <SEP> 0,45 <SEP> 0,45
<tb> 
 
 EMI5.2 
 Vergleicht man das   U.

   V.-Spektrum   des Danomycins mit dem gewisser anderer Antibiotika, so unterscheidet sich Danomycin davon wie folgt : 
Lage der Maxima 
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<tb> 
<tb> Grisein <SEP> 265 <SEP> nij. <SEP> i, <SEP> 420 <SEP> mg
<tb> Albomycin <SEP> 270 <SEP> mbi, <SEP> 440 <SEP> mg
<tb> Ferrimycin <SEP> 228 <SEP> mg, <SEP> 319,425 <SEP> mg
<tb> LA-5352 <SEP> keine
<tb> Danomycin <SEP> 270 <SEP> mg, <SEP> 325, <SEP> 430 <SEP> mg
<tb> 
 Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne diese einzuschränken. 



  Beispiel 1: Zusammensetzung des Mediums : 
 EMI5.4 
 
<tb> 
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Trockenes <SEP> Pferdeblut <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Kaliumphosphat, <SEP> zweibasisch <SEP> l <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Calciumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 
<tb> 
 
Ein die oben stehenden Bestandteile enthaltendes Nährmedium (100 ml) wird in einem Kolben von 500 ml Inhalt sterilisiert, mit einer Kultur von Streptomyces albaduncus geimpft und bei 27 ¯   1 C   8 Tage unter Schütteln wachsen gelassen, wobei die Danomycinbildung in der Fermentationsbrühe 240  g/ml erreicht. 



   Beispiel2 :ZusammensetzungdesMediums: 
 EMI5.5 
 
<tb> 
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 65 <SEP> g
<tb> Kaliumphosphat, <SEP> zweibasisch <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Calciumchlorid <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 
<tb> 
 

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   Ein die oben stehenden Bestandteile enthaltendes Nährmedium (100 ml) wird in einen Kolben von 500 ml Inhalt sterilisiert, mit einer Kultur von Streptomyces albaduncus geimpft und bei 27 A 1 C 8 Tage unter Schütteln wachsen gelassen, wobei die Danomycinbildung in der Fermentationsbrühe 440 p g/ml erreicht.   
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3 :

   Die Fermentationsbrühe wurde gefiltert, der PH auf 7-8 eingestellt undthanollösung gewaschen und das Danomycin mit Wasser, gesättigt mit n-Butanol, eluiert. Das aktive
Eluat wurde zur Trockne eingeengt und das rohe, feste Danomycin in Wasser gelöst und durch Aktivkohle-
Chromatographie gereinigt. Die Säule wurde mit Wasser und   50% figer   wässeriger Methanollösung gewaschen und dann fraktioniert mit 60%igem wässerigem Aceton eluiert. Die so erhaltene reine Zubereitung wurde wieder in etwas Wasser   gelöst ;   durch Zufügen von 10   Vol.-Teilen   Aceton wurde das Danomycin ausgefällt und weiter mit 95% Äthanol zur Entfernung geringer Verunreinigungen extrahiert. Das rötlich- braune Danomycin wurde in Wasser gelöst und mit einer Mischung von Phenol-Chloroform (1 : 1) extra- hiert.

   Der Extrakt wurde mit einer 0,   5% gen   wässerigen Lösung von Natriumbicarbonat, n/100 Chlorwas- serstoffsäure und Wasser gewaschen und anschliessend unter Zusatz von Äther und Petroläther in Wasser gegeben. Durch Gefriertrocknung wurde eine reine Zubereitung von Danomycin erhalten. 



     Beispiel 4 :   Danomycin kann durch Gegenstromverteilung gereinigt werden. Zwischen dem Lö- sungsmittelsystem Benzylalkohol-n-Butanol-n/100-Chlorwasserstoffsäure-20%iger wässeriger Natriumchlo- ridlösung (20 : 10 : 3 : 30) wurde Danomycin rund um ein Spitzrohr Nr. 9 in 35 Übertragungen verteilt. 



   Der Inhalt der aktiven Rohre wurde gesammelt und eine reine Zubereitung von Danomycin durch Gefrier- trocknung erhalten. Das so erhaltene Danomycin wurde als rein durch die gute Übereinstimmung der Ver- teilungskurven, aufgetragen als biologische Testwerte, und der Absorptionen bei 420   mp   mit der theoreti- schen Kurve ermittelt. 



   Danomycin ist ein orangerötlich gefärbtes Antibiotikum, welches Eisen im Molekül enthält. Es ist 
 EMI6.2 
 unlöslich in Aceton und ändern organischen Lösungsmitteln. Die Ninhydrin-,   Tollen- und Fehlingreak-   tionen sind sämtlich negativ, jedoch konnten einige Ninhydrin-positive Substanzen bei der sauren Hydrolyse des Danomycins durch Papierchromatographie festgestellt werden. Die Gegenstromverteilung unter Verwendung von Benzylalkohol-n0Butanol-n/100 HCl-20%ige wässerige NaCI-Lösung   (20 : 10 : 3 : 30)   wurde zur Gewinnung der reinen Zubereitung angewendet. Das so erhaltene Danomycin schmilzt bei 135 bis   1380C   unter Zersetzung. 



     Analyse : Gefunden : C 48,   82 ; H7,05; N 7,81; Fe 3,13. 



   Auf Grund dieser analytischen Daten und der Annahme, dass nur ein Eisenatom vorliegt, wurden die 
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 EMI6.4 
 
 EMI6.5 
 
Bei Durchführung der Papierstreifen-Chromatographie in verschiedenen Lösungsmittelsystemen wurden folgende Rf-Werte erhalten : 
 EMI6.6 
 
<tb> 
<tb> Nasses <SEP> n-Butanol <SEP> 0,05
<tb> tiges <SEP> wässeriges <SEP> Ammoniumchlorid <SEP> 0,95
<tb> 8 <SEP> Öliges <SEP> Phenol <SEP> 0, <SEP> 95
<tb> 5 <SEP> Obiges <SEP> wasseriges <SEP> Aceton <SEP> 0,85
<tb> n-Butanol-Methanol-Wasser <SEP> (4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 2) <SEP> + <SEP> 
<tb> l, <SEP> 5% <SEP> Methylorange <SEP> 0,50
<tb> n-Butanol-Methanol-Wasser <SEP> (4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 2) <SEP> 0,30
<tb> Benzol-Methanol <SEP> (4 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> 0,05
<tb> Wasser <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> n-Butanol-Essigsäure-Wasser <SEP> (4:1:

   <SEP> 5) <SEP> 0,23
<tb> n-Butanol-Essigsäure-Wasser <SEP> (4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 2 <SEP> . <SEP> 0, <SEP> 35
<tb> n-Butanol-Essigsäure-Wasser <SEP> (2:1: <SEP> 1) <SEP> 0,50
<tb> Äthanol-Wasser <SEP> (3 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> + <SEP> 21o <SEP> Natriumchlorid <SEP> 0,65
<tb> n-Butanol-Äthanol-Essigsäure-Wasser <SEP> (25 <SEP> : <SEP> 25 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> : <SEP> 47) <SEP> 0,85
<tb> 
 

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Danomycin zeigt die vorstehenden Eigenschaften ; und beim Vergleich dieser Eigenschaften mit denen anderer eisenhaltiger Antibiotika wie Grisein, Albomycin,   LA-5352   und Ferrimycin kann es von diesen unterschieden werden. 
 EMI7.1 
 Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Danomycin ist gegenüber koagulasepositiven Staphylococcen einschliesslich der gegenüber den meisten Antibiotika resistenten Stämmen wirksam. 



   Tabelle 1 
 EMI7.2 
 
<tb> 
<tb> Test-Organismus <SEP> minimale <SEP> Hemmungskonzentration <SEP> (11 <SEP> g/ml) <SEP> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> NIHJ <SEP> > 50
<tb> Klebsiella <SEP> pneumonia <SEP> Julianelle <SEP> Typ <SEP> A <SEP> > 50
<tb> Salmonella <SEP> typhi <SEP> > 50
<tb> Shigella <SEP> dysenteriae <SEP> A <SEP> > 50 <SEP> 
<tb> Neisseria <SEP> sp. <SEP> (CP-R) <SEP> > 50
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> FDA <SEP> 209-P <SEP> 0, <SEP> 039
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> FDA <SEP> 209-P <SEP> (ST-R) <SEP> 0,039
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> FDA <SEP> 209-P <SEP> (NB-R) <SEP> 0,078
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Nr.

   <SEP> 52-34 <SEP> (TC, <SEP> EM, <SEP> CM, <SEP> Pc, <SEP> SM-R) <SEP> 0, <SEP> 078
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> strain <SEP> 0,078
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 193 <SEP> (Pc, <SEP> SM-R) <SEP> 0,078
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 193 <SEP> (Pc, <SEP> SM, <SEP> EM-R) <SEP> 0,078
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> PCI <SEP> 1200 <SEP> A <SEP> > 50
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> PCI <SEP> 1001 <SEP> 0,313
<tb> Micrococcus <SEP> Savus <SEP> 0,019
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> PCI219 <SEP> 0,039
<tb> Bacillus <SEP> sphericus <SEP> 122 <SEP> 0,02
<tb> Bacillus <SEP> anthrasis <SEP> 115 <SEP> 0,02
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> ATCC <SEP> 10702 <SEP> > 50 <SEP> 
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 53-K-l <SEP> 0,

  01
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> B-40203 <SEP> > 50
<tb> Streptocoecushemolyticus <SEP> Dickstrain <SEP> > 50
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> DP-3-5A <SEP> 0,0024
<tb> Diploeoccus <SEP> pneumoniae <SEP> Type <SEP> n <SEP> 0,0024
<tb> Mycobacterium <SEP> tubereulosis <SEP> v. <SEP> hominis <SEP> Hg-Rv <SEP> > 50
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> 607 <SEP> > 50
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> > 50 <SEP> 
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> > 50
<tb> Abkürzungen <SEP> :-R <SEP> resistent <SEP> 
<tb> CP <SEP> : <SEP> Chloramphenicol <SEP> 
<tb> ST <SEP> Streptothricin
<tb> NB <SEP> Novobiocin
<tb> TC <SEP> Tetracyclin
<tb> EM <SEP> : <SEP> Erythromycin <SEP> 
<tb> CM <SEP> :

   <SEP> Carbomycin <SEP> 
<tb> Pc <SEP> Penicillin
<tb> SM <SEP> Streptomycin
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 
 EMI8.1 
 sehen ist, wird die Aktivität des Danomycins durch einen mittleren PH nicht beeinflusst.   i Tabelle   2 
 EMI8.2 
 
<tb> 
<tb> Testorganismus <SEP> Minimale <SEP> Hemmungskonzentration
<tb> (ftg/ml)
<tb> PH=6,2 <SEP> Ph=7,2 <SEP> Ph=8,2
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209-P <SEP> 0,039 <SEP> 0, <SEP> 039 <SEP> 0, <SEP> 078
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 193 <SEP> 0,078 <SEP> 0,078 <SEP> 0,078
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> strain <SEP> 0,078 <SEP> 0,078 <SEP> 0,078
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0,039 <SEP> 0,039 <SEP> 0,078
<tb> 
 
3. Wirkung von Serum auf die antibakterielle Aktivität :
Die Wirkung wurde   durch Verdünnung   der Brühe festgestellt.

   Wie in Tabelle 3 zu sehen ist, übt das Serum keine Wirkung auf die Aktivität des Danomycins aus. 



   Tabelle 3 
 EMI8.3 
 
<tb> 
<tb> Testorganismus <SEP> Minimale <SEP> Hemmungskonzentration
<tb> (g/ml)
<tb> Kontrolle <SEP> mit <SEP> 50% <SEP> Serum
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209-P <SEP> 0,078 <SEP> 0, <SEP> 078
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 193 <SEP> 0,078 <SEP> 0,078
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> strain <SEP> 0, <SEP> 039 <SEP> 0, <SEP> 078
<tb> 
 
4. Antibakterielle Aktivität des Danomycins gegenüber klinisch isolierten, koagulasepositiven Staphylococcen :
Die Aktivitäten von Danomycin und sieben allgemein verwendeten Antibiotika wurden gegenüber 60 Stämmen von koagulasepositiven Staphylococcen geprüft, die von Patienten verschiedener Kliniken isoliert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

   Es wurde eine ziemlich weite Streuung der gegenüber allgemein angewandten Antibiotika beobachtet, während die Streuung von gegenüber Danomycin resistenten Stämmen nur 1,   7%   betrug. 



   Tabelle 4 
 EMI8.4 
 
<tb> 
<tb> Minimale <SEP> Hemmungs-Streuung <SEP> resistenter <SEP> Staphylococcen <SEP> (0/0)
<tb> konzentration <SEP> (pg/ml) <SEP> Dano-DSM <SEP> KM <SEP> Tc <SEP> CP <SEP> Pc <SEP> EM <SEP> NB
<tb> mycin
<tb> 100 <SEP> 1,7 <SEP> 55,2 <SEP> 0 <SEP> 52,5 <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 0.

   <SEP> 0
<tb> 100 <SEP> 0 <SEP> 10, <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 43, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 22, <SEP> 4 <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 98, <SEP> 5 <SEP> 11, <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 1 <SEP> 10 <SEP> 12,1 <SEP> 93, <SEP> 5 <SEP> 32,2 <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> 97 <SEP> 52, <SEP> 5
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> 87 <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 44
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 11, <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 9> 

 Tabelle 4 (Fortsetzung) 
 EMI9.1 
 
<tb> 
<tb> Abkürzungen <SEP> :

   <SEP> DSM <SEP> Dihydrostreptomycin
<tb> KM <SEP> Kanamycin
<tb> TC <SEP> Tetracyclin
<tb> CP <SEP> Chloramphenicol
<tb> Pc <SEP> Penicillin <SEP> G
<tb> EM <SEP> Erythromycin
<tb> NB <SEP> Novobiocin
<tb> 
 5. Toxizität : Die Toxizität von Danomycin ist äusserst gering, die intravenöse    LD50 beträgt   3250 mg/kg bei Mäu- 
 EMI9.2 
 Danomycin wurden nach 90 Tagen keine negativen Auswirkungen im Wachstum oder Verhalten festgestellt. 



   6. Chemotherapeutische Wirkung gegenüber experimenteller Infektion von Mäusen :
Mäuse wurden intraperitoneal mit Staphylococcus. aureus Stamm Smith infiziert, wobei die Impfdosis das 100fache der    LD50 des   Krankheitserregers betrug, und Danomycin wurde nach Eintreten der Infektion subkutan angewendet. Die mittlere heilende Dosis einer Einzelinjektion    (CD 50)   wurde mit 0,04 mg/kg ermittelt. Vergleichsweise wurde Natrium-Penicillin G geprüft, dessen CD 50-Wert 0,3 mg/ kg betrug. 



   Das gemäss der Erfindung erhältliche Antibiotikum ist ein wertvolles Mittel zum Nachweis der Schädlichkeit von gramnegativen Bakterien, Pilzen, Hefe u. dgl. bei der Gewinnung des Enzyms Amylase durch Fermentation von B. subtilis. So ermöglicht der Zusatz von 1 bis   1000/lg/ml   und vorzugsweise von   10 fig/   ml des Antibiotikums zu dem geimpften Medium des Wachstum der Schädlinge und ihren visuellen Nachweis.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Gewinnung des neuen Antibiotikums Danomycin, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm des Streptomyces albaduncus ATCC 14 698 oder dessen Mutanten oder Varianten in einer wässerigen, ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthaltenden Kohlehydratlösungen unter submersen, aeroben Bedingungen unter Anwendung einer Bebrütungsdauer von 1 bis 10 Tagen und einer Bebrütungstemperatur von etwa 20 bis etwa 350C gezüchtet wird, bis eine wesentliche Aktivität gegenüber grampositiven Bakterien in der Lösung auftritt, worauf das Danomycin aus der Lösung abgetrennt wird.