DE961655C

DE961655C - Herstellung eines Antibiotikums

Info

Publication number: DE961655C
Application number: DES40266A
Authority: DE
Inventors: Jean Preud Homme; Sylvie Pinnert
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1953-07-31
Filing date: 1954-08-01
Publication date: 1957-04-11

Description

Herstellung eines Antibiotikums Die Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen Antibiotikums.

Dieses Antibiotikum, das im folgenden als Spiramycin bezeichnet wird, wird aus Kulturen eines besonderen, weiter unten beschriebenen Mikroorganismus durch Fermentation erhalten. Es konnte bisher nicht in kristallisiertem Zustand erhalten werden. Die Base liegt in Form eines amorphen weißen Pulvers vor; ihre Säureadditionssalze, z. B. das Sulfat und das Chlorhydrat, können in festem Zustand isoliert werden. Die Base ist in Chloroform, chlorierten Lösungsmitteln, Alkoholen, Hexan, Benzol, Ketonen und Äthyl- und Amvlacetat löslich. Das Sulfat ist in Wasser und niedrigeren aliphatischen Alkoholen, wie Methanql, Äthanol, Butanol, löslich. Die Elementaranalyse der Base zeigt, daß sie nur die Elemente C, H, O und N enthält; mehrere Analysen, die an Proben der Base durchgeführt wurden, ergaben die folgenden Werte:

Kohlenstoff . . . . . . . . . . . . . 6o,o bis 61:,o0/,

Wasserstoff . . . . . . . . . . . . . . 8,9 bis 9,q

Sauerstoff . . . . . . . . . . . . . . . 25,5 bis 27,o °/o

Stickstoff . . . . . . . . . . . . . , . . 3,3 bis 3,6 °/o

Durch Gegenstromverteilung mit 6o Rohren nach der Methode von Craig unter Verwendung von Cyclohexan und einer wäßrigen Spiramycinlösung, die 10/0 Dinatriumphosphat enthielt, konnte man die Anwesenheit von drei Bestandteilen feststellen. Diese drei Körper scheinen jedoch vom Standpunkt der Zusammenfassung, der chemischen Eigenschaften und der antibakteriellen Wirksamkeit aus außerordentlich nahestehend zu sein. Das Molekulargewicht der Base, berechnet aus dem Neutraläquivalent oder durch Bestimmung der Sulfationen am Sulfat, liegt zwischen (4oo)n und (450)n. Die Bestimmung des Molekulargewichts nach Rast scheint anzuzeigen, daß n = 2 ist. Der Stickstoffgehalt ergibt ebenfalls eine Zahl -innerhalb dieser Grenzen, was darauf hinweist, daß der gesamte Stickstoff basisch ist. Die Base gibt negative Teste bei folgenden Reaktionen: Reaktion nach Sakaguchi, Reaktion nach Molish, Ninhydrinreaktion, Ninhydrinreaktion nach saurer Hydrolyse, Reaktion mit Fehlingscher Lösung, Biuretreaktion, Ferrisalzreaktion des Maltols, Ferrisalzreaktion des Maltols nach alkalischer Hydrolyse. Mit starken, konzentrierten Säuren gibt die Base eine rotviolette Färbung: Die Base ist optisch aktiv, und ihre Lösungen in Chloroform oder Äthylalkohol sind linksdrehend = - 72' (c = 2 °/a in Äthanol) für ein besonders gereinigtes Produkt. Ihr Absorptionsspektrum (Lösungen in Äthylalkohol) zeigt im Ultraviolett ein einziges Maximum bei 2,31 m» = 346 für eine besonders gereinigte Probe), wodurch sie sich vom Erytromycin (28o mß) und vom Carbomyciii (24o mu) unterscheidet, denen sie auf Grund ihres antibakteriellen Spektrums nahesteht. Sie unterscheidet sich auch von diesen zwei Antibiotika in dem Sinne, daß Erreger, die gegenüber Spiramycin resistent wurden, eine teilweise Sensibilität gegenüber Erytromycin und Carbomycin behalten. Das Spiramycin ist besonders wirksam gegen grampositive Erreger, ist jedoch wenig aktiv gegenüber gramnegativen Erregern: es besitzt auch eine gewisse Wirksamkeit auf Mycobakterien. Es ist sehr wirksam gegen anaerobe Erreger und insbesondere Clostridium septicum und Clostridium histolyticum. In der folgenden Tabelle ist das antibakterielle Spektrum einer teilweise gereinigten Probe zusammengestellt, wobei die Aktivität in flüssigem Medium bestimmt wurde.

Stämme

Eventuelle Resistenz

Bebrütung Aktivität

mcg/ccm

Staphy. aureus 2o9 P....................... - 16 Std. bei 37' 1.4

desgl. B3 ........................ Penicilhn-Streptomycin desgl. 3,5

desgl. 270o R 16 . . . . . . . . . . . . . . . . . . Streptothricin-Streptomycin- desgl. 1,6

Neomycin

desgl. Hb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chlortetracyclin-Oxytetra- desgl. 1,6

- cyclin

desgl. Beaujon 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cblortetracyclin-Oxytetra 16 Std. bei 37' 1,6

cyclin-Chloramphenicol-

Penicillin-Streptomycin

Klebs. pneumoniae ATCC 9997 . . . . . . . . . . . . . - desgl. 33,0

Bac. cereus ATCC 6630 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 16 Std. bei 28' 2,7

Micro. citreus.............................. - 16 Std. bei 37' 5,1

Sarc. lutea ATCC 9341. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 40 Std. bei 28' o,8

Strept.faecalis ........................... - 16 Std.bei37' 1,0

Strept. faecalis ATCC 979o . . . . . . . . . . . . . . . . . - desgl. 1,o

Strept. hemolyticus......... . . . . . . . . . . . . . . . - desgl. o,6

Strept. viridans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - desgl. 3,1

Diplo. pneumoniae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - desgl. o,2

Neisseria catarrhalis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 40 Std. bei 37' 10,3

Mycobact. Sp. ATCC 6o7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . - desgl. 85,0

desgl. NR .............. Neomycin desgl. 38,o

desgl. SR . . . . . . . . . . . . . . . . Streptomycin desgl. 38,o

Corynebact. pseudodiphtericum . . . . . . . . . . . . . . - desgl. 3,5

Bac. subtilis ATCC 6633 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 16 Std. bei 37' 3,75

Brucella bronchiseptica CN-387 . . . . . . . . . . . . . - desgl. 75,0

Bac. mycoides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 16 Std. bei 28' 2,3

Mycobact. phlei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 40 Std. bei 370 330

Mycobact. parasmegmatis . . . . . . . . . . . . . . . . . . - desgl. 166,o

Gaff. tetragena............................. - 16 Std. bei 37' 0,8

Das Spiramycin ist in vivo bei der Maus sowohl oral als auch subkutan verabreicht, bei Streptococcen-, Pneumococcen- und Staphylococcen-Infektionen in geringen Teilen der maximal verträglichen Dosen sehr wirksam. Es hat sich als Antimalariamittel bei der Behandlung der Infektion der Maus mit P. Berghei als wirksam erwiesen. Es besitzt auch für die Rickettsien-Infektionen der Maus eine heilende und vorbeugende Wirkung. Seine Toxizität ist bei der Maus sehr gering; es wird oral in einer Dosis von 5 g/kg gut vertragen. Die letale Dosis für 50"/, der Tiere (DL 5o) beträgt subkutan 1,5 bis 2,5 g/kg und intravenös o,15 bis 0,25 g/kg.

Der Organismus, der das neue erfindungsgemäße Antibiotikum erzeugt, ist eine Art aus der Gattung Streptomyces und soll im folgenden als »S. 3486<c oder :,Streptomyces 3486« (ebenso wie seine Mutanten, ausgenommen, daß der Zusammenhang es nicht gestattet) bezeichnet werden.
Dieser Mikroorganismus wurde aus einer Erdprobe isoliert, die aus einem Feld aus der Umgebung von Peronne im Departement Somme (Frankreich) stammte. Die Isolierungsmethode ist die folgende: Eine Erdprobe wurde in destilliertem, sterilem Wasser suspendiert, die Suspension wurde verdünnt und eine kleine Menge dieser Suspension auf einer Petrischale ausgebreitet, die Nähragar enthielt. Nach 7tägiger Bebrütung bei 28° wurde die Kolonie von Streptomyces 3486 mittel eines Platinfadens zum Beimpfen von schrägen Röhrchen mit Nähragar entnommen, damit man größere Mengen dieses Organismus erhielt.
Diesar Stamm Streptomyces 3486 wurde im Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria 5, Illinois, USA., unter der Bezeichnung NRRL 242O hinterlegt.
Unter Verwendung der Klassifikation von Bergeys »Manual of determinative Bacteriology,; (6. Aufl., 1949) für die Gattung Streptomyces kann dieser Organismus am ehesten mit Streptomyces griseolus verglichen werden, der zuerst von Waksman unter dem Namen Actinomyces 96 (vgl. Soil Science 8, 121 A9197) beschrieben wurde. Wie im folgenden gezeigt werden wird, existieren zwischen S.3486 und dem von Waksman beschriebenen Organismus gewisse Unterschiede, so daß man diese beiden Streptomyceten nicht derselben Art zuordnen kann. Einige Eigenschaften von S. 3486,. insbesondere die Erzeugung eines braunen Pigments in synthetischem Medium und auf Kartoffeln, würden auch eine Einteilung in der Nähe Streptomyces fimicarius zulassen. Die Pigmenterzeugung durch S. 3486 ist in diesen beiden Fällen jedoch außerordentlich gering, und er unterscheidet sich von S. fimicarius durch eine bestimmte Anzahl anderer Eigenschaften. Schließlich hat der Stamm S.3486 im Verlaufe der Identifizierungsversuche wechselnde Eigenschaften gezeigt, und die weiter unten gegebene Beschreibung entspricht den am häufigsten beobachteten Eigenschaften. Mikroskopische Morphologie Dieser Stamm erzeugt bei der Züchtung auf Czapek-Agar mit Glukose verzweigte Fäden. Unter günstigen Impfbedingungen kann man rasch die Bildung von Sporenketten beobachten, die sich an die Hauptfäden einzeln oder vereinigt in baumartigen Verzweigungen anhängen. Die Form der Sporenfäden kann entweder einfach gekrümmt oder schraubenartig gewunden oder unregelmäßig verdreht sein. In den Winkeln zwischen den Sporenfäden trifft man häufig nicht segmentierte Elemente in Form von Schrauben mit mehreren geschlossenen Spiralen. Die Sporen haben im allgemeinen verschiedene Form von kurzoval bis kreisrund.
Form der Kolonien Monosporenkulturen auf Agar mit Asparagin zeigen runde Kolonien, deren Größe je nach dem Entwicklungsgrad variieren kann.
Im Falle einer dichten Beimpfung bleiben die Kolonien klein, rund, halbkugelig und können in gewissen Fällen eine mehr oder weniger ausgeprägte zentrale Vertiefung zeigen. Die Sporenbildung ist schnell und erstreckt sich im allgemeinen auf die gesamte Kolonie oder den Umfang mit der Tendenz, um die Kolonie herum baumartige Verzweigungen zu bilden. Die Farbe des zuerst weißen Luftmycels geht im Moment der Sporenbildung in Grau über.
Falls die Kolonien nicht sehr zahlreich sind, kann ihre Form veränderlich sein, jedoch ist das am häufigsten beobachtete Aussehen einer Kolonie rund und kann bis zu io mm Durchmesser erreichen. Das gelbliche vegetative Mycel hat gelappte Ränder und bildet entlang Radien tiefe Falten und mehrere- konzentrische Ausbuchtungen, die im allgemeinen eine Vertiefung in der Mitte der Kolonie lassen. Entlang der Falten bilden sich Sprünge, besonders in der Mitte der Kolonie, die die Rückseite des vegetativen Mycels zeigen. Das zunächst weiße Luftmycel (ganz schwach hellgelbrosa gefärbt) nimmt im Augenblick der Sporenbildung rasch eine graue Färbung an. Diese Sporenx Bildung kann an dem äußeren Teil der Kolonie intensiver erfolgen.
Züchtungseigenschaften - biochemische Eigenschaften Die Züchtungsbedingungen und die biochemischen Reaktionen sind in der folgenden Tabelle angegeben. Die verwendeten Kulturmedien wurden in der Mehrzahl nach den von S. A. Waksman in »The Actinomycetes « (195o, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA., S. 193 bis 197) veröffentlichten Angaben hergestellt.
Die den v erschiedenenMedien in »TheActinonycetes" gegebenen Nummern wurden hier beibehalten.
z. Biochemische Eigenschaften Milch, bei 26°: Kultur bildet einen Schleier. Teilweise Peptonisierung in i Monat ohne sichtliche Koagulation. Die peptonisierte Zone nimmt eine orangebraune oder rötliche Färbung an. Auf Milch mit rotem Bromkresol: p$ unverändert oder je nach den Kulturen, zum alkalischen Bereich übergehend.
Milch, bei 37°: Entwicklung weniger gut. Gelegentliche Flockung, teilweise Peptonisierung.
Gelantine (Zusammensetzungen Nr. 7 und 8 nach W a k s m an): Mittlere Verflüssigung. Gelblicher Schleier und gelbliche Flocken in dem verflüssigten Teil. Pigment: variabel, braunorange, schwach in dem verflüssigten Teil, ausgeprägter auf dem Glukosemedium.

Nitrite: Die Reduktion der Nitrate zu Nitriten erfolgt in synthetischem Medium (in Gegenwart von Saccharose). In organischem Medium- sind die Reaktionen auf Nitrite negativ. Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen: Diese Versuche wurden unterVerwendung der Methode von Pridham und Gottlieb (vgl. J. Bact. 56, 107 bis 114 [1948]) durchgeführt. Gut verwendete Elemente: Glycerin, Arabinose, Glukose, Laevulose, Mannose, Laktose, Rhamnose, Galaktose, Stärke, Mannit. Langsamer verwendete Stoffe (Kulturen gut entwickelt, jedoch langsamer) oder unregelmäßig verwendete Stoffe: Xylose, Saccharose, Maltose, Inosit.

Streptomyces griseolus

Stamm S.3486

Mikroskopische Morphologie ...... Spiralen nicht beobachtet; ovale bis Anwesenheit von Spiralen; ovale

kuglige Sporen bis kuglige Sporen

Synthetischer Agar . . . . . . . . . . . . . Vorherrschen des grauenLuftmycels ; Vorherrschen des grauen Luftmycels ;

kein lösliches Pigment sehr schwaches, gelbbraunes, lös-

liches Pigment

Glukose-Bouillon . . . . . . . . . . . . . . . . braunes Pigment, schwach oder gar bernsteingelbes Pigment oder keines

keines

Gelatine ....................... verflüssigt; gelbliches Häutchen verflüssigt; schwaches gelbbraunes

Pigment

Kartoffeln . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .. cremefarben bis schwarz; Kartoffel hell- bis dunkelbraun; Kartoffel

wird braun braun gefärbt

Milch . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . .. koaguliert, peptonisiert bei 26°: peptonisiert ohne sichtbare

Koagulation

Nitrate .... ... ........ ...... . reduziert zu Nitriten reduziert zu Nitriten

Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bildung eines schwachen, braunen Bildung eines schwachen, gelblichen

Pigments bis bräunlichen Pigments

Nach einer Durchführungsform der Erfindung besteht ein Verfahren zur Herstellung von Spiramycin darin, daß ein wäßriges Nährmedium mit einer Kultur des Stammes S. 3486 beimpft wird, daß eine aerobe Fermentation durchgeführt wird und daß das so gebildete Spiramycin aus dem Kulturmedium abgetrennt wird. Das Kulturmedium enthält auch ein in der Literatur bereits beschriebenes Antibiotikum (vgl. C o s ar, N i n e t, Pinnert, Preud'homme, C. R. 234, 1498 [19527), dem man den Namen Congocidin gegeben hat (vgl. D e s p o i s und N i n e t, 6. Internationaler Mikrobiologischer Kongress, Rassunti delle Communicazioni, Bd. I, S. 162 (1953]). Das Congocidin besitzt nicht dieselben interessanten Eigenschaften wie das Spiramycin und kann in kristalliner Form isoliert werden. Die Trennung dieser beiden Antibiotika kann, wie im folgenden beschrieben, leicht durchgeführt werden.

Die Züchtung des S. 3486 durch Fermantation kann an der Oberfläche durchgeführt werden; im allgemeinen wird es jedoch vorgezogen, die Fermentation in submerser Züchtung durchzuführen.
Die Fermentation kann besonders nach folgendem Schema geführt werden.
Züchtung auf Agar Züchtung in bewegten Erlenmeyern Beimpfung im Fermentationsbehälter Produktionszüchtung in Fermentationsbehältern Das Nährmedium enthält wie bei den anderenMedien, in denen andere Pilze zur Erzeugung von antibiotischen Nicht verwendete Stoffe: Raffmose, Erythrit, Dulcit, Sorbit.
Vergleich zwischen S. griseolus und S. 3486: Die folgende Tabelle gibt einige der Eigenschaften wieder, aus der die Gleichheit bzw. Verschiedenheit des von W aksman beschriebenen Stammes S. griseolus und dem das Spiramycin erzeugenden Stamm ersichtlich wird. Substanzen gezüchtet werden, eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine organische oder anorganische Quelle für assimilierbaren Stickstoff, gewisse Mineralsalze, wie Phosphate, und Spuren von verschiedenen Metallen, die sich normalerweise als Verunreinigungen in den übrigen Bestandteilen des Mediums befinden.
Als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff kann man verwenden: Fette (pflanzliche oder tierische Öle), verschiedene Polyole (Glycerin) und vorzugsweise assimilierbare Kohlehydrate, wie gewöhnliche Stärke, lösliche Stärke, Zucker, wie Saccharose, Glukose, Maltose und Dextrose und andere in Wasser lösliche oder teilweise lösliche Kohlehydrate, wie Alkoholzucker. Als geeignete Quelle für assimilierbaren Stickstoff kann man eine Vielzahl von Substanzen verwenden, wie Aminosäuren, hydrolysiertes oder nicht hydrolysiertes Kasein, Fischmehl, Sojamehl, Fleischextrakte, Rückstand von der Leberextraktion, distiller's solubles, Hefeextrakte oder -autolysate und verschiedene andere stickstoffhaltige Substanzen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs. Als Stickstoffquelle kann man dem Nährmedium auch chemische Substanzen zusetzen, wie Harnstoff, Nitrate oder Ammoniumsalze. Man hat festgestellt, daß Maisquellwasser auf Grund der Vielzahl der in ihm enthaltenen organischen und anorganischen Substanzen ein gutes Hilfsmittel für das Fermentationsmedium darstellt. Vorzugsweise werden dem Medium auch die wesentlichsten Mineralsalze zugesetzt, wie Natriumsalze (z. B. Chlorid), Calciumsalze (Carbonat) usw. Der pH-Wert des Mediums wird vor der Sterilisation auf im wesentlichen neutral und vorzugsweise zwischen 6 und 7 gebracht. Die Fermentation wird bei einer Temperatur von 24 bis 28° und vorzugsweise bei 26° geführt. Die Entwicklung der Produktionskultur ist nicht sehr rasch; man kann sie jedoch nach 3 bis 4 Tagen als beendet betrachten. Die hauptsächlichsten Merkmale sind: Zuerst erfolgt eine Erniedrigung des pH-Wertes bis gegen 6,4, und dann, nach etwa 30 Stunden, erfolgt ein Wiederanstieg des pH-Wertes auf etwa 7,5 und manchmal darüber. Es scheint, daß dieser Anstieg mit dem Ende des Glukoseverbrauchs zusammenfällt. Die auf das Spiramycin zurückzuführende antibiotische Aktivität ist von Beginn der Fermentation an regelmäßig ansteigend. Obzwar die Belüftung keinen kritischen Faktor darstellt und in ziemlich weiten Grenzen variieren kann, ist es vorzuziehen, mit einer Belüftung von o,5 bis 21 Luft je Liter Bouillon und j e Minute zu arbeiten.
Das Spiramycin kann aus der Fermantationsflüssigkeit durch verschiedene Methoden isoliert werden. Die Methode, die sich bisher als vorzugsweise erwiesen hat, ist die Extraktion mit einem Lösungsmittel. Man kann ein Lösungsmittel verwenden; das in der zurückbleibenden Flüssigkeit die im Verlaufe der Fermentation gleichzeitig gebildeten Substanzen, wie z. B. das Congocidin, zurückläßt. Man kann auch ein Lösungsmittel verwenden, das einen Teil dieser Verunreinigungen extrahiert, die man dann im Verlaufe der weiteren Behandlungen entfernt. Diese Extraktion erfolgt nach dem Filtrieren von der Gärflüssigkeit in Gegenwart von Filterhilfen bei einem p11-Wert zwischen 7 und g. Man führt die Extraktion bei einem p11-Wert zwischen 8 und ii und vorzugsweise bei p$ g mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel durch, das zur Gruppe der Alkohole (insbesondere Butanol), der aliphatischen Ketone (Methyläthylketon, Methyl-isobutylketon usw.), der halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoffe (Chloroform), der aromatischen Kohlenwasserstoffe (Benzol) und der Ester, wie Äthylacetat oder Amylacetat, gehört. Die so erhaltene Lösung wird dann mit Wasser bei einem sauren p$ (unter 4 und vorzugsweise zwischen 2 und 3) extrahiert. Der wäßrige Extrakt wird dann konzentriert und bei pg g mit Chloroform oder Benzol extrahiert. Die organische Lösung wird dann konzentriert, entwässert, mit Schwefelsäure auf PH 5 gebracht, und das Sulfat des Antibiotikums wird mit Äther ausgefällt.
Man kann den ersten organischen Extrakt auch direkt konzentrieren, mit Wasser bei p$ 2 extrahieren und diese wäßrige Lösung dann, wie oben angegeben, behandeln. Das so erhaltene rohe Sulfat kann dann durch aufeinanderfolgende Extraktion mit organischen Lösungsmitteln oder mit Wasser oder durch Chromatographie gereinigt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken. Die willkürlich gewählte Einheit ist die kleinste Menge eines bestimmten gereinigten Produktes, die, gelöst in i ccm eines geeigneten Kulturmediums, die Entwicklung von Staphylococcus aureus (Stamm F. D. A. Zog P) verhindert. Für das betreffende Produkt beträgt diese Menge z Mikrogramm. Beispiel i Man bereitet folgendes Medium:

Maisquellwasser

(Trockenextrakt 50 %) .... 4,o Gewichtsprozent

Glukose .................... 2,o -

Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . 0,5 -

Natriumchlorid .............. 0,5 -

Magnesiumsulfat . ...... .. .... o,i -

401 dieses Mediums werden in einen Fermentationsbehälter von 751 Inhalt gegeben. Der" pH-Wert wird auf 7 eingestellt und die Mischung 45 Minuten bei i2o° sterilisiert. Nach dem Abkühlen auf 26° wird das Medium mit 250 ccm einer Kultur von S. 3486 aus einem bewegten Erlenmeyer beimpft. Die Kultur in dem Fermentationsbehälter wird 25 Stunden belüftet und gerührt und dient zum Impfen der Produktionskultur.

Diese wird in einem Fermentationsbehälter von 3501 Inhalt durchgerührt, der mit Zoo 1 des folgenden Mediums beschickt ist:

Glukose .................... 2,o Gewichtsprozent

Sojamehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,0 -

distiller's solubles . . . . . . . . . . . . 0,5 -

Natriumchlorid ..... .... .. ... 2,o -

Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . i,o -

Der pH-Wert vor der Sterilisation ist 6,8. Die Entwicklung der Produktionskultur ist nicht sehr rasch, man kann sie jedoch nach 3 bis 4 Tagen bei 26° mit einer Belüftung von i2 cbm/Std. und Rühren von 400 Umdrehungen in der Minute als beendet ansehen. Man verzeichnet zuerst eine Erniedrigung des pH-Wertes auf 6,4 und dann nach etwa so Stunden ein Wiederansteigen des pH-Wertes bis auf etwa 7,5. Nach 4 Tagen beträgt die erhaltene Aktivität g2 Einheiten je ccm. Beispiel 2 In einen Fermentationsbehälter von 3501 Inhalt gibt man Zoo 1 des folgenden Mediums:

Glukose .................... i,o Gewichtsprozent

Maisquellwasser

(500/,Trockenextrakt) . . . . . 3,0 -

Monokaliumphosphat ........ o,i -

Magnesiumsulfat . . ... ... .. ... o,i -

Natriumchlorid .... .. .... .... 2,o -

Calciumca.rbonat . . . . . . . . . . . . . 0,5 -

Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf 7 eingestellt und das Medium 45 Minuten bei 120' sterilisiert. Das Medium wird dann auf 26° gebracht und dann wie im Beispiel i beimpft. Die Fermentation wird dann unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Die maximale Aktivität wird nach 6o Stunden erhalten und beträgt 129 Einheiten/ccm.

Beispiel 3 Eine Fermentation wird wie im Beispiel? durchgeführt, nur wird die Glukose durch 20/0 Saccharose ersetzt und die Menge an Maisquellwasser auf 2 Gewichtsprozent gebracht. Unter diesen Bedingungen beträgt die maximale Aktivität go Einheiten j e ccm nach 40 Stunden.

Beispiel 4

In einen Fermentationsbehälter von 301 Inhalt gibt

man 15 1 des folgenden Mediums:

Glukose .................... 3,o Gewichtsprozent

Hefeautolysat................ 1,o -

Natriumchlorid .............. 2,o -

Magnesiumsulfat . . ....... . .. . o,1 -

Monokaliumphosphat ........ 0,x -

Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . 0,5 -

Der p11-Wert wird mit Natronlauge auf 7 eingestellt, und nach dem Sterilisieren und Abkühlen auf 26° wird das Medium mit x l eines Kulturimpfstoffes, der in einem. Fermentationsbehälter auf dem vorher beschriebenen Medium mit Maisquellwasser gezüchtet worden war, beimpft. Nach 4tägiger Züchtung erhält man 144 Einheiten/ccm.

Beispiel 5 21o 1 Gärflüssigkeit werden bei pH 8 mit 1o kg Filterhilfe (Supercel Hyflo) versetzt und über einer Filterpresse filtriert. Der Filtrationskuchen wird mit 501 Wasser gewaschen. Das Filtrat, das 230 1 beträgt und 15,8 Millionen Einheiten enthält, wird mit xo°/oiger Natronlauge auf p.. g alkalisch gemacht und mit 461 Methylisobutylketon extrahiert. Das Lösungsmittel wird abgetrennt und die wäßrige Phase wieder mit 231 Methylisobutylketon extrahiert. Nach dem Dekantieren werden die beiden Extrakte vermischt und mit 61 Wasser, das auf pH g alkalisch gemacht wurde, gewaschen. Das in dem Lösungsmittel enthaltene Antibiotikum wird mit Wasser bei 5° extrahiert, wobei der pH-Wert durch Phosphorsäure in 5°/aiger Lösung auf 3 erniedrigt wird. Diese Extraktion wird mit 81 und dann dreimal mit je 41 Wasser durchgeführt; man findet das gesamte Antibiotikum in der wäßrigen Phase wieder. Die wäßrige Lösung, die mit verdünnter Natronlauge auf p$ 6,5 eingestellt wird, wird im Vakuum bei einer 35° nicht übersteigenden Temperatur konzentriert. Man erhält dann 1750 ccm Lösung, die 14,6 Millionen Einheiten enthält. Das Antibiotikum wird aus der wäßrigen, auf p. g alkalisch gemachten Lösung aufeinanderfolgend mit x l und zweimal mit je o,51 Benzol extrahiert. Der Benzolextrakt wird im Vakuum bei einer 30° nicht übersteigender Temperatur bis auf xoo ccm eingeengt. Dann gibt man xoo ccm n-Butylalkohol zu und stellt den pH-Wert durch Zugabe einer n2-Schwefelsäurelösung in Butanol auf 5 ein. Die Lösung wird von neuem auf xoo ccm eingeengt und das Sulfat des Antibiotikums mit 21 Äther ausgefällt. Das Sulfat, das in Form eines weißen Pulvers ausfiel, wird abgesaugt, mit Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 9,6 g Sulfat mit einem Gehalt von 1320 Einheiten/mg, was einer Ausbeute von 8o °/o entspricht. Beispiel 6 1851 Gärflüssigkeit werden wie im Beispiel 5 filtriert. Das Filtrat, das 1551 beträgt und 12,q. Millionen Einheiten enthält, wird durch Zugabe von xo°/oiger Natronlauge auf pu g alkalisch gemacht und nacheinander mit 401 und dann mit 2o 1 n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte werden im Vakuum auf 1o 1 eingeengt, wobei die Temperatur 3o° nicht übersteigt. Die Butanollösung wird nacheinander mit 81 und dann zweimal mit j e 31 Wasser extrahiert, wobei der pH-Wert durch Schwefelsäure auf 2 erniedrigt wird. Die wäßrige Lösung, die durch verdünnte Natronlauge auf pH 6,5 eingestellt wurde, wird im Vakuum bei einer 3o° nicht übersteigenden Temperatur auf 1500 ccm eingeengt. Die wäßrige Lösung enthält dann 8 Millionen Einheiten.
Die wäßrige Lösung, die auf p$ g alkalisch gemacht wurde, wird dreimal mit je 700 ccm Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden im Vakuum eingeengt und wie im Beispiel x behandelt.
Man erhält 7,4 g Antibiotikum in Form des Sulfats mit einem Gehalt von 746 Einheiten/mg, was einer Ausbeute von 440/0 entspricht.
Beispiel 7 30 g rohes Sulfat des Antibiotikums werden in 7oo ccm Wasser gelöst. Der pH-Wert wird durch Zugabe von Natronlauge auf g gebracht und die Extraktion mit dreimal je 300 ccm Benzol bewirkt. Die vereinigten Benzolextrakte werden mit Zoo ccm Wasser von p. g gewaschen und die Lösung bei niedriger Temperatur zur Trockne eingedampft.
Man erhält 24,2 g Spiramycin-Base mit einem Gehalt von 2150 Einheiten je Milligramm.

Claims

PATENTANSPRUCH: Die Verwendung von Pilzstämmen aus der Gruppe der Streptomyceten, insbesondere von Streptomyces 3486, zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, des Spiramycins, auf biologischem Wege, vorzugsweise im bekannten Submersverfahren, das folgende Eigenschaften besitzt: weißes Pulver mit basischen Eigenschaften, wenig löslich in Wasser, jedoch löslich in den meisten organischen Lösungsmitteln, Drehvermögen = -72° in 2%iger äthanolischer Lösung, das ein einziges Absorptionsmaximum im Ultraviolett bei 231 mß besitzt, Extraktion der Gärflüssigkeit, vorzugsweise bei pg 8 bis ix, und gegebenenfalls Umsetzung mit einer Säure zur Bildung des der Säure entsprechenden Salzes.