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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
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griseoflavusDuggar und S. parvulus Waksman et Gregory, welche ebenfalls glatte Sporen, aschgraues Luftmycel und Sporenketten in Spiralen besitzen. Alle drei Arten unterscheiden sich aber von S. galilaeus dadurch, dass sie keine schwarzbraune, melanoide Verfärbung peptonhaltiger Nährböden zeigen. Des weiteren ist S. hygroscopicus verschieden durch die geschlossenen Spiralen, S. aureofaciens durch die offenen, unregelmässigen Spiralen und schliesslich S. parvulus durch die kurze gerade Hauptachse der Sporenketten.
Nach dem System von Waksman in Bergey's Manual, 7. Auflage, steht S. galilaeus n. sp. folgenden Arten am nächsten : S. californicus, S. bobiliae, S. aurantiacus, S. erythraeus und S. novaecaesareae. Diese unterscheiden sich vor allem in folgender Hinsicht von S. galilaeus :
Streptomyces californicus : Bildet kein lösliches Pigment auf Gelatine ; Kultur auf synthetischem Agar weinrot, kein lösliches Pigment ; Peptonisierung von Lackmusmilch ; Kultur auf Kartoffeln rotbraun.
Streptomyces bobiliae : Rasche Gelatineverflüssigung ; Kultur auf synthetischem Agar korallenrot bis dunkelrot ; keine Koagulation von Lackmusmilch, dafür aber Peptonisierung.
Streptomyces aurantiacus : Schwache Peptonisierung, aber keine Koagulation von Lackmusmilch ; lösliches braunes Pigment auf Kartoffeln.
Streptomyces erythraeus : Kultur auf synthetischem Agar weiss bis hellgelb ; Kolonien auf Stärke-Agar cremefarben mit grünlichem Stich ; Kultur auf Glukose-Agar creme bis braun ; Peptonisierung von Lackmusmilch ; Kultur auf Kartoffel hellgelb.
Streptomyces novaecaesareae : Kultur auf synthetischem Agar grau bis bläulich, gefurcht, Luftmycel
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ne Kolonien, Peptonisierung von Lackmusmilch.
Streptomyces galilaeus n. sp. NRRL 2722 zeigt, nach der Methodik von T. G. Pridham und D. Gottlieb, J. Bacteriology 56 [1943J. S. 107 untersucht, bei Verwendung der folgenden Kohlenstoffquellen gutes Wachstum : L-Xylose, L-Arabinose, L-Rhamnose, Saccharose, Raffinose, Inulin, D-Mannit, D-Sorbit,
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Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums Pilosomycin anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces galilaeus n. sp. NRRL 2722 oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder. von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
Zur Erzeugung des Antibiotikums Pilosomycin wird ein der obigen Beschreibung entsprechender Streptomyceten-Stamm in wässeriger, eine Kohlenstoff-und Stickstoffquelle und gegebenenfalls wachs-
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Wirkung zeigt und das Antibiotikum Pilosomycin hierauf isoliert.
Als Kohlenstoffquelle kommen z. B. assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glukose, Saccharose, Laktose, Mannit, Stärke sowie Glycerin, in Frage. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt : Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton ; ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Soyapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.
Von andern anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
, Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 C. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 1 1/2 - 5 Tagen.
Zur Isolierung des Antibiotikums Pilosomycin können z. B. folgende Verfahren dienen : Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich Wasser und wässerige organische Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. wässeriges Methanol.
Um das Antibiotikum dem Kulturfiltrat zu entziehen und zu reinigen, sind verschiedene Methoden geeignet, die einzeln oder in Kombination miteinander angewandt werden können. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Kulturlösung während dieser Operationen auf einem PH zwischen 3 und 5 zu halten.
1. Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z. B. Aktivkohlen, wie Norit, aktivierte Erden, wie Ful-
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lererde oder. Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser oder wässerigen Säuren, z. B. mit Wasser-
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man das Antibiotikum an Kationenaustauschern adsorbiert, wobei besonders Säuregruppen enthaltende
Harze, wie Amberlite IRC-50, geeignet sind. Letzteres kann sowohl in der Säureform als auch in der Na- triumform verwendet werden, doch hat sich ein Gemisch dieser beiden Formen im Volumenverhältnis 1 : 2 besonders bewährt. Die Elution geschieht zweckmässig mit verdünnten Säuren, z. B. mit methanolischer
Salzsäure.
3. Weiter kann das basische Antibiotikum auch direkt aus dem Kulturfiltrat ausgefällt werden, z. B. mittels Umsetzung mit einer organischen Säure vomTypus der Pikrinsäure. Durch Behandlung dieser Fäl- lungen mit Salzen organischer Basen, z. B. mit Triäthylammoniumsulfat, oder mit verdünnten Säuren, wird das Antibiotikum in Form des entsprechenden Salzes erhalten. Man kann dabei sowohl in wässerigem
Medium als auch in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, arbeiten.
Diese Überführung der schwerlöslichen Salze in leichtlösliche Salze des Antibiotikums wird entweder mit
Mineralsäuren oder an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Amberlite IRA-400, durchgeführt.
4. Eine Anreicherung des Antibiotikums wird auch dadurch erreicht, dass man wässerige oder alkoholisch-wässerige Lösungen des Salzes mit einem Überschuss von organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Aceton, Dioxan usw., versetzt, wobei die Salze in fester Form ausgefällt werden.
5. Eine weitere Methode der Anreicherung des Antibiotikums besteht darin, dass man wässerige Lösungen desselben mit Lösungen von Phenol In Chloroform extrahiert, wobei sowohl das PH der wässerigen Lösung als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden. So befindet sich das Antibiotikum z. B. bei einer Verteilung zwischen einer Lösung, die auf 100 cams Chloroform 100 g Phenol enthält, und einer wässerigen Phase von PH 1 bis 6 fast ausschliesslich in der organischen Phase, während es bei der Verwendung einer Lösung, die auf 100 cm3 Chloroform nur 33 g Phenol enthält, der wässerigen Phase lediglich bei einem PH zwischen 4 und 6 annähernd vollständig entzogen wird.
Versteht man unter dem Verteilungskoeffizienten des Antibiotikums das Verhältnis von Konzentration in der organischen Phase zur Konzentration in der wässerigen, so geht aus den obigen Angaben hervor, dass der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinkendem PH der wässerigen Phase abnimmt. Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoeffizienten des Antibiotikums in diesem System einzustellen, kann man durch Kombination von wenigen Verteilungsoperationen einen Grossteil inaktiver Verunreinigungen abtrennen.
6. Eine andere Anreicherungsmethode für das Antibiotikum stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z. B. an Norit, Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikaten, Silicagel, Calciumsulfat sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel, Celite u. dgl. als Trägersubstanzen oder aber Chromatographie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Dowex 50, Amberlite IRC-50 u. dgl. Beispielsweise hat sich die Verteilungschromatographie an Cellulose unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Butanol (4 Vol.-Teile), Eisessig (1 Vol.-Teil) und Wasser (5 Vol.-Teile) besonders bewährt.
7. Weiter kann das Antibiotikum durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden. Folgende Lösungsmittelsysteme haben sich dabei besonders bewährt : a) Sek. Butanol-1/10 N Ammoniumacetatpuffer von PH 4, 68 ; b) 1/10 N Ammoniumacetatpuffer vom PH 4, 6-10% ige Lösung von Phenol in Chloroform. Der Verteilungskoeffizient des Antibiotikums im System b) und damit die Lage des Aktivitätsmaximums in der Verteilung kann einerseits durch Änderung des PH der Pufferlösung und anderseits durch Variierung des Phenolgehaltes der organischen Phase beliebig verändert werden.
Zur Herstellung eines weitgehend reinen Präparates hat sich folgende Kombination der aufgeführten Anreicherungsverfahren bewährt. Aus dem Kulturfiltrat wird das Antibiotikum am gepufferten Ionenaustauscher Amberlite IRC-50 adsorbiert und mittels methanolischer Salzsäure eluiert. Die Eluate werden bei PH 5 im Vakuum eingeengt, wobei ein wässeriges Konzentrat des Antibiotikums erhalten wird, das volumenmässig ungefähr 1/100 der Kulturlösung entspricht. Dieses wird gemäss der oben erwähnten Methode 5 einige Male zwischen Phenol-Chloroform-Gemischen einerseits und wässerigen Lösungen von variierendem PH anderseits verteilt, wobei nach Gefriertrocknung ein Präparat erhalten wird, das in bezug
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auf das Kulturfiltrat eine um den Faktor 500-1000 erhöhte spezifische Wirksamkeit besitzt.
Durch Behandlung eines solchen Präparates gemäss den oben aufgeführten Methoden 6 (Verteilungschromatographie an Cellulose) und Methode 7 kann das basische, weitgehend einheitliche Antibiotikum Pilosomycin vorzugsweise in Form eines Salzes erhalten werden.
Wie aus papierchromatographischen Untersuchungen hervorgeht, besteht das Antibiotikum Pilosomycin aus mindestens zwei Komponenten, nämlich der Hauptkomponente A und der Nebenkomponente B. Diese werden im Verlaufe des beschriebenen Anreicherungsprozesses weitgehend voneinander getrennt, speziell bei der Verteilungschromatographie an Cellulose und bei der Gegenstromverteilung.
Die beiden Komponenten-von Pilosomycin werden papierchromatographisch definiert durch einen direkten Vergleich ihrer Rf-Werte mit den Rf-Werten einer Reihe von bekannten Antibiotika (2-11) in den Systemen A-G. Beim System H :'Wird durchlaufend chromatographiert. Die angegebenen Zahlen sind dort die in cm gemessenen Laufstrecken der Antibiotika nach 16stündiger Chromatogrammdauer. Der Nachweis der Antibiotika erfolgt autobiographisch mit Staphylococcus aureus oder Bacillus subtilis.
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<tb>
<tb>
System <SEP> la <SEP> lob <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11
<tb> A <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,92 <SEP> 0,07 <SEP> 0
<tb> B <SEP> 0,49 <SEP> 0,63 <SEP> 0,05 <SEP> 0,05 <SEP> 0,17 <SEP> 0,02 <SEP> 0,02 <SEP> 0,66 <SEP> 0,55 <SEP> 0,92 <SEP> 0,32 <SEP> 0,22
<tb> C <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 0. <SEP> 58 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP> 0.
<SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0, <SEP> 72 <SEP> 0, <SEP> 62 <SEP> 0, <SEP> 93 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP>
<tb> D <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP> 0
<tb> E <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0, <SEP> 86 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP>
<tb> F <SEP> 0,47 <SEP> 0,47 <SEP> 0,22 <SEP> 0,14 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP> 0,05 <SEP> 0,49 <SEP> 0,42 <SEP> 0,91 <SEP> 0,43 <SEP> 0,36
<tb> G <SEP> 0, <SEP> 74 <SEP> 0, <SEP> 74 <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 61 <SEP> 0.
<SEP> 69 <SEP>
<tb> H <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 7, <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> (14,5) <SEP> (8,8) <SEP> 27 <SEP> 1
<tb>
A wassergesättigtes Butanol
B Butanol-Eisessig-Wasser (4:1:5) (obere Phase)
C wassergesättigtes Butanol + 2% p-Toluolsulfosäure
D wassergesättigtes Butanol-t-2% Piperidin
E Butanol-Pyridin-Wasser (6 : 4 : 3)
F 80% Äthanol +1, 5% Natriumchlorid, Whatman Nr. 4 imprägniert mit 0, 95-m. Na- triumsulfat+ 0. 05-m.
Natriumhydrosulfat
G Butanol-Äthanol-Wasser (1 : 1 : 2)
H Butanol-Butylacetat-Eisessig-Wasser (10 : 3 : 1, 3 : 14, 3) (obere Phase) la Pilosomycin Base A 1b Pilosomycin Base B
2 Streptomycin
3 Ristocetin A
4 Ristocetin B
5 Neomycin B
6 Viomycin
7 Chlortetracyclin
8 Oxytetracyclin
9 Actinomycin J 10 Cycloserin 11 Grisein x Antibiotikum über ganze Laufstrecke verteilt () Position unscharf.
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Die Komponente A des Antibiotikums Pilosomycin ist ein orangegelbes Pulver, das sich leicht in Wasser, gut in Methanol und schwer in den meisten organischen Lösungsmitteln löst.
Die Base A gibt folgende Farbreaktionen:FeCl : braunrot, FeCl -KFe (CN) : blau, Ninhydrin : schwach violett, der Sakaguchi-, Maltol- und Ehrlich-Morgantest sind negativ. Die Substanz enthält neben Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff auch Eisen.
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und bei 315 m/l (E1cm = 42).z. B. durch Umsetzung in wässerigem Medium mit Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen Baryts mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumcarbonat-und-sulfat-Niederschlages und Isolierung der freien Base mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines stark basischen Anionenaustauschers, z. B. der OH-Form des unter der Bezeichnung Dowex-2 im Handel befindlichen Produktes.
Eine der auffalendsten Eigenschaften des Antibiotikums Pilosomycin ist ein ausgeprägtes Stabilitätsminimum zwischen PH 7 und 11. Lösungen des Antibiotikums verlieren bei 200C und bei einem PH von 8 bis 10 innerhalb 48 Stunden den grössten Teil ihrer Aktivität, während sie bei der gleichen Temperatur und bei pH-Werten von 1 bis 5 vollständig und bei einem PH von 6 bis 7 und grösser als 11 teilweise wirksam bleiben.
Die Salze des Antibiotikums Pilosomycin und seiner Komponente leiten sich von den bekannten anorganischen und organischen Säuren ab, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren und Phosphorsäuren, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von Pilosomycinsulfat mit pantothensaurem Calcium.
Das Antibiotikum Pilosomycin besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschie-
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diphtheriae, Escherichia coli, Bacillus megatherium und Bacillus subtilis.
In vivo ist das Antibiotikum Pilosomycin sowie die Komponente A und B ebenfalls wirksam. Bei fünf- maliger subkutaner Verabreichung der Komponente A von 1 mg/kg an mit Staphylococcus pyogenes, var. aureus, mit Pneumococcus Typ III oder mit Streptococcus haemolyticus infizierte Mäuse werden 80 bis 100% und bei einer Dosis von fünfmal 0, 1 mg/kg 60% Überlebende beobachtet. Bei peroraler Applikation wird der gleiche Effekt mit zehnmal höheren Dosen erzielt. Die Komponente B zeigt gegenüber Pneumococcus Typ III die gleich hohe antibiotische Wirksamkeit in vivo.
Die Toxizität des Antibiotikums und seiner Komponenten A und B ist gering. So wird z. B. die subkutane Applikation von 500 mg/kg von Mäusen ohne Schädigung ertragen.
Das Antibiotikum Pilosomycin, seine Komponenten, seine Salze oder Derivate können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 : Die Züchtung des S. galilaeus n. sp. NRRL 2722 wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die pro l Leitungswasser 20 g Sojamehl und 20 g Mannit enthält. Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern während 20 - 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein PH von 7,5 bis 8, 0. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 10% einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus. Man inkubiert unter gutem
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Schütteln oder Rühren bei 270, wobei Kulturen in Fermentern mit zirka 2 Volumen steriler Luft pro Volumen Lösung in der Minute belüftet werden. Nach 48 - 120 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den grössten.
Hemmwert gegenüber den Testorganismen (B. subtilis, B. megatherium, Micrococcus pyogenes, var. aureus) erreicht. Man unterbricht die Kultur, bringt das PH durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure auf 4, 5 und trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge des Antibiotikums enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 1% eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird. Die Filter-
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dem Kulturfiltrat.
Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro l Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit. a) Glukose 10 g
Soyamehl 10 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g b) Glycerin 20 g
Soyamehl 10 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g
Calciumcarbonat 10 g c) Glukose 10 g
Soyamehl 10 g Corn steep liquo (Maisquellwasser)
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g
Calciumcarbonat 10 g d) Laktose 20 g
Distillers solubles 20 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g Beispiel 2 :
31 eines gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf PH 7,5 gebracht und mit 50 g Aktivkohle (Norit A) versetzt. Man lässt während 1 Stunde mechanisch rühren, wobei die gesamte antibiotisch wirksame Substanz von der Kohle adsorbiert wird. Diese wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von etwas Filterhilfsmittel, wie z. B. Hyflo Supercel, von der vollständig inaktiven Lösung abgetrennt. Die Kohle wird darauf in 500 cm3 einer Mischung von 4 Vol.-Teilen Wasser und 1 Vol.-Teil Pyridin eingetragen, die Mischung 1/2 Stunde mechanisch gerührt und dann filtriert, worauf der Kohlerückstand noch einmal in gleicher Weise extrahiert wird.
Die Eluate enthalten die gesamte antibiotische Aktivität.
Beispiel 3 : 31 eines gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden durch Zugabe von ver- dünnter Natronlauge auf PH 7, 5 gebracht und dann sofort mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 0,5 l pro Stunde auf eire Säule von Amberlite IRC-50 (H-Form) gebracht, deren Länge bzw. Durchmesser 30 cm bzw. 5 cm beträgt. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Die Säule wird mit 3 1 Wasser gewaschen. Zur Elution verwendet man 11 l 4n-Salzsäure. Die ersten 500 cm3 des Eluates sind antibiotisch unwirksam, während die zweiten 500 cm3 die gesamte Aktivität enthalten. Dieses aktive Eluat wird zur Entfernung der überschüssigen Salzsäure durch eine Säule von Amberlite IR-4B perkoliert.
Durch Gefriertrocknung des Perkolates erhält man das angereicherte Antibiotikum Pilosomycin in Form eines hochwirksamen amorphen Pulvers.
Beispiel 4 : 61 eines gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf PH 7,5 gebracht und dann sofort durch eine Säule von Asmit 173 perkoliert, die 14 cm lang ist und einen Durchmesser von 4,5 cm hat. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Man wäscht das Adsorberharz hierauf mit 51 Wasser und eluiert das Antibiotikum mit 11 einer Mischung von Methanol und ln-Essigsäure (1 : 1). Das Eluat, das die gesamte Aktivität enthält, wird im Va-
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aufentzogen werden. Die Chloroformphase wird nun mit 300 + zweimal 100 cm3 1/lOn-Salzsäuie extrahiert.
Der tiefrot gefärbte Säureextrakt, der das Antibiotikum enthält, wird mit Kaliumbicarbonat auf PH 3,5 gebracht und mit vier 50 cm3-Portionen Phenol-Chloroformgemisch (100 g : 100 cm3) zurückextrahiert.
Man filtriert den Phenol-Chloroformextrakt durch Celite. Das klare, rotgefärbte Filtrat (200 cm3) wird unter starkem schütteln mit 50 cm3 Wasser, 500 cms Äther und 300 cm3 Petroläther versetzt. Nach dem
Abtrennen der wässerigen Phase wird die organische Phase mit zweimal 50 cm3 Wasser nachgewaschen.
Die vereinigten wässerigen Extrakte werden zweimal mit 500 cm3 Äther und einmal mit 500 cm3 Benzol ausgeschüttelt und hierauf lyophilisiert. Man erhält 2, 60 g eines antibiotisch hochwirksamen, orangebraun gefärbten Pulvers. Dieses Material zeigt in bezug auf das Ausgangsmaterial eine 500- bis 1000fache spezifischeantibiotischeAktivität (AktivitätproGewichtseinheitTrockensubstanz). AufWhatman Nr. 1-Pa- pier zeigt dieses Material im System n-Butanol : n-Butylacetat : Eisessig : Wasser = 10 : 3 : 1, 3 : 14, 3 bei der autobiographischen Entwicklung mit Staphylococcus aureus 2 Substanzflecken. Die langsamer wandernde antibiotische Substanz wird als Base A, die 2,5mal schneller wandernde Substanz als Base B bezeichnet.
Die Base A gibt auf dem Papier beim Besprühen mit fecal + KFeCN eine blaue Farbreaktion.
B eis piel 8 : 338 g eines nach Beispiel 6 erhaltenen Antibiotikumpräparates werden in 1, 5 1 Was- ser gelöst. Man setzt 150 g kristallines Ammoniumsulfat zu und extrahiert die Lösung mit 1 1 + zweimal
500 cm3 eines Phenol-Chloroformgemisches, das 100 g Phenol in 100 cm3 Chloroform enthält. Die ver- einigten Phenol-Chloroformextrakte werden mit 750 cms 1n-Salzsäure ausgeschüttelt und hierauf durch eine Schicht von Celite filtriert. Das klare rotbraune Filtrat wird unter Rühren mit 600 cm3 Wasser, 4 1 Äther und schliesslich 4 1 Petroläther versetzt. Die wässerige Phase wird abgetrennt und die organische
Phase mit zweimal 200 cm3Wasser nachextrahiert. Die vereinigten wässerigen Phasen (l l) werden zweimal mit 1 1 Äther gewaschen und hierauf lyophilisiert.
Man erhält 136 g eines braunen Pulvers, das in bezug auf das Ausgangsmaterial eine um den Faktor 2 erhöhte spezifische antibiotische Aktivität aufweist.
Beispiel 9 : 550 mg eines nach Beispiel 11 erhaltenen, stark aktiven Antibiotikumpräparates (Base A) werden in 55 cms eines 1/10n-Ammoniumacetatpuffers von PH 4, 60 gelöst und mit viermal20 cm3 eines Phenol-Chloroformgemisches, das ioo g Phenol in 400 ems Chloroform enthält, extrahiert. Die organischen Extrakte werden mit zweimal 15 cm Pufferlösung zurückgewaschen. Der das Antibiotikum enthaltende organische Extrakt (80 cms) wird mit 40 cm3 Chloroform verdünnt, noch einmal mit 60 cm3 Pufferlösung gewaschen und hierauf durch ein doppeltes Faltenfilter filtriert.
Das tiefrot gefärbte Filtrat extrahiert man mit 30 + 20 + 10 em3 0, 2n-Salzsäure. Die das Antibiotikum enthaltende Säurelösung wird mit 50 em3 Wasser verdünnt und mit einem Phenol-Chloroformgemisch, das 100 g Phenol in 100 cm3 Chloroform enthält, erschöpfend extrahiert (zweimal 20 + 10 ems). Die vereinigten Phenol-Chloroformextrakte werden durch ein doppeltes Faltenfilter filtriert und mit 20 cm3 Wasser, 200 cm3 Äther und 100 cm3 Petroläther geschüttelt. Nach dem Abtrennen der wässerigen Phase wird die organische Phase mit zweimal 15 cm3 Wasser nachextrahiert. Die vereinigten wässerigen Extrakte werden zweimal mit 50 em3 Äther und einmal mit 50 cm3 Benzol gewaschen und hierauf lyophilisiert.
Man erhält 117 mg-eines braunroten Pulvers, das in bezug auf das Ausgangsmaterial eine annähernde fünffache Anreicherung der antibiotischen Aktivität aufweist.
Beispiel 10: 700 mg eines nach Beispiel 7 erhaltenen Antibiotikumpräparates werden an 127 g Whatman Nr. 1 Cellulosepulver chromatographiert. Als Elutionsmittel verwendet man die obere Phase eines Gemisches von 4 Teilen Butanol, 1 Teil Eisessig und 5 Teilen Wasser. Der abgetrennten oberen Phase werden 10 Vol.-% reines Butanol zugesetzt. Die Substanz wird mit der zehnfachen Menge Cellulosepulver verrieben und als Pulver auf die Säule aufgetragen. Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 15 - 20 cm3/Stunde. Es werden Fraktionen zu 40 cm aufgefangen. Die einzelnen Fraktionen werden mit 50 cm Petroläther geschüttelt. Die ausgeschiedene wässerige Phase wird mit Benzol gewaschen und lyophilisiert.
Die Hauptmenge der antibiotisch wirksamen Substanz befindet sich in den Fraktionen 7 - 8 (121 mg) und 10 - 13 (142 mg). Gemäss papierchromatographischen Untersuchungen enthalten die Frak- tionen 7-8 vorwiegend Base B, die Fraktionen 10 - 13 vorwiegend Base A.
B eis piel 11 : 3 g eines nach Beispiel 8 erhaltenen Antibiotikumpräparates werden in einer Craig' schen Verteilungsapparatur im System sek.Butanol-0,1n-Ammonacetatpuffer PH 4. 68 über 100 Stufen verteilt. Jede Einheit enthält je 100 cm3 obere und untere Phase. Die Substanz wird in die Einheit Nr. 3 eingefüllt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Versetzen des Gemisches der beiden Phasen mit dem doppel- ten Volumen Petroläther und Lyophilisation der wässerigen Phase. Die dunkel gefärbten Fraktionen 3 - 11 enthalten nur wenig antibiotisch wirksame Substanz. Die orangegelbgefärbten Fraktionen 12-20 (631 mg) enthalten den Hauptteil der antibiotisch wirksamen Substanz (vorwiegend Base A).
Die gelb gefärbten Fraktionen 21-40 sind schwächer aktiv und enthalten ein Gemisch von Base A und B, in dem die letztere überwiegt.
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Beispiel 12 : 200 mg eines nach Beispiel 10 erhaltenen Antibiotikumpräparates (Base A) werden in einer Craig'schen Verteilungsapparatur im System 1/20n-Ammoniumacetatpuffer PH 4, 58-10 Phenol in Chloroform über 29 Stufen verteilt. Jede Stufe enthält je 10 cm3 obere und untere Phase. Die Hauptmenge der antibiotisch wirksamen Substanz befindet sich in den Fraktionen 6-15. Diese werden vereinigt (zirka 200 cm3), mit 400 ems Äther und 300 cm3 Petroläther versetzt und geschüttelt. Die abgetrennte, orangerot gefärbte wässerige Phase wird mit Chloroform gewaschen und mit 20 + dreimal 10 cms eines Gemisches von 100 g Phenol in 100 cm Chloroform extrahiert.
Den Phenol-Chloroformextrakt versetzt man unter Schütteln mit 20 cm Wasser, 200 cm3 Äther und 200 cm3 Petroläther. Die rotgefärbte wässerige Phase wird abgetrennt, mit viel Äther und Benzol gewaschen und lyophilisiert. Man erhält 86. 4 mg der Base A in Form eines gelben wasserlöslichen Pulvers. Ultraviolett-Spektrum in Wasser :
EMI9.1
EMI9.2
mti (ENinhydrin : schwach positiv.
Negativ : Sakaguchi, Maltol, Elson-Morgan.
Die Substanz enthält neben Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff auch Eisen.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Pilosomycin, seiner Komponenten, Salze und Derivate durch aerobe Züchtung von Streptomyces-Stämmen in einer wässerigen Nährlösung, die assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen, anorganische Salze sowie allenfalls wachstumsfördernde Stoffe enthält, und anschliessende Isolierung der antibiotisch wirksamen Substanzen nach an sich bekannten Methoden, Aufteilung in Komponenten und Überführung in therapeutisch verwendbare Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces S. galilaeus n. sp.
NRRL 2722 oder eine Mutante dieses Stammes, vorzugsweise submers, während 36 - 120 Stunden bei einer Temperatur zwischen 18 und 40OC, vorzugsweise bei 27oC, züchtet, das Antibiotikum Pilosomycin aus dem Kulturfiltrat abtrennt, weiter reinigt, gegebenenfalls in seine Komponenten aufteilt und, wenn erwünscht, Salze oder Derivate dieser Verbindungen herstellt.