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Anthracyclingcoside, \'erfahren zu ihrer Her-
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stellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel Die Erfindung
betrifft neue Anthracyclin-Antibiotika mit Antitumorwirkung, Verfahren zu ihrer
Herstellung und Gewinnung, pharmazeutische Mittel, die diese Verbindungen enthalten
und die Verwendung dieser Antibiotika als antibakterielle Mittel und als Antitumor-Arzneimittel.
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Die Erfindung betrifft insbesondere Anthracyclinglycosid-Antibiotika,
die hier als Rhodirubin A und B bezeichnet werden.
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Diese Antibiotika erhält man durch Kultivierung eines Rhodirubinerzeugenden
Streptomyces-Stammes in einem wäßrigen Nährmedium
unter submersen
aeroben Bedingungen bis eine wesentliche Menge Rhodirubin durc diesen Mikroorganismus
in dem Kulturmedium gebildet worden ist. Gegebenenfalls wird dann das Rhodirubin
aus dem Kulturmedium gewonnen. Rhodirubin A und B können aus dem Kulturmedium gewonnen
und abgetrennt werden, z.B. durch Extraktion der Kulturbrühe, mit oder ohne vorherige
Abtrennung des Mycels, oder durch Extraktion aus dem Mycel und anschließende Trennung
und Reinigung der einzelnen hntibiotika nach Standardverfahren, die für die Isolierung
und Reinigung anderer wasserunlöslicher Antibiotika verwendet werden. Zur Erfindet
gehören Rhodirubin A und a in Form der festen Rohprodukte, in Form der gereinigten
Festsubstanzen und in Form ihrer Salze mit organischen oder anorganischen Säuren
sowie ihre DNA-Komplexe.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen Rhodirubin A und B haben die folgenden
Strukturformeln:
Rhodirubin A und
Rhodirubin B Wie bereits gesagt gehören die nicht-toxischen Säureadditionssalze
und die Komplexe dieser Verbindungen mit Desoxyribonucleinsäure zum Gegenstand der
Erfindung.
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Es wurde gefunden, daß Rhodirubin A und B sowohl antimikrobielle als
auch Antitumor-Wirksamkeit besitzen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen
insbesondere antimikrobielle
Wirksamkeit gegenüber gram-positiven
Bakterien, hemmen das Wachstum von festen und aszitischen Formen bösartiger Tumore
bei Säugetieren, z.B. Mäuseleukämie L-1210, besitzen hohe Cytotoxizität und hennen
daher das Wachstum von Säugetier-Tumorzellen in Kulturen, haben aber eine geringe
Toxizität.
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Die hier verwendete Bezeichnung Rhodirubin bezieht sich auf cas AntibioFikum,
das wenigstens eines der beiden Antibiotika Rhodiracin A oder 6 enthält.
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Die erfindunssqemäßen Verbindungen werden durch Fermentation verschiedener
Rhodirubin-erzeugender Streptomyces-Stämme erzeugt. Zu diesen Stämmen gehören mehrere
bekannte Pyrromycin-, Cinerubin-, Aclacinomycin- und Galirubin-erzeugende Stämme,
wie Streptomyces galilaeus MA 144-M (ATCC 31133, FERM P-2455), Streptomyces galilaeus
(ATCC 14969), Streptomyces cinereoruber (ATCC 19740), Streptomyces antibioticus
(ATCC 8663), StreptomycPs p!rpurasceus (ATCC 25489) und Streptomyces niveoruber
(hTCC 14971).
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Ein bevorzugter Rhodirubin-erzeugender Streptomyces-Stamm ist von
den Erfindern der vorliegenden Anmeldung aus einer Bodenprobe isoliert wcrden, die
auf dem Grundstück des Institutes of Microbial Chemistry von Osaki, Shinagawa-ku,
Tokio, Japan genommen wurde und Kulturen dieses Stammes mit der Stammbezeichnung
ME 05-HEI sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland und
im Fermentation Research Institute, Japan, hinterlegt worden und in deren ständige
Mikroorganismensamnlung als ATCC 31273 bzw. FERM P-3667 aufgenommen worden.
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Beim derzeitigen Stand der Untersuchungen läßt sich der Stamm Nr.
ME 505-HEI wie folgt charakterisieren: Unter dem Mikroskop hat das Luftmycel keirie
wirtelig angeordnete bzw. quirlsthndige
Verzweigungen und keine
Spiralstruktur. Das Wachstum auf den verschiedenen Medien ist farblos, bla!) rötlich
braun bis dunkel-.
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bräunlich purpurfarben und Luftmycel wird nicht gebildet oder nur
schwach gebildet mit weißer bis rosa-weiser Farbe. Schwach rotes, lösliches Pigment
wird in geringem Umfange gebildet.
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Die Melaninbildung ist positiv. Aufgrund der obigen Charakterist;i
ka gehört der Stamm M# 505-HEI zum Genus Streptomyces.
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Da Streptomyces sich leicht auf natürliche oder künstliche Weise mutieren
läßt, umfaßt StreDtomyces ME 505-HEI und die anderen Rhodirubin-erzeugenden Streptomycesarten
der vorliegenden Erfindung die ozen beschriebenen typischen Stämme und alle natürlichen
und künstl-chen Rhodirubin-erzeugenden Varianten und Mutanten dieser Stämme.
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Die Erzeugung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt durch Kultivierung
eines Rhodirubin-erzeugenden Streptomyces-Stammes in einem üblichen wäßrigen Nährmedium,
das bekannte Nährstoffquellen für Actinomyceten enthält, nämlich assimilierbare
Quellen fr Kohlenstoff und Stickstoff plus gegebenenfalls anorganische Salze und
andere bekannte Wachstumsfaktoren. Man verwendet vorzugsweise submerse aerobe Kulturen
für die Erzeugung großer Antibiotikamengen, für die Erzeugung begrenzter Mengen
können natürlich auch Oberflächenkulturen und Flaschenkulturen verwendet werden.
Geeignet sind Medien, die aus bekannten Arten von Nährstoffquellen für Actinomyceten
bestehen und es können die allgemeinen Verfahren fUr die Kultivierung anderer Actinomyceten
im Rahmen der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Das Medium enthält vorzugsweise
handelsübliche Produkte, wie Glukose, Glycerin, Stärke, Dextrin, , Saccharose, Maltose
und dergleichen als Kohlenstoffquelle, ! wobei andere Kohlenhydrate, Alkohole, organische
Säuren, öle und Fette, entweder im gereinigten oder rohen Zustand für diese; Zwecke
verwendbar sind, je nach der Assimilierbarkeit des
Stammes. Handelsübliche
Produkte, wie Sojabohnenmehl , Baumwollsame"mehl, Fleischextrakte, Peptone, getrocknete
Hefe, Hefeextrakte, Maiswasser und dergleichen werden vorzugsweise als organische
Stickstofquellen verwendet und anorganische Salze, wie (NH4)2504, NaN03, NH4C1 und
dergleichen benutzt man als anorganische Stickstoffquellen. Falls erforderlich kann
man auch anorganische Salze, wie Chloride (NaCl oder KCl) oder Phosphate, Spurenmetalle
(z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen nd dergleichen) odrr Entschäumer, wie
Adekanol (Warenzeichen der Asahi Denka Ind. Co.), Silikon (Warenzeichen der Shinetsu
Chem. Ind. Co.), flüssiges Paraffin, Sojabohnenöl oder Fett zugeben. Die Temperatur
der Kultur sollte im Bereich von etwa 200C bis 37°C. vorzugsweise bei etwa 25 0C
bis 300C, liegen. Der p: des Kulturmediums liegt üblicherweise im Bereich von etwa
5 bis 8. Die Rhodirubin-Erzeugung der Kulturbrühe erreicht gewöhnlich etwa 3 bis
7 Tage nach dem Animpfen ein Maximum.
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Für die isolierung aus dem Fermentationsmedium und die Reinigung der
Rhodirubinverbindungen kann man die verschiedensten bekannten Verfahren verwenden,
z.B. Extraktion mit Lösungsmittel, Ausfällung mit Lösungsmittel, Einengung, Gelfiltration,
Gegenstromverteilunc, Chelierung mit Metallionen, Adsorption und anschließendes
Eiuieren aus einem Ionenaustauscherharz, einem adsorbierenden Kiesel erdemateri
al oder einem synthetischen Adsorptionsmittel, oder man kombiniert verschiedene
der oben beschriebenen Verfahren.
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Ein bevorzugtes Gewinnungsverfahren bedient sich der Extraktion von
Rhodirubin A und B aus dem Kulturmedium mit Lösungsmittel. Die Rhodirubin-Antibiotika
existieren sowohl intrazellulär als auch extrazellulär, man findet sie jedoch hauptsächlich
im Mycel. en trennt daher vorteilhafterweise zuerst das Mycel vom Filtrat der Kulturbrühe
in an sich bekannter Weise,
z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren,
ab. Die Antibiotika können jedoch auch direkt aus der Kulturbrühe - ohne vorherige
Abtrennung des Mycels - extrahiert werden, z.B. mit Hilfe der unten diskutierten
Verfahren. Rhodirubin A und B können aus dem Filtrat bei neutralem oder schwach
basischem pH (z.B. pH 7 bis 9) mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen
Lösungsmittel, z.B. Athylacetat, Butylacetat, Chloroform, n-Butanol, etc. extrahiert
werden. Rhodirubin A und B im Mycel können mit einem organischen Lösungsmittel,
wie Chloroform, Athylacetat, n-Butanol, Methanol, Aceton oder Methyl-äthylketon
oder mit einer wäßrigen Lösung einer organischen oder anorganischen Säure, z.B.
Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure, extrahiert werden. Die aktiven r;hodirubin-Extrakte
werden dann eingeengt und im Vakuum getrocknet, dabei erhält man ein rötliches oder
rötlich-purDurfarbenes Pulver, das ein Gemisch aus rohem Rhodirubin A und B ist.
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Die Abtrennung der einzelnen Rhodirubin A und B-Komponenten aus dem
rohen Gemisch erfolgt mit hilfe von weiteren Reinigungs-und Trennungstechniken,
z.B. mit Hilfe von Säulenchromatographie, mit Adsorbentien, wie Silikagel, modifizierten
Dextranen (z.B.
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Sephadex LH-20 - Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals, Sweden),
mit schwach sauren Ionenaustauscherharzen, Aktivkohle oder Aluminiumoxyd, durch
Gegenstromverteilung oder Flüssigkeitschromatographie mit geeigneten organischen
Lösungsmitteln.
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Ein geeignetes Trennverfahren ist z.B. folgendes: Rohes Rhodirubinpulver
(ein Gemisch der Komponenten A und B) kann in Toluol/Methanol gelöst werden, an
Silikagel in einer Säule chromatographiert werden und mit einem geeigneten organischen
Lösungsmittel, wie Toluol/Methanol eluiert werden, dabei erhält man die einzelnen
Rhodirubin-Komponenten A und B. Die aktiven Eluate, die das Rhodirubin A und B enthalten,
werden unter vermindertem Druck eingeengt, dann werden die einzelnen Komponenten
durch Chromatographie an Sephadex LH-20 weiter gereinigt.
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Die Lösungen von gereinigtem Rhodirubin A und B können auch nach Zugabe
von einer oder mehreren Substanzen, wie Deoxyribonucleinsäure, Glycerin, Zuckern,
Aminosäuren und organischen oder anorganischen Säuren, lyophilisiert werden.
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Die physikochemischen Eigenschaften von Rhodirubin A und B sind folgende:
Rhodirubin A: Rotes Pulver mit einem Schmelzpunkt von 141 bis 143 0C.
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Elementaranalyse (C42H55NO16): C H O N ber.: 60,77 6,68 30,81 1,69
% gen. : 60,39 6,63 30,72 1,71 % Molekulargewicht: 829,9 Spezifische Drehung: [α]
2D0 + 120 (C = 0,1, CHCl3) Löslichkeit: Rhodirubin A ist löslich in Methanol, n-Butanol,
Aceton, Athylacetat, Chloroform, Toluol, Benzol und Dimethylsulfoxyd, unlöslich
in Wasser, n-Hexan und Petroläther und schwach löslich in Diäthyläther.
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Farbe und Reaktion: Die Methanollö.uns von Rhodirubin A ist rot gefärbt,
verfärbt sich jedoch im alkalischen Zustand nach rötlich-purpurfarben. Die Ninhydrin-Reaktion
ist negativ, Fehling'sche Lösung wird nicht reduziert.
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Absorptionsspektrum: UV und sichtbarer Bereich: Absorptionsmaxima
bei 235 nm, E1cm1% = 507; 258 nm, E1cm1% = 267; 295 nm, E1cm1% = 100; 457 nm, E1cm1%
= 127; 490 nm, E1cm1% = 153; 510 nm, E1cm1% = 117; 522 nm, E1cm1% = 100 (in Methanol
bei einer Konzentration von 15 mcg./ml) Absorptionsspektrum: Infrarot Das IR-Spektrum
in KBr zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen in cm ¹: 3430, 2950, 2930, 2810,
2750, 1735, 1640, 1600, 1450, 1320, 1300, 1220, 1160, 1120, 1040, 1003, 970, 960,
920, 800 und 760.
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NMR-Spektrum: Das PMR-Spektrum von Rhodirubin A in CDCl3 (100 MHz)
zeigt die folgenden chemischen Verschiebungen (ppm): 7,6, s; 7,24, s; 5,50, m; 5,62,
m; 5,02, m; 4,84, m; 4,52, q; 4,7~3,90, überlagert m; 3,72 s; 3,60~0,09, überlagert
m und 2,18.
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Rhodirubin B: Rotes Pulver mit einem Schmelzpunkt von 135 bis 137°C.
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Elementaranalyse (C42H55N015): C H O N ber.: 61,99 6,77 29,52 1,72
% gef.: 61,23 6,80 28,77 1,94 % Molekulargewicht = 813,9; Spezifische Drehung: [α]D20
+ 190 (C = 0,1, CHCl3)
Löslicnkeit: Rhodirubin 3 ist löslich in
Methanol, n-Butanol, Aceton, Chloroform, .thylacetat, Toluol, Benzol und Dimethylsu,foxyd,
unlöslich in Wasser, Petroläther und n-Hexan und schwach löslich in Diäthyläther.
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Farbe und Reaktion: Die Methanol lösung von Rhodirubin B ist rot gefärbt,
im alkalischen Zustand verfärbt sie sich jedoch nach rötlich-purpurfarben. Die Ninhydrin-Reaktion
ist negativ und Fehling'sche Losung -rd nicht reduziert.
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Absorptionsspektrum: UV und sichtbares Spektrum, Absorptionsmaxima
findet man bei: 235 nm, E1cm1% = 593; 257 nrn, E1cm1% = 307; 295 nm, E1cm1% = 113;
457 nm, E1cm1% = 153; 490 nm, E1cm1% = 187; 510 nm, E1cm1% = 147; 522 nm, E1cm1%
= 120 Absorptionsspektrum: Infrarot Das IR-Spektrum in KBr zeigt Peaks bei den folgenden
Wellenlängen in cm 3470, 2960, 2940, 2820, 2790, 1740, 1640, 1600, 1450, 1300, 1220,
1160, 1120, 1040, 1000, 980, 960, 920, 800, 790 und 760.
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NMR: Das PMR-Spektrum von Rhodirubin B in CDC13 (100 MHz) zeigt die
folgenden chemischen Verschiebungen (ppm): 7,6, s; 7,24, s; 5,50, m; 5,02, m; 4,84,
m; 4,52, q; 4,7~3,90, überlagert m; 3,72, s; 3,6-0,09, überlagert m und 2,18, s.
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Rhodirubin A und B haben die folgenden Rf-Werte auf Silikagel-Dünnschichtchromatogrammen
bei Verwendung der angegebenen Lösungsmittelsysteme: Rf-Werte Lösungsmittelsystem
Rhodirubin A Rhodirubin 8 Äthylacetat:Benzol:Methanol (5:5:1) (v/v) 0,37 0,42 Chloroform:Methanol
(10:1) (v/v) 0,19 0,28 Chloroform:Methanol (60:1) (v/v) 0,17 0,20 Die Strukturen
von Rhodirubin A und B wurden wie folgt bestimmt: Aglykone von Rhodirubin A und
B erhielt man durch saure Hydrolyse mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure (0,1n)
bei 85°C und 30 Minuten Dauer. Die physikochemischen Eigenschaften, z.B.
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die IR, UV und NMR-Spektren, der Schmelzpunkt und die Rf-ilerte der
Dünnschichtchromatogramme der erhaltenen Aglykone stimmten vollständig mit denjenigen
von #-Pyrromycinon überein, das in der Literatur beschrieben ist [Chem.Ber., 92,
1904 (1959)].
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Nach Neutralisierung und Konzentrierung der wäßrigen Schicht der Rhodirubin
A und B-Hydrolysate wurde der Zuckerteil entwickelt und dünnschichtchromatographisch
abgetrennt (Silikagel TLC, Merck F254; Lösungsmittel:Butanol:Essigsäure:Wasser =
4:1:1) (Vol./Vol.). Drei Zuckerreste (Rf = 0,14:0,53:0,67) wurden aus Rhodirubin
A erhalten und zwei Zuckerreste (Rf = 0,14:0,67) aus Rhodirubin B. Durch Vergleich
dieser Zucker mit den aus Aglacinomycin fJ.Antibiotics, 28, 830 bis 834 (1975)j
und Streptolydizin [J.Am.Chem.Soc., 86, 3592 bis 3594 (1954)7, erhaltenen Zuckern
anhand der verschiedenen Farbreaktionen [Pharmazie, 27, H12, 782 bis 789 (1972)j,
der spezifischen
Drehung und dem NMR-Spektrum wurden die Zucker
mit Rf-Werten von 0,14, 0,53 und 0,67 als Rhodosamin, 2-Desoxyfucose bzw. Rhodinose
identifiziert.
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Methanolyse von Rhodirubin A oder B ergab Pyrromycin (Rhodosaminyl-e-pyrromycinon).
Außerdem wurce aus Rhodirub,n A oder B durch milde Hydrolyse (0,5 % HCl, 200C, 10
Minuten) Rhodinose freigesetzt, gemäß dem in tQaturwissenschaften, 50, 43 bis 44
(1963) beschriebenen Verfahren.
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Aufgrund der oben beschriebenen Ergebnisse wurden folgende Strukturformeln
für die erfindungsgemäßen Rhodirubin-Verbindungen A und 8 ermittelt:
worin R die beiden folgenden Bedeutungen hat:
| BeiRhodirubin A steht Bei Rhodirubin B steht |
| R für: R für: |
| Pol. |
| 1':cH3 o N-CH |
| t;P\ cH3 C1H33 |
| ÖwH ÜcÜ |
Von den in der Literatur beschriebenen Anthracyclin-Antibiotika ist bekannt, daß
Cinerubin, Aclacinomycin, Violamycin und Rhodomycin aus einem Aglykon und drei Zuckerresten
bestehen. I Ihre Bestandteile sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:
| Antibiotika Aglykon Verknüpfungs- Erster Zweiter Dritter |
| stelle von Zucker Zucker Zucker |
| Zucker und Aglykon |
| Cinerubin A E-Pyrromycinon 7 Rhodosamin 2-Deoxy- Cinerulose |
| fucose |
| Aclacino- Alkavinon 7 Rhodosamin " " |
| mycn A |
| Violamycin verschiedene unbekannt Rhodosamin " Rhodonose |
| Rhodomycinone |
| Rhodomycin X - Rhodomycinon 9- oder 10- Rhodosamin " " |
| - Rhodomycinon |
| 10-Deoxy-r- |
| rhodomycinon |
Man sieht, daß die Rhodirubin-Antibiotika sich leicht von den
obigen Anthracyclinen unterscheiden lassen.
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Rhodirubin A und B besitzen antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber
zahlreichen Mikroorganismen. Die minimalen Hemmkonzentrationen von Rhodirubin A
und B, bestimmt mit Hilfe der methode, sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt:
Minimale Hemmkonzentrationen von Rhodirubin A und B
| MIC (mcg./ml) |
| Testmikroorganismus |
| Rhodirubin A Rhodirubin B |
| Staph. aureus FDA 209P 1.56 1.56 |
| Staph aureus Smith 0.4 0.78 |
| B. subtilis ATCC 6633 0.78 1.56 |
| B. cereus ATCC 9634 0.2 0.4 |
| B. megaterium NRRL-938 0.78 1.56 |
| Sarcina lutea ATCC 9341 0.4 0.78 |
| Micrococcus flavus 0.2 0.2 |
| Coryne. bovis 0.2 0.4 |
| Ps. fluorescens NIHJB-254 100 100 |
| Proteus morgenii >100 >100 |
| Mycobacterium smegmatis ATCC 607 6.25 3.1 |
| Candida albicaris IAM 4905 | > 100 >100 |
| Candida troptcalis IAM 4942 >100 >100 |
Wie oben gezeigt, besitzen Rhodirubin A und B antimikrobielle
Wirksamkeit insbesondere gegenüber gram-positiven Bakterien.
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Sie sind daher therapeutisch brauchbar für die Behandlung von Lebewesen,
einschließlich Menschen, bei infektiösen Erkrankungen, die durch derartige Mikroorganismen
verursacht sind.
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Im Tierversuch haben Rhodirubin A und B eine ausgeprägte Antitumor-Wirksamkeit
bei niedriger Toxizität gezeigt. Sie eignen sich daher für die Therapie und Hemmung
des Wachstums von Säugetier-Tumoren. Rhodirubin A und B besitzen insbesondere eine
ausgeprägte Hemmwirkung gegenüber Mäuse L1210-Leukämie.
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Beispielsweise wurden CDF1-Mäuse intraperitoneal mit 1 x 10 L1210-Zellen/Maus
beimpft, dann wurden 0,1 bis 0,2 ml Wirkstofflösung intraperitoneal an 10 aufeinanderfolgenden
Tagen verabreicht. Die Tiere wurden 30 Tage lang beobachtet, Die prozentuale Verlängerung
der Oberlebenszeit im Vergleich zu den Kontrollmëusen, denen intraperitoneal physiologische
Kochsalzlösung verabreicht worden war, ist aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich:
Verlängerung der Oberlebenszeit T/C (%) Dosis Rhodirubin A Rhodirubin B (mglglTag)
(HCl-Salz) (HCl-Salz) 10 87 104 8,5 121 160 5 195 179 2,5 167 215 1,25 117 126 0,6
102 107
Akute Toxizität: Rhodirubin A und B haben folgende LD50-Werte,
ermitelt bei Mäusen bei intraperitonealer Injektion: LD50 (mg/kg) Rhodirubin A 7,5
- 10 Rhodirubin B 10 - 12,5 Wie bereits gesagt sind die erfindunqsgemäßen Verbindungen,
Rhodirubin A und B, neue Antibiotika, die sich sowohl für die Humanmedizin als auch
für die Veterinärmedizin eignen. Sie sind Arzneimittel mit Antitumor-Wirkung, die
ausgeprägte Hemmwirkung gegenüber bösartigen Säugetier-Tumoren, einschließlich aszitischen
und festen Arten, besitzen.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen bilden nicht-toxische Säureadditionssalze
mit einer Vielzahl organischer und anorganischer salzbildender Reagentien und sie
bilden nicht-toxische Komplexe mit Desoxyribonucleinsäure. Man kann daher Säureadditionssalze,
die mit derartigen pharmazeutisch verträglichen Säuren gebildet worden sind, z.B.
mit Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Propionsäure,
Ulsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Glutaminsäure,
Pantothensäure etc. und nicht-toxische Komplexe mit Desoxyribonucleinsäure in gleicher
Weise verwenden wie die Rhodirubin-Verbindungen selbst. Die Salze werden nach den
allgemein für die Salzbildung von Antibiotika benutzten Verfahren hergestellt, isoliert,
gereinigt und formuliert. Im Falle der DNA-Komplexe, kann aus Tieren und Mikroorganismen,
wie Kalbsthymus, Hela-Zellen, Human- und Tier-Embryozellen, Hefen, etc. extrahierte
DNA verwendet werden. Die Herstellung von Rhodirubin-DNA-
Komplexen
kann nach den in der Literatur zur Herstellung von DNA-Komplexen anderer Anthracvclin-Antibiotika,
wie Adriamycin,| Daunorubicin, etc.[vgl. z.B. Natur, New Biol., 239, 110 (1973)
und Europ.J.Cancer, 10, 399 (1974)i beschriebenen Verfahren erfolgen. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung sind Rhodirubin-Verbindungen in Form ihrer freien Base,
ihren nicht-toxischen Säureadditionssalzen und DNA-Konplexen äquivalenz.
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Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur therapeutischen
Behandlung eines Säugetieres, das unter einer Infektion durch gram-positive Bakterien
leidet oder von einem bösartigen Tumor befallen ist (nämlich einem festen oder aszitischen
Tumortyp, wie L1210-Leukämie), wobei man dem befallenen Lebewesen eine wirksame
antibakterielle oder tumorhemmende Rhodirubin A oder B-Dosis oder ein Gemisch der
beiden oder ein niht-toxisches Säureadditionssalz oder einen DNA-Komplex dieser
Verbindungen verabreicht.
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Weiterhin betrifft die Erfindung pharmazeutische Mittel, die eine
antibakteriell wirksame oder tumorhemmende Menge Rhodirubin A oder B oder ein Gemisch
dieser beiden, oder ein nichttoxisches Säureadditionssalz oder einen DNA-Komplex
dieser Verbindungen in Kombination mit einem inerten pharmazeutisch verträglichen
Träger oder Verdünnungsrnittel enthalten. Diese Mittel können in beliebige pharmazeutische
Formen gebracht werden, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind.
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Erfindungsgemäße Präparate für die parenterale Verabreichung sind
z.B. sterile wäßrige oder nicht wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen.
Sie können auch in Form von sterilen festen Mitteln vorliegen, die in sterilem Wasser,
physiologischer Salzlösung oder anderen sterilen injizierbarzn Medien unmittelbar
vor der Verwendung aufgelöst werden können.
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Es ist klar, daß die tatsächlich bevorzugten Mengen an verwendetem
Rhodirubin-Antibiotikum je nach der speziell verwendeten Verbindung, dem speziellen
Präparat, der Art der Verabreichung und der besonderen Lage sowie in Abhängigkeit
von dem zu behandelnden Patienten und dem zu behandelnden Leiden variiert werden.
Im allgemeinen werden die Rhodirubin-Antibiotika intraperitoneal, intravenös, subkutan
oder lokal Tieren injiziert und beim Menschen intravenös oder lokal injiziert. Viele
die Wirkung des Arzneimittels modifizierende Faktoren werden vom Fachmann berücksichtigt,
z.B. das Alter, Körpergewicht, Geschlecht, die Ernährung, die Zeit der Verabeichung,
die Art der Verabreichung, die Ausscheidungsrate, der Zustand des Patienten, Arzneimittelkombinationen,
Reaktions-Empfindlichkeiten und die schwere des Leidens. Die Verabreichung kann
kontinuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis erfolgen.
Der Fachmann kann die optimalen Anwendungsmengen für vorbegebene Bedingungen mit
Hilfe üblicher Dosis-Bestimmungstests und unter Berücksichtigung der obigen Richtlinien
ermitteln.
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Bei der Verwendung als anti bakterielle Mittel werden die Rhodirubin-Präparate
im allgemeinen so verabreicht, daß die Konzentration an Wirkstoff größer ist als
die minimale Hemmkonzentration für den speziellen, zu behandelnden Organismus.
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Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Veranschaulichung der
Erfindung:
B e i s p i e 1 1 Man stellt ein Nährmedium folgender
Zusammensetzung her: Kartoffelstärke 1 % (Gew./Vol.%) Glucose 1 % "Prorich" (Sojabohnenpulver)
1,5 % K2HPO4 0,1 % MgSO4 . 7H2O 0,1 % NaCl 0,3 % Mineralien * 0,125 % (pH 7,4) *
Mineralienlösung folgender Zusammensetzung: CuSO4,5H20 2,8 g FeSO4.7H2O 0,4 g MnCl2.4H2O
3,2 g ZnSO4.7H2O 0,8 g in 500 1 Wasser 50 ml dieses Mediums wurden in einen 500
ml-Kolben sterilisiert, mit einer Probe aus der Agar-Schrägkultur von Streptomyces
glilaeus (ATCC 31133) angeimpft und bei 28°C 48 Stunden lang auf einer rotierenden
Schüttelvorrichtung (230 Upm) bebrütct, wobe nan die Saatkultur erhielt.
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Dann wurde cas folgende Medium hergestellt: Kartoffelstärke 2 % (Gew./Vol.%)
Glucose 2 % "Nisshin toast" (entfettete Sojabohnen) 2 Hefeextrakt 0,5 % NaCl 0,25
% CaCO3 0,3 % Mineralien 0,125 X (pH 7,4)
* Mineralienlösung bestehend
aus: CuSO4.5H2O 1,25 g MnCl2.4H2O 1,25 g ZnSO4.7H2O 1,25 g in 500 ml Wasser Zwei
ml dieser Saatkultur wurden dann zu 100 ml des zuvor sterilisierten und unmittelbar
oben beschriebenen Mediums in einen 500 ml-Kolben gegeben. Die Fermentation wurde
bi 280 C in einer rotierenden Schüttelvorrichtung (230 Upm) durchgeführt und die
Produktion an Phodirubin erreichte nach 4 Tagen ein Maximum. Die Brühe wurde filtriert,
um Mycelkuchen und Filtrat zu trennen. Zu den Filtrat gab man ein halbes Volumen
Chloroform, diese Extraktion wurde zweimal durchgeführt. Der Mycelkuchen wurde mit
Aceton Versetzt (2 Liter Aceton/1 kg feuchter Kuchen), auch diese Extraktion wurde
zwei val durchgeführt.
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Danach wurde das Aceton unter vermindertem Druck abgedampft.
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Der Rückstand wurde rdo t 1/2 Volumen. Chloroform versetzt und zweimal
extrahiert. Die erhaltenen Chloroformextrakte wurden mit den Chloroformextrakten
des Filtrates vereinigt und unter vermindertem Druck eingeangt, dabei erhielt man
eine teerartige Substanz. Diese Substanz wurde in einer kleinen Menge Äthylacetat
gelöst und durch tropfenweise Zugabe dieser Lösung zu 10 Volumina n-Hexan wurde
ein Nioderschlag gebildet (man erhielt 4,5 9 rotes rohes Pulver). Dieses rohe Pulver
wurde in 30 ml einer Mischung aus Toluol und Methanol (50:1) (Voi./Vol.) gelöst,
auf eire mit 100 9 Silikagel gefüllte Kolonne (3 x 50 cm), die mit dem gleichen
Lösungsmittelgemisch ins Gleichgewicht gebracht worden war, gegeben, dann wurden
Rhodirubin B und danach Rhodirubin A eluiert. Jedes Eluat wurde unter vermindertem
Druck getrccknet, dabei erhielt man 27 mg rohes Rhodirubin A und 60 mg rohes Rhodirubin
B.
-
B e i s p i e l 2 Rohes, in Beispiel 1 erhaltenes Rhodirubin A (27
mg) wurde an siser Dünnschichtplatte (Merck F254, Lösungsmittel: Chloroform:Methanol
- 10:1 (Vol./Vol.) chromatographiert, un Verunreinigungen, einschließlich Rhodirubin
B, zu entfernen. Nach Auflössen in 2 ml Methanol wurde die aktive Fraktion an einer
Sephadex LH-20-Kolonne (1 x 70 cm) chromatographiert. Das so erhaltene Eluat wurde
eingeengt und mit n-Hexan wurden 16,3 mg gereinigtes Rhodirubin A als rotes Pulver
ausgefällt.
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13 mg dieses roten Pulvers wurden in einem Gemisch aus 200 µl trockenem
Aceton urid 73 ul trockenem Methanol gelöst, dann wurden 10 µl einer 3n HCl-Methanollösung
zugegeben. Nach betätigem Rühren wurde durch Zugabe von 10 Volurina Tri-@@ ein Niederschlag
gebildet. Der Niederschlag wurde Ab@@twiert und getrocknet, dies engeb 7,2 mg Rhodirubin
A-HCl-Salz.
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B e i s p i e l 3 80 mn rohes, in Beispiel 1 erhaltenes Rhodirubin
B, gereinigt nach dem oben in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren, ergaben 63,4 mg
Rhodirubin 8 als rotes Pulver.
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B e i s p i e l 4 Gemäß dem gleichen allgemeinen Verfahren, wie es
oben in den Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben worden ist, wurden die folgenden Mikroorganismen
kultiviert und die Kulturen aufgearbeitet, dabei erhielt man Rhodirubin A und B
in den in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßten Ausbeuten:
| Ausbeuten an Rhodirubin |
| (mg) |
| Mikroorganismen A B |
| Streptomyces galilaeus |
| ATCC 14949 23 14 |
| Streptomyces cinereoruber |
| ATCC 19740 16 5 |
| Streptomyces purpurascens |
| ATCC 25489 11 7 |
| Streptomyces antibioticus |
| ATCC 8663 8 10 |
| Streptomyces sp. ME 505-HEI |
| ATCC 31273 21 48 |