DE2904186C2

DE2904186C2 - Anthracyclin-Glykoside, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE2904186C2
Application number: DE2904186A
Authority: DE
Inventors: Giuseppe Voghera Pavia Cassinelli; Arpad Milano Grein; Sergio Bernareggio Milano Merli; Giovanni Milano Rivola
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1978-02-09
Filing date: 1979-02-05
Publication date: 1984-09-06
Also published as: US4247545A; BE874032A; GB2016005B; NL7900869A; CH640246A5; FR2424285B1; FR2429770A1; GB2016005A; JPS54115363A; FR2429770B1; FR2424285A1; DE2904186A1

Description

11-Desoxy-adriamycin -CO-CH₂OH

11 -Desoxy- 13-dihydrodaunomycin — CHOH-CH j

11-Desoxy-daunomycin —CO—CHj

11-Desoxy-13-desoxodaunomycin -CH₂-CHi

und deren Salze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den bei »Deutsche Sammlung von Mikroorganismen« mit der Aufnahme-Nr. DSM 1190 hinterlegten Mutantenstamm Micromonospora peucetica sp. nova unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 37"C und bei einem pH-Wert von zunächst 6,5 bis 7,0, am Ende der Fermentation von 6,5 bis 8,0 kultiviert, die genannten Anthracyclin-Glykoside gewinnt und gegebenenfalls in deren Salze überführt.

3. Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine oder mehrere Verbindungen gemäß Anspruch 1 in Mischung mit üblichen Trägerstoffen.

Die Erfindung betrifft Anthracyclin-Glykoside, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.

Die neuen Anthracyclin-Glykoside zeigen Antitumor- und antibakterielle Wirksamkeit. Insbesondere sind die neuen Anthracyclin-Glykoside als Antitumormittel bei Versuchstieren verwendbar.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus wird durch mutagene Behandlung von Streptomyces peucetius var. caesius mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin erhalten (Arcamone et al., Biotechnol. Bioengen, 1969, Xl, 1101 — 1110). Dem neuen Stamm wurde die Code-Nummer B 211 F. I. der Farmitalia Collection of Microorganismen gegeben, und er wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer 1190 DSM, bei der American Type Culture Collection unter der Nummer 31 366 ATCC und beim Fermentation Research Institute (Japan) unter der Nummer 4363 FRI hinterlegt. Wie bei vielen Antibiotika produzierenden Kulturen führt die Fermentation des Stammes B 211 F. I. zur Bildung einer Mischung oder eines Komplexes aus Antibiotika. Vier bioaktive Anthracyclin-Glykosid-Verbindungen wurden vom Komplex abgetrennt.

Es wurde festgestellt, daß diese Anthracyclin-Glykoside die folgende Formel aufweisen:

OH

H₃CO 0 OH O

OH

t>

mit folgenden Bezeichnungen und Zuordnungen von R:

11-Desoxy-adriamycin -CO-CH₂OH (Glykosid 1)

11-Desoxy-13-dihydrodaunomycin -CHOH-CHs (Giykosid II)

11-Desoxy-daunomycin —CO-CHj (Glykosid III)

il-Desoxy-13-desoxodaunomycin -CH₂-CH₁ (Glykosid IV)

Die Bezeichnungen Daunomycin und Adriamycin werden hier für Daunorubicin bzw. Doxorubicin verwendet Die obigen Anthracyclin-Glykoside enthalten alle Daunosamin (3-Amino-23.6-tridesoxy-L-lyxo-hexose), die Aminozuckerkomponente von Daunomycin und Adriamycin (F. Arcamone, G. Cassinelli, P. Orezzi, G. Franceschi und R. Mondelli, J. Am. Chem. Soc. 86, 5335. 1964, und eigene US-PS 35 90 028). Die Strukturen wurden durch Analyse ihrer IR-, UV-, sichtbaren, Masse- und NMR-Spektren bestimmt und stimmen mit den im nachstehenden angegebenen chemischen und physikalischen Daten überein.

Die neuen Anthracyclin-Glykoside bilden sowohl mit Säuren als auch mit Basen Salze, und pharmazeutisch verwendbare Salze sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Beispiele derartiger pharmazeutisch verwendbarer Salze sind Salze mit Säuren, wie Salz-, Schwefel-, Stickstoff- und Phosphorsäure, und mit Metallkationen, z. B. Alkalimetall- oder Erdalkalimetallkatbnen, wie Na'rium. Kalium, Kalzium und Magnesium, und auch mit anderen Kationen, wie dreiwertigen Eisenkationen.

Mikroskopische Eigenschaften des Stammes B 211 F.!.

Die Sporen weisen folgende Größe auf: 0,9—1,1 · 1,1 —1.6 μπι. Sie werden einzeln oder sehr häufig als Paare gebildet, selten als Büscheln, endständig auf kurzen Sporophoren, die monopodial als Äste an langen, willkürlich gebildeten Hyphen mit einer Dicke von 0,5 bis 0,9 μιη entstehen. Selten werden sessile Sporen beobachtet Es werden keine polymorphen Formen gebildet. Luftmycel ist nicht vorhanden.

Makroskopische Eigenschaften des Stammes B 211 F. I.

Die Kultureigenschaften des Stammes B 211 F. I. sind in Tabelle I angegeben. Das Wachstum ist im allgemeinen auf organischen Medien gut und auf synthetischen Medien weniger gut; auf ersteren ist es im allgemeinen erhaben und gefurcht und im Aussehen feucht, aber nicht schleimig.

Die Sporulationsschichi ändert das orange-terrakotta farbene vegetative Mycel beim Altern auf braun bis fast schwarz. Im allgemeinen wird kein lösliches Pigment gebildet. Bei Temperaturen über 40⁰C wird kein Wachstum festgestellt Die physiologischen und biochemischen Eigenschaften des Stammes B 211 F. I sind in Tabelle Il angegeben.

t-1

I-; Identifizierung und Klassifizierung des Stammes B 211 F. I,

35

Der Stamm B 211 F. I. ist klar auf den Genus Micromonospora Orskov (0rskov J. »Investigations into the \',( Morphology of the Ray Fungi«, Levin und Maunksgaard, Kopenhagen, 1923, S. 171) der Reihe Actinomycetales

Iv: zurückzuführen, und zwar auf Grund seiner morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften. Jedoch

[' ermöglichte eine sorgfältige vergleichende Prüfung der von Waksman S. A. (»The Actinomycetes« Bd. 2, 1961. to

I\ Williams und Wilkins Co., Baltimore, und »The Actinomycetes a Summary of Current Knowledge« 1967, Ronald

N Press Co.), Luedemann und Brodsky (1963) und Luedemann G. (»Micromonospora Taxonomy« Advances in

ji Applied Microbiology«, 1970, 11, 101 — 133) für bekannte Arten, die diesem Genus angehören, beschriebenen

Ii und angegebenen Eigenschaften mit jenen, die der Stamm B 211 F. I. zeigt, keine Identifizierung dieses Stammes

mit irgendeiner der genannten Species, die für den obengenannten Genus angeführt sind. Wegen seiner speziellen Kohlenwasserstoffverwertung und im Hinblick auf die Tatsache, daß er neue Anthracycline produziert, kann geschlossen werden, daß der Stamm B 211 F. I. sich von allen bisher beschriebenen Species dieses Genus unterscheidet und eine neue Species ist. Der Name Micromonospora pcucetica sp. nova wurde diesem Stamm gegeben.

50

Tabelle I

Kultureigenschaften des Stammes B 211 F.l. auf verschiedenen Medien gemäß Waksman, 1961, supra,
wenn nicht anders angegeben

Medium Reaktion

Bennett's -Agar Wachstum gut, erhöht und gefurcht; orange bis terrakotta

oder korallenrot, wird bei Altern schwarz bo

Emerson's-Agar Wachstum schön, erhöht und gefurcht; durchgehend

hell-tcrrakotta, wird beim Altern braun

Glucosc-Asparagin-Agar Wachstum gut. flach; durchgehend hell-tcrrakotia

1 % NZ-Amin Typ Λ, 1 % Glucose + Agar Wachstum gut. erhöht und gefurcht; orange-terrakotta bis

(Luedemann G. M. et al. Antimicrobial hellrot, wird beim Altern braun bis schwär/

Aecnts. 1963. S. 116-124)

Fortsetzung

Medium

Reaktion

GIucose-Hefeextrakt-Agar 5

Stärke-Casein-Agar Gelatine-Agar

Tyrosin-Agar (Gordon R. D. und Smith M. L, J. Bacteriol.69,1955,S. 147-150)

H ef eextrakt- L-Tyrosin- Agar

Pepton-Eisen-Agar (Tresner H. D. und Danga F, J. Bacteriol. 76.1958, S. 239-244)

Kartoffel-Glucose-Agar

Czapeck's-Agar Glycerin-Glycin-Agar

Anorganische Salze-Stärke-Agar (Pridham T. C. et al. Antibiotics Annual 1956/1957, S. 947 -953)

Glycerin-Asparagin-Agar

S A-Agar (bezüglich Zusammensetzung siehe Aufrechterhaltungsmedium in Beispiel 1)

Wachstum schlecht, erhöht und gefurcht; durchgehend hell-tcrrakotta

Wachstum gut, flach; durchgehend terrakotta Wachstum schlecht, erhöht und gefurcht; terrakotta bis hellrot

Wachstum gut. erhöht und gefurcht: zuerst hell-terrakotta, dunkel-rötlich, wird beim Altern kupferbraun bis fast schwarz. Ein dunkelbraunes lösliches Pigment wird gebildet

Wachstum ziemlich flach; braun; ein dunkelrötliches bis kaffcbraunes lösliches Pigment wird gebildet

Wachstum gut, erhöht und gefurcht; durchgehend hell-tcrrakotla

Wachstum mäßig, erhöht und gefurcht; terrakotta bis braun, wird bei Altern fast schwarz

Wachstum gering, flach; hell-terrakotta, wird bei Altern schwarz

Wachstum mäßig, flach; zuerst farblos, wird bei Altern olivgrün bis dunkelgrün

Wachstum schön, flach; rosa bis terrakotta, wird bei Altern orangebraun

Wachstum gering, flach; hell-terrakotta, wird bei Altern fast schwarz

Wachstum gut, erhöht und gefurcht; zuerst cremefarben bis honigfarben, wird später terrakotta und bei Altern leicht bräunlich. Manchmal wird ein gelbes lösliches Pigment festgestellt, das bei Altern hellbraun wird

Tabelle II 40 Physiologische und biochemische Eigenschaften des Stammes B 211 F. I.*)

Verwertung von:

Glucose +

Saccharose +

D-Xylose +

M-Mannit +

M-Inosit +

L-Arabinose -ΙΟ-Fructose + Adonit +

Lactose +■

d( + )-Mannose +

Maltose +

Raffinose +

L-Rhamnose +

Λ-Λ-Trehalose +

Äsculin +

Glycerin +

Na-Citrat +

NHn-Succinat +

Na-Acetat +

NH^-Tartrat +

Glycogen —

Paraffin —

Tabelle II (Fortsetzung)

Negative Kontrolle:

Verflüssigung von Gelatine +

Tyrosinzersetzung +

Malaninbildung +

Stärkehydrolyse +

H₂S-Bildung -

Nitratreduktion +

Milch (Pepton und Koag.) gebildete Antibiotika: neue Anthracycline

+ = positive Reaktion. — ■= negative Reaktion.

*) das Medium für den Kohicnwasserstoffverwertungstesl wurde von R. D. Gordon und M. L Smith, supra, beschrieben; die für die anderen physiologischen Reaktionen verwendeten Medien sind von S. A. Waksman, !96!, supra, angegeben.

Fermentierungsverfahren

Die Produktion wird durch übliche, wohlbekannte Methoden durchgeführt und besteht im Kultivieren des Mikroorganismus in einem vorher sterilisierten flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37°C (vorzugsweise bei 28"C) während 5 bis 30 Tagen (vorzugsweise 15 Tagen) und bei einem pH-Wert von zunächst 6,5 bis 7,0 und am Ende der Fermentation von 6,5 bis 8,0.

Das Kulturmedium besteht aus einer Kohlenstoff- und einer Stickstoffquelle sowie aus Mineralsalzen. Die Kohlenstoffquelle kann beispielsweise Stärke, Dextrin, Glucose, Glycerin, Mannit, Maltose, Getreideweiche, Trebern. Sojabohnenöl oder Sojabohnenmehl sein. Die Stickstoffquelle kann außer den obererwähnten komplexen Substanzen, die Stickstoff enthalten, beispielsweise Trockenhefe, Fleischpepton oder Casein sein. Gute Ergebnisse werden sogar durch Verwendung von Ammoniumsalzen, wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfaten, Diammoniumphosphaten, erhalten. Die Mineralsalze variieren entsprechend dem verwendeten Medium. In einem Medium, das komplexe Substanzen, wie verschiedene Mehle und Fermentationsrückstände, enthält, hat sich der Zusatz von Calciumcarbonat und Natrium- oder Kaliumphosphaten als zweckmäßig erwiesen. In Medien, die Glucose oder Ammoniumsalze enthalten, sind wesentlich höhere Mengen an Mineralsalzen, wie Kalium-, Natrium- oder Calciumsalzen, und Zusätze von Spurenelementen, wie Eisen, Zink, Kupfer, Magnesium und Mangan, notwendig. Die Fermentation kann in Erlenmeyer-Kolben oder in Laboratoriums- oder Industriefermentern mit verschiedenem Fassungsvermögen durchgeführt werden.

35 Analytische Methoden

Proben der Fermentationsbrühen und der rohen Zubereitungen werden unter Verwendung von Whatman Nr. 1 -Papier, gepuffert mit M/15 Phosphatpuffer auf pH 5,4, einer Papierchromatographie unterworfen, wobei als Eluierungsmitte! eine Mischung von n-Propanol : Ethylacetat: Wasser (7:1 :2) verwendet wird. Die Papierstreifen werden einer Bioautographie gegen Bacillus subtilis unterworfen, und es wurde gefunden, daß vier antibiotische Substanzen auftreten. Diese werden als Glykosid I (Rf 0.30), Glykosid II (Rf 0,50), Giykosid III (Rf 0.55) und Glykosid IV (Rf 0,65) bezeichnet.

Rohe Zubereitungen werden unter Verwendung von vorher überzogenen Dünnschicht-Chromatografie-Platten aus Silikagel 60-F-254 (Merck) einer Dünnschichtchromatographie (TLC) unterworfen, wobei als Eluierungsmittel eine Mischung aus Chloroform : Methanol : Essigsäure : Wasser (80 : 20 : 14 :6) verwendet wird. Es treten vier gelbe Verbindungen auf,die Glycosid I (Rf 0,50), II (Rf 0,55), III (Rf 0,65) bzw. IV(Rf 0,70) entsprechen.

Eine quantitative Bestimmung der gesamten, in den Fermeniationsbrühen vorhandenen gelben Bestandteile kann wie folgt durchgeführt werden. Einer Probe der Brühe, auf pH 8,5 eingestellt, werden zwei Volumina Chloroform : Methanol (9 : 1) zugesetzt Die erhaltene Mischung wird 1 min bei R. T. beschallt. An einer Probe der organischen Phase, die mit saurem Methanol verdünnt ist, kann der Gesamtgehait der gelben Anthracyciine und deren Aglycone spektrophotometrisch bei 418 nm bestimmt werden. An einer Probe der organischen Phase, die unter vermindertem Druck konzentriert wurde, kann die quantitative Bestimmung der einzelnen Glycoside durch präparative TLC unter Verwendung des oben abgegebenen Systems erhalten werden. Die verschiedenen gelben Zonen werden abgekratzt und mit Methanol eluiert. Jeder Bestandteil wird spektrophotometrisch bei 418 nm bestimmt-11-Desoxy-adriamycin ist in den Fermentationsbrühen gewöhnlich der Hauptanteil.

Isolierungsverfahren

Nach der Fermentation sind die aktiven Verbindungen in den Mycelen und in der Fermentationsflüssigkeit ta enthalten. Der antibiotische Anthracyclinkomplcx kann bei pH 8,5 bis 9,0 in Form freier Basen aus der Kukurbrühe »insgesamt« mit einem mit Wasser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Butanol, Methylisobutylketon. Chloroform, Methylendichiorid oder Ethylacetat, extrahiert werden. Vorzugsweise werden die Mycelc und die Fermentationsflüssigkeit durch Filtrieren bei pH 4 mit Hilfe von Diatomeenerde getrennt und dann getrennt extrahiert.

Der Filtrationskuchen wird mit einer Mischung eines in Wasser löslichen Lösungsmittels, wie Aceton, Methanol oder einem anderen nied. Alkohol, und einer wässerigen 0,1 N Lösung einer anorganischen oder organischen Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure, extrahiert. Im allgemeinen wird eine Mischung aus Ace-

ton :0,l N Salzsäure im Verhältnis 4:1, bezogen auf das Volumen, verwendet. Die Mycclcxtrakte werden gesammelt, auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Das wässerige Konzentrat wird mit der filtrierten Hrühe vereinigt, auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,0 eingestellt und dann mit einem mit Wasser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder n-Butanol, ■> extrahiert. Die Extrakte werden unter vermindertem Druck eingeengt, und der Anthracyclinkomplex wird durch Zusetzen von 5 Volumina n-Hexan ausgefällt. Die Bestandteile des rohen Komplexes werden dann fraktioniert und durch Säulcnchromatographie gereinigt.

Reinigungsverfahren

ίο Die weitere Reinigung des antibiotischcn Komplexes und dessen Trennung in die vier Bestandteile kann durch Säulenchromatographie mit Silikagel bewirkt werden. Das rohe orangebraune Pulver wird in Chloroform gelöst und die Lösung, gemischt mit 1 Äquivalent methanolischem Chlorwasserstoff, auf Silikagel mit Mischungen aus Chloroform, Methanol und Wasser chromatografiert. 11 -Desoxy-13-desoxodaunomycin und 11 -Desoxy-daunomycin werden zuerst mit einer 94,8 :5,0 :0.2-Mischung eluicrt. li-Desoxy-13-dihydro-daunomycin und U-Desoxyadriamycin folgen mit einer 89,5 :10 :0,5-Mischung. Die Komponenten werden gewöhnlich getrennt, wie durch Papier- und Dünnschichtchromatografie gezeigt, und die vier Bestandteile werden als Hydrochloride in kristalliner Form erhalten.

Chemische und physikalische Eigenschaften

Die neuen Antibiotika der vorliegenden Erfindung besitzen einige gemeinsame Eigenschaften, doch können sie auf Grund ihrer chemischen und physikalischen Merkmale unterschieden werden. Alle neuen Anthracycline besitzen eine vergleichbare Löslichkeit; als freie Basen sind sie in Chloroform. Methylendichlorid, Aceton, Methanol, Ethanol, wässerigen Alkoholen, sauren Wasser, Dioxan und Pyridin löslich, aber wenig löslich oder unlöslich in Diethylether, η-Hexan, Cyclohexen und Petrolether; als Hydrochloride sind sie in Wasser, Methanol, Ethanol und wässerigen Alkoholen löslich, aber unlöslich in Aceton, Benzol, Chloroform, Diethylether und Petrolether. Sie können als Indikatoren, die in neutralen und sauren Lösungen organge-gelb sind und in welchen sie auch unter UV-Licht orange-rote Fluoreszenz zeigen, verwendet werden. Ihre alkalischen Lösungen sind rotbraun und, wenn sie mit alkoholischem Magnesiumacetat behandelt werden, ergeben sie rote Lösungen.

All diese Eigenschaften und die Absorptionsspektra in den UV- und sichtbaren Zonen zeigen, daß diese neuen Verbindungen zu der Gruppe der Anthracyclinantibiotika gehören. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Glykoside gemäß der Erfindung als Hydrochloride isoliert, sind in Tabelle I ί Ι angegeben.

Tabelle III

3₅ Eigenschaft

Glykosid I · UCI Fp. 171 —173"C (Zers.)

Glykosid Il ■ HCl Fp. I63-164°C (Zcrs.)

Glykosid III · HCI Fp. 175-176°C (Zers.)

Glykosid IV · HCI Fp. 140-150"C (Zcrs.)

[x]» (c=0,2 in Methanol) UV- und sichtbare Spektren

j MlOH

pn

S..

£jr

IR-Spektrum (KBr): cm-'

+ 11Γ

228,260,418 nm 645.420.193 235,262.426 nm 600,406,161 510nm 120

3700-2400 1725 1670 1625 1585 1490 1470 1450 1420 1385 1330 1300 1290 1240 1200 1180 1115 1085 1055 101"; 985

+ 107°

228,260,418 nm

640,410,179

235,262.246 η m

605,400,160

510 nm

118

3700-2400

1665

1625

1585

+ 485

1470

1445

1420

1385

1325

1290

1235

1195

1180

1115

1050

1010

985

940

840

820

+ 139°

228,260,418 nm

713,450,199

235,262.426 nm

617,424,166

510nm

3700-2300

1710

1670

1625

1585

1490

1470

1445

1420

1385

1325

1295

1235

1195

1115

1085

1010

985

835

815

795

+ 122°

228.260,418 nm

610,395,171

235,262,426 η m

580,400.160

510nm

110

3700-2400

1665

1625 .

1585

1 AOC

ItOJ

1465 1445 1420 1385 1325 1295 1255 1235 1190 1180 1110 1040 1010

980

830

750

Fortsetzung

Eigenschaft

Glykosid I · HCI

Fp.171-173"C

(Zcrs.)

Glykosid Il ■ HCI Ip. 163-IWC (Zcrs.)

Glykosid III ■ HCl
Fp. 175-176°C
(Zers.)

Glykosid IV ■ HCl
Fp. 140-!50⁰C
(Zers.)

IR-Spektrum
(KBr):cm'

940

875 840 820 795 755 440

750

435

430

empirische Formel
Molgewicht

564

HCl C₂₇Hj₁NO, · HCI 550

C₂₇H_nNO₉ · HCl
548

C₂₇Hj₁NO₈ · HCI
534

Diese neuen Anthracyclinantibiotika /eigen auch charakteristische NMR-Spektren. Das Spektrum von Glykosid I, als Hydrochlorid in DMSO-d„, zeigte charakteristische Signale bei 1,14 <J(d,CH,-C-5'), 3,39 rf(s, CH₃O), 4,60 rf(breites s,C-H-H₂),4,89 rf(breitcs s,C-7-H), 5.27 rf(breitcs s,C-l'-H). 7,23 rf(s,C-Il-H), 7,4-7,9 rf(m,C-I-H, C-2-N und C-3-H) und 13,61 rf(s, C-6-OH). Das Glykosid, als Hydrochlorid in DMSO-d_b, zeigte Signale bei 1,15 rf (d, CHrC-5'), 2,26 rf(s, CHiCO), 3,92 rf(s, CH₁O), 4,90 rf (breites s, C-7-H), 5,26 rf (breites s, C-l'-H), 7,31 rf(s, C-11-H), 7,4-7,9 rf(m,C-1-H.C-2-H und C-3-H) und 13,65 rf(s,C-6-OH).

Felddesorptionsmassespektroskopie der freien Basen der erfindungsgemäßen Glykoside bestätigten die zugeschriebenen Molekularformeln, wie in Tabelle IV gezeigt.

%:-	Tabelle IV	Molekularformel	Molgewicht bcr.	gef. m/e
lift	Verbindung	C₂₇H_nNOk, C₂₇H₁₁NO, C₂₇H_nNO, C₂₇Hj₁NOh	527 513 511 497	527(M⁺) 514(MH⁺) 512(MH+) 498(MH + )
I	Glykosid I Glykosid II Glykosid III Glykosid IV

Biologische aktive Daten a) Antibakterielle Wirksamkeit

Die »in vitro« minimalen Hemmungskonzentrationen (MlC) der erfindungsgemäßen Glykoside wurden für bestimmte Mikroorganismen unter Anwendung des Standardrohrverdünnungsverfahrens bestimmt und sind in Tabelle Vl angegeben.

Tabelle VI

Testorganismus

Staphylococcus aureus 209 P Staphylococcus aureus 153 Sarcina lutea ATCC 9341 Bacillus subtilis ATCC 6633 Escherichia coli B

M IC in ng/ml	(H)
Glykosid (I)	1000
125	1000
500	100
100	100
100	100
50

(III)

(IV)

62
250
12,5
50
25

250

1000 50 25
100
50

b) Antitumorwirksamkeil

Die neuen Verbindungen wurden gegen HeLa-Zellen in vitro (Zeit der Einwirkung der Heilmittel 24 h) und auf L 1210- und P 388-Leukämie an Mäusen im Vergleich mit Daunorubicin getestet. Die Ergebnisse der in vitro-Versuche gehen aus Tabelle VlI hervor. Es kann festgestellt werden, daß alle Verbindungen die Zellenentwicklungsfähigkeit von HeLa-Zellen in vitro hemmten, wobei die ID₅O für Glykosid IH 0,05 μg/ml, für Glykosid I 0,1 ug/ml. Glykosid IV 0,22 ^g/ml und für Glykosid II 0,44 ug/ml beträgt.

Die in vivo-Daten, die bei Mäusen erhalten wurden, sind in Tabelle VIII angegeben. Glykosid I war gegen P 388-Leukämie in einer Dosis von 66 mg/kg wirksam und bei der Dosis von 100 mg/kg toxisch; bei der tolerierten Dosis war die Antitumorwirksamkeit höher als jene von Daunorubicin.

Tabelle VII Wirkung auf die Entwicklungsfähigkeit von Hcl.a-Zcllen in vitro Verbindung

Duunorubicin (Daunomycin)

Glykosid(l) Glykosid(lll)

Glykosid(IV)

25 Glykosid(ll)

*) HeLa-Zellen wurden den Heilmitteln 24 h lang ausgesetzt und dann plattiert. Die Kolonienanzahl wurde 5 Tage später festgestellt.
30 **) % gegenüber unbehandclten Kontrollen.

Tabelle VIII

Wirkung gegen P 388- und L 1210-Leukämie bei Mäusen

Doms*)	Anzahl von	ID^
(ng/ml)	Kolonien·*). %	(ng/ml)
12,6	35-15	b-7
6,25	48-66
3,12	71-80
200	I
100	63	105
50	73
25	74
200	3
100	44	54
50	54
400	0
200	53	220
100	109
1600	0
800	20	440
400	66

Verbindung

Dosis*)	T/C. %	P 388	toxische
(mg/kg)	1.1210	199	Todesfälle*·)
2,9	133-133	200
4.4	140-133	223
6,b	111-133		14/26
2,9	111
6,6	128
10	122	245
66		254
100			1/10
2,9	100
6,6	117
15	122	iöi
i00		45	3/8
150			3/19
2.9	100
6,6	100
15	111	18
125		9	5/5
250	0		5/5
2,9	100
6,6	122
15	122

Daunorubicin

Glykosid(I)

Glykosid(IIi)

55 Glykosid(IV)

Glykosid(II)

500 9 2/2

·) Mäuse wurden intraperitoncal einen Tag nach der Tumor/cllenanimpfung behandelt. **) Die Bewertung erfolgte auf Grundlage der makroskopischen Autopsieuntersuchungen.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, ohne daß diese jedoch hierauf beschränkt sein soll.

Beispiel 1

Eine Kultur von Micromonospora peucetica. Siamm B 211 F. 1, wurde 25 Tage lang bei 28°C auf Schrägagar mit dem Aufrechterhaltungsmedium SA gezüchtet. Das Medium SA hatte die folgende Zusammensetzung:

Glucose	3%
Brauerei-Trockenhefe	U%
Natriumchlorid	0,1%
Kaliumdihydrogenorthophosphat	0,05%
Calciumcarbonät	0,1%
Magnesiumsulfat	0.005%
Ferrosulfatheptahydrat	0,0005%
Zinksulf a theptahydra t	0,0005%
Cuprisulfatpentahydrat	0,0005%
Agar	2%
Leitungswasser bis zu	100%

Die Sterilisierung wurde durch Erhitzen in einem Autoklaven bei 120°C während 20 min bewirkt
Die Mycelmatte der so erhaltenen Kultur wurde abgekratzt und in 3 ml sterilem destillierten Wasser suspendiert. Die Suspension wurde in 300-ml-Erlenmeyerkolben mit einem Gehalt von 60 ml des folgenden flüssigen Wachstumsmediums angeimpft:

Brauerei-Trockenhefe
Pepton

Calciumnitrattetrahydrat
Leitungswasser bis zu

0,3% 0.5% 0,05% 100%

Die Sterilisierung wurde durch Erhitzen in einem Autoklaven bei 120° C während 20 min bewirkt. Der pH-Wert des Mediums betrug nach der Sterilisierung 6,8 bis 7.0.

Die angeimpften Kolben wurden 8 Tage lang bei einer Temperatur von 28°C auf einem Drehschüttler bei 250 UpM. der einen Kreis mit einem Durchmesser von 7 cm umschrieb, geschüttelt. 5 ml der wie oben gezüchteten Kultur wurden in einen 300-ml-Erlenmayerkolben mit einem Gehalt an 50 ml des folgenden Produktionsmediums eingeimpft:

Glucose 6%

Brauerei-Trockenhefe 3%

Natriumchlorid 0,2%

Kaliumdihydrogenorihophosphat 0,1 %

Calciumcarbonat 0,2%

Magnesiumsulfat 0,01%

Ferrosulfatheptahydrat 0,001%

Zinksulfatheptahydrat 0,001%

Cuprisulfatpentahydrat 0,001%

Leitungswasser bis zu 100%

Das Sterilisieren wurde durch Erhitzen im Autoklaven oci 115"C während 20 min bewirkt.

Die Kolben wurden 25 Tage lang bei 28°C unter Bedingungen bebrütet, die mit jenen für die Animpfphase identisch sind. Die maximale Konzentration der aktiven Verbindungen wurde zwischen dem 18. und 22. Tag der Fermentation mit einer Produktion von 90 mcg/ml erzielt.

Beispiel 2

Eine Kultur des Stammes B 211 F. I. wurde 14 Tage lang, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, und die Mycelmatte, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, gesammelt wurde, wurde in 300-ml-Erlenmeyerkolben mit einem Gehalt an 50 ml des folgenden flüssigen Wachstumsmediums eingeimpft:

lösliche Stärke 4%

Sojabohnenmehl 1,5%

Brauerei-Trockenhefe 0,5%

Getreideweiche 0,8%

Calciumcarbonai 0,3% Kaliummonohydrogenorthosphosphat 0.05%

Magnesiumsulfat 0,025%

Kaliumchlorid 0,025%

Leitungswasser bis zu 100%

10

20 25 30 35 40 45

50

55

6(

Der pH-Wert von 5,7 wurde vor der Slerilisierung mit Natriumhydroxyd auf 7,5 erhöht. Die Sterilisierung wurde bei 120⁰C während 20 min bewirkt.

Nach 4 Tagen Bebrütung unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wurden 5 ml der so gezüchteten Kultur in 300-ml-Erlenmeyerkolben mit einem Gehalt an 50 ml des oben beschriebenen Mediums eingeimpft. Dann wurden die Ko.aen unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, 10 Tage lang bebrütet. Die maximalen Konzentrationen der aktiven Verbindungen wurden zwischen dem 8. und 9. Tag der Fermentation mit einer Produktion von 15 mcg/ml erzielt.

Beispiel 3

Das gesamte Bier (201) aus einer gemäS Beispiel 1 erhaltenen Fermentation wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa 4 eingestellt und unter Verwendung von 3% Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert, wobei ein Kuchen und ein Filtrat erhalten wurden, die getrennt extrahiert wurden. Der nasse Filterkuchen wurde mit etwa 4 1 einer Mischung aus Aceton und 0.1 N wässeriger Salzsäure (80 :20) behandelt Nach Filtration gewährleistete eine zweite Behandlung mit weiteren 3 1 angesäuertem wässerigen Aceton die vollständige Extraktion der aktiven Verbindungen. Die kombinierten wässerigen Acetonextrakte wurden mit Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert von etwa 4 eingestellt, unter vermindertem Druck auf etwa 1 1 eingeengt und mit der filtrierten Brühe vereinigt. Die erhaltene Mischung wurde auf einen pH-Wen von etwa 8,5 bis 9,0 eingestellt und dann zweimal mit einem halben Volumen einer Chloroform-Methanol^:1)-Mischung extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Durch Zusetzen 1 I n-Hcxans fiel der rohe Komplex als gelbbraunes Pulver (7 g) aus.

B c i s ρ i c I 4

Eine Chloroformlösung des rohen Komplexes als freie Base (6 g in 200 ml) wurde nach Behandlung mit 10 ml 1 N methanolischen Chlorwasserstoffs auf eine Kieselsäuresäule (hergestellt in Chloroform) aufgebracht. Die Säule wurde mit Chloroform gewaschen, worauf mit einer Mischung aus Chloroform, Methanol, Wasser (94,8 :5 :0,2) eluiert wurde. Die erste gelbe Fraktion enthielt einige Aglycone, die nächsten zwei gelben Banden enthielten das Glykosid IV bzw. III. Die Eluierung wurde mit einer Mischung aus Chloroform, Methanol, Wasser (893 :10 :0,5) fortgesetzt, bis zwei andere gelbe Banden, entsprechend den Glykosiden Il und 1, eluiert wurden. Die Fraktionen, die diese vier Banden enthielten, wurden getrennt unter vermindertem Druck konzentriert, wobei die praktisch reinen Hydrochloride von Glykosid IV (0,2 g). Glykosid 111 (0,4 g), Glykosid Il (0,2 g) und Glykosid I (0,6 g) als mikrokristalline Pulver erhalten wurden. Durch Umkristallisieren der Glykoside I und III aus Methanol: n-Butanol wurden die entsprechenden reinen Hydrochloride als gelborangefarbene Kristalle erhalten, Fp. 171-173⁰C mit Zersetzung für Glykosid I, Fp. 163-i64°C mit Zersetzung für Glykosid II, Fp. 175-176°C mit Zersetzung für Glykosid III und Fp. 150- 15O¹¹C mit Zersetzung für Glykosid IV.

Claims

Patentansprüche:

1. Anthracyclin-Glykoside der allgemeinen Formel
O

HjCO O OH O

OH

mit folgenden Bezeichnungen und Zuordnungen von R: