DE3012665C2 - 13-Desoxycarminomycin, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende pharmazeutische Mittel - Google Patents

13-Desoxycarminomycin, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende pharmazeutische Mittel

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DE3012665C2
DE3012665C2 DE3012665A DE3012665A DE3012665C2 DE 3012665 C2 DE3012665 C2 DE 3012665C2 DE 3012665 A DE3012665 A DE 3012665A DE 3012665 A DE3012665 A DE 3012665A DE 3012665 C2 DE3012665 C2 DE 3012665C2
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin

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Description

Die Erfindung betrifft das in Anspruch 1 genannte Anthracyclinglycosid und seine Salze, ein mikrobiologisches Verfahren zu dessen Herstellung und diese Substanz enthaltende pharmazeutische Mittel.
Gegenstand der Erfindung ist 13-Desoxycarminomycin und seine pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze.
13-Desoxycarminomycin hat die Formel:
O OH
CH2CH3
OH
H3C
NH2
HO
Die Erfindung schließt 13-Desoxycarminomycin in Form von Rohkonzentraten, erhalten von mikrobiologischen Herstellungsverfahren, wie unten beschrieben, in reiner kristalliner Form (Base oder Salz), wie aus den Rohkonzentraten isoliert, und in Form von pharmazeutischen Mitteln, die diese Substanz oder ihr Salz im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger enthalten, ein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 13-Desoxycarminomycin, bei dem man so verfährt, daß man Streptomyces peucetius var. carminatus (Farmitalia Carlo Erba-Sammlung von Mikroorganismen Nr. DR 81 F. I., Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Nr. 1524 DSM, American Type Culture Collection Nr. 31502 ATCC, Fermentation Research Institute, Japan, FERM P 4929) unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und Mineralsalze enthält, kultiviert bzw. züchtet.
Die Mikroorganismen Streptomyces peucetius var. carminatus, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können durch eine mutagene Behandlung von Streptomyces peucetius var. caesius mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (Arcamone et al. »Biotechnol. Bioengin.« Xl, 1969, Seitr >s 1101 bis 1110) erhalten werden.
Das neue Anthracyclinglycosid gemäß der Erfindung ist bei Versuchstieren als Antitumormittel geeignet. Es ist auch gegenüber grampositiven und gramnegativen Bakterien aktiv. Das erfindungsgemäße Anthracyclinglyccjid wird nachstehend als »Antibiotikum DOC« bezeichnet.
Der Mikroorganismus
Mikroskopische Eigenschaften des Stammes DR 81 F. 1.
Das Substratmycel wird durch ziemlich verzweigte Hyphen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 0,9 (xm und mit variierender Länge gebildet. Das Luftmycel,das aus dem ersteren entsteht, ist aus ziemlich langen, geraden bis gekrümmten Hyphen mit einem Durchmesser von 1,1 bis 1,6 am gebildet. Von diesen gehen durch sympodiale Verzweigung in gebündelter bzw. gebüschelter Weise sporentragende Hyphen mit variierender Länge aus, die in Haken oder Schleifen enden.
Die Sporen sind kugelförmig und sie haben eine Größe von 1 bis 2 um im Durchmesser. Zuerst sind sie in Ketten angeordnet und dann frei. Unter dem Elektronenmikroskop erscheinen die Sporen nahezu kugelförmig, mit unregelmäßigen Konturen und mit einer warzigen Oberfläche.
Makroskopische Eigenschaften des Stammes DR 81 F. I.
Die Kultureigenschaften des Stammes DR 81 F. I. sind in Tabelle I zusammengestellt.
Das Wachstum ist auf organischen sowie synthetischen Medien im allgemeinen gut. Wachstumsbeobachtungen auf den in Tabelle I angegebenen Medien erfolgten vom 5. Tag der Inkubation bei 28°C bis zum Wachstumsende.
Die biochemischen und physiologischen Eigenschaften des Stammes DR 81 F. I. sind in Tabelle II zusammengestellt.
Kein Wachstum wird bei einer Temperatur oberhalb 400C beobachtet. Die Bildung von Verhärtungen auf de,; Medien der Tabelle I wurde nicht beobachtet.
Identifizierung und Klassifizierung des Stammes DR 81 F. I.
Die Gesamtcharakteristiken des Stammes DR 81 F. I. entsprechen eindeutig denjenigen, die für die Gattung Streptomyces Waksman et Henrici angegeben werden. Weiterhin entsprechen die morphologischen, die Kultur betreffenden und physiologischen Eigenschaften des Stammes DR 81 F. I. denjenigen, die für die Art Streptomyces peucetius var. caesius (US-PS 35 90 028; Arcamone et al. »Biotechnol. Bioengin.« XI, 1969, Seiten 1101 bis I ί 10) beschrieben wurden. Davon unterscheidet sich jedoch der Stamm aufgrund seiner Fähigkeit, ein terracottafarbenes bis helloranges bis karminfarbenes Substratmycel zu bilden. Weiterhin unterscheidet sich der Stamm dadurch,^Jaß erm-Inosit und L-Arabinose verwertet, und schließlich dadurch, daß erneue Anthracyclinantibiotika erzeugt.
Tabelle I
Kultureigenschaften des Stammes DR 81 F. I.
Medium
Substratmycel
Luftmycel lösliche Pigmente
Bennet-Agar (Waksman, 1961)
Czapek-Agar (Waksman, 1961)
Asparaginglucose-Agar
(Waksman, 1961)
G lycinglycerin-Agar (Waksman, 1961)
Emerson-Agar (Waksman, 1961)
anorganische Salze Stärke-Agar (Pridham et al, 1957)
Kartoffelglucose-Agar (Waksman, 1961)
Asparaginglycerin-Agar (Waksman, 1961)
Hcfeextraktglucose-Agar (Waksman, 1961)
Stiirke-Kasein-Agar (Waksman, 1961)
üppiges Wachstum, leicht flechtenartig, orange- nicht
rote bis roseweinfarbene Färbung vorhanden
gutes -Wachstum, flach, kompakt, weinartige bis nicht
violette Färbt ig vorhanden
üppiges Wachstum, flach, kompakt, orange bis nicht
weinartige Färbung vorhanden
üppiges Wachstum, erhöht und mit Kämmen nicht
versehen, die Kolonien sind manchmal krater- vorhanden formig, orange bis braune Farbe mit violetten Tönungen
üppiges Wachstum, erhaben und mit Kämmen nicht
versehen, kraterartig, rosa-violett bis braun vorhanden gefärbt
üppiges Wachstum, flach, orange bis hell rosa nicht
gefärbt vorhanden
üppiges Wachstum, geringfügig erhöht, von wein- nicht
artig-violett bis braun gefärbt vorhanden
üppiges Wachstum, erhöhte und mit Kämmen nicht
versehene Kolonien, kraterartig, terracottaartig vorhanden bis hellorange bis karmin gefärbt
üppiges Wachstum, erhöht und mit Kämmen nicht
versehen, kraterartige Kolonien von orange bis vorhanden karminfarben bis weinartig gefärbt
üppiges Wachstum, flach, orange bis karmin- nicht
farben vorhanden
orange-weinfarbene Färbung bis braun
weinartige Färbung
bis violett -15
rosa bis weinartig
von weinartig bis braun bis dunkelbraun
hellrosa bis weinartig braun
nicht vorhanden
braun-violett
hellorange bis
karminfarben
von orange bis
hell-weinartig
von orange bis
rosa-weinfarben
Fortsetzung
Medium Substratmycel Luftmyce! lösliche Pigmcnlc
SA-Medium (zur Zu- üppiges Wachstum, erhöht und mit Kämmen häufig weinartig bis
sammensetzung und versehen, terracottaartig bis hellorange bis nicht vor- violett
hinsichtlich des Auf- karmin gefärbt handen,
rechterhaltungs- manchmal
mediums siehe Bei- vorhanden,
spiel 1) grau mit
glau-grünen Tönen
Tabelle II
Physiologische und biochemische Eigenschaften des Stammes DR 81 F. I.*)
Verwertung von Glucose +
Verwertung von Saccharose +
Verwertung von D-XyI öse +
Verwertung von Mannit +
Verwertung von m-Inosit +
Verwertung von L-Arabinose +
Verwertung von D-Fructose +
Verwertung von Adonit -
Verwertung von Lactose +
Verwertung von d(+)-Mannose +
Verwertung von Maltose +
Verwertung von Raffinose +
Verwertung von L-Rhamnose —
Verwertung von a,ff-Trehalose +
Verwertung von Glycerin +
Verwertung von NH4-Succinat +
Verwertung von Glycogen +
Verwertung von Paraffin +
Negativkontrolle -
Verflüssigung von Gelatine -
Tyrosinzersetzung +
M^laninbildung -
Hydrolyse von Stärke +
HjS-Bildung +
Nitratreduktion -
Milch (Pepton- und Koag.) +
erzeugte Antibiotika: neue Anthracycline
+ = positive Reaktion
- = negative Reaktion
*) Als Medium für den Kohlenhydrat-Verwertungstest wurde das Medium, beschrieben von R. D. Gordon und
M. L.Smith: »J. Bacteriology«, Band 69, 1955, Seiten 147 bis 150, verwendet. *i Als Medien für die weiteren physiologischen Reaktionen wurden die Medien·, beschrieben von S. A. Waksman »The Actinomycetes«, Band II, 1961, The Williams Wilkins Company, Baltimore, verwendet.
Der Stamm DR 81 F. I. wird daher als Varietät von Streptomyces peucetius var. caesius angesehen und es wird ihm die Bezeichnung Streptomyces peucetius var. carminatus verliehen. Waksman S. A.: »The Actinomycetes«, Band II, 1961, William Wilkins Co., Baltimore. Pridham T. G., Anderson P., Foley C, Lindenfelser L. A., Hesseltine C. A. und Benedict R. G.: »A selection of media for maintenance and taxonomic studies of Streptomyces«, »Antibiotics Ann.« 1956/1957, Seiten 947 bis 953.
Fermentationsprozeß
Die Produktion erfolgt nach den üblichen, gut bekannten Methoden. Der mutierte Mikroorganismus wird ir
<i5 einem zuvor sterilisierten flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37°C (vorzugf weise von 28°C) über einen Zeitraum, der von 3 bis 7 Tagen v.iriiert ("orzugsweise 5 Tage), und bei einem pH-Wert, der anfangs 6,5 bis 7,0 und am Enrie des Fermentationsprozesses 6,5 bis 8,0 beträgt, durchgc-
Das Kulturmedium besteht aus einer Kohlenstoff- und einer Stickstoffquelle sowie aus Mineralsalzen.
Die Kohlenstoffquelle kann z. B. Stärke, Dextrin, Glucose, Glycin, Mannit, Maltose, Maisquellflüssigkeit, lösliche Deslillierprodukte, Sojabohnenöl oder Sojabohnenmehl sein. Die Stickstoffquelle kann neben den obengenannten komplexen Substanzen, die Stickstoff enthalten, beispielsweise Trockenhefe, Fleischpepton odei Kasein sein. Gute Ergebnisse werden auch bei Verwendung von Ammoniumsalzen, wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und Diammoniumphoiphat, erhalten. Die Mineralsalze, die für die Produktion geeignet sind! können entsprechend dem verwendeten Medium variieren. In einem Medium, das komplexe Substanzen, wie verschiedene Mehle und Fermentationsrückstände, enthält, hat sich die Zugabe von Calciumcarbonat'und Natrium- oder Kaliumphosphat als nützlich erwiesen. Bei Medien, die Glucose oder Ammoniumsalze enthalten, werden erheblich höhere Gehalte von Mineralsalzen, z. B. von Kalium, Natrium oder Calcium, und Zugaben von Mikroelementen, wie von Eisen, Zink, Kupfer, Magnesium und Mangan, benötigt. Die Zugabe von Schwefel enthaltenden Verbindungen, z. B. von Sulfanilamid, Sulfathiazol, Sulfapyridazin, Penthiobarbital, Äthionin und anderen, kann gleichfalls zweckmäßig sein.
Die Fermentation kann in Erlenmeyer-Kolben oder im Laboratorium sowie in technischen Fermentationseinrichtungen mit verschiedenen Kapazitäten durchgeführt werden.
Analysenmethode
Wenn Proben der Fermentationsbrühen und der Rohgemische einer Papierchromatographie unter Verwendung von Whatman-Papier Nr. 1 unter Pufferung mit einem M/15-Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,4 und unter Anwendung eines Gemisches aus 7 :1: 2-n-Propanol/Äthylacetat/Wasserals Eluierungsmittel unterworfen werden und wenn der Papierstreifen gegen Bacillus subtilis bioautographiert wird, dann wird festgestellt, daß das neue Anthracyclinglycosid bei einem mittleren Rf-Wert von 0,77 zusammen mit den anderen aktiven Komponenten bei verschiedenen Rf-Werten auftritt. ·>5
Eine quantitative Bestimmung der Gesamtrotbestandteile, die in den Fermentationsbrühen vorhanden sind, kann nach folgender Methode durchgeführt werden.
Zu einer Probe der Brühe, die auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt ist, werden 2 Volumina von 9,1-Chloroform/Methanol gegeben und das resultierende Gemisch wird 1 min lang bei Raumtemperatur beschallt. Sodann kann mit einer Probe der organischen Phase, die mit saurem Methanol verdünnt ist, der Gesamtgehalt von anthracyclinartigen Bestandteilen und ihrer Aglycone spektrophotometrisch bei 495 nm bestimmt werden.
Unter Verwendung einer Probe der organischen Phase, die unter vermindertem Druck konzentriert worden ist, kann eine quantitative Bestimmung des Antibiotikums DOC durch Papierchromatographie unter Verwendung des oben beschriebenen Systems durchgeführt werden. Die rotgefärbte Zone wird abgeschnitten und mit einem 80 : 20-Gemisch aus Methanol und 0,01 n-Salzsäureeluiert und die Lösung wird für die spektrophotometrische Bestimmung bei 495 nm verwendet.
Isolierungsverfahren
Nach beendeter Fermentation sind die aktiven Verbindungen in den Mycelien und in den Fermentationsflüssigkeiten enthalten. Das Anthracyclinantibiotikum kann bei einem pH-Wert von 8,5 bis 9,0 als freie Basen aus der Kulturbrühe »in toto« mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Butanol, Methylisobutylketon, Chloroform, Methylendichlorid und Äthylacetat, extrahiert werden. Vorzugsweise werden die Mycelien und die Fenmentationsflüssigkeiten durch Filtration bei einem pH-Wert von 4 unter Verwendung von Diatomeenerde abgetrennt und sodann gesondert extrahiert.
Der Filtrationskuchen wird mit einem Gemisch aus einem wasserlöslichen Lösungsmittel, wie Aceton, und niedrigen Alkoholen und einer Ο,ΐη-wäßrigen Lösung einer organischen oder anorganischen Säure, vorzugsweise einem 4 : HVolumen/Volumen)-Gemisch von Aceton : O.ln-Salzsäure, extrahiert.
Die Mycelienextrakte werden gesammelt, auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und sodann unter vermindertem Druck konzentriert.
Das Konzentrat wird mit der filtrierten Brühe kombiniert, auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9 eingestellt, und sodann mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder n-Butanol, extrahiert. Die Extrakte werden unter vermindertem Druck konzentriert und ein Rohgemisch wird durch Zugabe des 5fachen Volumens von η-Hexan ausgefällt. Die Bestandteile dieses Rohgemisches werden sodann fraktioniert und durch säuienchromatographische Methoden gereinigt.
Reinigungsverfahren
Die Reinigung des Antibiotikums DOC und seine Trennung kann unter Verwendung einer Säulenchromatographie mit Silicagel und Cellulose durchgeführt werden. Das rohe purpurrote Pulver kann in einem : 55 : 6-Gemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser aufgelöst und mit dem gleichen Gemisch einer Siücagelsäulenchromatographie unterworfen werden. Die aktiven Eluate, die das Glycosid DOC enthalten, werden im Vakuum zur Trockene konzentriert und der Rückstand wird durch Säulenchromatographie mit einem auf einen pH-Wert von 5,4 gepufferten Cellulosepulver und mit einem 9 :1-n-Butanol: Äthylacetat-Gemisch gereinigt. Die Aktivfraktionen, die das reine Glycosid DOC enthalten, werden mit saurem Wasser extrahiert. Sodann wird die wäßrige Phase auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird
mit Wasser gewaschen, auf Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem kleinen Volumen konzentriert. Die Zugabe eines Äquivalents von methanolischem Chlorwasserstoff ergibt einen kristallinen Niederschlag des reinen Antibiotikums DOC als Hydrochlorid.
Chemische und physikalische Eigenschaften
Das neue Anthracyclinantibiotikum, isoliert als Hydrochlorid, ist ein roter Feststoff mit einem Schmelzpunkt vT-n 171 bis 175°C (unter Zersetzung). Die errechnete Molekularformel C26H29NO., ■ HCl für das Hydrochlorid ίο wird durch Felddesorptionsmassenspektrometrie bestätigt, bei dem die folgenden Peaks erhalten worden sind, welche dem Molekulargewicht 499 des Antibiotikums als freie Base und seinen Spaltungsprodukten entsprechen: m/e 500 (MH + ), 499 (M + ), 481 (M-H2O), 370 (Aglycon) und 334 (Bisanhydroaglycon).
Spezifische Drehung: [af + 275° (c = 0,1, Methanol). Löslichkeit: als freie Base ist das Antibiotikum DOC in
Chloroform, Methylendichlorid, Dioxan, Aceton, n-Butanol, Methanol und Wasser löslich, geringfügig löslich in Äthylacetat und in Benzol und Petroläther unlöslich. Das Hydrochlorid ist in Wasser, niedrigen Alkoholen und Dimethylsulfoxid löslich, in Aceton und Äthylacetat geringfügig löslich und in Chloroform, Diäthyläther und Petroläther unlöslich.
Die wäßrigen und alkoholischen Lösungen sind rot, schlagen jedoch im alkalischen Medium nach purpurrötlich um.
Absorptionsspektrum: Ultraviolett- und sichtbare Absorptionsmaxima werden gesehen bei: 236, 256, 293, 464 (sh), 495, 512 (sh) und 529 nm (E|% cm 620, 520, 164, 200, 260, 197 und 186).
Das IR-Spektrum in KBr zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm"': 3420,2930,1600, 1440, 1410, 1290, 1250, 1240, 1200, 1160, 1130, 1120, 1085, 1060, 1040, 1010, 985, 920, 870, 820 und 435.
Das PMR-Spektrum des Antibiotikums als Hydrochlorid in DMSO zeigt unter anderem die folgenden Peaks (ppm): 0,96 (t, CH3-C(H2)), 1,18 (d, CHj-C(5")), 4,76 (breites s, C(7)-H), 5,24 (breites s, C-(l')-H) und 7,20 bis 7,85 (m, aromatische Protonen).
Anhand des papierchromatographischen Verhaltens kann das neue Anthracyclinglycosid auch von anderen bekannten Anthracyclinen unterschieden werden:
ίο Antibiotikum DOC Rf 0,77
Carminomycin Rf 0,65
13-Dihydrocarminomycin Rf 0,60
Daunorubicin Rf 0,50
Doxorubicin Rf 0,30
Die Papierchromatographie wurde unter Verwendung von Whatman-Papier Nr. 1, gepuffert mit M/15-Phosphatpuffer, auf einen pH-Wert von 5,4, und einem Gemisch aus n-Propanol: Äthylacetat: Wasser von 7:1:2 (auf das Volumen bezogen) als Eluierungsmittel nach der absteigenden Methode durchgeführt.
Strukturbestimmung
Die Struktur des Antibiotikums DOC wurde wie folgt bestimmt: Die wäßrige saure Hydrolyse lieferte ein unlösliches purpurrotes Aglycon.
Nach der Neutralisation wurde die wäßrige Schicht gefriergetrocknet und der Rückstand wurde kristallisiert. Dieser lieferte einen Aminozucker als Hydrochlorid, der durch direkten Vergleich mit einer authentischen Probe als Daunosamin identifiziert wurde.
Die Struktur des Aglycons wurde aufgrund der chemischen und physikalischen Eigenschaften gemäß Tabelle III und durch direkten Vergleich mit einer authentischen Probe von 13-Deoxycarminomycinon, hergestellt aus 13-Deoxydaunomycinon gemäß Beispiel 8, bestimmt.
Tabelle III
Chemische und physikalische Eigenschaften des Aglycons
Fp: 2400C (unter Zersetzung)
UV- und sichtbare Spektren:
A^?" 235, 525, 293, 467, 481 (sh), 495, 516 (sh) und 530 nm
E| cm 1020, 770, 298, 320, 363, 410, 300 und 290
IR-Spektrum: 3250, 2970, 2930, 1600, 1450, 1430, 1400, 1375, 1350, 1310, 1250, 1200, 1180,
in KBr, cm'1 1160, 1140,1125,1100,1080,1060, 1040,1020,1000, 990,915, 875, 830,820, 745, 720,695, 680,
660, 585, 490, 470, 460, 425 und 395.
Empirische Formel: C2oH|807
Molekulargewicht: berechnet 370
gefunden durch Massenspektrometer m/e 370 (M+)
Werte der biologischen Aktivität
a) Antibakterielle Aktivität
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) in vitro des Antibiotikums DOC wurden für einige Mikroorganismen nach der Standardröhrchenverdünnungsmethode bestimmt. Sie sind in 'labeile IV aufgeführt.
Tabelle IV
Testorganismus MHK in ug/ml
Antibiotikum
DOC
Staphylococcus aureus 209P 12,5
Sarcina lutea ATCC 9341 1,56
Bacillus subtilis ATCC 6633 6,25
Escherichia coli B 3,12
Staphylococcus aureus 153 25
b) Antitumoraktivität
Das neue Antibiotikum DOC wurde gegen HeLa-Zellen in vitro (Aussetzungszeit an das Arzneimittel: 24 h)
und bei der P-388-Leukämie von Mäusen im Vergleich zu Daunorubicin (Daunomycin) getestet. Die erhaltenen
Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.
Tabelle V
Vorbindung Effekt auf die Lebensfähigkeit Dosis P-388") toxische
von HeLa-Zellena) in vitro mg/kg T/C Sterberaile1')
ID 50 ng/ml % 2/8
Daunorubicin · HCl 9,6 2,9 170 6/8
(Daunomycin) 4,4 175 7/8
6,6 ϊόΰ 1/10
13-Desoxycarminomycin · HCl 3,2 1 154 10/10
1,5 109 10/10
2,25 54
;l) Die HeLa-Zellen wurden den Arzneimitteln 24 h lang ausgesetzt und dann plattiert.
h) Die Mäuse wurden i. p. am Tag 1 nach Inokulierung der Tumorzellen behandelt.
c) Bewertung erfolgte auf der Grundlage von makroskopischen Feststellungen.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
Beispiel 1
Eine Kultur des Stammes DR 81 F. I. von Streptomyces peucetius var. carminatus wurde 14 Tage lang bei 28°C
auf Agarschrägkulturen mit folgendem Aufrechterhaltungsmedium (Medium SA) gezüchtet:
Glucose
Brauerei-Trockenhefe
Natriumchlorid
Kaliumdihydrogenorthophosphat Calciumcarbonat
Magnesiumsulfat
Eisen(II)-sulfatheptahydrat
Zinksulfatheptahydrat
Kupfer(II)-sulfatpentahydrat
Agar
Leitungswasser
pH-Wert
Sterilisation
3%
1,2%
0,1%
0,05%
0,1%
0,005%
0,0005%
0,0005%
0,0005%
2%
100 mlr«
6,7
im Autoklaven/l 15°C/20 min
Die Sporen der so erhaltenen Kultur wurden gesammelt und in 3 ml sterilem destillierten Wasser suspendier'. Die so erhaltene Suspension wurde in 300-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, weiche 60 ml des folgenden flüssigen Wachstumsmediums enthielten:
Brauerei-Trockenhefe 0,3%
Pepton 0,5%
Calciumnitrattetrahydrat 0,05%
Leitungswasser auf 100 ml
Sterilisation im Autoklaven/120°C/20 min
pH-Wert (nach der Sterilisation) 6,8 bis 7,0
Die inokulierten Kolben wurden 2 Tage bei einer Temperatur von 28°C auf einem Drehschüttler geschüttelt, welcher mit 250 Upm umlief und der einen Kreis mit einem Durchmesser von 7 cm beschrieb. 1,5 ml der so gezüchteten Kultur wurden in einen 300-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, der 50 ml des folgenden Produktionsmediums enthielt:
Glucose 6%
Brauerei-Trockenhefe 3%
Natriumchlorid 0,2%
Kaiiuii'idiuydrogcnorthopuGSpiiat η ίο/.
«1 * /υ
Calciumcarbonat 0,2%
Mdgnesiumsulfat 0,01%
Eisen(II)-sulfatheptahydrat 0,001%
Zinksulfatheptahydrat 0,001%
Kupfer(II)-sulfalpentahydrat 0,001%
Leitungswasser auf 100 ml
pH-Wert 6,7
Sterilisation im Autoklaven/l 15°C/20 min
Die Kolben wurden sg 7 Tage lang bei 28°C bei identischen Bedingungen, wie für die Beimpfungsphase beschrieben, inkubiert.
Die maximale Konzentration der aktiven Verbindungen wird zwischen dem 16. und 17. Fermentationstag mit einer Produktion von 20 mcg/ml erreicht.
Beispiel 2
Die Kultur des Stammes DR 81 F, I, wurde gemäß Beispiel 1 erhalten. Die Sporen der drei Schrägkulturen
wurden gepoolt und in 10 ml sterilem destillierten Wasser gesammelt. Die so erhaltene Suspension wurde in einen 2-l-Rundkolben, der mit Leitblechen versehen war und 500 ml des Beimpfi'ngsmediums gemäß Beispiel 1 enthielt, inokuliert. Der Kolben wurde 48 h bei 28°C auf einem Drehschüttler inkubiert, der mit 120 Upm umlief und einen Kreis mit einem Durchmesser von 7 cm beschrieb.
Das gesamte Beimpfungsmaterial wurde in ein 80-1-Edelstahl-Fermentationsgefäß, das 50 1 des Beimpfungsmediums gemäß Beispiel 1 enthielt und das durch 30minütige Dampfdruckbehandlung bei 1200C fterilisiert worden war, inokuliert. Die Beimpfungsphase wurde bei 28°C unter Rührbedingungen von 230 Upm und einem Luftstrom von 0,5 1 pro 1 Medium pro min durchgeführt. Nach 30 h wurde dieses Beimpfungsmaterial in ein 800-l-Edelstahl-Fermentationsgefäß inokuliert, das 500 1 des Produktionsmediums gemäß Beispiel 1 enthielt und das durch 30minütige Dampfdruckbehandlung bei 12O0C sterilisiert worden war.
Am 24. Tag der Fermentation erfolgte eine Zugabe von Sulfonylamid mit einer Konzentration von 0,5 g/l. Am 48. Fermentationstag erfolgte eine weitere Zugabe dieser Substanz mit einer Konzentration von 1 g/l. Die Fermentation wurde bei 28°C unter Rühren mit 250 Upm und unter Belüften mit einem Luftstrom von 0,7 1 pro I Medium pro min durchgeführt.
Die maximale Konzentration wurde zwischen dem 6. und 7. Tag der Fermentation mit einer Produktion von 70 mcg/ml an aktiven Verbindungen erreicht.
Beispiel 3
Das gesamte Material (41) von einer Fermentation gemäß Beispiel 1 wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und unter Verwendung von 3% Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Dabei wurde ein Kuchen und ein Filtrat erhalten, die gesondert extrahiert wurden. Der nasse Filterkuchen wurde mit etwa 4 I eines Gemisches aus Aceton und Ο,ΐη-wäßriger Salzsäure (Volumenverhältnis 80 : 20) behandelt. Nach der Filtration wurde eine zweite Behandlung mit weiteren 3 1 von angesäuertem wäßrigen Aceton durchgeführt, um eine vollständige Extraktion der aktiven Verbindungen zu gewährleisten. Die kombinierten wäßrigen Acetonextrakte wurden mit Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 4 eingestellt, unter vermindertem Druck auf etwa 1! konzentriert und mit der filtrierten Brühe kombiniert, die bei einem pH-Wert von 8,5 bis 9,0 mit dem halben Volumen von Chloroform extrahiert wurde. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck aufein VoIu-
men von etwa 50 ml konzentriert Durch Zugabe von 200 ml η-Hexan fiel der rohe Komplex als rot-purpurfar- .·:■·
ben-braunes Pulver (50 mg) aus. >y.
Beispiel 4 5
Eine Chloroformlösung des rohen Komplexes (50 mg), erhalten gemäß Beispiel 3, wurde auf einer Silicagelsäule, hergestellt in Chloroform, Chromatographien. Die Säule wurde mit Chloroform gewaschen und sodann wurde mit einem Gemisch aus Chloroform/MethanolAVasser im Volumenverhältnis von 300:55 :6 ehüert Die aktiven Eluate, die das Antibiotikum DOC enthielten, wurden zur Trockene eingedampft und auf einer Säule io aus auf einen pH-Wert von 5,4 gepuffertem Cellulosepulver durch Elution mit einem n-Butanol/Äthylacetat- '
Gemisch im Volumenverhältnis von 9 : 1 weiter gereinigt. Die aktiven Fraktionen, die das reine Antibiotikum DOC enthielten, wurden mit saurem Wasser extrahiert. Sodann wurde die wäßrige Phase, die auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt worden war, mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt, der mit Wasser gewaschen und auf was- . :
serfreiem Natriumsulfat getrocknet worden war, wurde unter vermindertem Druck zu einem kleinen Volumen 15 %
konzentriert Die Zugabe eines Äquivalents von methanolischem Chlorwasserstoff lieferte einen kristallinen ;f
Niederschlag des reinen Antibiotikums DOC (10 mg) als Hydrochlorid: Fp 171 bis 175°C (unter Zersetzung). '■■'.
Beispiel 5 20 ä
Das gesamte Material (500 1) einer Fermentation, erhalten gemäß Beispiel 2, wurde gemäß Beispiel 3 extra- S
hicrt. Das überschüssige Sulfanilamid, das in dem Extrakt enthalten war, wurde durch Kristallisation aus η-Pro- i
panol/Aceton abgetrennt und der rohe Komplex (30 g) wurde aus den Mutterlaugen mit η-Hexan ausgefällt. ^
Beispiel 6
Das Antibiotikum DOC wurde aus dem rohen Komplex, der im Beispiel 5 erhalten worden war, gemäß den Arbeitsweisen des Beispiels 4 abgetrennt und gereinigt. Es wurde als kristallines Hydrochlorid (1 g) isoliert: Fp 30 171 bis 175°C (unter Zersetzung).

Claims (3)

Patentansprüche:
1. 13-Desoxycarminomycin und dessen pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze.
2. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 13-Desoxycarminomycin, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Streptomyces peucetius var. carminatus (1524 DSM, 31502 ATCC. FERM P 4929) unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das eine assimilierbare KohlenstofFquelle, eine assimilierbare Stickstoflquelle und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 37°C über einen Zeitraum von 3 bis 7 Tagen und bei einem pH-Wert, deram Anfang6,5 bis 7,0 und am Ende der Fermentation 6,5 bis 8,0 beträgt, kultiviert und 13-Desoxycarminomycin aus der Fermentationsmasse, dem abgetrennten Mycel oder der filtrierten Brühe extrahiert.
3. Pharmazeutische Mittel, enthaltend 13-Desoxycarminomycin oder ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz davon im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger.
DE3012665A 1979-04-27 1980-04-01 13-Desoxycarminomycin, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende pharmazeutische Mittel Expired DE3012665C2 (de)

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