DE2344020A1 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums cephemimycin - Google Patents
Verfahren zur herstellung des antibiotikums cephemimycinInfo
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Description
Priorität: 31. August 1972, Japan, Nr. 87 339/1972
Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephemimycin
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephemimycin. Die Erfindung betrifft insbesondere
ein neues mikrobiologisches Herstellungsverfahren für dieses Antibiotikum.
Es wurde nämlich gefunden, daß das Antibiotikum Cephemimycin in einer KuItürbrühe des Mikroorganismus Streptomyces jumonjinensis
Stamm Nr. 3008 erzeugt wird. Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe
isoliert, die bei Jumonjitoge, Chichibu, Saitama Prefecture ,Japan
gesammelt wurde. Das Antibiotikum kann aus dieser Kulturbrühe isoliert und gereinigt werden. Es ist gegenüber gram -negativen
Bakterien, insbesondere gegenüber streptomycin-resistenten, kanamycin-resistenten und multi-resistenten Erregern von Sscherichia,
multi-resistenten Erregern von Klebsiella und multi-resistenten Erregern von Proteus hoch wirksam.
Das Antibiotikum Cephemimycin, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
erzeugt wird, hat die folgende chemische Struktur. Dieses Antibiotikum wurde als die gleiche Substanz identifiziert, wie
sie als "antibiotisehe Substanz 1-l6S86l" in der Niederländischen
Patentschrift 7oll8o5 und als "antibiotisehe Substanz 842A11 in
4 0 9 810/1188
on®lNAL
23ΊΌ20
den offengelegten Unterlagen der Japanischen Patentanmeldung 3286/1971 beschrieben wird. Dem Cephemimycin kommt folgende
Strukturformel zu:
H2N-CH(CH )_-C-HN
COOH
OCH
Die morphologischen Eigenschaften des oben genannten Cephemimyci:
erzeugenden Stammes Nr. 3008' sind wie folgt:
(1) Bei der Beobachtung unter einem Mikroskop zeigt sich, daß das Luftmycel gut verzweigt ist und eng geschlossene Ipiralen
bildet. Es werden jedoch keine Konoid-Ketten beobachtet. Die Sporen haben eine zylindrische Gestalt und eine Größe von 0,6 0,8
χ l,o - l,2,u. Die Sporenoberfläche ist glatt. Sporenkettsen
sind in Io - 50 Sporen je Sporenkette. Es v/erden keine Gei3elsporen
und Sporandien gebildet. Auf dem Luftmycel befinden sich Sporophoren.
(2) In Tabelle I sind die Ergebnisse zusammengestellt, die bein;
Züchten auf verschiedenen Kulturmedien erhalten wurden (die Beobachtung
erfolgte nach einer 2-wöchigen Kultivierung bei 28°C, wenn nichts anderes angegeben ist).
| Wachs tum |
Luftmycel | Tabelle I | Rückseite | lösliches Pigment |
|
| mäßig | schwach, weiß |
weiß | keines | ||
| Medium | Substrat- mycel |
||||
| Saccha- rose- Nitrat- Agar |
schwach, farblos |
||||
409810/ 1 1 88
BAD
| Medium | Wachs tum |
Luftmycel | Substrat- mycel |
Rückseite | lösliches Pigment |
| Glucose- Asparagin- Agar |
gut | mäßig, braun- grau |
schwach, gelb grau |
leicht
bräun lichgrau |
dto. |
| Glycerin- Asparagin- A gar |
mäßig | schwach, weiß |
üppig, gelb grau |
fahl gelbbraun |
dto. |
| Anorganische Salze-Stärke- Agar |
gut | schwach, grau weiß |
mäßig, gelb grau |
fahlgelb | dto. |
| Tyrosin- Agar |
mäßig | keines | mäßig, farblos |
fahlgelb | dto. |
| Nährstoff- Agar-Medium |
gut | schwach, weiß |
mäßig, gelbgrau |
fahlgelb | dto |
| Hefeextrakt- Malzextrakt- Agar |
üppig | üppig, weiß bis braungrau |
üppig, gelbgrau |
mattgelb | fahlgelb braun |
| Hafermehl- Agar |
mäßig | keines | mäßig, farblos. |
farblos | keines |
In Tabelle II sind die physiologischen Eigenschaften des
Stammes Nr. 3008 zusammengestellt.
Temperaturbereich für das Wachstum: l8 - 37°C
Gelatinverflüssigung (l8°C): , kein Wachstum
.Stärkehydrolyse:
Milchkoagulierung: 250C, 7 Tage
37°C, kein Wachstum
Milchpeptonisierung: 25°C, 7 Tage + (pH 6,4)
37°C, kein Wachstum
409810/1188
- 4 - 23AA 020
Melaninbildung: (in Tyrosin-Agar-Medium)
(in Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar-Medium)
Nitratreduktion· —
(4) In Tabelle III ist das Kohlenstoff-Verwertungsmuster des
Stammes Nr. 3°°8 auf einem Agar-Medium nach Pridham-Gottlieb
zusammengestellt.
| . L-Arabinose | + Lactose + |
| D-Xylose | Cellobiose + |
| D-Glucose | + Trehalose |
| D-Galactose | + Raffinose |
| D-Mannose | + Inulin |
| D-Pructose | Inosit + |
| L-Rhamnose | + D-Mannit |
| Saccharose | + |
Aus der Zusammenfassung der obigen Eigenschaften geht hervor, daß der Stamm Nr. 3008 zu der Art Streptomyces gehört. Sein Mycelium
bildet dicht enge Spiralen". Die Sporen haben eine zylindrische
Gestalt und die Sporenoberfläche ist eben. Auf verschiedenen Medien wird ein farbloses bis gelbgraues Wachstum beobachtet. Es
werden weiße bis braungraue Luft-Hyphen gebildet. Lösliche Pigmente werden nur spärlich bisjzu einem Ausmaß gebildet, daß einige
fahlgelblich-braune lösliche Pigmente nur in einem Hefeextrakt-Malzextrakt-Agarmedium
beobachtet werden. Auch werden fahlgelbe bis leicht bräunlich-graue Färbungen auf der Rückseite der Kolonie beobachtet.
Hinsichtlich der physiologischen Eigenschaften wird keine Melanin-Bildung, Stärkehydrolyse und Milchkoagulierung beobachtet.
Wenn man unter den bekannten Stämmen mit den obigen Eigenschaften sucht, dann kann man als den am-nächsten kommenden Stamm
den Stamm Actinomyces r.-ru^abilis bezeichnen, der im International
Journal of Systematic Bacteriology, Vol. l8, Nr. 2 148 - 15o (1968)
4098 10/1188 U00n^ -5-
2 3 A /; O 2 O
beschrieben wird.
Der erfindungsgemäß verwendete Stamm Nr. 3008 unterscheidet sich
Jedoch vom Stamm ISP Nr. 5169, der der autentische Stamm von
Actinomyces mutabilis ist, durch die in der Tabelle IV angegebenen Unterschiede.
Natur
Stamm Nr.
Stamm ISP Nr. 5169
Gestalt, Ober- zylindrisch, glatt fläche und Anzahl der Io - 50 Sporen
Sporen
Sporen
zylindrisch, glatt, 3 - Io Sporen
| Spiralen | kompakte Spiral faden |
Spiralfäden oder Hakenfäden |
| Farbe des Luft-, mycels |
weiß bis bräunlich grau |
weiß bis grau |
| Coremienbildung | + | - |
| Spyrophoren | spiralförmig | spiralförmig oder hakenförmig |
| Kohlenstoff-Ver wertung |
D-Xylose, D-Fructose, jedoch keine Verwer tung von D-Mannit |
D-Xylose, D-Fructose, D-Mannit verwertet |
| Antibiotikum- | Cephemimycin | |
| Bildung |
Aus den obigen Gründen geht hervor, daß der Stamm Nr. 3008 als
eine neue Art identifiziert wurde, die sich ausgeprägt von Actinomyces mutabilis unterscheidet. Er erhielt die Bezeichnung
Streptomyces jumonjinensis Stamm Nr. 3°°8· Der Stamm Nr. J5o°8
wurde unter der Hinterlegungsnummer 15^5 beim Technical Research
Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of,International Trade and Industry, Japan
und auch unter der Hinterlegungsnummer NRRL-ST1H beim Northern
9 8 10/1188
2 3 A Λ ': 2 Q
Regional Research Laboratory, Northern Central Region, Agricultural
Research Service, United States Department of Agriculture, at Peoria, Illinois, U.S.A., hinterlegt..
Bekanntlich sind verschiedene Eigenschaften von Streptomyces
nicht definiert, sondern sie können leicht natürlich und künstlich variiert werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme
schließen daher sämtliche Stämme ein, die zur Art Streptomyces gehören und die dazu imstande sind, Cephememycin zu erzeugen.
Nachfolgend wird ein Vergleich der verschiedenen Eigenschaften
des Stammes Nr. 3008 mit demjenigen von Mikroorganismen gegeben,
die das gleiche Antibiotikum Cephemimycin erzeugen. Es handelt sich dabei um Streptomyces clavuligerus gemäß der Niederländischen
Patentschrift 7 oll 805 und International Journal of Systematic Bacteriology, 21, 4, 326, 1971 sowie Streptomyces
lactamdurans gemäß der offengelegten Japanischen Patentanmeldung
Nr. 3286/1971.
(1) Morphologische Eigenschaften (nach einer l4-tägigen Kultivierung
Stamm
Eigenschaften
Eigenschaften
Streptomyces jumonjinensis
Streptomyces clavuligerus
Streptomyces lactamdurans
Verzweigung des
Luftmycels
Luftmycels
monopodiale Verzweigung
sympodiale Verzweigung (keulenförmige Seitenverzweigungen)
gerade mit wenigen Verzweigungen
| Spyrophoren | spiralenförmig | gerade bis gebogen |
keine |
| Sporenketten | «je Kette I0-50 | 1 - 4 je Kette |
keine |
| Geiselsporen | keine | keine | keine |
AQ981Q/1188 OFMWNAL INSPEÖTiD
Stamm
Eigenschaften
Eigenschaften
Streptomyces Streptomyces Streptomyces
jumonjinensis clavuligerus lactamdurans
Sporangium
keine keine
keine
Sporenoberfläche
glatt (zylindrisch) glatt (länglich bis
zylindrisch)
zylindrisch)
keine
Stelle der Sporoforen-Bildung
nur auf dem Luftmycel nur auf dem
Luftmycel
Luftmycel
(2) Kultureigenschaften nach verschiedenen Agar-Medien (nach l4-tägiger Kultivierung)
Streptomyces Streptomyces Streptomyces jumonjinensis clavuligerus lactamdurans
Saccharose-Nitrat-Agar
Wachst, mäßig Luftmyc. schwach, weiß Rucks. weiß
lösl.Pig. keines spärlich
mäßig
cremeweiß
tief cremefarben
keines
Glucose-Aspa- Wachst, gut
ragin-Agar Luftmyc. gut, olivgrau Rucks. gelbgrau
lösl.Pig. keines mäßig
gut, weiß
fahl gelblich grün
keines
gut, weiß
fahl gelblich grün
keines
Glycerjn-Aspa-Wachst. mäßig
ragin-Agar Luftmyc. schwach, weiß Rucks. fahlgelb
lösl.Pig. keines gut
gut, weiß
fahl-gelblichgrün
keines
fahl-gelblichgrün
keines
mäßig
cremefarben golden bis orange
fahlbernsteinfarben
Anorganische Wachst, gut Salze-Stärke- Luftmyc. schwach, hell-Agar
grau
Rucks. fahl-gelblichbraun
lösl.Pig. keines üppig mäßig gut, graues weiß bis grün
Medium bis zimtfarbig graugelb cremefarbig bis grünlich-orange
keines keines
Nährstoff-Me- Wachst, gut dium Luftmyc. schwach, weiß
Rucks. fahl-gelblichbraun
lösl.Pig. keines gut mäßig spärlich, weiß cremefartig
fahl-gelblich- golden grün
keines keines
09810/1188
Streptomyces Streptomyces Streptomyces
jumonjinensis clavuligerus lactamdurans
| Tyrosin- | Wachst. | mäßig | mäßig | mäßig | weiß | - | mäßig |
| Agar | Luftmyc. | keines | schwach, gelb-cremefarben und | lohgelb bis | cremefarben | ||
| 1ichgrau | orange | orange | |||||
| Rucks. | hellgelblich- | fahlgelb | keines | keines | |||
| braun | * Tomatenpaste-Hafermehl-Agarmedium für Streptomyces lactam- | ||||||
| lösl.Pig. | keines | keines | |||||
| Hefeextrakt- | Wachst. | üppig | üppig | ||||
| Malzextrakt- | Luftmyc. | üppig, weiß | üppig, leicht | ||||
| Agar | grünlich-oliv | ||||||
| Rucks. | mattgelb | grün-.lichgelb | |||||
| lösl.Pig. | keines | keines | |||||
| Hafermehl- | Wachst. | mäßig | mäßig | ||||
| Agar *· | Luftmyc. | keines | gut, weiß | ||||
| Rucks. | farblos | fahlgelb | |||||
| lösl.Pig. | keines | keines |
durans
Physiologische Eigenschaften
| Streptomyces Jumonjinensis |
Streptomyces clavuligerus |
- | nicht beschrie ben |
Streptomyces Iac taiiKhir ans |
|
| - | - | - | |||
| Tyrosinase-Reaktion | - | - | |||
| Nitrat-Reduktion | - | - | |||
| Stärkehydrolyse | - | + | |||
| Gelatinverflüssigung < |
+ |
Melaninbildung Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar
Tryρ t on-He fe brühe
nicht beschrieben
409810/1188
- 9
Streptomyces Streptomyces Streptomyces
jumonjinensis clavuligerus lactamdurans
Milchkoagulierung: 25 C
- (Tempera- nicht betur nicht schrieben kein Wachstum beschrieben)
Milchpeptonisierung:
25°C 37°C
+ (pH 6,4) kein Wachstum
+ (Tempera- + (Alkali) tür nicht (Temperatur beschrieben) nicht beschrieben
(4) Kohlenstoff-Verwertung
Streptomyces jumonjinensis
Streptomyces Streptomyces clavuligerus lactamdurans
D-Glucose L-Arabinose Saccharose L-Rhamnose
Raffinose D-Xylose i-Inosit D-Mannit D-Pructose
Aus den oben angegebenen Vergleichsuntersuchungen hinsichtlich der
physiologischen und morphologischen Eigenschaften kann eindeutig
die Schlußfolgerung gezogen werden, daß der erfindungsgemäß verwendete
Stamm Streptomyces Jumonjinensis sich in physiologischer
und morphologischer Hinsicht ausgeprägt von dem Stamm Streptomyces lactamdurans unterscheidet. Weiterhin kann die Schlußfolgerung gezogen
werden, daß der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus sich ausgeprägt von dem Stamm Streptomyces clavuligerus aufgrund
der unterschiedlichen Verzweigung des Luftmycels unterscheidet, welche bei der Klassifizierung von Actinomyceten signifikant ist.
Λ09810/11Θ8
- Io -
Dafür spricht auch die große Unterschiedlichkeit der Kohlenstoff-Verwertung
bei beiden Stämmen.
Die Kultivierung kann bei dem Verfahren der Erfindung nach der
Methode durchgeführt werden, die allgemein für Streptomyces verwendet
wird. Bevorzugt wird eine Schüttelkultur oder eine Submers-KuItür
in einem flüssigen Medium.
Als Medium-Komponenten können alle bekannten Nährstoffe für Streptomyces verwendet werden. So können z.B. als assimilierbare
Kohlenstoffquelle Glucose, Glycerin, Maltose, Dextrin, Stärke, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, etc. und als assimilierbare Stickstoff
quelle Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Fischmehl,
Maisquellflüssigkeit, Peptone, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat etc. verwendet
werden. Als anorganische Salzekönnen z.B. Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat, etc. verwendet werden. Erforderlichen-'
falls kann eine geringe Menge eines Metallsalzes zugesetzt werden.
Bei Durchführung der flüssigen Kultivierung unter Belüftung und Durchbewegungkann geeigneterweise auch ein Antischaummittel, z.B.
ein Silikonöl, ein Pflanzenöl oder ein oberflächenaktiver Stoff verwendet werden.
Der pH-Viert des Mediums kann geeigneterweise im neutralen Bereich
oder darum herum sein. Die Kultivierungstemperatur kann gewöhnlich im Bereich von 25 - 300C liegen, wobei insbesondere eine
Temperatur von etwa 27°C bevorzugt wird.
Zeitliche Veränderungen der Aktivität des Antibiotikums Cephemimycin,
das in der Kulturbrühe mit fortschreitender Kultivierung erzeugt wird, können nach dem bekannten Zylinderplatte-Testverfahren
unter Verwendung von Proteus vulgaris als Testmikroorganismus
durchgeführt werden. Gewöhnlich kann eine maximale Bildung von Cephemimycin erhalten werden, wenn man eine Kultivierung von 4o
bis 80 Stunden durchführt. So wurden z.B. in einem Flaschenfermen-
409810/1188
tator mit einem Volumen von J5o ml in der Kulturbrühe nach 4o Stunden
^o/Ug/ml Cephemimycin erzeugt.
Cephemimyein ist in Wasser leicht löslich und liegt vorherrschend
in einem flüssigen Teil der Kulturbrühe vor.
Nach Beendigung der Kultivierung werden das Mycel und die anderen
Peststoffe durch Filtration entfernt, wobei Diatomenerde und
dergleichen als Filterhilfsmittel verwendet werden. Die Entfernung
kann auch durch Abzentrifugieren durchgeführt werden. Das in dem Filtrat oder der überstehenden Phase enthaltene Cephemimycin kann
isoliert und unter Verwendung seiner physicochemischen Eigenschaften
gereinigt werden.
So kann z.B. das Cephemimycin aus der Kulturbrühe durch Verwendung
eines Absorptionsmittels gewonnen werden. Als Absorptionsmittel kann z.B. Aktivkohlepulver verwendet werden. Das durch das Aktiv-·
kohlepulver adsorbierte Cephemimycin kann mit Methanol-Wasser,
n-Butanol-Wasser, wässrigem Aceton und .dergleichen eluiert werden.
Da Cephemimycin eine amphotäre Substanz mit einer starken Acidität und einer schwachen Basicität ist, kann es auch an Kationen- oder
Anionen-Austauscherharzen adsorbiert und daraus eluiert werden.
Beispiele für geeignete Kationenaustauscher-Harze sind stark saure Kationenaustauscher-Harze wie Dowex 5oW χ k (hergestellt von
Dow Chemical Co., U.S.A.), Amberlite IR-12o (hergestellt von Rohm
& Haas Co., U.S.A.) und dergleichen. Beispiele für geeignete Anionenaustauscher-Harze sind stark basische Anionenaustauscher-Harze,
wie Dowex IxI (hergestellt von Dow Chemical Co.) etc. Vorzugsweise
werden jedoch schwach basische Anionenaustauscher-Harze wie Duolite A-2 (hergestellt von Diamond-Alkali Co., USA) verwendet,
Ferner kann eine Chromatographie durchgeführt werden, wobei z.B. Silikagel, Avicel (mikrokristalline Cellulose von AsähiKasei Kogyo
K.K., Japan) etc. verwendet wird. Das Cephemimycin kann auch
durch Dünnschichtchromatographie durch wiederholte Verwendung Jeder
beliebigen Kombination von solchen Reinigungsmaßnahmen zu einem
Λ 0 9 8 1 0/1188
einzigen isolierten Zustand gereinigt werden.
Das Cephemimycin besitzt die folgenden physicoehemischen Eigenschaften.
(1) Aussehen
fahl-gelblich-weißes Pulver
fahl-gelblich-weißes Pulver
(2) Schmelzpunkt
1600C (unter Zersetzung)
(3) Elementaranalyse
C : 42,6o# H : 5,76# N : 11,42$ S:5,52#
(4) Spezifische Drehung
[oj20 = + lo2° (c = 1, Wasser)
D
(5) Neutralität, Basizität oder Acidität PKa1 = 2,97, 9,41
(6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum
In Tabelle V sind die Werte der maximalen Absorptionsstellen und von E1^ entsprechend Pig. I zusammengestellt.
| Tabelle V | 114 98 162 |
Absorptionsmaximum (να αϊ) Ε 1 % ' 1 cm |
130 I08 |
|
| Lösungsmittel | Absorptionsmaximum (m/a) „1 % / El cm |
263 263 |
||
| H2O ο,Ι η' HCl ο,Ι η NaOH |
238 244 229 - 230 |
|||
(7) Infrarot-Absorptionsspektrum
Gemäß Pig. 2 (gemessen mit KBr-Tabletten)
(8) Löslichkeit
Das Antibiotikum ist in Wasser leicht löslich, in Methanol löslich, in Äthanol schwach löslich und in anderen organischen
4098 10/ 1 188 - 13 -■
Lösungsmitteln unlöslich.
(9) Farbreaktionen
Positiv bei den Ninhydrin-, Benedikt- und Tollens-Reaktionen.
Negativ bei Eisen(lll)-chlorid-, Biuret-, Resorcin-Salzsäure-,
Anthron- und Elson-Morgan-Reaktionen.
(10) Stabilität
Die wässrige Lösung des Antibiotikums ist im sauren oder leicht alkalischen Zustand relativ stabil. Bei pH-Werten
von 2, 7 und 8 bleiben 9o#, loo$ bzw. 85$ selbst nach einer
3o-minUtigen Wärmebehandlung bei 6o°C unverändert.
(11) Dünnschichtchromatographie
In Tabelle VI sind die Rf-Werte einer Dünnschichtchromatographie
(aufsteigende Methode) bei Verwendung eines Cellulose-Chromatogram-Sheet
6065 (hergestellt von Eastman Kodak Co., U.S.A.) zusammengestellt. Zur Erfassung wurde eine
Bioautographie. mit Proteus vulgar is oder eine Farbreaktion
mit Ninhydrin angewendet.
| Entwicklungslösungsmittel | ■7) | Rf-Wert |
| n-Butanol : Essigsäure : V/asser .('2I- : 1 : 2) |
: V/asser | o,33 |
| 4o$ n-Propanol | 0,83 | |
| 3$ Ammoniumchlorid : Methanol (3 : ι |
o,5o | |
| n-Propanol : Pyridin : Essigsäure (15 : Io : 3 1 lo) |
o,29 | |
Methyläthylketon : n-Butanol : Wasser
(3o : 5 : 65)
(3o : 5 : 65)
- 14 -409810/1188
(12) Hochspannungs-Papier-Elektrophorese Die Elektrophorese wurde 30 Minuten bei 3.300 Volt und
4o mA mit einer Pufferlösung aus Ameisensäure : Essigsäure : Wasser (1 : 3 : ^6) mit einem pH-V/ert von 1,8 unter Verwendung
eines Toyo Filterpapiers Nr. 5 mit den Abmessungen 60 cm χ 2o cm (hergestellt von Toyo Roshi K.K., Japan)
durchgeführt. Die Erfassung erfolgte in der gleichen V/eise •wie bei der Dünnschichtchromatographie. Die Beweglichkeit
des Cephemimyeins ist 0,3, wenn diejenige von L-Alanin
l,o ist.
Das pulverförmige Cephemimycin mit den obigen physicochemisehen
Eigenschaften wird durch eine Säulenchromatographie wird durch eine Säulenchromatographie weitergereinigt, wodurch ein weißes
Pulver erhalten wird, das die gleichen Eigenschaften, wie oben
angegeben, mit Ausnahme der untenstehenden physikalischen iligenschaften
besitzt.
(1) Elementaranalyse (als Monoarr,moniumsalz)
C * 4i 69^ H * 5 861^ N · i4 37^3 s * 6 88/0
berechnet: C : 4l,46^, H : 5,44£, N : 15,ll£, 3 : 6,92^
(2) Spezifische Drehung
]20
(3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum
i>]20 = + 135° (c = 1, H
D
D
Lösungsmittel Absorptionsmaximum E l<3
| (nyu) | 132 157 |
|
| H2O 4 |
242 263 |
117 133 |
| o,l η HCl | 245 263 |
|
409810/1188
Nachstehend sind die biologischen Wirkungen von Cephemimycin
angegeben,
(l) Antimikrobielles Spektrum In Tabelle VII sind die minimalen Hemmungskonzentrationen
für verschiedene Mikroorganismen zusammengestellt.
| Tabelle | TestOrganismus | VII | Il | It | MHK /Ug/ml |
| Staphylococcus aureus 2o9P JC-2 | Medium * | u \ ti | U | > 2oo | |
| S. aureus 56 | H | If | tt | 2oo | |
| S. aureus 193 | It | P. mirabilis GN829 (multi-resistent) " | It | 2oo | |
| S. aureus 52-34 | It | P. mirabilis GN1973 | It | > 2oo | |
| Bacillus subtilis PCI 219 | It | P. mirabilis GN1973 R„„2984 | 12,5 | ||
| Sarcina lutea PCI lool | Il | ...... ijiM (multi*-resistent) Pseudonionas aeruftinosa B 1-1 |
25 - | ||
| Corynebacterium xerosis B58-3 | Il | P. aeruginosa oC-8753 | 25 | ||
| Mycobacterium smegmatis ATCC 6o7 | Il | L·. §RL· sc -S328 | >2oo | ||
| Escherichia coli NIHJ JC-2 | G | 12,5 | |||
| E. coli (SM-resistent) Ej_ coli (KM-resistent) E^ coli GN2645 (multi-resistent) Klebsiella pneumoniae PCI 6o2 |
H | 3,12 o,78 12,5 3,12 |
|||
| G It It It |
6,25 | ||||
| K. pneumoniae C-N 2984 (multi-resistent) G | 3,12 | ||||
| Proteus vulgaris OX 19 | 5o | ||||
| P. rettgeri GIT2S25 (multi-resisten' | 3,12 | ||||
| P. mirabilis I?O 3849 | • 3,12 | ||||
| 12,5 | |||||
| 3,12 | |||||
| 12,5 | |||||
| > 2oo | |||||
| > 2oo |
4098 1-0/1188 Bad orio - l6 -
■· 1β
Testorganismus
| 2344020 | |
| Medium * | MHK |
| /Ug/ml | |
| 3 | > 2oo |
| ti | >2oo |
| η | >2oo |
| If | >2oo |
| M | >2oo |
| M | >2oo |
| ti | >2oo |
| K | >2oo |
| It | >2oo |
| It | >2oo |
| Il | >2oo |
| 11 | >2oo |
Candida albicans YU 12oo
Sjl tropicalis WH 42
Saccharomyces cerevisiae ATCC
Cryptococcus neoformans IVH 15-4
Trichophyton mentagryphytes P 6j>-9
Epidermophyton floccosum ATCC Io227
Penicillium chrysogenum Q 176
Aspergillus oryzae IAM 26j5o
Fusarium miniliforme IAM 5o62
Botrytis cinerea IAM 5126
Piricularia oryzae IAM 5087
Pellicularia sasakii P-J55
Sjl tropicalis WH 42
Saccharomyces cerevisiae ATCC
Cryptococcus neoformans IVH 15-4
Trichophyton mentagryphytes P 6j>-9
Epidermophyton floccosum ATCC Io227
Penicillium chrysogenum Q 176
Aspergillus oryzae IAM 26j5o
Fusarium miniliforme IAM 5o62
Botrytis cinerea IAM 5126
Piricularia oryzae IAM 5087
Pellicularia sasakii P-J55
* Medium
H: Herζinfusions-Agar
G: " " mit 1% Glycerin S: Sabouraud-Dextrose-Agar
K: Kartoffel-Dextrose-Agar
Kultivierung: Als MHK-Werte wurden diejenigen genommen, welche
nach 24-stündiger Kultivierung bei J57°C für Bakterien und nach
48-stündiger Kultivierung bei 28°C für Hefen und Pilze erhalten wurden. Als Ergebnis der MHK-Werte bei Bakterien zeigten sich
in einem Herzinfusions-Medium mit lo^o Pferdeserum keine Wirkungen
nach der Zugabe des Pferdeserums.
Wie aus Tabelle 711 ersichtlich wird, hat das Cephemimycin eine
hohe antibakterielle Aktivität gegen gram -negative Bakterien.
(2) Toxizität
l4 Tage nach Verabreichung von 800 mg/kg des Antibiotikums
durch intravenöse Injektion an Mäuser wurden keine unnormalen Erscheinungen festgestellt.
- 17 -
409810/1188
(3) Schutzaktivität
Es wurde festgestellt, daß das Cephemimycin beim Schutztest,
der bei der Maus mit Escherichia coil durchgeführt wurde, wirksam ist. Mäuse des ddY-Stamms mit einem mittleren Körpergewicht
von etwa 2o g, die in Gruppen zu je Io Tieren auf-
Ύ geteilt waren, wurden mit 1 χ Io Zellen je Maus von
Escherichia coil 64o, einem multi-resistenten Stamm inokuliert.
Cephemimycin wurde in steriler Natriumchlorid-Lösung mit 6,25 bis 5o mg/kg zweimal subkutan den Tieren verabreicht,
und zwar unmittelbar nach der Inokulierung und 4 Stunden nach der Inokulierung. Tabelle VIII zeigt die Zahlen der überleben-.
den Mäuse.
Tage nach der Verabreichung
Dosis (mgAg) ο 1 2 3 5 7
O (Kontrollversuch Io 4 O O O O
6,25 Io 7 6 6 6 6
12,5 Io Io 9 9 9 9
25 Io Io Io Io Io Io
5o Io Io Io Io Io Io
Aus der Tabelle VIII wird ersichtlich, daß das Cephemimycin selbst
bei einer Dosierung von 6,25 mg/kg seine Schutzwirkung ausüben kann.·
Aus Untersuchungen an bekannten antibiotischen Substanzen mit den oben beschriebenen physicochemischen und biologischen Eigenschaften
wurde bestätigt«, daß das erfindungsgemäß hergestellte Cephemimycin
mit den oben genannten antibiotischen Substanzen A-16886I und 842A identisch ist.
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele erläutert.
409810/1188 ~ l8 -
Die erflndungsgemäße Herstellung kann jedoch in verschiedener
Welse entsprechend den hierin beschriebenen Eigenschaften des Cephemimycins durchgeführt werden. Die Erfindung ist daher
nicht auf diese speziellen Beispiele beschränkt, sondern umfaßt alle Methoden zur Herstellung, Extraktion und Reinigung des
Cephemimycins nach den bekannten Verfahren.
Der Stamm Nr. J5oo8, der auf einem Malzextrakt-Hefeextrakt-Agarmedium
kultiviert worden war, wurde auf loo ml eines Mediums (in einem 5oo ml-Sakaguchi-Kolben) gegeben. Das Medium hatte
einen pH-Wertjvon 7,2 vor der Sterilisierung und enthielt 2,o%
Glucose, l,o# Stärke, o,9^ Hefe, o,5# Polypepton, o,5# Fleischextrakt,
o,j$ Calciumcarbonat, o,5# Natriumchlorid und o,o2^
Disfoam CB442 (von Nippon Oils & Fats Co., Ltd., Japan) als
Entschäumer. Es wurde 2 Tage lang eine Schüttelkultur bei 27°C durchgeführt, um eine Samenkultur herzustellen. 2oo ml dieser
Samenkultur wurden in einem 3o 1-Flaschenfermentator eingebracht,
der 15 1 des Kulturmediums mit der obigen Zusammensetzung enthielt.
Die Kultivierung erfolgte 4o Stunden bei einer Umdrehung mit 2oo Upm, einer Belüftung mit 15 l/min., einem Innendruck von
1,1 kg/cm und einer Temperatur von 27- IC, wodurch 4o/Ug/ml
Cephemimycin hergestellt wurden.
l4 1 der Kulturbrühe wurden unter Verwendung von Diatomenerde
(Celite 5^5, Warenzeichen) als Filterhilfsmittel filtriert und
mit den wässrigen Waschwässern kombiniert, wodurch 12 1 Filtrat
erhalten wurden. Zu dem auf diese Weise erhaltenen Kulturfiltrat wurden 3oo g Aktivkohlenpulver gegeben und es wurde gerührt. Auf
diese Weise wurde das Cephemimycin auf der Aktivkohle adsorbiert. Es wurde erneut ureter Verwendung von Diatomenerde filtriert und
mit Wasser gewaschen. Zur Eluierung des Cephemimycins aus der Aktivkohle wurden 8o?£ Aceton in zwei Portionen mit 7*5 1 verwendet,
Das Aktivkohle-Pulver wurde abfiltriert'und das Eluat wurde unter
vermindertem Druck konzentriert, wodurch 25o ml Konzentrat er-
- 19 409810/1188
-19- 23AAÜ20
halten wurden. (4l,3# Aktivitätsäusbeute). Das Konzentrat wurde
durch eine Säule geleitet, die mit 4oo ml Duolite A-2 (Cl-Typ)
gefüllt war, um das Cephemimycin darauf zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 650 ml Wasser gewaschen und mit ο,Ι η Salzsäure eluiert.
650 ml des aktiven Eluats (Ausbeute 34,3$) wurden mit ο,Ι η wässrigem Ammoniak neutralisiert. Zur Entsalzung wurden 13 g Aktivkohle-Pulver
zugesetzt, wodurch das Cephemimycin adsorbiert wurde. Sodann erfolgte zweimal eine Eluierung mit 350 ml 80^-igem
wässrigem Aceton. (Ausbeute 17,2$). Das Eluat wurde auf 2o ml
unter vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet. Auf diese Weise wurden 95o mg eines rohen Pulvers erhalten (Aktivität
86,2 mcgu/mg). Das rohe Pulver wurde in einer kleinen Menge 80$- igem wässrigem Methanol aufgelöst und auf einer Säule aufgelöst,
die mit 300 g Silikagel, Mallinckrodt CC-4 (hergestellt von
Mallinckrodt Chemicals Works) in Chloroform : Methanol : Wasser (9 J 9 ϊ 2) hergestellt worden war. Die Eluiering erfolgte mit
dem Lösungsmittelsystem der gleichen Zusammensetzung wie oben. 180 ml des aktiven Eluats wurden gesammelt, bei vermindertem
Druck zur Trockene eingedampft, in 50 ml Wasser aufgelöst, zweimal
in gleichen Portionen mit Äthylacetat extrahiert, um Verunreinigungen zu entfernen und sodann gefriergetrocknet, wodurch
8l mg Cephemimycin (Aktivität 25o mcgu/mg) als rohes Pulver erhalten
wurden (Ausbeute 4,2Ja).
2 1 des nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 aus Duolite A-2 erhaltenen
Cephemimycin enthaltenden Eluats (Aktivitätsausbeute 31,2#) wurden mit 1 η wässrigem Ammoniak neutralisiert und auf
einer Säule mit 46 g Aktivkohle für die Chromatographie, (hergestellt von Wako Junyaku K.K., Japan) die mit Wasser gepackt war,
adsorbiert. Es wurde mit 5ooml Wasser gewaschen und sodann mit 8#-igem wässrigen Aceton eluiert. 1 1 des aktiven Eluats (Ausbeute
22,6;o) wurde durch eine Säule mit 300 ml Dowex 50W χ 4 (das mit
o,öl m Natriumeitrat mit einem pH-Wert von 3 ins Gleichgewicht gebracht
worden war) geleitet, um darauf das Cephemimycin' zu adsorbieren. Sodann wurde die Säule mit 600 ml der gleichen Pufferlösung
409810/1188 -20-
- 2ο -
gewaschen und sodann mit 0,03 m Natriumeitrat mit einem pH-Wert
von 3 eluiert. 5oo ml des aktiven Eluats (Ausbeute 18,7$) wurden gesammelt und entsalzt, indem wiederum eine Chromatographie mit Aktivkohle
bei den oben angegebenen Bedingungen durchgeführt wurde, 8o ml des Eluats aus 8$-igem wässrigen Aceton wurden auf 2o ml
unter vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet. Auf diese Weise wurden 79 mg Cephemimycin als fahlgelblich-weißes
rohes Pulver erhalten (Aktivität 527 mcgu/mg) (Ausbeute 9
In einem 6oo 1-Permentationstank wurden 3oo 1 eines flüssigen
Kulturmediums mit der in Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung hergestellt. Nach der Sterilisierung wurden 5° 1 einer Impfkultur,
die zuvor in einem Medium mit der gleichen Zusammensetzung 24 Stunden lang kultiviert worden war, inokuliert und die Kultivierung
erfolgte 45,5 Stunden bei 27°C (Belüftung mit 3oo l/min., Umdrehung mit 190 Upm, Innendruck 1 kg/cm ). 35o 1 der durch die
obige Kultivierung erhaltenen Kulturbrühe wurden durch eine Filterpresse unter Verwendung von Diatomenerde als Filterhilfsmittel
filtriert, wodurch 3I0 1 des Kulturfiltrats erhalten wurden. Zu
dem so erhaltenen Kulturfiltrats erhalten wurden. Zu dem so erhaltenen KuIturfiltrat wurden 6,2 kg Aktivkohle-Pulver und 6 kg
Diatomenerde gegeben. Nach dem Rühren wurde filtriert, um das Aktivkohle-Pulver zu sammeln. Der Aktivkohle-Kuchen wurde mit
Wasser gewaschen und zweimal mit loo I 8o$-igem wässrigen Aceton
extrahiert. I90 1 des Extrakts wurden unter vermindertem Druck
konzentriert, wodurch 42 1 eines Konzentrats erhalten wurden (Aktivitätsausbeute 47,0$). Das Konzentrat wurde auf einen pH-Wert
von .8 eingestellt und durch eine Säule mit 25 1 Duolite A-2
(Acetatform) geleitet. Durch diese Maßnahme wurden 80^0 der Aktivkomponente
hierdurch geleitet. (Ausbeute 37,6$). Der Abstrom wurde
mit der wässrigen Waschflüssigkeit kombiniert, wodurch 92 1 erhalten wurden. Dazu wurden 1,84 kg Aktivkohle-Pulver gegeben. Nach
dem Rühren wurde das adsorbierte Cephemimycin zweimal mit 45 1
^m wässrigen Aceton extrahiert, wodurch 7o 1 Extrakt erhalten
- 21 409810/1188
wurden. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck auf 3 1 konzentriert. (Ausbeute 23,0$). Das Konzentrat wurde mit Wasser
auf 6 1 verdünnt, auf einen pH-Wert von 4,15 mit Essigsäure eingestellt
und durch eine Säule mit 3 1 Duolite A-2 (Acetatform) geleitet. Nach dem Waschen mit 1,5 1 Essigsäuremit einem pH-Wert
von 3,ο wurde das Cephemimycin mit einem o,2 η Pyridin-Essigsäure-Puffer
mit einem pH-Wert von 5,5 eluiert. Das aktive Eluat (18 1) wurde auf 9oo ml unter vermindertem Druck konzentriert (pH 3,o,
Ausbeute 2o,7$). Aus dem Konzentrat wurde das Cephemimycin erneut auf einer Säule mit 1,65 1 Duolite A-2 (Acetat-Form) adsorbiert.
Die Säule wurde sodann mit 7*5 1 Essigsäure mit einem pH von 3*ο
gewaschen und mit der oben genannten Pyridin-Essigsäure-Pufferlösung
eluiert. 3 1 des aktiven Eluats wurden unter vermindertem
Druck zur Trockene eingedampft (Ausbeute 2o,o^). Das rohe Pulver wurde zweimal mit 300 ml Äthanol gewaschen und in 3oo ml V/asser
aufgelöst. (Ausbeute 18,4$). 660 mg des Aktivkohle-Pulvers wurden
zugegeben und es wurde gerührt und abfiltriert (Ausbeute 17,3^).
Das Filtrat wurde auf 3o ml konzentriert. Das Konzentrat wurde
durch eine Säule mit 900 ml Amberlite CG-5o (Η-Form) geleitet,
um die Spuren des restlichen Pyridins durch Adsorption zu entfernen, Sodann wurde die Säule mit Wasser gewaschen und der Abstrom wurde
konzentriert, worauf gefriergetrocknet wurde. Auf diese weise wurden 3,94 g Cephemimycin im reinen Zustand (looo mcgu/mg) mit
einer fahlgelblich-weißen Farbe erhalten (Ausbeute
- Patentansprüche -
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Claims (5)
- Patentansprüche1". Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephemimycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces jumonjinensis Stamm Nr. ^008 in einem Nährmedium kultiviert und daß man das Antibiotikum aus der Kulturbrühe gewinnt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung unter aerobischen Bedingungen durchführt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man die Kultivierung bei Temperaturenim BereLch von 25 bis 3o°C durchführt.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis ^, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung über einen Zeitraum von 4o bis 8o Stunden durchführt.
- 5. ■" Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzei chnet, daß man ein Medium verwendet, das einen pH-V/ert im neutralen Bereich oder in dessen Nähe aufweist.0 9 8 I 0 / T 1 8 8Leerseite
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|---|---|---|---|
| OD | Request for examination | ||
| 8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: STREHL, P., DIPL.-ING. DIPL.-WIRTSCH.-ING. SCHUEBE |
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| 8364 | No opposition during term of opposition |