DE2905066A1 - Neue antibiotika sf-2050 und sf- 2050b, verfahren zur herstellung derselben und antibakterielle mittel, welche dieselben enthalten - Google Patents

Description

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MEISSNER & BOLTE

BREMEN

PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. HANS MEISSNER

Anmelder; -, dipl-ing. erich bolte

MEIJI SEIKA KAISHA, LTD.

4-16, Kyobashi 2-chome,Chuo-ku, _ _ , „„„*

Tokyo, Japan 7.Februar 1979

D 2800 BREMEN Sievogtstraße 21 Bundesrepublik Deutschland

Erfinder; _{TeIe(on M21} ._MM19

Kazunori OHBA, No. 1443, Hiyoshi Honcho, Telegramme: patmeis buemen

Kohoku-ku, Yokohama-shi,Kanagawa-ken, ^{ΤβΙβΧ: M6157 (meibo d)} Japan ^J ,„,

Unser Zeichen 1 Pl Ί

Chuhei NOJIRI, No. 4275-28, Izumi-cho, _lhrZelchen Totsuka-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan,

Yasuaki OGAWA, No. 920, Hiyoshi-Honcho, Kohoku-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan,

Jiro ITOH, No. 1443, Hiyoshi-Honcho, Kohoku-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan,

Kunikazu TOTSUGAWA, No. 1270-48, Kita Ohizumi-cho, Nerima-ku, Tokyo, Japan,

Norio EZAKI, No. 25-1, Sakuradai, Midori-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan,

Takashi SHOMURA, No. 203, Komaoka-cho, Tsurumi-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan,

Tomizo NIWA, No. 920, Hiyoshi-Honcho, Kohoku-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan,

Shigeharu INOUYE, No. 16, Isutsujigaoka, Midori-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan,

Yujirο YAMADA, No. 385-13, Shimoda-cho, Kohoku-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan

Neue Antibiotika SF-2050 und SF-2O5OB, Verfahren zur Herstellung derselben und antibakterielle Mittel, welche dieselben ■ enthalten

Die Erfindung betrifft zwei neue und wertvolle Antibiotika, welche die Bezeichnung SF-2050 und SF-2050B tragen. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Antibiotika durch Züchtung eines Stammes der Gattung Streptomyces. Noch

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Elngeiandte Modelle werden nach 2 Monaten, lallt nicht zurückgefordert, vernichtet. Mündliche Abredin, Insbesondere durch Fernsprecher bedürfen schriftlicher Bestätigung. — Die in Rechnung gestallten Kosten »Ind mit Rechnungsdatum ohne Abzug fällig.- — Bei verspäteter Zahlung werden Bankzinsen berechnet.

Gerichtsstand und Erfüllungsort Bremen. Bremer Bank, Bremen, Nr. 2 310 028 · DIa Sparkasse In Bremen, Nr. 1045855 · Postscheckkonto: Hamburg 33952-202

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ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind antibakterielle Mittel, die wenigstens eine der beiden Antibiotika bzw. Substanzen SF-2O5O und SF-2050B als aktiven Bestandteil enthalten.

Es ist bereits eine Reihe wertvoller Antibiotika mit verschiedenen Stämmen der Gattung Streptomyces hergestellt und aus den jeweiligen Kulturbrühen isoliert worden. Bei dem Versuch, neue und wertvolle Antibiotika zu finden, die gegen gram-negative und gram-positive Bakterien sowie gegen verschiedene Bakterienstämme, die bekannten Antibiotika gegenüber resistent sind, aktiv sind, wurde jetzt auch die Gärbrühe eines neuen Mikroorganismus untersucht, der die Bezeichnung Streptomyces sp. SF-2050 trägt. Dabei wurde gefunden, daß bei der Züchtung von Streptomyces sp. SF-2O5O in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Nährstoffe enthält, zwei neue Antibiotika gewonnen werden können. Erfindungsgemäß wurden diese beiden aktiven Substanzen aus der Kulturbrühe isoliert; sie werden hier und im Folgenden als Antibiotikum bzw. Substanz SF-2050 und Antibiotikum bzw. Substanz SF-2O5OB bezeichnet. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der beiden neuen Antibiotika wurden bestimmt. Dabei konnte auch festgestellt werden, daß die beiden neuen Antibiotika eine inhibierende Wirkung gegenüber ß-Lactamase aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind infolgedessen neue Antibiotika, die als antibakterielle Mittel wirksam sind und gegenüber ß-Lactamase inhibierend wirken.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dar neuen Antibiotika SF-2050 und/oder SF-2050B, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

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einen Stamm der Gattung Streptomyces, der die Fähigkeit besitzt, die Substanzen SF-2050 und SF-2050B zu produzieren, in einem wässrigen Kulturmedium, welches Kohlenstoff und Stickstoff in assimilierbarer Form enthält, unter aeroben Bedingungen über eine ausreichend lange Zeitspanne züchtet, so daß sich wenigstens eine der beiden Substanzen SF-2050 und SF-2050B in der Kulturbrühe ansammeln kann, und daß man wenigstens eine der beiden Substanzen SF-2050 und SF-2050B aus der Kulturbrühe isoliert.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können beliebige Stämme der Gattung Streptomyces verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie die Fähigkeit besitzen, die Substanzen SF-2050 und SF-2050B unter den Züchtungsbedingungen zu erzeugen. Ein spezifisches Beispiel für einen Stamm, welcher für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist, ist der Stamm SF-2050, der aus einer Bodenprobe isoliert worden ist, die in Ibaragi-Prefecture, Japan gesammelt worden ist und die jetzt die Bezeichnung Streptomyces sp. SF-2050 trägt. Dieser Stamm SF-2050 ist in der öffentlichen japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute", Chiba-City, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 4358 und außerdem bei der "American Type Culture Collection", Washington, D.C, U.S.A. unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31450 am 9.November 1978 hinterlegt worden.

Der Stamm SF-2050 weist folgende mikrobiologische Kennwerte auf:

I. Morphologische Charakteristika

Bodenmycel wird auf verschiedenen Kulturmedien reichlich gebildet; die Bildung von Luftmycel ist dagegen

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verhältnismäßig gering. Auf Nährmedien aus anorganischen Salzen-Stärke-Agar, Tyrosin-Agar oder Saccharose Nitrat-Agar, auf denen sich Luftmycel verhältnismäßig gut entwickelt, wies dieses Luftmycel monopodiale Verzweigungen auf; quirlständige Verzweigungen wurden nicht beobachtet. Die Spitzen des Luftmycels erschienen gerade. Besondere Strukturen wie Sclerotium wurden nicht beobachtet.

Bei der elektronen-mikroskopischen Beobachtung konnte festgestellt werden, daß die Oberflächenstruktur der Sporen glatt.ist. Die Sporen haben eine elliptische bis kurz-zylindrische Form und eine Größe von 0,5 Ms 0,8 χ 0,8 bis 1,4 Mikron.

II. Eigenschaften der Kulturen auf verschiedenen Kulturmedien

Die Eigenschaften der Kulturen des Stammes SF-2050 sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt. Die in der Zusammenstellung in Klammern angegebenen Farben wurden nach dem Standardwerk "Color Harmony Mannual of Container Corporation of America" festgestellt. Die Bebrütungstemperatur betrug 28 C und die Beobachtungen wurden 14 bis 21 Tage nach der Bebrütung durchgeführt.

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	-#-	7.02.	79	-	keins	Itpi η et
	Tabelle 1
Kulturmedium	Wachstum Farbe	Luftmycel	lösliches			keins
	der Rückseite		Pigment
Saccharose-	normales Wachs	schwach	keins	keins
Nitrat-Agar	tum, farblos bis	muschel-
	schwach perl	rosa			keins
	farbig	(3 ca)
Glucose-
Asp aragin-Agar	dünnes Wachs	schwach,	keins
	tum, gelb bis	weiß bis
	gelblich-braun	schwach	sehr schwach,
		gelb	weiß bis	keins
Glycerin- Asp aragin-Agar	normales Wachs	schwach,	hellgelb
	tum ,schwach	weiß bis	schwach,
	perlfarbig	schwach	muschel-
		perlfarbig (2 ba)	rosa
anorganische	gutes Wachs	muschel-	(3 ca)
Salze-Stärke-	tum, schwach	rosa bis	schwach
Agar	gelb bis gelb	hell-	muschel-
	lich-braun	melonen	rosa bis
		gelb (3 ca -	hellgelb
		3 ea)	(3 ca bis
		1 1/2 db)
Hafermehl-	normales Wachs	schwach,
Agar	tum, gelb bis	weiß
	zitronengelb
Hefeextrakt-	gutes Wachs
Malz extrakt -	tum, hell
Agar	braun
Tyrosin-Agar	gutes Wachs
	tum, hell
	braun
Nähragar	normales Wachs
	tum, hellgelb

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III. Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstums-Temperaturbereich:

der Stamm SF-2050 wächst in einem Temperaturbereich von 20 - 33⁰C auf Stärke-Agar-Medium. Die optimale Wachstumstemperatur liegt zwischen 25 und 30 C.

(2) Verflüssigung von Gelatine:

positiv (bei 2O⁰C, 14-tägige Bebrütung).

(3) Hydrolyse von Stärke: positiv (bei %PC).

(4) Koagulation von Magermilch!
negativ (bei 28°C).

(5) Peptonisierung von Magermilch: positiv (bei 28°C).

(6) Farbstoffbildungsvermögen:
negativ.

IV. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen (festgestellt in Pridham-Gottlietfs-Agarmedium bei einer Bebrütungstemperatur von 28°C):

(1) ausgenutzt werden: D-Glucose, Rhamnose. (2) zweifelhaft: D-Xylose, L-Arabinose.

(3) nicht verwendet werden: D-Fructose, D-Mannit,

I-Inosit, Saccharose, Raffinose.

V. Diaminopimelinsäure (DAP) im Hydrolysat der Gesamtzelle: LL-Form

Die vorstehend aufgeführten Charakteristika des Stammes SF-2050 können wie folgt zusammengefaßt werden: der Stamm SF-2050 gehört zur Gattung Streptomyces, das Luftmycel ist durch gerade Spitzen gekennzeichnet und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt. Die Farbe

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des Luftmycels ist anfänglich weiß bis hellgelb und wird gelegentlich muschel-rosa bis gelbstichig, wenn der Stamm altert. Der Stamm SF-2050 gehört zu den Rot- oder Gelb-Reihen nach Tresner und Backus (H.D. Tresner und F.J.Backus: Appl. Microbiol. V\_, 335 (1963)). Die Rückseite des Wachstums ist gelb bis hellbraun gefärbt; in keinem der Kulturmedien wurde ein lösliches Pigment erzeugt.

Die Eigenschaften des Stammes SF-2050 können sich verändern, wie dies gelegentlich auch bei anderen Arten von Streptomyces zu beobachten ist. So kann der Stamm SF-2050 beispielsweise Varianten oder Mutanten erzeugen, wenn er mit verschiedenen Mutagenen, beispielsweise UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequenten elektromagnetischen Wellen, radioaktiven Strahlen oder Chemikalien behandelt wird. Alle Stämme der Gattung Streptomyces, einschließlich der natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten des Stammes SF-2050 können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, solange sie die Fähigkeit besitzen, die Substanz SF-2050 und/oder die Substanz SF-2050B zu erzeugen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der vorstehend beschriebene Stamm in an sich bekannter Weise in einem Kulturmedium gezüchtet, welches Nährstoffquellen enthält, die für gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbar sind. Zu diesem Zweck können beliebige Nährstoffe verwendet werden, die auch üblicherweise bei der Züchtung bekannter Stämme der Gattung Streptomyces eingesetzt werden. Beispiele für solche Nährstoffquellen sind Glucose, Glycerin, Stärke, Stärkesirup, Melasse und Sojabohnenöl als Kohlenstoffquellen; Sojabohnenmehl, Weizenkeime, getrocknete Hefe,

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Pepton, Fleischextrakt, Maiswexchwasser, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat als Stickstoffquellen. Gegebenenfalls können auch anorganische Salze wie Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kobaltchlorid, die entsprechenden Phosphate u.a. Verbindungen zugesetzt werden. Darüberhinaus können solche organischen und anorganischen Materialien zugesetzt werden, die das Wachstum des benutzten Stammes unterstützen und die Bildung der Substanzen SF-2050 und SF-2050B begünstigen. Insbesondere die Zugabe von Kobaltionen begünstigt die Bildung der gewünschten Antibiotika.

Als Züchtungsmethode bietet sich für die vorliegende Erfindung insbesondere die Züchtung in flüssigem Medium an, insbesondere die submerse Kultur unter aeroben Bedingungen, die auch üblicherweise zur Herstellung bekannter Antibiotika angewandt wird. In dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Züchtung unter aeroben Bedingungen, geeigneterweise bei einer Temperatur von 22 bis 30°C, am häufigsten bei einer Temperatur um 28°C. Unter diesen Bedingungen erreicht die Bildung der Substanzen SF-2050-und SF-2050B in der Kulturbrühe ein Maximum nach einer Züchtungsdauer von 1 bis 4 Tagen, wobei sowohl nach der Schüttelkultur-Methode als auch nach der Tankkultur-Methode (Züchtung in Ruhe) gearbeitet werden kann.

Zur Untersuchung der Substanzen SF-2050 und SF-2050B, die erfindungsgemäß wie beschrieben erzeugt worden sind, kann folgende Methode angewandt werden: Das Prüf-Kulturmedium enthielt 0,1 % Glucose, 0,5 % 30' Trypton, 0,25 % Hefeextrakt und 1,5 % Agar (pH 7,0). Als Prüf-Mikroorganismus wurde Bazillus stearothermophilus verwendet.«Die Prüfung wurde nach der üblichen Papierscheiben-Methode in der Weise durchgeführt,

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daß der Durchmesser der Hemmzone nach 16-bis 18-stündiger Züchtung bei 55°C bestimmt wurde. Die Substanzen SF-2050 und SF-2050B gemäß vorliegender Erfindung sind beide Verbindungen saurer Natur, die jeweils eine Carb-5 oxylgruppe (-COOH) und eine Sulfonsäuregruppe (-SO-H) im Molekül enthalten. Die physiko-chemischen Eigenschaften werden im Folgenden noch näher erläutert werden. Infolge dieser physiko-chemischen Eigenschaften können sie aus der Kulturbrühe, die bei der Züchtung des Stammes SF-2050 anfällt, isoliert und dann gereinigt werden. Beispielsweise lassen sich die Substanzen SF-2050.und SF-2050B aus der Gärbrühe des Stammes SF-2050 wie folgt isolieren:
die Gärbrühe, die die Substanzen SF-2050 und SF-2050B enthält, wird filtriert, um Feststoffe abzutrennen. Das so gewonnene Brühenfiltrat wird mit Aktivkohle behandelt, an der die gewünschten Antibiotika adsorbiert werden. Die Aktivkohle wird anschließend mit 50#igem Aceton (einer Mischung aus Wasser und Aceton im Volumenverhältnis 1:1) eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen und die Fraktionen, die die aktiven Substanzen enthalten, werden vereinigt und durch Verdampfen des Wassers und des Acetons unter vermindertem Druck eingeengt. Die verbleibende konzentrierte Lösung wird unter vermindertem Druck destilliert zur Entfernung des restlichen Acetons. Der Rückstand wird mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. einem Halogenalkan wie Dichlormethan, welches eine gewisse Menge eines quaternären Ammoniumsalzes wie Benzyld.imethylcetylammoniumchlorid oder Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat enthält, extrahiert. Der so gewonnene Extrakt wird wiederum mit Wasser extrahiert, welches Natriumiodid enthält. Die gewonnene wässrige Lösung, die die Substanzen SF-2050 und SF-2050B enthält, wird der Gefriertrocknung unterworfen, durch welche man ein pulverförmiges Roh-

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produkt erhält, welches aus den Substanzen SF-2050 und SF-2050B besteht. Zur Reinigung und Trennung wird dieses Rohprodukt einer chromatographischen Behandlung unterworfen, wobei man beispielsweise mit einem Anionen-Austauscher, der aus Diäthylaminoäthyldextran besteht, arbeitet. Man erhält auf diese Weise aktive Fraktionen, die die Substanz SF-2050 enthalten, sowie weitere aktive Fraktionen, die die Substanz SF-2050B enthalten. Die Reinigung und Trennung kann auch mit Hilfe eines GeI-filtrationsmittels auf der Basis von Polyacrylamiden oder mit einem synthetischen Adsorberharz, welches aus einem mikroporösen Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol besteht, durchgeführt werden. Die aktiven Fraktionen, die nur die Substanz SF-2050 enthalten, oder die aktiven Fraktionen, die nur die Substanz SF-2050B enthalten, werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Auf diese Weise erhält man die Substanzen getrennt, pulverförmig und in reiner Form, so daß sie bei der Prüfung mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie an Silikagel oder Cellulose Einzelflecke ergeben, wenn mit verschiedenen Lösungsmitteln als Laufmittel entwickelt wird.

Die erfindungsgemäßen Substanzen SF-2050 und SF-2050B sind bei Temperaturen, die höher liegen als Umgebungstemperatur, und auch unter sauren Bedingungen sehr instabil. Bei der Abtrennung der Substanzen SF-2050 und SF-2050B aus der Gärbrühe ist es daher sehr wichtig, zu verhindern, daß die Lösungen im Verlauf der Aufarbeitungs- und Reinigungsstufe sauer werden; die Behandlung der Lösungen muß schnell bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden.

Weil die Substanzen, SF-2050 und SF-2050B unter sauren Bedingungen sehr instabil sind, ist es äußerst schwierig,

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sie in Form der freien Säuren zu isolieren. Aus diesem Grund ist es in der Praxis vorzuziehen, die beiden Substanzen in Form ihrer Alkalimetallsalze, z.B. als Natrium- oder Kaliumsalze, oder auch als Bariumsalze zu gewinnen. Neutralisierte wässrige Lösungen der Substanz SF-2050 oder SF-2050B werden der Gefriertrocknung unterworfen; die Substanzen fallen dabei in Form amorpher Pulver an. Die Reinheit der so gewonnenen Salze ist Schwankungen unterworfen, die von der Potenz oder dem Gehalt der Antibiotika in der aufgearbeiteten Gärbrühe abhängen. Die Natur des Salzes von SF-2050 oder SF-2050B wird von dem Kation bestimmt, welches in den Lösungen bei der Behandlung der Substanzen bei der Aufarbeitung und Reinigung vorhanden ist. Beispielsweise erhält man die Substanzen SF-2050 und SF-2O5OB in Form ihrer Dinatriumsalze, wenn man eine wässrige Lösung von Natriumchlorid zum Eluieren bei der chromatographischen Behandlung verwendet und das Chromatographieren an einem Diäthylaminoäthyldextran vorgenommen wird. Außer in Form der Dinatriumsalze können die Substanzen SF-2050 und SF-2O5OB auch in Form anderer pharmazeutisch akzeptabler Salze gewonnen werden, beispielsweise in Form der Dikaliumsalze, der Erdalkalimetallsalze wie Calcium- oder Bariumsalze, der Ammoniumsalze oder anorganischen Aluminiumsalze sowie in Form von Salzen mit substituierten Ammoniumverbindungen, d.h. als quaternäre Ammoniumsalze (organische Salze). Diese pharmazeutisch akzeptablen Salze können in derselben Weise hergestellt werden, wie vorstehend für das Dinatriumsalz beschrieben. Das Dinatriumsalz der Substanz SF-2050 oder der Substanz SF-2050B kann in ein anderes Salz mit unterschiedlichem Kation umgewandelt werden, indem man die wässrige Lösung des Dinatriumsalzes durch eine "Kolonne mit einem Kationenaustauscherharz leitet, in welchem die Wasserstoffionen durch das

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7.02.79 gewünschte Kation ersetzt worden sind.

Die Substanz SF-2050 und die Substanz SF-2O5OB sind beide dibasische Säuren. Die jeweiligen Natriumsalze sind farblose Pulver ohne definierten Schmelzpunkt. Die Reaktion mit Ninhydrin ist negativ, die mit Natrium jodid positiv. Die Dinatriumsalze sind farblose, in Wasser lösliche Pulver; die Löslichkeit in Methanol ist geringer und die Löslichkeit in Äthylacetat, Chloroform und Benzol sehr schwach.

Die Substanz SF-2050 weist darüberhinaus folgende Kenndaten auf:

(a) sie stellt eine zweibasige Säure dar, die sich bei der Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese bei pH 6,7 auf die Anode zu bewegt; die Mobilität bei dieser Elektrophorese beträgt 1,6, wenn man die Mobilität von Cephamycin A als Vergleichssubstanz mit 1,0 ansetzt.

Das Dinatriumsalz der Substanz SF-2050 weist folgende Kenndaten auf:

(a) sie besitzt einen charakteristischen Absorptions-Peak bei 295nm im Ultraviolett-Absorptionsspektrum in wässriger Lösung;

(b) das Infrarot-Absorptionsspektrum des Dinatriumsalzes, tablettiert in Kaliumbromid, entspricht

der Kurve, die in Figur 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist (Peaks bei 3350, 2940, 1750, 1600, 1390, 1250, 1230, 1120, 940, 900 und 700 cm"¹);

(c) das kernmagnetische Wasserstoff-Absorptionsspektrum in Deuterowasser entspricht der in Figur 3 der bei-

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ι?

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gefügten Zeichnungen dargestellten Kurve;

(d) die Werte der Elementaranalyse der Substanz sind: C 32,5 % H 5,0 %, N 5,8 % und S 13,3%;

(e) bei der DünnschichtChromatographie an Cellulose

ergibt die Substanz einen Einzelfleck bei R.„ = 0,36, wenn η - Butanol - Isopropanol - Wasser (7:7:6) als Laufmittel verwendet wird, bzw. bei R^ 0,59, wenn Acetonitril-Wasser (7:3) als Laufmittel eingesetzt wird, und bei R^ = 0,22, wenn man mit Isopropanol-Wasser (8:2) als Laufmittel arbeitet;

(f) sie verliert ihre antibakterielle Wirkung, wenn sie mit Hydroxylamin behandelt wird;

(g) sie besitzt eine Hemmwirkung gegenüber ß-Lactamase.

Die Substanz SF-2O5OB weist folgende Kenndaten auf:

(a) die Substanz stellt eine zweibasige Säure dar, die bei der Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese bei pH 6,4 zur Anode wandert, wobei die Mobilität bei dieser Elektrophorese 1,58 beträgt, wenn man die Mobilität von Cephamycin A als Vergleichssubstanz mit 1,0 ansetzt.

Das Dinatriumsalz der SF-2O5OB weist folgende Kenndaten auf:

(a) die Substanz besitzt charakteristische Absorptions-Peaks bei 228nm und 305nm im Ultraviolett-AbsorptionsSpektrum in wässriger Lösung;

(b) im Infrarot-Absorptionsspektrum (tablettiert in Kaliumbromid) zeigt die Substanz die in Figur 6 der beigefügten Zeichnungen dargestellte Kurve (Peaks bei 3450, 1760, I63O, 1520, 1410, 1260, 1080, 940, 910 und 870 cm"¹);

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(c) das kernmagnetische Wasserstoff-Resonanzspektrum im Deuterowasser entspricht der in Figur 7 der beigefügten Zeichnungen dargestellten Kurve;

(d) das kreisförmige Kristallspektrum der Substanz ist in Figur 8 der beigefügten Zeichnungen zu erkennen;

(e) bei der Elementaranalyse ergaben sich folgende Werte:

C 33,5 %, H 3,9 %, N 5,7 % und S 13,8 %;

(f) bei der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an einer Kolonne mit einer Größe von 4 mm χ 30 cm, die mit mit aliphatischen Kohlenwasserstoffen behandeltem Silikagel (dem Handelsprodukt "/U Bondapak" (NH₂) der Firma Waters Co., U.S.A.) gefüllt war, ergab sich eine Verweildauer von 22 Minuten und 20 Sekunden bei der Entwicklung mit 0,3 ml pro Minute einer auf 0,01m gepufferten Phosphatlösung bei pH 6,5;

(g) die Substanz ergibt einen Einzelfleck bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose bei R- = 0,42, wenn n-Butanol-Isopropanol-Wasser (7:7:6) als Laufmittel verwendet wird, bzw. bei R^ = 0,32 bei Verwendung von 80%igem wässrigem Propanol (d.h. einer Mischung aus Wasser und Propanol im Volumenverhältnis von 8:2) und bei R~ = 0,65 bei

Aft<\L· J-

Verwendung von Aceton-Wasser (7:3) als Laufmittel;

(h) die Substanz verliert ihre antibakterielle Wirkung bei der Behandlung mit Hydroxylamin;

(i) die Substanz weist eine Hemmwirkung gegenüber ß-Lactamase auf.

Weitere physiko-chemische Eigenschaften, zusätzlich zu den oben aufgeführten des Natriumsalzes der Substanz SF-2050 gemäß vorliegender Erfindung sind im Folgenden

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zusammengestellt; die Substanz wurde in reinster Form als amorphes Pulver bei der Gefriertrocknung einer neutralen wässrigen Lösung gewonnen; die Substanz enthält möglicherweise einige wenige Prozent Wasser sowie nicht feststellbare Spuren von Verunreinigungen.

1. Das Natriumsalz der Substanz SF-2050 liegt im wesentlichen in Form des Dinatriumsalzes vor, da die freie Säure nach den Ergebnissen der Elementaranalyse und der Elektrophorese eine zweibasige Säure ist.

2. Das Natriumsalz der Substanz SF-2050 wandert bei der Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese in Pyridin-gepufferter Acetatlösung bei pH 6,7 zur Anode und weist dabei eine Mobilität von 1,6 auf, wenn man die Mobilität von Cephamycin A als Vergleichssubstanz mit 1,0 annimmt.

3. Das Natriumsalz ist etwas stabil, wenn es in der Kälte in getrocknetem Zustand gelagert wird. In wässriger Lösung ist das Natriumsalz unter sauren Bedingungen sehr unbeständig und unter neutralen Bedingungen unbeständig; die höchste Stabilität besitzt es bei einem pH-Wert von 7 bis 8. Aber selbst unter neutralen Bedingungen kann das Salz leicht bei erhöhter Temperatur zersetzt werden. Wird eine neutralisierte wässrige Lösung des Natriumsalzes mit der gleichen Volumenmenge einer wässrigen Lösung von 0,02m Hydroxylamin vermischt und läßt man anschließend die gewonnene Mischung bei Umgebungstemperatur 30 Minuten oder länger stehen, so verschwindet die antibakterielle Wirkung vollständig und der charakteristische Absorptions-Peak bei 295nm ist nicht mehr feststellbar.

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4. Das Natriumsalz ist leicht löslich in Wasser, weniger gut löslich in Methanol und im wesentlichen unlöslich in Chloroform und Äthylacetat.

5. Die Substanz SF-2050 (das Natriumsalz) weist

keinen definierten Schmelzpunkt auf und zersetzt sich langsam bei 150⁰C oder darüber.

6. Das Natriumsalz weist folgende Elementaranalyse . auf:

C 32,5 %, H 5,0 %, N 5,8 % und S 13,3 %.

7. Das Natriumsalz zeigt in einer Konzentration von 38/ug/ml in m/200-gepufferter Phosphatlösung (pH 7) ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum auf, welches in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist und welches einen charakteristischen Absorptions-Peak bei 295nm aufweist.

8. Das Natriumsalz, tablettiert in Kaliumbromid, besitzt ein Infrarot-Absorptionsspektrum, welches aus Figur 2 der beigefügten Zeichnungen zu erkennen ist.

9. Das Natriumsalz weist in Deuterowasser ein kernmagnetisches Wasserstoff-Resonanzspektrum auf, welches in Figur 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist.

10. Die spezifische Drehung beträgt (a)^² = -46° (c=0,1; H₂O).

11. Das Natriumsalz zeigt im Wasser in einer Konzentration von 1 mg/ml eine Drehkristall-Spektralkurve wie in Figur 4 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.

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2Λ

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12. Die R«-Werte bei der Dünnschichtchromatographxe an Cellulose sind wie folgt:

(a) R_f = 0,36 bei Verwendung von n-Butanol-Isopropanol-Wasser (7:7:6) als Laufmittel,

(b) R- = 0,59 bei Verwendung von Acetonitril-Wasser (7:3) als Laufmittel und

(c) Rf. = 0,22 bei Verwendung von Isopropanol-Wasser (8:2) als Laufmittel.

13. Das Natriumsalz gibt eine positive Farbreaktion, die die Anwesenheit einer Sulfoxidogruppe im Molekül anzeigt. Hierzu wird eine Probe des Natriumsalzes auf ein Filterpapierblatt oder auf eine Silikagel-Dünnschicht gegeben und mit einer Mischung aus 10 Volumenteilen einer 0,5%igen wässrigen Natriumjodidlösung und 1 Volumenteil konzentrierter Chlorwasserstoffsäure besprüht, anschließend 15 Minuten im Dunklen unter vermindertem Druck in einem Exsikkator stehengelassen, welcher als Trockensubstanz Natriumhydroxid enthält. Das Filterpapierblatt oder die Silikagel-Dünnschicht wird dann aus d.em Exsikkator entnommen und mit einer 0,5%igen wässrigen Lösung von löslicher Stärke besprüht, wobei sich eine Purpurfärbung entwickelt, welche die Freisetzung von elementarem Jod anzeigt.

Das Natriumsalz reagiert auf Ninhydrin negativ.

Weitere physikο-chemische Eigenschaften des Natriumsalzes der Substanz SF-2050B sind im Folgenden aufgeführt; eine Analysenprobe dieser Substanz konnte in Form eines amorphen Pulvers durch Gefriertrocknung ihrer neutralen wässrigen Lösung gewonnen werden; die Probe enthält mq§.icherweise einige wenige Prozent Wasser und nicht feststellbare Spuren von Verunreini-

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- 18· - 7.02.79

gungen.

1. Das Natriumsalz der Substanz SF-2050B liegt im wesentlichen als Dinatriumsalz vor, da die freie Säure aufgrund der Ergebnisse der Elementaranalyse und der Elektrophorese als zweibasige Säure anzusehen ist.

2. Das Natriumsalz der Substanz SF-2050B wandert bei der Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese in Pyridin-gepufferter Acetatlösung bei pH 6,4 zur Anode und zeigt bei dieser Elektrophorese eine Mobilität von 1,58, wenn man die Mobilität von Cephamycin A als Vergleichssubstanz mit 1,0 annimmt.

3. Das Natriumsalz ist bei der Lagerung als festes Pulver in der Kälte und in Gegenwart eines wasserbindenden Mittels etwas beständig. In wässriger Lösung ist das Natriumsalz unter sauren Bedingungen sehr unbeständig und unter neutralen Bedingungen ebenfalls unbeständig; es zeigt seine größte Stabilität bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8. Selbst unter neutralen Bedingungen läßt es sich leicht bei erhöhter Temperatur zersetzen. Wird eine neutralisierte wässrige Lösung des Natriumsalzes mit der gleichen Volumenmenge einer wässrigen Lösung von 0,02m Hydroxylamin vermischt und läßt man anschließend die Mischung bei Umgebungstemperatur 30 Minuten oder länger stehen, so verschwindet die antibakterielle Wirkung vollständig, ebenso wie der charakteristische Absorptiongs-Peak bei 3O5nm.

Das Natriumsalz ist verhältnismäßig leicht löslich im Wasser, weniger löslich in Methanol und im wesentlichen unlöslich in Chloroform und Äthylacetat.

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-Vi- 7.02.79

5. Die Substanz SF-2050 B (das Natriumsalz) besitzt keinen definierten Schmelzpunkt und zersetzt sich langsam bei Temperaturen von 15O°C und darüber.

6. Bei der Elementaranalyse des Natriumsalzes wurden folgende Werte festgestellt:·

C 33,5 %, H 3,9 %, N 5,7 % und S 13,8 %.

7. Das Natriumsalz weist in einer Konzentration von 25/Ug/ml in einer m/100-gepufferten Phosphatlösung (pH 6,5) ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum auf, wie in Figur 5 der beigefügten Zeichnungen dargestellt; man erkennt charakteristische Absorptiongs-Peaks bei 228nm und 305nm.

8. Das Natriumsalz, tablettiert in Kaliumbromid, besitzt ein Infrarot-Absorptiongsspektrum wie in Figur 6 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.

9. Das Natriumsalz weist im Deuterowasser ein kernmagnetisches Wasserstoff-Resonanzspektrum auf,wie in Figur 7 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.

10. Das Natriumsalz zeigt in 1/1OOm-gepufferter Phosphatlösung (pH 6,5) eine Drehkristall-Spektralkurve, wie in Figur 8 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.

11. Die R_f-Werte bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose sind wie folgt:

(a) R^ = 0,42 bei Verwendung von n-Butanol-Isopropanol-Wasser (7:7:6) als Laufmittel,

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2<l·

7.02.79

(b) R« = 0,^fF bei Verwendung von .Acetonitril-WasserN^'V¹N_n (7:3) als Laufmittel und \Ä_X

(c) R^. = O,ßÖ bei Verwendung von Isopropanol-Wasser

(8:2) als Laufmittel.

12. Bei der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an einer Kolonne mit einer Größe von 4 mm χ 30 cm, die mit Silikagel ("/U Bondapak" (NH₂)) gefüllt war, wies das Natriumsalz eine Verweildauer von 22 Minuten und 20 Sekunden auf, wenn als Laufmittel eine 1/10Omgepufferte Phosphatlösung (pH 6,5) verwendet und' die Fließgeschwindigkeit auf 0,3 ml pro Minute eingestellt wurde.

13. Farbreaktionen:

gegenüber Kaliumpermanganat und Natriumiodid sind die Farbreaktionen positiv, gegenüber Ninhydrin sind die Farbreaktionen negativ.

In den beigefügten Zeichnungen bedeuten:

Figur 1 die Kurve des Ultraviolett-Absorptions-

spektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-2050 gemäß vorliegender

Erfindung (38/ug/ml in i/200m-gepufferter Phosphatlösung bei pH 7);

Figur 2 die Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-2050 gemäß vorliegender

Erfindung, tablettiert in Kaliumbromid;

Figur 3 die Kurve des kernmagnetischen Wasserstoff-Absorptionsspektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-2050

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7.02.79

gemäß vorliegender Erfindung, bestimmt in Deuterowasser bei 100 MHz;

Figur 4 die Kurve des Drehkristallspektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-2050;

Figur 5 die Kurve des Ultraviolettabsorptionsspektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-2O5OB gemäß vorliegender Erfindung (25/ug/ml, in 1/iOOm-gepufferter Phosphatlösung

bei pH 6,5);

Figur 6 die Kurve des Infrarotabsorptionsspektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-2050B, tablettiert in Kaliumbromid;

Figur 7 die Kurve des kernmagnetischen Wasserstoff-Resonanzspektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-2050B, bestimmt in Deuterowasser bei 100 MHz;

Figur 8 die Kurve des Drehkristallspektrums einer Probe des Natriumsalzes der Substanz SF-2050B, bestimmt in 1/100m-gepufferter Phosphatlösung bei pH 6,5.

Die antibakterielle Wirkung der Substanzen SF-2050 und SF-2050B gemäß vorliegender Erfindung, d.h. die Wirkung, mit der die> Substanzen das Wachstum verschiedener Bakterien hemmen, wurde nach der üblichen Petri-

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2905Q66

- .22 - 7.02.79

schalen-Methode bestimmt. Dazu wurden die Substanzen SF-2050 und SF-2O5OB in Form ihrer Natriumsalze jeweils in destilliertem V/asser in den in der folgenden Tabelle 2 angegebenen Konzentrationen gelöst. Mit den so hergestellten Testlösungen wurden Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 8 mm imprägniert und anschließend an der Luft getrocknet. Alle so behandelten Papierscheiben wurden auf eine Platte mit einem Versuchs-Bebrütungsmedium (1), (2) oder (3) mit der in der folgenden Tabelle 2 angegebenen Zusammensetzung gelegt. In dem Bebrütungsmedium war auch der Test-Mikroorganismus enthalten. Die Platte wurde auf eine Agar-Schicht in der Petrischale gelegt. Die Bebrütung erfolgte bei 37°C in 16 Stunden. Anschließend wurde der Durchmesser der Hemmzone, die sich um die Papierscheibe ausgebildet hatte, gemessen. Die Ergebnisse der Versuche sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt.

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	Tabelle 2	20	7.02.79	Hemm-	38,5 36,3 32,2	(D
	Konzentra tion der	10		Substanz Substanz Bebrütungs- SF-2050 SF-2050B medium	-
Test organismus	g epruften Antibiotika (yug/ml)	80 40	Durchmesser der zone (mm)	38,0 32,4 30,6	23,5 20,5 17,6	(2)
	10 5 2,5	20		26,8	- -
Bacillus stearothermo- philus	1,25	10		18,6 15,5 12,4	25,6 21,5	(3)
	80 40 20	10 5	11,0	16,7
Bacillus subtilis ATCC 6633	10	2,5 ■	23,3 18,4
	Staphylococcus 80 aureus 209P ^0	1,25	15,1	25,0 21,5	(2)
		80 40	12,1	19,9
		20	22,3 19,0	-
Escherichia coli K-12	10	14,9	22,5 19,0	(2)
	11,2	16,4
	21,9 18,7	-
Vibrio percolans	14,8	30,0 28,2	(2)
	12,0	'23,6
	24,5 21,0	-
Proteus mirabiles	17,9
	14,6

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290SQ6S

7.02.79

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Klebsiella pneumoniae

80
40
20
10

17	,2	17	,6
12	,7	16	,6
11	,5	13	,4

(2)

Die Bebriitungsmedien (1), (2) und (3) wiesen folgende Zusammensetzung auf:

Bebrütuni	;smedium	Bebrütungsmedium (2?	0,5%	Bebrütungsmedium (3)	1,0%
Glucose	0,1 %	Polypepton	0,3%	Polypepton	0,5%
Trypton	0,5 %	Fleisch extrakt	1,5%	Fleisch extrakt	0,25%
Hefe extrakt	0,25%	Agar		Natrium chlorid	1,5%
Agar	1,5 %			Agar
(pH 7,0)		(pH 7,0)	(pH 7,0)

Durch weitere Versuche konnte festgestellt werden, daß die Substanzen SF-2050 und SF-2050B beide die Fähigkeit haben, die Wirkung von ß.-Lactamase zu inhibieren; die Bestimmung erfolgte nach der Methode von Sargent (M.G. Sargent, "Journal of Bacteriology" 95, 1493 (1968)). Nach der Methode von Sargent wird die Hemmwirkung gegenüber ß-Lactamase wie folgt bestimmt: es werden zunächst wie folgt vier Reagentien hergestellt:

Reagenz A: eine Penicillinase wurde in 0,1m-gepufferter Phosphatlösung (pH 7,0) gelöst und die entstandene Lösung wurde mit der gleichen gepufferten Phosphatidsung auf eine Potenz verdünnt, daß sich eine Lichtabsorption

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7.02.79

(optische Dichte) von etwa 0,5 bei einer Lichtwellenlänpe von 490nm, gemessen unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen, ergibt.

Reagenz B: 1,3?oige Lösung des Kaliumsalzes von Penicillin G in Wasser.

Reagenz C: 0,1n-gepufferte Phosphatlösung, pH 7,0.

Reagenz D: Jod-gepufferte Acetatlösung, die nach der Methode von Sargent hergestellt wurde.

Für den Kontrollversuch wurden 0,5 ml Reagenz B und 2 ml Reagenz C zusammen in ein Reagenzglas gegeben und die Mischung in dem Reagenzglas wurde 5 Minuten auf 30⁰C erhitzt. Danach wurden 0,5 ml Reagenz A in das Reagenzglas gegeben und die entstandene Mischung wurde 30 Minuten bei 30°C gehalten und dann mit weiteren 5 ml Reagenz D vermischt. Nach 10-minütigem Stehen wurde die Lichtabsorption (bezw. die optische Dichte) der Reaktionslösung bei einer Lichtwellenlänge von 490nm bestimmt und als Wert a ausgedrückt. Als Blindversuch für diesen Kontrollversuch wurden 0,5 ml Reagenz B und 2- ml Reagenz C zusammen in ein Reagenzglas gegeben und die Mischung 5 Minuten auf 30¹C erhitzt. Der Inhalt des Reagenzglases wurde weitere 30 Minuten bei 30⁰C gehalten und dann mit 5 ml Reagenz D und unmittelbar danach mit 0,5 ml Reagenz A vermischt.

Die Mischung ließ man 10 Minuten stehen und danach wurde die Absorption der entstandenen Reaktionslösung bei 490nm bestimmt und als Wert b ausgedrückt. Zur Bestimmung der Hemmwirkung der Substanz SF-2050 oder SF-2050B wurden 0,5 ml Reagenz B und Reagenz C, welches eine Lösung der Substanz SF-2050 oder SF-2O5OB (als Penicillinase-Inhibitor) in der richtigen Hemmkonzentration in Reagenz C darstellt, zusammen in ein Reagenzglas gegeben und die Mischung wurde 5 Minuten

909833/0762 BAD

3ο

- 7.02.79

auf 30⁰C erhitzt. Der Inhalt des Reagenzglases wurde dann mit 0,5 ml Reagenz A und 5 ml Reagenz D in derselben Weise wie bei dem Kontrolltest umgesetzt. Die Absorption der Reaktionslösung wurde bei 490nm bestimmt und als Wert c ausgedrückt. Der Blindversuch für diesen Hemmtest wurde in derselben Weise durchgeführt, wie dies bei dem Kontrolltest beschrieben worden ist, wobei jedoch Reagenz C anstelle von Reagenz C verwendet wurde. Die Absorption der Reaktionslösung bei 490nm wurde bestimmt und als Wert b¹ ausgedrückt.

Die vorstehend beschriebenen Tests wurden gleichzeitig durchgeführt. Die Hemmung der ß-Lactamase durch den Hemmstoff wurde nach folgender Gleichung berechnet:

Hemmung {%) = ( 1 - ) χ 100

D — a

Wie eingangs bereits gesagt, sind die Substanzen SF-2050 und SF-2O5OB nicht nur gegen gram-positive und gram-negative Bakterien wirksam, sondern wirken auch gegen resistente Bakterien, die die Fähigkeit zur Bildung von ß-Lactamase haben. Sie sind infolgedessen wertvolle Antibiotika, die zur Behandlung bakterieller Infektionen bei Menschen und Haustieren verwendbar sind. Darüberhinaus können die Substanzen SF-2050 und SF-2O5OB als antibakterielle Mittel oder als Desinfektionsmittel zum Sterilisieren von Nahrungsmitteln sowie von chirurgischen und medizinischen Instrumenten verwendet werden. Die Substanzen SF-2050 und SF-2O5OB können allein oder in Mischung miteinander verwendet werden; sie können auch in Verbindung mit beliebigen Antibiotika vom ß-Lactam-Typ, beispielsweise Ampicillin, eingesetzt werden.

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7.02.79

Die Substanzen SF-2050 und SF-2O5OB gemäß vorliegender Erfindung können sowohl in Form der freien Säuren als auch in Form ihrer pharmazeutisch akzeptablen Salze, beispielsweise des Natriumsalzes und des Kaliumsalzes zu injizierbaren Lösungen verarbeitet werden, indem man sie in geeigneter Konzentration in einer physiologischen Salzlösung oder in einem anderen üblichen pharmazeutisch akzeptablen flüssigen Trägermaterial löst, beispielsweise in wässrigen Vehikeln wie Ringers-Injektionslösung oder Dextrose-Injektionslösung. Sie lassen sich auch zu anderen Verabreichungsformen verarbeiten, indem man sie mit festen, pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterialien wie Talcum, Stärke oder Calciumcarbonat vermischt. Die injizierbaren Lösungen der Substanzen SF-2050 und SF-2050B können intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal verabreicht werden. Als antibakterielles Mittel können beide Substanzen SF-2050 und SF-2050B in Dosen von 50 bis 1500 mg, insbesondere 100 bis 1000 mg bei Erwachsenen verabreicht werden, und zwar zwei, drei oder vier mal pro Tag. Eine geeignete Dosierung liegt bei etwa 2 mg bis 500 mg/kg/Tag. .

In dem erfindungsgemäß in Betracht gezogenen antibakteriellen Mittel soll die Menge an aktiver Substanz, d.h. an Substanz SF-2050 und/oder SF-2050B oder an pharmazeutisch akzeptablen Salzen dieser Verbindungen, neben einem pharmazeutisch akzeptablen flüssigen oder festen Trägermaterial zwischen 5 und 50 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtpräparat, liegen.

Die nun folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

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290S066

- Se - 7.02.79

Beispiel 1

Herstellung der Substanz SF-2050

(1) Bebrütung des Stammes SF-2050

Es wurde eine Vorratskultur von Streptomyces sp. Stamm SF-2050 (Hinterlegungsnummer FERM-P 4358 oder ATCC 314-50) verwendet; eine Schlinge voll dieser Vorratskultur wurde in 10 ml eines sterilisierten Kulturmediums aus 1,0 % löslicher Stärke und 3,0 % Sojabohnenmehl (pH 7,0 vor dem Sterilisieren), die sich in einem weiten 50 ml-Reagenzglas befanden, eingeimpft. Die Bebrütung erfolgte während 48 Stunden bei 28⁰C. Ein Milliliter der so gewonnenen Impfkultur wurde dazu verwendet, fünf Sakaguchi-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml, die jeweils 100 ml des genannten Kulturmediums enthielten, zu impfen; die Bebrütung der Kolben erfolgte während 24 Stunden bei 28°C. Die zweite so gewonnene Impfkultur (500 ml) wurde wiederum zum Impfen von 20 1 des Kulturmediums mit der angegebenen Zusammensetzung, die sich in einem 30 1-Gärbehälter befanden, verwendet. Das geimpfte Medium wurde unter Belüftung und unter Rühren bzw. Schütteln während 24 Stunden bei 28°C bebrütet. Die dritte so gewonnene Impfkultur (15 l) wurde zum Impfen von 200 1 eines Produktions-Kulturmediums in einem 300 1-Gärbehälter verwendet. Das Produktions-Kulturmedium enthielt 2,0 % Glucose, 1,0 % Sojabohnenmehl, 0,1 % K₂HPO^, 0,02 % CaCO₃ und 0,0001 % CoCl₂.6H₂O (ph 6,5 vor dem Sterilisieren) . Die Bebrütung erfolgte unter Belüftung und Schütteln während 44 Stunden bei 28°C. Nach der Bebrütung wurde die Kulturbrühe mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert; man erhielt so 170 1 Brühenfiltrat.

(2) Gewinnung der Substanz 3F-2050

Das gewonnene Brühenfiltrat (170 l) wurde durch eine

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£3»

7.02.79

Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 10 1 entsprechende Menge Aktivkohle enthielt, um die aktiven Substanzen zu adsorbieren. Die Kohlekolonne wurde zweimal mit je 6 1 Wasser gewaschen und dann mit 50%-igem wässrigen Aceton eluiert. Das Eluat wurde in 8 1-Fraktionen aufgefangen und die vier Fraktionen Nr. 1, 2, 3 und 4 wurden verwendet. Die Fraktionen Nr. 2 und 3 wurden vereinigt und auf ein Volumen von 7 1 eingeengt, indem man das Aceton unter vermindertem Druck abdestillierte. Die entstandene konzentrierte Lösung wurde mit 7 1 Dichlormethan, welches 0,2 % (Gewicht/Volumen) Benzyldimethylcetylammoniumchlirid enthielt, unter Rühren vermischt, um die aktiven Substanzen zu extrahieren. Die Dichlormethanschicht wurde nochmals mit 700 ml Wasser, welches 1 % (Gewicht/Volumen) Natriumiodid enthielt, extrahiert, um die Überführung der aktiven Substanzen in die wässrige Phase zu erreichen. Der so gewonnene wässrige Extrakt wurde durch eine 1 1-Kolonne geleitet, die mit einem Anionenaustauscher (Diäthylaminoäthyldextran) gefüllt war und die durch Behandlung mit einer Phosphatlösung (pH 7) abgepuffert worden war. Auf diese Weise wurden die aktiven Substanzen an dem Anionenaustauscher der Kolonne adsorbiert. Die Kolonne wurde anschließend mit 6 1 einer Lösung gewaschen, die 0,1m Natriumchlorid, gelöst in 20 millimolarer gepufferter Phosphatlösung (pH 7), enthielt. Die Eluierung der aktiven Substanzen aus der Kolonne wurde unter Verwendung einer Lösung als Eluierungsmittel durchgeführt, die 0,14m Natriumchlorid, gelöst in dem gleichen Volumen der bereits genannten gepufferten Phosphatlösung (pH 7), enthielt. Das Eluat wurde in 150 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen waren die Fraktionen Nr. 32 bis 52, die das Natriumsalz der Substanz SF-2050 enthielten, sowie die Fraktionen Nr. 78 bis 98, die das Natriumsalz der

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29050:68

7.02.79 Substanz SF-205OB enthielten.

Die Fraktionen 32 bis 52 wurden vereinigt und zusammen über eine Kolonne mit einer einem Volumen von 25 ml entsprechenden Menge Aktivkohle geleitet, um die Adsorption der aktiven Substanzen (das Natriumsalz der Substanz SF-2050) zu erreichen. Diese Aktivkohlekolonne wurde zweimal mit je 10 ml Wasser gewaschen und dann mit 290 ml 50%igern wässrigen Aceton eluiert, um die . aktive Substanz zu insolieren. Das Eluat wurde auf 110 rnl eingeengt, indem man das Wasser und das Aceton unter vermindertem Druck verdampfte. Das entstandene Konzentrat wurde durch eine Kolonne geleitet, welche eine einem Volumen von 100 ml entsprechende Menge des bereits genannten Anionenaustauscherharzes (Diäthylaminoäthyldextran) enthielt und die durch Behandlung mit einer gepufferten Phosphatlösung (pH 7) abgepuffert worden war. Auf diese Weise wurde die Adsorption der aktiven Substanz erreicht. Diese Kolonne wurde anschliei3end eluiert, wobei man als Lauf mittel eine Lösung benutzte, die 50 Millimol Natriumchlorid, gelöst in 20 millimolarer gepufferter Phosphatlösung (pH 7),enthielt. Das Eluat wurde in 100 ml-Fraktionen aufgefangen und die aktiven Fraktionen Kr. 30 bis 37 wurden vereinigt und über eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 8 ml entsprechende Menge Aktivkohle enthielt, um die Adsorption der aktiven Substanz zu erreichen. Diese Aktivkohlekolonne wurde zweimal mit je 3 ml Wasser gewaschen und dann mit 150 ml 50/'Uigeni wässrigen Aceton eluiert, um das Natriumsalz der Substanz SF-2050 zu isolieren. Das so gewonnene Eluat wurde unter vermindertem Druck auf 7 ml eingeengt. Das entstandene Konzentrat wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wobei man das Natriumsalz der Substanz SF-2050 als farbloses Pulver erhielt. Ausbeute 10,4 mg.

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- 2ή - 7.02.79 .46° (c = 0,1, H₉O).

Beispiel 2

Herstellung der Substanz SF-205OB (1) Bebrütung des Stammes SF-2050

Es wurde eine Yorratskultur von Gtreptomyces sp.

Stamm SF-2050 (Hinterlegungsnummer FERM-P 4358 oder _ ATCC 31450) verwendet. Eine Schlinge voll dieser Vorratskultur wurde zum Impfen von 10 ml eines sterilisierten Impfkulturmediums verwendet, welches aus 1,0 % löslicher Stärke und 3,0 % Sojabohnenmehl bestand und vor dem Sterilisieren einen pH-Wert von 7₅O aufwies. Das Medium befand sich in einem weiten Reagenzglas mit einem Fassungsvermögen von 50 ml. Die Bebrütung erfolgte während 48 Stunden bei 28⁰C. 1 ml-Portionen dieser so gewonnenen Impfkultur wurden dazu verwendet, fünf Sakaguchi-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml, die jeweils 100 ml des genannten Impfkulturmediums enthielten, zu impfen; die Kolben wurden 24 Stunden bei 28°C bebrütet. Die zweite so gewonnene Impfkultur (500 ml) wurde zum Impfen von 20 1 des Impfkulturmediums der bereits genannten Zusammensetzung in einem 30 1-Gärbehälter verwendet. Das geimpfte Medium wurde 2.4 Stunden unter Belüftung und Schütteln bei 28°C bebrütet. Die dritte so gewonnene Impfkultür (15 Liter) wurde zum Impfen von 200 1 eines Produktions -Kulturmediums -in einem 300 1-Gärbehälter verwendet. Das benutzte Produktions-Kulturmedium enthielt 2,0 % Glucose, 1,0 % Sojabohnenmehl, 0,1 % K^HPO^, 0,02 % CaCO₃ und 0,0001 % CoCl₂.6H₂O (pH 6,5 vor dem Sterilisieren). Die Bebrütung erfolgte unter Belüftung und Schütteln während 44 Stunden bei 28°C. Nach der Bebrütung wurde die Kulturbrühe mit Hilfe von Diato-

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7.02.79

meenerde filtriert; auf diese Weise erhielt man 170 Brühenfiltrat.

(2) Gewinnung der Substanz SF-2050B Das gewonnene Brühenfiltrat (170 1) wurde durch eine 10 1-Kolonne mit Aktivkohle geleitet, um die aktiven Substanzen zu adsorbieren. Die Kohlekolonne wurde zweimal mit je 12 1 Wasser gewaschen und dann mit 50!faigem wässrigen Aceton eluiert. Das Eluat wurde in* 8 !-Fraktionen aufgefangen und die vier Fraktionen Nr. 1, 2 , 3 und 4 wurden verwendet. Die Fraktionen Kr. 2 und 3 wurden vereinigt und auf ein Volumen von 7 1 eingeengt, indem man das Aceton bei 38°C unter vermindertem Druck abdestillierte. Die entstandene konzentrierte Lösung wurde mit 7 1 Dichlormethan, welches 0,2 % (Gewicht/Volumen) Benzyldimethylcetylammoniunw chlorid enthielt, unter Schütteln vermischt, um die aktiven Substanzen zu extrahieren. Die Dichlormethanschicht wurde nochmals mit 700 ml Wasser, welches 1 % (Gewicht/Volumen) Natriumiodid enthielt, extrahiert, um den Übergang der aktiven Substanzen in die wässrige Phase zu erreichen. Der entstandene- wässrige Extrakt wurde durch Abdestillieren des Dichlormethan unter vermindertem Druck eingeengt. Der konzentrierte wässrige Extrakt wurde durch eine 1 1-Kolonne geleitet, die einen Anionenaustauscher (Diäthylaminoäthyldextran) enthielt, der durch Behandlung mit einer gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) abgepuffert worden war. Auf diese Weise wurden die aktiven Substanzen an dem Anionenaustauscher adsorbiert. Die Kolonne wurde anschließend mit 3 1 einer 20 millimolaren gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) gewaschen und dann mit 6 1 einer Lösung eluiert, die 0,1m Natriumchlorid gelöst in 20 millimolarer gepufferter Phosphatlösung (pH 7,2)

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7.02.79

enthielt. Zum Eluieren der aktiven Substanzen aus der Kolonne wurde eine Lösung verwendet, die 0,14m Natriumchlorid gelöst in einer weiteren Menge derselben gepufferten PhQsphatlösung (pH 7,2) enthielt. Das EIuieren der aktiven Substanzen von der Anionenaustauscherkolonne wurde so lange fortgesetzt, bis die etwa 12- bis I4fache Menge des Kolonnenvolumens an Lösungsmittel durchgeleitet worden war. Das Eluat wurde in 150 ml-Praktionen aufgefangen, und zwar sowohl das Natriumsalz der Substanz SF-2050 als auch das Natriumsalz der Substanz SF-2050B; letzteres war in den aktiven Fraktionen I:"r. 78 bis 9β (etwa 2,1 1 insgesamt) enthalten.

Die aktiven Fraktionen Nr. 78 bis 98 wurden vereinigt und durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 30 ml entsprechende Menge Aktivkohle zum Adsorbieren der aktiven Substanz (Natriumsalz der Substanz SF-2O5OB) enthielt. Die Aktivkohlekolonne wurde zweimal mit je 50 ml Wasser gewaschen und dann mit 120 ml 5O?6igem wässrigen Aceton eluiert, um die aktive Substanz zu isolieren. Das Eluat wurde durch Verdampfen des Wassers und des Acetons unter vermindertem Druck eingeengt. Die entstandene konzentrierte Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wobei man 62 mg des Natriumsalzes der Substanz SF-2050B als farbloses pulverförmiges Rohprodukt erhielt.

(3) Reinigung der Substanz SF-2050B

Das pulverförmige Rohprodukt, welches die Substanz SF-2050B (62 mg) darstellte, wurde in 2 ml einer 20 millimolaren gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) aufgenommen; die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet,"die eine einem Volumen von 120 ml entsprechende Menge des Antionenaustauschers (Diäthyl-

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- Jr* - 7.02.79

aminoäthyldextran) enthielt, die durch Behandlung mit einer gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) abgepuffert war, so daß die aktive Substanz an der Kolonne adsorbiert wurde. Die Kolonne wurde anschließend mit 600 ml der 20 millimolaren gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) gewaschen und dann mit einer Lösung eluiert, die 0,1m Natriumchlorid, gelöst in einer weiteren Menge der gleichen 20 millimolaren gepufferten Phosphatlösung (pH 7,2) enthielt. Die aktive Substanz (d.h. das Natriumsalz der Substanz SF-2050B) wurde aus der Kolonne eluiert, indem man solange Eluierungsmittel durch die Kolonne schickte, bis etwa die 18- 22fache Volumenmenge der Kolonne desselben verbraucht waren. Während des Eluierungsvorganges wurde das Eluat in 18 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. bis 146 (etwa 480 ml insgesamt) enthielten das Natriumsalz der Substanz SF-2050B. Diese aktiven Fraktionen wurden vereinigt und über eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 10 ml entsprechende Menge Aktivkohle enthielt, an welcher die Adsorption der aktiven Substanz erfolgte.

Diese Aktivkohlekolonne wurde mit 40 ml Wasser gewaschen und mit 50 ml 50%igem wässrigen Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf ein Volumen von etwa 3 ml eingeengt, indem man das Aceton unter vermindertem Druck abdestillierte. Die konzentrierte Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wobei man ein reines farbloses Pulver erhielt, welches aus dem Natriumsalz der Substanz SF-20503 bestand. Ausbeute 2,2 mg.

Θ09833/0762

Claims (1)

1. 230S086

   - «25 - 7.02.79

   Patentansprüche

   Λ J Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotika, nämlich der Substanz SF-2050 und/oder der Substanz SF-2050B, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm der Gattung Streptomyces, der die Fähigkeit besitzt, die Substanz 3F-2050 und SF-2050B zu produzieren, in einem wässrigen Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in assimilierbarer Form enthält, unter aeroben Bedingungen über eine ausreichend lange Zeitspanne züchtet, so daß sich wenigstens eine der 1ö beiden Substanzen SF-2050 und SF-2050B in der Kulturbrühe ansammeln kann, und daß man wenigstens eine der beiden Substanzen SF-2050 und SF-2050B aus der Kulturbrühe isoliert.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Streptomyces sp. SF-2050 mit der Hinterlegungsnummer FERM-P 4358 oder ATCC Mr. 31450 unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird.

   3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz SF-2050 aus der Kulturbrühe von Streptomyces sj). SF-2050 isoliert wird.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz SF-2050B aus der Kulturbrühe von StreOtomyces sp. SF-2050 isoliert wird.

   5. Meue Antibiotika, nämlich die Substanzen SF-2050 und SF-2050B einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Salze derselben, gekennzeichnet durch folgende Charakteristika:

   die Substanzen SF-2050 und SF-2050B sind dibasige

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   7.02.79

   Säuren, deren Natriumsalze in Form farbloser Pulver vorliegen, die keinen definierten Schmelzpunkt besitzen und negativ gegen Ninhydrin, jedoch positiv gegen Natriumiodid reagieren und deren Dinatriumsalze farblose Pulver darstellen, die in Wasser löslich, in Methanol weniger löslich und in Äthylacetat, Chloroform und Benzol nur ganz geringfügig löslich sind;

   die Substanz SF-2050 bewegt sich in Form der freien dibasigen Säure bei der Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese bei pH 6,7 auf die Anode zu, wobei ihre Mobilität 1,6 beträgt, wenn man die Mobilität von Cephamycin A als Vergleichssubstanz mit 1,0 ansetzt;

   als Dinatriumsalz weist die Substanz SF-2050 folgende Kenndaten auf:
   einen charakteristischen Absorptions-Peak bei 295nm im Ultraviolfitt-Absorptionsspektrum in wässriger Lösung;

   das Infrarot-Absorptionsspektrum des Dinatriumsalzes, tablettiert in Kaliumbromid, wie aus der in Figur 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellten Kurve ersichtlich;

   das kernmagnetische Wasserstoff-Absorptionsspektrum in Deuterowasser entsprechend der aus Figur 3 der beigefügten Zeichnungen ersichtlichen Kurve;

   Elementaranalyse: C 32,5 %, H 5,0 %, N 5,8 % und S 13,3 %;

   bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose ergibt die Substanz einen Einzelfleck bei R- => 0,36, wenn n-ßutanol-Isopropanol-Wasser (7:7:6) als Laufmittel verwendet wird, bzw. bei R^. 0,59, wenn Acetonitril-Wasser (7:3) als Laufmittel eingesetzt wird, und bei R^ = 0,22, wenn man mit Isopropanol-Wasser (8:2) als Laufmittel arbeitet;

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   2305066

   7.02.79

   Verlust der antibakteriellen Wirkung bei der Behandlung mit Hydroxylamin;

   eine Hemmwirkung gegenüber ß-Lactamase;

   die Substanz SF-2050B wandert in Form der freien dibasigen Säure bei der Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese bei pH 6,4 zur Anode, wobei ihre Mobilität 1,58 beträgt, wenn man die Mobilität von Cephamycin A als Vergleichssubstanz mit 1,0 ansetzt;

   als Dinatriumsalz weist die Substanz SF-2O5OB folgende Kenndaten auf:

   einen charakteristischen Absorptions-Peak bei 228nm sowie einen weiteren Peak bei 3O5nm im Ultraviolett-Absorptionsspektrum in wässriger Lösung;

   das Infrarot-Absorptionsspektrum des Dinatriumsalzes, tablettiert in Kaliumbromid, wie aus der in Figur 6 der beigefügten Zeichnungen dargestellten Kurve ersichtlich;

   das kernmagnetische Wasserstoff-Absorptionsspektrum in Deuterowasser entsprechend der aus Figur 7 der beigefügten Zeichnungen ersichtlichen Kurve;

   das kreisförmige Kristallspektrum wie aus Figur 8 der beigefügten Zeichnungen ersichtlich;

   Elementaranalyse: C 33,5 % H 3,9 %, N 5,7 % und S 13,8 %·

   bei der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an einer Kolonne mit einer Größe von 4 mm χ 30 cm, die mit mit aliphatischen Kohlenwasserstoffen behandeltem Silikagel gefüllt ist, eine Verweildauer von 22 MinutQn und 20 Sekunden bei der Entwicklung mit 0,3 ml pro Minute einer auf 0,01m ge-

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   ι*.

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   pufferten Phosphatlösung bei pH 6,5;

   einen Einzelfleck bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose bei FL? = 0,42, wenn n-Butanol-Isopropanol-Wasser (7:7:6) als Laufmittel verwendet wird, bzw. bei Rf = 0,32 bei Verwendung von 80%igem wässrigem Propanol (d.h. einer Mischung aus Wasser und Propanol im Volumenverhältnis von 8:2) und bei R- = 0,65 bei Verwendung von Aceton-Wasser (7:3) als Laufmittel;

   Verlust der antibakteriellen Wirkung'bei der Behandlung mit Hydroxylamin;

   eine Hemmwirkung gegenüber ß-Lactamase.

   6. Antibiotikum gemäß Anspruch 5, nämlich die Substanz SF-2050 oder das Natriumsalz dieser Substanz.

   7· Antibiotikum gemäß Anspruch 5, nämlich die Substanz SF-2O5OB oder das Natriumsalz dieser Substanz.

   8. Antibakterielles Mittel, bestehend aus einer antibakteriell wirksamen Menge wenigstens einer der Substanzen SF-2050 uns SF-2050B einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Salze derselben in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial.

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