DE1914527C - N hoch I-(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-O-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-D-glucopyranosyl)-5-O-D-xylofuranosyl-2-deoxystreptamin, N hochl -(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-O-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-Dglucopyranosyl)5-OD-ribofuranosyl-2deoxystreptamin, deren Gemische und Säureadditionssalze - Google Patents
N hoch I-(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-O-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-D-glucopyranosyl)-5-O-D-xylofuranosyl-2-deoxystreptamin, N hochl -(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-O-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-Dglucopyranosyl)5-OD-ribofuranosyl-2deoxystreptamin, deren Gemische und SäureadditionssalzeInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf N'-(4-Amino-2-hydroxybutyryI)-4-O-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-D-gJucopyranosyl) - 5 - O - τ» - xylof uranosyl - 2-deoxystreptamin, N'-(4-amino-2-hydroxYbutyr>l)-4-O-(.2,6-diamino^o-dideoxy-D-glucopyranosyl^S-O-n-ribofuranosyl-2-deoxystreptamin, deren Gemische und Säureadditionssalze, besonders die Sulfate. Die bisher nicht
besehtiebenen Verbindungen werden als Ambutyrosin A und Ambutyrosin B bezeichnet, deren .emische
einfach als Ambutyrosin.
Ambutyrosin wild normalerweise in Form der freien
Base hergestellt. Ambutyrosin kann als solches isoliert, identifiziert, charakterisiert und verwendet werden, es
kam jedoch auch in einzelne Bestandteile, das Ambutyrosin A und das Ambutyrosin B, aufgeteilt werden,
und jeder diesel Bestandteile kann isoliert, identifiziert, chanl "erisiert und für sich allein verwendet werden.
Außerdem können Ambutyrosin, Ambutyrosin A und Ambutyrosin B entweder in Form der freien Basen
oder in Fotm ihrei Säureadditionssalze isoliert, identifiziert, charakterisiert und verwendet werden. Wenn
nicht andeis angegeben, bezieht sich nachstehend der
Ausdruck »Ambutyrosin« auf ein Gemisch aus Ambutyrosin A und Ambutyrosin B oder auch auf einen von
diesen beiden Stoffen, falls eine Unterscheidung zwischen ihnen bedeutungslos ist. Das Ambutyrosin, wie
es normalerweise erfindungsgemäß aus Fermentationsbriihen gewonnen wird, enthält einen Hauptanteil an
Ambutyrosin A und einen getingeren Anteil (bis zu 10 bis 15°/0) an Ambutyrosin B.
Ambutyiosin A, Ambutyrosin B und Gemische daraus sind stabile, weiße, feste Basen, die in Wasser sehr
leicht, in Methanol mäßig und in Äthanol wenig löslich sind. Die freien Basen bilden Säuresalze mit
einer Vielzahl von organischen und anorganischen Säuren, wie Essig- und Propionsäure, Malein- und
Äpfelsäure, Zitronensäure, Glukonsäuie, Chlorwasserstoff- und Bromwassetstoffsäure, Phosphorsäuie und
Schwefelsäure. Jede der freien Basen hat vier primäre Aminogruppen, die sämtliche Säureadditionssatze
bilden können. Ist die Säure in geringerer Menge vorhanden, so bleiben einige der Aminogruppen in freier
basischer Form.
Ambutyrosin A schmilzt unter Zersetzung innerhalb eines weiten Bereiches, der bei etwa 1490C beginnt, in
einem zugeschmolzenen Kapillarröhrchen. Es hat pK'a-Werte von 5,6,7,3,8,7 und 9,8. Es hat ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum in Kaliumbromid mit Absorptionsmaxima bei 700, 1028, 1090,
1340,1390,1457,1498,1550 bis 1610,1652, 2938, 3040
und 3410 cm"1. Zwischen 220 und 3t0 Millimikron
zeigt es keine Ultraviolett-Absorptionsmaxima. Die spezifische Rotation ist [«]£ = +26° (1,46% in
Wasser).
Ambutyrosin B kann erhalten werden in Form einer Substanz, welche die Analysenwerte eines Dihydrates
zeigt und im zugeschmolzenen Kapillarröhrchen innerhalb eines weiten Bereiches schmilzt, der bei etwa 146°
beginnt. Es hat pK'a-Werte von 5,3, 7,1, 8,6 und 9,8. Es hat im Kaliumbromid ein Infrarot-Absorptionsspektrum mit Absoiptionsmaxima bei 700,1026,1100,
1345, 1390, 1458, 1497, 1549, 1580, 1650, 2938, 3040, 3315 und 3370 cm1. Zwischen 220 und 360 Millimikron
ίο zeigt es keine Ultraviolett-Absorptionsrnaxima. Die
spezifische Rotation ist [«]? = +33C (1,5% in
Wasser).
Dank ihrer funktionellen Gruppen bilden sowohl Ambutyrosin A wie Ambutyrosin B eine große Anzahl
wichtiger und charakteristischer chemischer Derivate, wie die Tetra-N-acetylderivate und die T<".ia-N-me~
thansulfonatderivate. Tetra-N-acetylambutyrosin A
hai eine spezifische Rotation [*]? = +25" (2,11% in
Wasser). Tetra-N-acetylambutyrosin B hat eine spezifi
sehe Rotation [x]? = +33° (1,34% in Wasser).
Säurehydrolyse von Ambutyrosin A unter relativ milden Bedingungen, z. B. mit 0,4 n-Chlorwasserstoff··
säure bei 65° C, ergibt D-Xylose. Säurehydrolyse von
Ambutyrosin B unter den gleichen milden Bedingungen
»5 führt nicht zu D-Xylose, sondern zu D-Ribose.
Ambutyrosin A ist N»-(4-Amino-2-hydroxybutyryl>·
4-0-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-D-glucopyranosyl)-5-0·
D-xyIofuranosyl-2-deoxystreptamin und besitzt folgende Strukturformel:
CH1NH,
HO
CH.NHj
ι |
O |
i
Q 1 |
|
I H |
H |
OH ι |
ι/ |
I c |
I NH, |
I
H |
|
:ch—o
Eine heftigere Säurehydrolyse von sowohl Ambutyrosin A wie Ambutyrosin B, z. B. mit 6 n-Chlorwasser-
:toffsäure bei Rückflußlemperatur innerhalb 6 Stunden,
führt zu Neamin, Deoxystreptamin, Neosamin C und t-Hydroxy-y-aminobuttersäure. Dieoi-Hydroxy-y-aminobuttersäure
ist eine kristalline Substanz vom Fp. 212,5 bis 214,5°C; spezifische Rotation f x]$ = —28,2°
(l,22e/o in Wasser).
An Ambutyrosin A und Ambutyrosin B wurden weitere umfangreiche Strukturbestimmungen durchgeführt.
In Form der freien Base, wasserfrei, haben beide die empirische Formel CnH41NsO12.
Ambutyrosin B ist N*-(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-D-gIucopyranosyl)-5-0-D-ribofuranosyl-2-deoxystreptamin
und weist folgende Strukturformel auf:
35
H-C
CH2OH
Ambutyrosin A und Ambutyrosin B sind demnach Isomeie, die sich in der Konfiguration an einem einzigen
Kohlenstoffatom in der Pentosehälfte unterscheiden.
Ambutyrosin und seine Bestandteile, Ambutyrosin A und Ambutyrosin B, haben gleiche antibakterielle ,60
Wirkungsspektren, wie dies in der folgenden Tabelle I an dem antibakteriellen Spektrum von Ambutyrosinsulfat
gezeigt werden kann. In der Tabelle ist das antibakterielle Spektrum von Ambutyrosinsulfat ausgedrückt
in Werten der Mindesthemmkonzentration, gemessen als Mikrogramm an freiem Basenäquivalent
je Milliliter Medium, gegen die verschiedensten für Menschen pathogenen Bakterienarten. Die Werte
wurden gewonnen mit Hilfe der üblicherweise anzutreffenden Stämme der betreffenden Organismen.
Wenn für einen Organismus mehr als ein Stamm angegeben ist, ist der Bereich der Mindesthemmkonzentrationen
zu dem Zweck wiedergegeben, die beobachteten Unterschiede bei verschiedenen Stämmen der gleichen
Species zu zeigen.
Antibakterielles Spektrum von Ambutyrosinsulfat in vitro
Aerobacter aerogenes
Diplococcus pneumoniae
Escherichia coli
Klebsieila pneumoniae ..
Mycobacterium tuberculosis
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa
*5 Salmonella enteritidis ...
*5 Salmonella enteritidis ...
Salmonealla typhimurium
Shigella flexneri
Shigella sonnei
Staphylococcus a ureus ..
Streptococcus faecalis ..
Streptococcus faecalis ..
Streptococcus pyogenes..
Anzahl
der Stämme
1
1
1
25
3
2
5
5
3
2
5
5
14
1
3
1
3
konzentration
0,8 bi* 6,3 3,t bis > 100 1,6 bis 50,0
1.6
1,6 6,3
4.5 bis 35,5 12.5 bis 50,0
12,5 bis 50,0 12,5
3.1 bis 12,5
1.6 bis 100
> 100 6,3 bis 12,5
Die antibakterielle Wirksamkeit von Ambutyrosinsulfat wurde außerdem demonstriert an experimentellen
akuten Infektionen bei Mäusen. Subkutane Einzeldosen von etwa 2 bis 10 mg Basenäquivalent/kg
Körpergewicht sind wirksam ge^en Infektionen mit Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris
und Staphylococcus aureus.
Die mittlere Einzeldosis von Ambutyrosin, subkutan verabreicht als Sulfat, die für die Hälfte der
Mäuse in einer Gruppe letal ist (LD50-WeH), wurde zu
3050 mg Base/kg Körpergewicht bestimmt; bei intraperiionealer Applikation beträgt sie 281 mg/kg, bei
intravenöser 487 mg/kg.
Gegenüber bekannten bakterizid wirksamen Substanzen zeichnet sich das erfindungsgemäße Ambutyrosin
durch eine besonders geringe Toxizität und eine sehr hohe Wirksamkeit aus.
Die Mindesthemmkonzentration der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in ln-vitro-Versuchen
gegenüber fünfzig frischen klinischen lsolaten von Pseudomonas aeruginosa bestimmt und mit derjenigen
von o-i-x-Carboxy-phenacetyO-penicillansäure (»Carbenicillin«),
einem halbsynthetischen Penicillin und derjenigen von Tetracyclin verglichen. Man erhielt
dabei die folgenden Ergebnisse.
Ambutyrosin .
«Carbenicillin«
Tetracyclin ...
«Carbenicillin«
Tetracyclin ...
Mindesthemmkonzentration
1 geometrisches Grenzwerte Mittel
(mg/kg) (mg/kg)
2,20 bis 35,5 j
4,89 bis 310 ,
> 125 I
8,89 46,6
Für die LD&0 wurden bei Mäusen die folgenden
Werte gefunden:
Ambutyrosin*)
Neomycin
Circulin
Intravenös
(mg/kg)
460
15 bis 53
10 bis 23
10 bis 23
Subkutan
(mg/kg)
2890
265 bis 353
77 bis 82
77 bis 82
*) Ein Gemisch aus einem Hauptanteil Ambutyrosin A und
einem kleineren Anteil Ambutyrosin B.
Das Fradiomycin ist dem Neomycin verwandt und besitzt eine ähnliche Toxizität.
Aus den oben angegebenen Werten geht r.irvor, daß
das erfindungsgemäße Ambutyrosin etwa fünfmal so wirksam ist wie 6-(\-Carboxy-phenacetyI)-penicillansäure
und mehr als zehnmal so wirk· 3m wie Tetracyclin. Die Toxizität der erfindungsgemäßen Verbin- ao
düngen ist dagegen um mehr als den Faktor 10 geringer als diejenige der bekannten bakteriziden Mittel.
Ambutyrosin und seine Säureadditionssalze können erfindungsgemäß dadurch hergestellt werden, daß man
einen Ambutyrosin produzierenden Stamm des Orga- as
nismus Barillus circulans unter künstlichen Bedingungen
züchtet.
Wenn hier von einem »Ambutyrosin produzierenden Stamm von Bacillus circulans« gesprochen wird, »o ist
damit ein Stamm von Bacillus circulans gemeint, det, wenn er, wie beschrieben, unter künstlichen Bedingungen
gezüchtet wird, eine Fermentationsbrühe ergibt, aus welcher Ambutyiosin oder eines seiner Säureadditionssalze
durch die beschriebenen Arbeitsgänge erhalten werden kann.
Ein für Zwecke der Erfindung geeigneter Stamm von Bacillus circulans vurde erhalten aus einer Bodenprobe,
die in der Nähe von Melspruit, Ost-Transvaal, Südafrika, gesammelt wurde. Subkulturen dieses
Stammes wurden bei dem United States Department of Agriculture, Northern Utilization Reseatch and
Development Division, Peoria, Illinois, hinterlegt und werden in ib-er permanenten Kulturkollektion unter
den Identifikationsnummern NRRL B-3312 und NRRL B-3313 gehalten. Die Nummer NRR.- B-3312
entspricht dem ur .prünglichen Isolat; die Nummer
NRRL B-3313 entspricht einer Einzelkolonie-Auswahl
Die beiden deponierten Subkulturen sind in ihren morphologischen und physiologischen Eigenschaften
im wesentlichen äquivalent. Die Ausdrücke »Bacillur 5c
circulans NRRL B-3312« und »Bacillus circulans NRRL B-33J3« beziehen sich auf einen Stamm von
Bacillus circulans mit den oben beschriebenen Eigenschaften.
Die Identifikation wurde an NRRL B-3313 gemäß »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«,
7. Ausgabe (1957), durchgeführt. Die zur Identifikation des Organismus benutzten Medien und Methoden sind
beschrieben in Smith, Gordon und Clark, »Aerobic Sporeforming Bacteria«, Agricultural Monograph
16, US. Department of Agriculture (1952), und Society of American Bacteriologists, Manual of Microbiological
Methods (1957).
Der Oiganismus ist ein aerobes, gramvariables, frei
bewegliches Stäbchen (0,3- bis 0,9mal 1,1 bis4,7 μ); er
gedeiht auf Fleischextrakt oder anderen komplexen organischen Medien und bildet Endosporen. Er gehört
daher zur Gattung Bacillus. Seine Sporangien sind deutlich angeschwollen. Seir Sporen sind elliptisch,
selten zylindrisch, zentral bis terr inal, und die Sporenwand
ist dick und leicht gefleckt. Er ist gramvariabel. Gemäß der Aufschlüsselung der Species des Genus
Bacillus (Bergey's Manual, S. 613 bis 615) gehört daher der Organismus unter die Arten in Ziffer II (S. 615).
Er produziert aus Kohlehydraten kein Gas, ist saprophytisch, wächst auf gewöhnlichen Medien, hydrolysiert
Stärke, produziert kein Indol oder Acetylmethylcarbinol
und vermehrt sich nicnt bei 65"C. Er gehört daher unter B., 1., a., bb., cc. Lediglich eine Species,
B. circulans, besitzt diese Eigenschaften. Bei den unten in Tabelle!! aufgeführten Versuchen unterscheidet
sich der Organismus nicht wesentlich von B. circulans, Jordan, 1890, emend. Ford, 1916, wie beschrieben
in Bergey's Manual, S. 628 und 629. Der Organismus ist daher als ein Stamm der Species B. circulans anzusehen.
Gemäß Vergleichsstudien unterscheidet sich B. circulans NRRL B-3313 in verschiedener Hinsicht von
dem American Type Culture Collection^ATCC-) Stamm 4513 (vorgeschlagener Neotyp, N. R. S m i t h
u. a., »Type cultures and proposed neotype cultures of some species in the genus Bacillus«, J. Gen. Microbiol.,
j4, S. 269 bis 272, 1964). Diffeienzen bestehen unter anderem in der Größe der vegetativen Zellen und
Sporen, der Dicke der Sporenwand, der Vermehrungsfähigkeit bei 45"C, den Wachstumseigenschaften auf
Nähragar, der Hydrolyse von Gelatine und Casein, der Verwertung von Citrat, der Reoxydation von Methylenblau
und der Fermentation von i.-Arabinose, Inulin, Lactose i'nd n-Xylose.
Die Eigenschaften von NRRL B-3313 und ein Vergleich mit ATCC-4513 sind in Tabelle II dargestellt.
Tabellen Eigenschaften vom Bacillus circulans NRRL B-3313 im Vergleich mit ATCC 4513
Eigenschaften auf dem
betreffenden Medium
betreffenden Medium
NRRL B-3313
ATCC-4513
Aussehen
Bacto-Nähragar, 24 Stunden
Wachstum bei 28°C; Huckers
Modifikation von Gramfärbung
Bacto-Peptor Eisen-Agar und
0,1% Bacto-Hefccxtrakt,
Wachstum bei 28' C; Conklins
Wachstum bei 28°C; Huckers
Modifikation von Gramfärbung
Bacto-Peptor Eisen-Agar und
0,1% Bacto-Hefccxtrakt,
Wachstum bei 28' C; Conklins
gramvariabel, gewöhnlich einzelne Stäbchen mit gerundeten oder sp'tzen
Enden, 0,3-bis0,9mal 1,1 bis4,7 μ gute Sporulation bei 2 Tagen; Sporangien
ausgebeult und keulenförmig; Sporen ellipsoid, gelegentlich nierenförmig, terminal und subterminal;
Sporenwand dick; Sporen 0,6- bis l,3mal 1,1 bis 2,3 μ
gramvariabel, gewöhnlich einzelne
Stäbchen mit abgerundeten Enden, 0,3- bis l.Omal 2,0 bis 6,5 μ
gute Sporulation bei 5 Tagen; Sporangien ausgebeult und keulenförmig; Sporen ellipsoid, gelegentlich
sphärisch, gewöhnlich terminal;
Sporenwand dünn; Sporen 0,4- bis 1,1 mal 0,8 bis 1,5 μ
Stäbchen mit abgerundeten Enden, 0,3- bis l.Omal 2,0 bis 6,5 μ
gute Sporulation bei 5 Tagen; Sporangien ausgebeult und keulenförmig; Sporen ellipsoid, gelegentlich
sphärisch, gewöhnlich terminal;
Sporenwand dünn; Sporen 0,4- bis 1,1 mal 0,8 bis 1,5 μ
Eigenschaften auf dem
betreffenden Medium |
NRRLB-3313 | Gas | ATCC-4S1J | Gas |
Beweglichkeit | ||||
Bacto-Nährbrühe, 24 Stunden | frei beweglich | frei beweglich | ||
Wachstum bei 28°C | ||||
Wachstumstemperatur auf Bacto- | — | — | ||
Nähragar | — | — | ||
28CC | positiv | — | positiv | — |
37°C | positiv | — | positiv | — |
45" C | negativ | — | positiv | — |
65PC | negativ | — | negativ | — |
Wachstumseigenschaften in Brühe | — | — | ||
Oberfläche | keine | — | keine | — |
unter der Oberfläche | trübe | — | trübe | — |
. Menge | mäßig | — | mäßig | — |
Sediment | weiß-flockig | — | weiß-flockig | — |
Kolonie-Eigenschaften auf Bacto- KlSUnnnni· |
— | — | ||
Nähragar Form |
kreisförmig, wenige punktförmig | — | unregelmäßig, wenige kreisförmig | — |
Erhebung | konvex | — | flach | — |
Rand | ganz | — | wellenförmig bis zackig | — |
Oberfläche | glatt | glatt | ||
Dichte | durchsichtig | durchsichtig | ||
Konsistenz | zäh bis butterförmig | butterförmig | ||
Faibe | farblos bis weißlich | farblos bis weißlich, leicht schillernd | ||
Gelatine-Hydrolyse auf Bacto- | 35- bis 37-mm-Zone in 7 Tagen | 1- bis 2-mm-2one in 7 Tagen | ||
Nähragar + 0,4% Bacto-Gelatine | ||||
Bacto-Gelatine Stich | Verflüssigung in 5 Tagen | keine Verflüssigung in 5 und 13 Tagen |
||
Casein-Hydrolyse | negativ in 7 Tagen, positiv in 13 Tagen |
negativ in 6 und 13 Tagen | ||
Indolproduktion | negativ in 5 und 13 Tagen | negativ in 5 und 13 Tagen | ||
Reduktion von Nitrat zu Nitrit | negativ in 5 und 13 Tagen | negativ in 5 und 13 Tagen | ||
Acetylmethylcarbinolproduktion | negativ in 2, 6 und 13 Tagen; | negativ in 2, 6 und 13 Tagen; | ||
pH-Wert der Brühe in 6 Tagen 5,8 | pH-Wert der Brühe in 6 Tagen 5,8 | |||
Stärkehydrolyse | positiv in 6 Tagen, 1- bis 2-mm- | positiv in 6 Tagen, 4- bis 5-mm- | ||
Zone | Zone | |||
Citratverwertung | negativ in 6 Tagen, positiv in 13 Tagen |
negativ in 6 und 13 Tagen | ||
Methylenblaureduktion | positiv in 2, 5 und 13 Tagen | positiv in 2 Tagen, reoxydiert in 5 Tagen |
||
Säure | Säure | |||
Fermentation (28°C) | ||||
Ammoniumsalze | ||||
Agar | ||||
t-Arabinose | — | + | ||
Dextrin | + | + | ||
D-Fructose | + | + | ||
D-Galactose | + | + | ||
D-Glucose | + | + | ||
Glycenn | + | + | ||
Inulin | — | + | ||
Lactose | — | + | ||
Maltose | + | + | ||
D-Mannit | + | + | ||
D-Mannose | + | + | ||
Raffinose | + | + | ||
Salicin | ± | + | ||
Sucrose | + | + | ||
D-Xylose | — | + |
Eigenschaften auf dem
betreffenden Medium
NRRL B-3313 Säure I Gas
ATCC-4513 Säure I Gas
Bacto-Phenolrolbrühe
i.-Arabinose
n-Glucose**)
*>-Mannit
Sucrose
♦*) pH nach 6 Tagen
5,3
Gewisse in Tabelle U erwähnte Medien haben die unten angegebene Zusammensetzung. Es ist auch
zweckmäßig, Medien von gleicher Zusammensetzung tu verwenden.
Bacto-Nähragar enthält 3 g Rindfleischextrakt, 5 g Pepton und 15 g Agar, gelöst in 1000 ml destilliertem
Wasser.
Bacto-Pepton-Hisen-Agar enthält 15 g Pepton, 5 g
Proteosepepton, 0,5 g Ferriammoniumcitrat, 1 g Dikaliumphosphat, 0,08 g Natriumthiosulfat und 15 g
Agar, gelöst in 1000 ml destilliertem Wasser.
Bacto-Hefeextrakt ist der wasserlösliche Teil von autolysierter Hefe und enthält die natürlich vorkommenden
Vitamine des Vitamin-B-Komplexes.
Bacto-Nährbrühe enthält 3 g Rindfleischextrakt und 5 g Pepton, gelöst in 1000 ml destilliertem Wasser.
Bacto-Gelatine ist eine erstklassige Gelatine in granu'ierter
Form.
Bacto-Phenolrot-Brühe, Base, enthält 1 g RindfleisihcÄiiäki,
10 g Piotccscpcpicn, 5 g Natriumchlorid
und 0,018 g Phenolrot, gelöst in 1000 ml destilliertem Wasser.
Ambutyrosin und seine Säureadditionssalze werden durch Beimpfen eines wäßrigen Nährmediums, das
Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, mit einem Ambutyrosin produzierenden Stamm
des Organismus Bacillus circulans und Bebrüten des Impf mediums bei einer Temperatur zwischen etwa
20 und 40" C unter aeroben Bedingungen hergestellt. Gemäß der üblichen Arbeitsmethode wird das wäßrige
Nährmedium vor dem Beimpfen sterilisiert, und das Bebrüten des beimpften Mediums erfolgt unter aseptischen,
aeroben Bedingungen, bis sich im Fermentationsgemisch eine wesentlich antibakterielle Wirksamkeit
entwickelt hat, worauf das Ambutyrosin in Form der freien Base oder des Säuresalzes durch weitere
Behandlung des Fermentationsgemisches isoliert wird. Die bevorzugten Bedingungen zur Durchführung der
Fermentation sind eine Temperatur zwischen 28 und 32° C und ein pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0, insbesondere von etwa 7,5.
Impfmaterial zur Herstellung von Ambutyrosin durch Kultivierung eines geeigneten Stammes von
Bacillus circulans kann «halten werden, indem man das Oberflächenwachstum von Schrägkulturen eines
Nähragarmediums anwendet. Beim Bebrüten zwischen etwa 25 und 32° C vermehrt sich der Organismus und
produziert in 1 bis 2 Tagen ein zusammenhängendes Wachstum. Ein Bebrüten über 2 Tage oder 'anger ist
notwendig, um eine Kultur mit voll ausgebildeten Sporen zu erhalten, was für Zwecke der Erfindung
wünschenswert, wenn auch nicht notwendig ist. Im allgemeinen werden Kulturen mit Sporen verwendet,
um ein belüftetes und gerührtes flüssiges Nährmedium zu beimpfen, das in einem geeigneten Gefäß, z. B.
einem geschüttelten Kolben oder einem gerührten und belüfteten Fermenter, enthalten ist. Man läßt den
Mikroorganismus keimen und sich 24 bis 48 Stunden bei 20 bis 40" C, vorzugsweise 26 bis 32°C, vermehren.
Diese Vorkultur wird dann zum Beimpfen der Produk-
tionsfermenter oder anderer Vor- oder Zwischenfermenter verwendet.
Wie bereits bemerkt, sind geeignete wäßrige Nähr-
ao medien diejenigen, die assimilierbaren Kohlenstoff und
Stickstoff zur Verfügung stellen. Kohlenstoffquellen, die assimilierbar und für die Verwendung geeignet sind,
sind unter anderem reine Kohlehydrate und mehrwertige Alkohole, die durch den Organismus verwertet
werden können, ebenso wie handelsübliche Kohlehydratgemische. Einige Beispiele für Stoffe, die für
diesen Zweck geeignet sind, sind Stärken, Maisschrot, Zucker und Glycerin. Die im Nährmedium anwesende
Menge von Kohlehydrat bzw. mehrwertigem Alkohol
ist nicht ausschlaggebend und liegt gewöhnlich /wischen
etwa 0,5 und 5% des Gewichtes des Mediums. Etwas außerhalb dieses Bereiches liegende Menge:;
können ebenfalls verwendet werden.
Die Stickstoffquellen im Nährmedium können von organischer oder gemischt organischer-anorganischcr
Natur sein. Einige Beispiele aus der großen Reihe von
stickstoffhaltigen Substanzen, die verwendet werden können, sind Casein, Sojabohnenmehl, Erdnußmeh!,
Baumwollsamenmehl, Weizenkleber, Gersten- oder
Haferabfälle, Lactalbumin, enzymatische Aufberci
tungsprodukte von Casein, Trypton, Fleischpeptor., Ammoniumchlorid und Ammoniumsulfat. Da viele
der leicht verfügbaren Stick stoffquellen Rohstoffe sinO,
schwankt die Menge, die dem Medium zugefügt wer-
den muß, mit der Reinheit, so daß man nicht ohm.
weiteres die genaue Menge an stickstoffhaltigen Stoffen festlegen kann, die dem Medium zugesetzt
werden sollen. Es läßt sich höchstens sagen, daß die Stoffe, die den Stickstoff bereitstellen, im allgemeinen
nicht 5 bis 6 Gewichtsprozent des gesamten Ferment«-
tionsmediums überschreiten und in den meisten Fällen
in geringerer Menge anwesend sind.
Die Anwesenheit von wachstumsfördernden Faktoren im Fermentationsmedium ist ebenfalls wünschens-
SS wert. Einige diese Faktoren sind bereits in den üblichen Rohstoffen, die den Stickstoff liefern, vorhanden und
müssen nicht eigens zugesetzt werden. Man kann dem Fermentationsgemisch jedoch auch geringe Mengen
derartiger Stoffe zusetzen, wie z. B. Rückstände aus
der Branntweinbereitung, Hefe, Hefeautolysat, Hefeextrakt und Rückstände aus der Melassefermentation:
oder man setzt anorganische Salze tu, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat, oder
auch Salze von Spurenmetallen, wie Zink, Kupfer,
Das wie oben bereitete Nährmedium wird gegebenenfalls auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 8,0,
vorzugsweise auf einen pH-Wert von etwa 7,5, einge-
11 12
stellt. Ein Puffer, wie Calciumcarbonat, kann ebenfalls arbeitet mit der Adsorption an einem starken Anzugegeben
werden, um den pH-Wert innerhalb der ionenaustauscherharz in Boratform und selektiver
gewünschten Grenzen zu halten, wenn die Fermenta- Eluierung der Komponenten. Vermutlich tritt die
tion fortschreitet. Falls nötig, kann auch ein Anti- Trennung durch selektive Eluierung auf, da Ambutyro-
schaummittel zugesetzt werden. 5 sin B im Riboseteil benachbarte cis-ständige Hydroxyl-
Die Züchtung des Ambutyrosin produzierenden gruppen aufweist und einen Boratkomplex bildet,
Stammes von Bacillus circulans im wäßrigen Nähr- während Ambutyrosin A im Xyloseteil keine benachmedium
kann auf verschiedenste Weise durchgeführt barte cis-ständige Hydroxylgruppe aufweist und keinen
werden. So kann z. B. der Organismus unter aeroben ßoratkomplex bildet. Wenn das Ambutyrosin an dem
Bedingungen an der Oberfläche des Mediums gezüch- io starken Aniorfenaustauscherharz in Boratform adsortet
werden, oder er kann unterhalb der Mediumsober- biert ist, wird zuerst die Ambutyrosinkomponente A
fläche, d. h. als Submerskultur, gezüchtet werden, vor- durch Eluieren mit Wasser entfernt, worauf die Ambuausgesetzt,
daß für eine adäquate Sauerstoffzufuhr ge- tyrosinkomponente B durch Eluieren mit 5°/oiger Borsorgt
wird. säurelösung ausgezogen wird. Beide Komponenten
Die bevorzugte Methode zur Erzeugung von Am- 15 können durch Adsorption an einem Carbonsäureharz
butyrosin und dessen Säureadditionssalzen gemäß der in Ammoniumform und Eluieren mit 1 molarem Am-
vorliegenden Erfindung besteht in der Fermentation moniumhydroxid weitergereinigt werden. Bo.tück-
eines Ambutyrosin produzierenden Stammes von stände in dem Produkt können mit Hilfe eines bor-
Bacillus circulans in einer Submers- oder Tiefkultur, spezifischen Anionenaustauscherharzes entfernt wer-
wobei man als Impfmaterial eine vermehrungsfähige, ao den.
24 bis 48 Stunden alte, belüftete und gerührte Brühen- Gemäß einem anderen Verfahren zum Auftrennen
kultur des Organismus verwendet. Nach diesem Vet- von Ambutyrosin in seine Komponenten wird das
fahren wird ein steriles wäßriges Nährmedium mit dem Ambutyrosingemisch in die Tetra-N-acetylderivate
Organismus beimpft und unter Rühren und Luftzufuhr übergeführt und diese dann der Trennchromatographie
bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 400C, as auf Diatomeenerde unterworfen, wobei ein System,
vorzugsweise in der Nachbarschaft von 28 bis 32" C, wie 1-Butanol, Wasser, Pyridin (10:10:3) oder
so lange bebrütet, bis das Ambutyrosin in hoher Kon- 1-Butanol, 5%ige Borsäure, Pyridin (10: 10: 3), verzentralion
in der Kulturflüssigkeit anwesend ist. Die wendet wird. Gemische aus den beiden Komponenten
Länge der für maximale Ausbeuten benötigten Zeit können getrennt und die Komponenten leicht voneinhängt
von der Größe und dem Typ dei verwendeten 3° ander unterschieden werden durch Anwendung von
Einrichtung, von der Rühr- und Belühungsgcschsvir.- Papierrhormatographie auf die Tetta-N-acetylderivate
digkeit und anderen Faktoren ab. Bei großtechnischen unter Verwendung von 1-Butanol, Pyridin, 5°/oiger
Fermentationen, die in Fermentern vom Tanktyp Borsäure (6: 4: 3); R( Tetra-N-acetylambutyrosin A,
durchgeführt werden, wird eine maximale Produktion 0,30 bis 0,38; Rf Tetra-N-acetylambutyrosin B, 0,16
gewöhnlich in etwa 3 bis 6 Tagen erreicht. 35 bis 0,20. Die Tetra-N-acetylderivate können auf Papier
Die in der Brühe nach der Fermentationsperiode festgestellt werden durch Anwendung einer Modinkaoder
zu irgendeiner Zeit während dieser Periode an- tion der allgemeinen Methode von Pan und Dutwesende
Menge an Ambutyrosin kann durch Bio- eher, Analytical Chemistry, 28, S. 836 (1956), bei
versuch bestimmt werden. Die antibakterielle Wirk- welcher an Stelle von Natriumhypochlorit Chlorgas
samkeit (die von Ambutyrosingehalt abhängt) der 40 verwendet wird. Zwecks Herstellung der für das obige
Buhe wird bestimmt durch Messen der Hemmwirkung Verfahren nötigen Tetra-N-acetylderivate werden 7,7 g
auf die Vermehrung des Mikroorganismus Escherichia Ambutyrosin in 150 ml Essigsäureanhydrid und 430 ml
cnli (bzw. eines anderen geeigneten Organismus) auf Methanol gelöst. Die Lösung wird 48 Stunden bei
einer Testplatte und Vergleichen des Resultates mit der 25°C gehalten und das Reaktionsgemisch dann in 3 1
Hemmung, die durch eine entnrechende Verdünnung 45 Diäthyläther eingegossen. Es scheiden sich die Tetrader
betreffenden Probe von gereinigtem Ambutyrosin, N-acetylderivate ab, die abfiltriert und getrocknet werdie
auf eine noch zu beschreibende Art erhalten wurde, den. Die Tetra-N-acetylderivate der beiden Kompobewirkt
wird. nenten können in einem einzigen Arbeitsgang herge-
Nach Abschluß der Fermentationsperiode kann stellt werden.
Ambutyrosin bzw. eines seiner Säureadditionssalzc aus 5° Ambutyrosin und seine Komponenten können durch
der Brfihe aiii noch zu beschreibende Art erhalten wer- Umsetzen mit einer gioßen Anzahl Säuren, wie Essig-
den und kann dann einer weiteren Reinigung im ge- säure, Propionsäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Zitro-
wünschten Umfang unterworfen werden, einschließlich nensäure, Gluconsäure, Chlor- oder Bromwasserstoff-
der Trennung in die Komponenten Ambutyrosin A säure, Phosphorsäure, Schwefelsäure usw., in pharma-
und Ambutyrosin B. 55 zeutisch brauchbare Säureadditionssalze übergeführt
Die Gewinnung des Ambutyrosins kann auf ver- werden.
schiedene Weise erfolgen. So kann beispielsweise die Ambutyrosin, seine einzelnen Komponenten und die
Brühe mit einem Carbonsäureharz in Ammoniumform entsprechenden Säuresalze sind antibakterielle Mittel,
behandelt werden, um das Ambutyrosin an das Harz die ein weites Spektrum an an»:bakterieller Wirksam-
zu adsorbieren. Aus dem Harz kann das Ambutyrosin 60 keit aufweisen. Eine besonders überraschende Eigen-
durch Eluieren mit einer Base, wie 1 molares schaft dieser Substanzen ist ihre relativ hohe Aktivität
Ammoniumhydroxid, gewonnen werden. Zwecks gegen Pseudomonas aeruginosa, sowohl in vitro als
Reinigung kann die Adsorption am Harz und das auch in vivo. Die Verbindungen können oral, paren-
Eluieren mit einer Base ein oder mehrmals wiederholt teral oder lokal angewandt werden. Bei Menschen sind
weiden. 6S intramuskuläre Einzeldosen Ambut-yrosinsulfat, die
Ambutyrosin kann in seine Komponenten Ambu- 4 mg Ambutyrosinbase je Kilogramm Körpergewicht
tyrosin A and Ambutyrosin B mit Hilfe verschiedener entsprechen, gut verträglich und ergeben therapeutisch
Verfahren getrennt werden. Ein bevorzugtes Verfahren wirksame Konzentrationen im Blutplasma und im Urin.
13 V 14
und ihrer bakteriziden, sowohl wie ihrer bakterio- schwindigkeit von 0,27 m3/Minute und gegebenenfalls
statischen Wirksamkeit sind die erfindungsgemäßen Zugabe eines Antischaummittels laufen.
Verbindungen als antibakterielle Mittel auch wirksam
bei Applikation in vitro, z. B. zum Sterilisieren von 5 stufe IV
Laboratoriumsinstrumenten und -oberflächen, zum
und ähnlichen In-vitro-Anwendungen können die Ver- von zwei 750-l-Fermentern eingebracht und in der
bindungcn in Form von 0,1· bis l,0°/„igen wäßrigen Hitze sleiilisiert und abgekühlt. Jeder Fermenter wird
f beiden Fermenter werden, gegebenenfalls in Portionen,
das die folgende Zusammensetzung hat: Die Brühen aus Stufe IV werden vereinigt und 1155 1
5 ε *s bezeichnung »Amberlite IRC-50« erhältliche Kunstharz
f veiwendet werden. Man läßt dann das Harz mit den
15 S dar'" adsorbierten Stoffen absitzen und wäscht es mit
n«tilliprt« Wawr
11 Wasser frei von suspendierten Feststoffen. Das ge-
uesuiuenes wasser waschene Harz wird in einen Glaszylinder von 15 cm
das gebildete Bakterienwachstum jeweils in 10 ml Carbonsäureharz in Ammoniumform als Bodenschicht
0.1%iger steriler Natriumheptadecylsulfatlösung sus- enthält. Die so hergerichtete Kolonne wird mit 3710 !
pendlest. lmolarem Ammoniumhydroxid gewaschen, um Verun-
35 dukt wird der Säule durch Eluieren mit 3801 lmolarem
Es wird ein Nährmedium der folgenden Zusammen- Ammoniumhydroxid entzogen. Das Ammoniumsetzung (Gewicht/Volumen) bereitet: >-*■" hydroxideluat wird auf 221 eingeengt, mit verdünnter
Sojabohnenmehl. 44% Protein ST'6'5**6 ?"' ^" ^Tl™ 1 ein8es^nt u Und
(mit Lösungsmittel extrahiert) ... 1,0·/, durch e,ne Kolonne von 275 ml des gleichen Carbon-
iTnÄSSrid \ \ \ [ ] \ \ \ ['. \'. \ 0AV° ** ™ T 1J""' "5™ S MinU£ "^^ D"
dieser Kolonne von oben über 8^ ml frisches Harz,
lauge auf 7,5 eingestellt, worauf 0,5% (Gewicht/ 45 befindet, beschichtet. Die Kolonne wird mit 49 1
Nun bringt man 12 I dieses Mediums in einen 30-1- Verunreinigungen zu entfernen, worauf das Ambuty-Fermenter ein. Das Medium wird durch Erhitzen auf rosinprodukt mit 41 lmolarem Ammoniumhydroxid
12ΓC innerhalb 90 Minuten sterilisiert, worauf man eluiert wird. Dann wird das Ambutyrosincijat im
es abkühlen läßt und mit 40 ml der Sporensuspension 50 Vakuum auf eine kleines Volumen eingeengt, nitriert
von Bacillus circulans NRRL B-3313 in Natrium- und Iyophilisiert. Der Rückstand besteht aus Ambuheptadecylsulfat, hergestellt gemäß Stufe I, beimpft. tyrosin; spezifüsche Drehung t«]£ = +26° (1,1% '"
Das beimpfte Medium wird 32 Stunden bei 26 bis 27" C Wasser). Durch Mikroanalyse läßt sich feststellen, daß
bebrütet, wobei man es mit 200 Umdrehungen je Mi- das Produkt 45,41% Kohlenstoff, 7,26% Wasserstoff
nute rührt und mit steriler Luft, die mit einer Geschwin- 55 und 12,83% Stickstoff hat. Ausbeute 21 g.
digkeit von 6 l/Minute zugeführt wird, belüftet. Durch Zugabe von überschüssiger Chlorwasser-Während des Bebrütens werden etwa 36 g eines stoffsäure oder Salzsäure zu einer wäßrigen Lösung der
Gemisches aus Schweinefett und Mineralölen mit freien Base kann man die entsprechenden Salze her-Mono- und Diglyceriden in Einzelant^len zugegeben, stellen, die durch Zugabe von Acöton ausgefällt werum ein allzu starkes Schäumen zu verhindern. 60 den. Das auf diese Weise erhaltene Sulfat hat eine βρες.,. .„ zifische Drehung [«]? = +29° (2% in Wasser). Die
btmem Mikroanalyse ergibt 32,32% Kohlenstoff, 6,20%
1141 eir.es Nährmediums mit der gleichen Zusam- Wassei stoff, 8,64% Stickstoff. In Wasser hat die
mensetzung wie in Stufe II werden in einen 200-I-Fer- Substanz pK'a-Werte von 6,5, 8,1 und 9,5.
menter eingebracht. Das Medium wird 60 Minuten bei 65 Äquivalente Resultate werden erhalten, wenn man
12rc sterilisiert, worauf man es abkühlen läßt und die Kulturen von Bacillus circulans NRRL B-3313
mit 40Om! der wachsenden 32-Stunden-Kultur aus gegen Kulturen von Bacillus circulans NRRL B-3312
I 914 527
15 i
16
Beispiel 2 fernen, und dann mit insgesamt 1701 !molarem Ammo-
_ - niumhydroxid in drei gleichen Portionen eluiert. Die
btuIe ' erste Fraktion von 571 enthält den größten Teil des
Es wird eine Sporensuspension von Bacillus circulans Ambutyrosins und wird im Vakuum auf ein Volumen
NRRLB-3313 in 0,l%iger steriler Natriumhepta- 5 von 41 eingeengt, mit verdünnter Schwefelsäure auf
decylsulfatlösung hergestellt wie im Beispiel 1, Stufe I. einen pH-Wert von 6,2 eingestellt und 1 Stunde mit
_ , 813 g mit Wasser gewaschener Aktivkohle und 400 g
mit Wasser gewaschener Diatomeenerde verrührt- Das
Analog Beispiel 1, Stufe II, wird cine-Fermentation Gemisch wird filtriert und der Filterkuchen mit 801
durchgeführt, wobei jedoch die 12 Γ Nährmedium nur χσ Wasser ausgewaschen. Das Filtrat wird mit den Waschmit
10 ml der Natriumheptadecylsulfatsuspensior von wässern vereinigt, im Vakuum auf 41 eingeengt, filtriert
Bacillus circulans NRRL B-3313 beimpft werden. und lyophilisiert. Das Produkt ist Ambutyrosmsulfat-
c , salz, spezifische Drehung [&]f = +29° (2% in
Mutem Wasser). Laut Mikroanalyse enthält es 31,85%
Es wird ein iHährmedium hergesteßt, dessen Zusam- 15 Kohlenstoff, 6,28% Wasserstoff, 8,83% Stickstoff,
mensetzung derjenigen des im Beispiel 1, Stufe II, ver- 8,01 % Schwefel und 24,01 % Sulfat. Im Wasser hat es
wendeten entspricht. Der pH-Wert des Mediums wird pK'a-Werte von 6,5, 8,1 und 9,5. Ausbeute 333,9 g.
mit 10 η-Natronlauge auf 7,5 eingestellt, worauf 0,5%
(Gewicht/Vohmen) Calciumcarbonal und 0,1 % (Ge- B e i s ρ i e I 3
wicht/Volumen) eines Polypropylenglykols als Anti- ao .
schaummittel zugegeben werden. Zwei Anteile von je Mute
114 1 dieses Gemisches werden in einen 190-l-Ferrhenter Eine Sporensuspension von Bacillus circulans
eingebracht, bei 121°C 60 Minuten sterilisiert, abge- NRRLB-3313 in 0,l%iger steriler Natriumhepta-•kühlt
und mit 200 ml der wachsenden, 32 Stunden alten decylsulfatlösung wird wie im Beispiel 1, Stufe I, beKultur aus Stufe II beimpft. Die Feimentations- 35 schrieben hergestellt,
gemistie werden 32 Stunden bei 29 bis 31° C unter Be- _ , ..
gemistie werden 32 Stunden bei 29 bis 31° C unter Be- _ , ..
lüftung mit einer Geschwindigkeit von 0,27 m3/Minute u e
bebrütet. Es wird ein Nährmedium der folgenden Zusammen-
ς . jV stellung (Gewicht/Volumen) bereitet:
Es wird ein Nährmedium hergestellt, dessen Zusam- Sojabohnenmehl, 44% Protein
mensetzung dem in Stufe III verwendeten entspricht, (mit Lösungsmittel extrahiert) ... 1,0%
das jedoch zusätzlich 4,0 % (Gewicht/ Volumen) Glyce- Tierisches Pepton 1.75%
rin enthält. Als Antischaummittel wird ein Polypropy- Ammoniumsulfat 0,4%
lenglykol zugegeben. In jeden von vier 757-1-Fermen- 35 Wasser auf 100%
tern werden 56S1 dieses Gemisches aufgegeben, in der
Wärme sterilisiert, gekühlt und mit 57 1 der 32 Stunden Der pH-Wert des Mediums wird mit 10 n-Natron-
alten Kultur aus Stufe III beimpft. Die Fermentations- lauge auf 7,5 eingestellt, worauf 0,5% (Gewicht/
gemische werden dann 128 Stunden bei 29 bis 31°C Volumen) Calciumcaibonat zugefügt werden.
unter Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 0,5 bis 40 121 dieses Mediums weiden in einen 30-1-Fermenter
1 ms/Minute bebrütet. Gegebenenfalls wird als Anti- eingebracht. Um das Medium zu sterilisieren, erhitzt
schaummittel ein Polypropylenglykol in Portionen man es 90 Minuten auf 121°C, läßt es dann abkühlen
zugefügt. und beimpft mit 10 ml einer Suspension von Bacillus
... , _ . . ' „ . , · circulans NRRL B-3313 aus Stufe 1 in Natriumhepta-
Isolation und Reinigung des Produktes 45 decyisu|fat. Das Gemisch wird 33 Stunden unter
Die Brühen aus den vier Fermentein werden vereinigt Rühren und Belüftung mit 61 Luft je Minute bei 28 bis
und das Ganze (23101; pH-Wert 6,9) 1 Stunde mit 30° C bebrütet. Während dieser Periode fügt man in
127 1 Carbonsäureharz in Ammoniu.nfotm verrührt. Portionen 400 ml eines Antischaummittel in Form
Man läßt dann das Harz mit dem adsorbierten Material von Polypropylenglykol zu, um das Schäumen einzu-
absitzen und entfernt die suspendierten festen Verun- 50 schränken,
ieinigungen durch Waschen des Harzes mit Wasser. Stufe III
Das gewaschene Harz wird dann in eine Säule von
Das gewaschene Harz wird dann in eine Säule von
30 cm Durchmesser eingefüllt, die bereits 1131 frisches 571 eines Nährmediums mit der gleichen Zusammen-Carbonsäureharz,
Ammoniumform, als Bodenschicht Setzung wie dasjenige in Stufe II (pH-Wert 7,5) werden
enthält. Die gefüllte Säule wird mit 16 4701 O.lmola- 55 in einem Feimenter von 1141 Inhalt sterilisiert, gerem
Ammoniumhydroxid gewaschen, um die Verun- kühlt und mit 40OmI der wachsenden, 3 Stunden alten
reinigungen zu c...fernen, worauf das Ambutyrosin Kultur aus Stufe II beimpft. Das beimpfte Medium
durch Eluieren der Säule mit 1900 1 lmolarem Ammo- wird 32 Stunden bei 28 bis 3O0C unter Luftzufuhr mit
niumhydroxid gewonnen wird. Das Eluat wird im einer Geschwindigkeit von 0,18 m3/Minute bebrütet.
Vakuum auf 1801 eingeengt, mit verdünnter Schwefel- 60 Gegebenenfalls wird ein Polypropylenglykol zur Versäure
auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und durch hinderung des Schäumens zugegeben,
eine Säule von 3,5 1 Carbonsäureharz, Ammoniumform, mit einer Geschwindigkeit von 0,03 ml/ml Harz Stufe IV
je Minute geschickt. Das Harz wird dann mit 21
eine Säule von 3,5 1 Carbonsäureharz, Ammoniumform, mit einer Geschwindigkeit von 0,03 ml/ml Harz Stufe IV
je Minute geschickt. Das Harz wird dann mit 21
Wasser gewaschen und über 10,5 1 frisches Harz in 65 11361 Nährmedium der gleichen Zusammensetzung
einer gläsernen Säule von 10 cm Durchmesser gepackt. wie in Stufe II (pH-Wert 7,5) wird in der Wärme sterili-
Die Säule wird mit 1035 1 O.lmolarem Ammonium- siert, gekühlt und mit 57 I der 32 Stunden alten Kultur
hydroxid gewaschen, um die Verunreinigungen zu ent- aus Stufe III beimpft. Das Gemisch wird 24 Stunden
bei 29 bis 31,50C unter Zufuhr von 1,27 m3 Luft je
Minute bebrütet. Gegebenenfalls wird PoJypropylenglykol als Antischaummittel zugegeben.
Stufe V
Es wird ein Nährmedium bereitet, dessen Zusammenstellung demjenigen aus Stufe II entspricht, außer daß
es zusätzlich noch 4 Gewichtsprozent (Gewicht/Volumen) Glycerin enthält. Das Medium (pH-Wert 7,5)
enthält außerdem Polypropylenglykol als Antischaummittel. 45401 dieses Mediums werden in je einen von
zwei 75701 fassenden Feimentern eingefüllt, mit Hitze sterilisiert, gekühlt und mit je 5681 der 24 Stunden alten Kultur aus Stufe IV beimpft. Die Fermentation wirJ 120 Stunden bei 28 bis 31"C durchgeführt,
wobei Luft mit einer Geschwindigkeit von 1,7 mV Minute hindurchgeleitet und, falls nötig, noch zusätzliches Antischaummittel zugegeben wird.
Der Inhalt der Fermenter wird vereinigt und die
vereinigte Brühe (110501) l'/2 Stunden mit 508 1
Carbonsäureharz in Ammoniumform verrührt. Das Harz mit dem daran adsorbierten Material läßt man
absitzen und wäscht es dann von den suspendierten Feststoffen mit Wasser frei. Das gewaschene Harz
wird in eine Kolonne aufgegeben, die schon 46 I frisches Carbonsäureharz, Ammoniumform, als BodenscMcht enthält. Die Harzkolonne wird gewaschen mit
11 360 I 0,1 molarem Ammoniumhydroxid, um die Verunreinigungen zu entfernen, und das Ambutyrosin
wird durch Eluieren mit 3785 11 molarem Ammoniumhydroxid ausgezogen. Das Eluat wird im Vakuum auf
ein Volumen von 121 1 eingeengt, mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und
filtriert.
Die in den Stufen I1 II, III, IV und V beschriebenen
Operationen und das oben beschriebene Isolationsverfahren werden wiederholt, so daß man ein zweites
konzentriertes Ambi'tyrosineluat von 2161 erhält, das
ebenfalls mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und filtriert wird.
Zur Weiterverarbeitung werden die beiden Eluate zu einer Lösung vereinigt, die ein Volumen von 337 1
hat.
Die vereinigte Lösung wird mit Wasser auf 11361 verdünnt und durch eine Kolonne vcn 30 1 Carbonsäureharz, Ammoniumform, mit einer Geschwindigkeit von 900 ml/Minute geschickt. Das Harz wird mit
571 Wasser gewaschen und dann über 911 frisches
Harz in einen Glaszylinder von 30,5 cm Durchmesser geschichtet. Die gefüllte Kolonne wird mit 7381
O.lmolarem Ammoniumhydroxid gewaschen, um die Verunreinigungen zu entfernen, worauf das Ambutyrosinprodukt durch Eluieren mit 15141 lmolarem
Ammoniumhydroxid, das in Anteilen zugegeben wird, entfernt wird. Die ersten 6701 lmolares Ammoniumhydroxid enthalten das meiste Ambutyrosin. Die Auszüge werden im Vakuum eingeengt, um das Ammoniak
abzutreiben. Zur weiterer. Reinigung wird das Produkt adsorbiert auf 35 1 frischem Carbonsäureharz, Ammoniumform, und dieses Harz wird über 105 1 frisches
Harz in eine Kolonne von 30,5 cm geschichtet. Die gefüllte Kolonne wird mit 75701 O.lmolarem Ammoniumhydroxid gewaschen, um die Verunreinigungen
zu entfernen, und das Ambutyrosinprodukt wird durch Eluieren mit 7571 lmolarem Ammoniumhydroxid abgetrennt Das Eluat wird im Vakuum auf ein Volumen
von 90 1 eingedampft, mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, 1 Stunde mit
ρ kg Aktivkohle und 12 kg Diatomeenerde verrührt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen bis das Gesamtvolumen des ursprünglichen
Filtrats zusammen mit den Waschwässern 833 i beträgt Die Lösung wird im Vakuum auf ein Volumen
von 301 eingeengt und dann filtriert und Iyophilisiert.
ίο Das Produkt, Ambutyrosinsutfatsalz, hat eine spezifische Drehung [xtf? ~ +29,3° (2% in Wasser).
Analyse: C21H41N5O1, · 2H2SO1 · 2H2O .
Berechnet C 32,02, H 6,27, N 8,89, S 8,14%; gefunden ... C32,08 H 6,36 N9,Γ<ί S8,14%.
Ausbeute 2017 s
Hie Si.iiiead.Jitu>nv>nl/e \on Ambutyrosin werden
in die fr.-ie Hase durch milde Behandlung mit einer
Base, wie Nairiumh\droxid, Kaliumcarbonat oder
Kaliumbicarbonat, oder durch Ionenaustausch in der Kälte übergeführt. Beispielsweise wird eine wäßrige
Lösung des Sulfatsalzos über ein starkes Anionaustauscherharz in der Hydroxidform geleitet. Ein
»5 hoch vernetztes Harz kann verwendet werden. Das
Produkt wird in Form der freien Base erhalten, wenn man die Lösung durch das Harz leitet und dieses dann
mit Wasser auswäscht. Man kann auch eine wäßrige Lösung des Sulfatsalzes auf eine Kolonne, die Carbon-
säureharz ·η der Ammoniumform enthält, aufgeben.
Das Harz mit dem adsorbierten Material wird mit Wasser und geringen Mengen von O.lmolarem Ammoniumhydroxid gewaschen und das Ambutyrosin als
freie Base von der Kolonne mit lmolarem Ammonium
hydroxid eluiert.
Eine Lösung von 6,169 g Ambutyrosin und 5,911 g Natriumformaldehyd-bisulfit in 20 ml Wasser wird
2 Tage stehengelassen. Dann werden 210 ml Methanol unter Rühren zugegeben. Das gummiartige Produkt
wird gerieben, bis es fest wird. Das feste Produkt wird auf ein Filter gebracht und mit Methanol ausgewaschen. Ausbeute 8,503 g. Es ist das Natriumsalz von
Ambutyrosintetra- (N - methansulfonsäure). Zwecks Reinigung wird es wieder in Wasser gelöst und durch
Zusatz von Methanol ausgefällt. Das entsprechende Kaliumsalz der Ambutyrosintetra-(N-methansulfoncpure) wird auf ähnliche Weise aus Kaüumformaldehyd-bisulfit gebildet. Diese Alkalisalze der Ambutyrosinietra-(N-methansulfonsäure) sind pharmazeutisch
brauchbare Derivate, die die gleichen antibakteriellen Eigenschaften aufweisen wie das Ambutyrosin selbst.
Das nach den obigen Methoden erhaltene Ambutyrosin kann auf folgende Weise in die beiden Komponenten Ambutyrosin A und Ambutyrosin B aufgespalten werden:
Man bereitet auf folgende Weise ein Ionenaus
tauscherharz in Boratform: 3 I eines starken Anion-
austauscherharzes in der Chlondform werden in eine Glaskolonne von 5 cm Durchmesser eingebracht. Es
kann dazu ein Harz mit einer Korngröße von 0,12 bis 0,25 mm verwendet werden. Das Hai ζ wird in die
6j Hydroxidform übergeführt, indem man 161 2molare
Natronlauge durch die Kolonne schickt. Es wird dann mit etwa 9,5 I Wasser gewaschen, bis der pH-Wert der
abfließenden Lösung 9,2 ist, worauf das Harz mit 17,51
1 S14527
19 20
einer 5%igen Borsäurelösung behandelt und zum R. β „. s
der abfließenden Lösung etwa 5,5 beträgt. Im folgenden sei ein weiteres Beispiel für die Auf-
sich aus Ambutyrosin A und Ambutyrosin B zusam- 5 B wiedergegeben.
mensetzt, in 15 ml Wasser gelöst und in die Säule ein- Ein starkes Anionenaustauscherharz in Boratform
gebracht. Die Säule wird mit 6,421 Wasser eluiert, und wird wie folgt hergestellt: 3,41 eines starken Anionenes werden Fraktionen von etwa 7 ml/Minute abge- austauschetharzes in Chloridform wird in eine Säule
nommen. Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, von 5,4 cm Durchmesser eingebracht. Hierzu kann ein
werden identifiziert und vereinigt. Bei einer typischen io Harz mit einer Korngröße von 0,12 bis 0,25 mm ver-Trennaktion wird beispielsweise das Produkt in dem wendet werden. Das Harz wird mit 2molarer Na:ron-Eluat gefunden, das nach dem Durchgang von 2,251 lauge in die Hydroxidform übergeführt, mit Wasser geWasser beginnt und abgezogen wird, bis die Säule mit waschen, bis der pH-Wert der abgezogenen Lösung
der Gesamtmenge von 4,951 Wasser eluiert worden ist. 10,5 ist, und dann mit 1215%iger Borsäure behandelt,
Das auf diese Weise durch Eluieren mit Wasser erhal- 15 worauf es zum Schluß mit Wasser gewaschen wird, bis
tene Produkt enthält Ambutyrosin A und ist frei von der pH-Wert der Lösung 6,9 beträgt.
Ambutyrosin B. Ausbeute etwa 3.5 g. Nun wild in die Säule eine Lösung von 4,03 g
Die Kolonne wird dann nacheinander mit 41 Ambutyrosin in 7,5 ml Wasser eingebracht. Die
lVo'ger Borsäure, 2 1 2° „icer Borsäure und zum Kolonne wird mit 11 I Wasser bei einer Geschwindig-Schluß mit 5%iger Borsäurelösung eluiert. Das Eluat ao keil von 14 ml/Minute eluiert und Fraktionen des
wird in Fraktionen gesammelt, und die Fraktionen, die Eluats gesammelt. Die Fraktionen, die bei einem
das Produkt enthalten, weiden identifiziert und ver- Volumen der abgezogenen Lösung von 3,96 1 beginnen
einigt. Bei einem typischen Trennvorgang findet man und bei einem Volumen von 6,97 I enden, enthalten ein
das Produkt hauptsächlich in Fraktionen, die einem Produkt, das ein im wesentlichen von der Komno-Volumen der abgezogenen Losung von 2,64 bis 4,01 25 nente B freies Ambutyrosin A darstellt. Diese Fraktionach Anwendung von 5°/,iger Borsäure entsprechen. nen werden vereinigt und das Ambutyrosin A durch
Dieses Produkt besteht aus Ambutyrosin B, das im Adsorption an einem Carbonsäureharz, Ammoniumwesentlichen frei ist von Ambutyrosin Λ. form, und nachfolgende Eluation mit lmolarem
den: Fraktionen aus der erwähnten Harzsäule, die 30 wurde. Die das starke Anionenaustauscherharz in
einem Lösungsvo'umen von 3,0 bis 3,61 (wobei Wasser Boratform enihaltene Säule wird dann mit 7,11
als Eluiermittel gedient hat) er::spre-hen, werden inner- 2,5%iger Borsäure und zum Schluß mit 51 5%iger
halb etwa 20 Stunden über eine Säule geschickt, die Borsäure eluiert. Man gewinnt ein Produkt aus der
11 ml Carbonsäureharz in Ammoniumform enthält. Säule durch Elution mit 5% Borsäure. Der Haupt-
40 ml O.lmoiarem Ammoniumhydroxid ausgewaschen, die einem Volumen an abgezogener Lösung von 0,5 bis
um Verunreinigungen zu entfernen. Das Ambutyro- 3,2 1 5%iger Borsäure entsprechen. Es handelt sich um
sin A wird dann mit zwei Portionen von je 80 ml Ambutyrosin B, das im wesentlichen von der Kompo-
1 molarem Ammoniumhydroxid eluiert. Der erste Teil nente A frei ist.
ergibt nach Eindampfen im Vakuum und Lyophilisiereti 40 Zwecks weiterer Reinigung wird die Lösung von
584 mg Ambutyrosin A, das Spuren von Bor enthält. Ambutyrosin B in 5%iger Borsäure sehr langsam durch
Um das Bor zu entfernen, wird das Produkt in 5 ml eine Säule von 0,6 cm Durchmesser, die 5 ml Carbon-Wasser gelöst und die Lösung durch 4 ml eines bor- säureharz, Ammoniumform, enthält, geschickt. Die
spezifischen Anionenaustauscherharzes geschickt. Hier- Säule wird mit Wasser gewaschen und dann mit 90 ml
für ist ein Harz wie »Amberlite XE 243« in Form der 45 lmolarem Ammoniumhydroxid eluiert. Das Ammofreien Base geeignet. Die Säule wird dann noch zusatz- niumhydroxideluat wird im Vakuum eingeengt und
lieh mit 8 ml Wasser eluiert und die abgezogene Lö- lyophilisiert und ergibt dann 624 mg Ambutyrosin B
sung lyophilisiert; man erhält das Ambutyrosin A als (freie Base), das mit einer kleinen Menge Borsäure verfreie Base, das keinerlei Borsäure mehr enthält. unreinigt ist. Eine wäßrige Lösung dieses Produktes
tyrosins A in 8 ml Wasser wird durch 6 ml eines starken ionenaustauscherharzes in Form der freien Base ge-
schickt. Die Säule wird zusätzlich mit 15 ml Wasser lieh 10 ml Wasser eluiert. Die abfließende Lösung wird
eluiert und die abfließende Lösung lyophilisiett; man lyophilisiert und ergibt 609 mg Ambutyrosin B, das nur
erhält gereinigtes Ambutyrosin A als freie Base, das 55 noch 0,02% Bor enthält und die folgenden Eigen-
die folgenden Eigenschaften aufweist: Die spezifischen schäften hat: Die spezifischen Potationen [λ]'} (1,5%
+27,2° bei 578 ηιμ; +30,4° bei 546 πιμ; +49,5° bei +38,5° bei 546 ΐημ; +64,0° bei 436 ηιμ. Nach 24stün-
436 ιημ; +74,4° bei 365 ηιμ. Nach 24stündigem 60 digem Trocknen in Vakuum bei 1000C ergibt die
analyse 44,94% Kohlenstoff, 7,05% Wasserstoff und 7,53% Wasserstoff und 11,45% Stickstoff (entspre-
12,23% Stickstoff. In Kaliumbromid hat das Produkt chend einem Dihydrat). Im Kaliumbromid hat das
1390,1457,1498,1550 bis 1610,1652, 2938, 3040 und 65 HOO, 1345, 1390, 1458,1497, 1549, 1580, 1650, 2938,
3410 cm-1. 3040, 3345 und 3370 cm-».
Claims (1)
- Patentanspruch:N'-{4-Amino-2-faydroxybutyiyl)-4-O-{2,6-diamino-li.ö-dideoxy-D-glucopyranosyO-S-O-D-xylofuranosyI-2-deoxystreptamin, N*-(4-Amino-2-hydroxybutyrylH-O-{2,6-dianiino-2,6-dideoxy-D-glucopyranosyO-S-O-D-ribofuranosyl^-deoxystreptamin, deren Gemische und Säureadditionssalze, besonders die Sulfate.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US71557068A | 1968-03-25 | 1968-03-25 | |
US71557068 | 1968-03-25 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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Family
ID=
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