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Verfahren zur Herstellung eines antimikrobiellen
Mittels
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen, die gegenüber einer Vielzahl von Bakterien und Protozoen, wie z. B. Eimeria tenella, antimikrobielle Eigenschaften aufweisen, nämlich des anti mikrobiellen Mittels "M -141" und seiner Säureadditionssalze.
Es wurde gefunden, dass durch Züchtung einer bisher noch nicht beschriebenen Streptomycetenart unter geregelten Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium ein neues, im Rahmen der Erfindung als antimikrobielles Mittel M-141 bezeichnetes Produkt entsteht. Die neue Streptomycetenart wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in der Nähe von Highland Indiana aufgefunden wurde. Durch Vergleich mit Streptomyceten, wie sie in einschlägigen Standardwerken, wie Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe (1957), beschrieben sind, wurden zwei Streptomyceten ermittelt, die der neuen isolierten Species, wie sie gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet wird, am nächsten kommen.
Im Hinblick auf die Charakteristika der Doppelquirl-Struktur und das relative Fehlen von löslichem Pigment wurde Streptomyces cinnamoneus, im Hinblick auf die Struktur des sporenbildende Luftmycels und die Sporen sowie die Farbe der Sporen Streptomyces netropsis ausgewählt. Die neue Streptomycetenart ist mit keinem der beiden oben genannten Streptomyceten identisch und hat den Namen Streptomyces flavopersicus nov. spec. erhalten.
Eine Kultur des Streptomyces flavopersicus nov. spec. wurde bei der Northem Utilization Research and Development Division of the Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt und ist dort in die ständige Sammlung unter der Bezeichnung NRRL Nr. 2820 aufgenommen worden.
In der folgenden Tabelle 1 sind die ähnlichen sowie die unterschiedlichen Merkmale von Streptomyces netropsis, Streptomyces cinnamoneus und Streptomyces flavopersicus zusammengestellt. Die Bezeichnung SAB bezieht sich auf eine Gemeinschaftsarbeit, die vom Subcommittee on Taxonomy of Actinomycetes of the Society, St. Louis, Missouri (1959), veröffentlicht wurde. Die Angaben über die Kohlehydratverwertung durch Streptomyces netropsis und Streptomyces cinnamoneus sind aus diesem Bericht entnommen. Für Vergleichszwecke sind in der Tabelle 1 Daten für Streptomyces flavopersicus, betreffend die Kohlehydratverwertung, aufgenommen worden, sie umfassen 13 Quellen aus der erwähnten Gemeinschaftsarbeit.
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Tabelle 1 Kurzvergleich von Streptomyces flavopersicus, Streptomyces netropsis und Streptomyces cinnamoneus.
EMI2.1
<tb>
<tb>
Merkmal <SEP> : <SEP> Streptomyces <SEP> Streptomyces <SEP> Streptomyces
<tb> flavopersicus <SEP> netropsis <SEP> cinnamoneus
<tb> Type <SEP> der <SEP> Sporenbildung <SEP> doppelquirlig <SEP> doppelquirlig <SEP> doppelquirlig
<tb> Retinaculum <SEP> apertum
<tb> Sporenketten <SEP> Stäbchen <SEP> und <SEP> offene <SEP> kurz <SEP> (USA-Patent <SEP> keine <SEP> Spiralen <SEP> (Dvonch
<tb> Schleifen, <SEP> keine <SEP> rich- <SEP> Nr. <SEP> 2, <SEP> 586, <SEP> 762), <SEP> et <SEP> al., <SEP> Antibiotic <SEP> and <SEP>
<tb> tigen <SEP> Spiralen <SEP> oder <SEP> spiralig <SEP> (Pridham <SEP> et <SEP> Chem., <SEP> Bd. <SEP> 4, <SEP> Nr. <SEP> ll, <SEP>
<tb> dichte <SEP> Windungen, <SEP> al., <SEP> Appl. <SEP> Microbiol. <SEP> November <SEP> 1954), <SEP> kurz,
<tb> mittlere <SEP> Länge <SEP> Bd. <SEP> 6, <SEP> Nr.
<SEP> 1, <SEP> Jänner <SEP> gerade <SEP> bis <SEP> gebogen
<tb> 1958), <SEP> spiralig <SEP> (Mikrophotographie <SEP> in
<tb> (SAB) <SEP> Duggar <SEP> et <SEP> al., <SEP> Ann.
<tb>
N. <SEP> Y. <SEP> Acad. <SEP> Sci., <SEP>
<tb> Bd. <SEP> 60, <SEP> Art. <SEP> I) <SEP>
<tb> Sporen <SEP> zylindrisch, <SEP> zylindrisch, <SEP> kugelförmig,
<tb> 0,4 <SEP> <SEP> x <SEP> 1. <SEP> 1 <SEP> <SEP> 0,65 <SEP> <SEP> x <SEP> 1,30 <SEP> <SEP> 0,6 <SEP>
<tb> Farbe <SEP> der <SEP> Sporenmasse
<tb> Czapek's <SEP> Agar <SEP> hellgelb-pfirsich0 <SEP> blass <SEP> weinrehbraun <SEP> Tönung <SEP> von <SEP> rosa <SEP> bis
<tb> farbig, <SEP> perlrosa <SEP> lavendel <SEP> (SAB)
<tb> Glukoseagar <SEP> hellgraues <SEP> Luftmycel <SEP> weisses <SEP> Luftmycel <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> zimtfarbig
<tb> (Sporen <SEP> spärlich)
<tb> Glukose-Asparagin <SEP> perirosa, <SEP> muschel- <SEP> weisses <SEP> Luftmycel,
<tb> Agar <SEP> farbig, <SEP> hellgelb, <SEP> keine <SEP> Sporen
<tb> pfirsichfarbig
<tb> Tomatenpaste-perlrosa-muschel-hell <SEP> lohfarbig,
<SEP> rosa-hellrosa <SEP> bis <SEP> hellHafermehlagar <SEP> farbig <SEP> getönt <SEP> bis <SEP> rosa <SEP> lohfarbig, <SEP> fleisch-purpurrosa <SEP> und <SEP> lavendel
<tb> und <SEP> hellgelb <SEP> bis <SEP> zimtlederfarbig <SEP> (SAB)
<tb> (SAB)
<tb> Stärkeagar <SEP> fleischrosa <SEP> bis <SEP> hell <SEP> weisses <SEP> Luftmycel <SEP> weisses <SEP> Luftmycel
<tb> aprikosenfarbig,
<tb> perlrosa <SEP> bis <SEP> hell
<tb> melonengelb
<tb> Kartoffelkeil <SEP> perlrosa <SEP> kein <SEP> Luftmycel <SEP> hellgraues <SEP> bis <SEP> graues
<tb> Luftmycel
<tb> Substratmycel
<tb> Czapek's <SEP> Agar <SEP> hellgelb, <SEP> pastellgelb <SEP> weiss, <SEP> sehr <SEP> blassrosa, <SEP> weiss
<tb> cremefarbig <SEP> (SAB),
<tb> blasso1ìve <SEP> -lederfarbig <SEP>
<tb> (USA-Patent
<tb> Nr.
<SEP> 2, <SEP> 586,762)
<tb> Glukose-Asparagin-maisfarbig, <SEP> gold-braun-- <SEP>
<tb> Agar <SEP> gelb <SEP> bis <SEP> altgold
<tb> Glukoseagar <SEP> senfgold <SEP> dunkelbraun <SEP> hellgrüngelb <SEP> bis
<tb> mattgelb-orange
<tb>
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Tabelle l (Fortsetzung)
EMI3.1
<tb>
<tb> Merkmal <SEP> Streptomyces <SEP> Streptomyces <SEP> Streptomyces
<tb> flavopersicus <SEP> netropsis <SEP> cinnamoneus
<tb> Tomatenpaste-amber <SEP> bis <SEP> goldbraun <SEP> dunkelbraun, <SEP> tief-hellbraun <SEP> bis
<tb> Hafermehlagar <SEP> kastanienbraun, <SEP> walnussbraun <SEP> (SAB)
<tb> schwarzbraun <SEP> (SAB)
<tb> Lösliches <SEP> Pigment
<tb> Czapek's <SEP> Agar <SEP> keines <SEP> keines <SEP> (SAB) <SEP> keines <SEP> (SAB)
<tb> Glukose-Asparagin-keines <SEP> braun--- <SEP>
<tb> Agar
<tb> Glukoseagar <SEP> keines <SEP> braun--Tomatenpaste-keines <SEP> braun, <SEP> tief- <SEP> keines <SEP> (SAB)
<tb> Hafermehlagar <SEP> kastanienbraun <SEP> (SAB)
<tb> Kartoffelkeil <SEP> senf-lohfarbige <SEP> mittel- <SEP> bis <SEP> dunkel- <SEP> keines <SEP>
<tb> Verfärbung <SEP> braun
<tb> Waksman's <SEP> Nähragar <SEP> keines <SEP> hellbraun--Nitratmedium <SEP> keines <SEP> braun--Gelatine <SEP> rötlichbraun <SEP> braun <SEP> keines <SEP> (SAB)
<tb> Lackmusmilch <SEP> keine <SEP> Koagulation, <SEP> keine <SEP> Peptonisierung <SEP> koaguliert, <SEP> peptonpeptonisiert, <SEP> oder <SEP> Hydrolyse, <SEP> Re-siert <SEP>
<tb> alkalisch <SEP> aktion <SEP> unverändert
<tb> (USA-Patent
<tb> Nr.
<SEP> 2,586, <SEP> 762),
<tb> Koagulation, <SEP> Peptonisierung <SEP> neutral <SEP> bis
<tb> schwach <SEP> sauer <SEP> (SAB)
<tb> reine <SEP> Gelatine <SEP> verflüssigt <SEP> keine <SEP> Verflüssigung---
<tb> (USA-Patent
<tb> N:.2. <SEP> 586,762)
<tb> Gelatine-Nährmedium <SEP> --- <SEP> verflüssigt <SEP> (SAB) <SEP> verflüssigt
<tb> Stärke <SEP> hydrolysiert <SEP> hydrolysiert <SEP> hydrolysiert
<tb> Nitratreduktion <SEP> positiv <SEP> negativ <SEP> negativ
<tb> Hämolyse <SEP> positiv <SEP> positiv <SEP> (SAB) <SEP> positiv <SEP> (SAB)
<tb> Kohlenstoffquellen
<tb> verwertet <SEP> D-Xylose, <SEP> D-Glukose, <SEP> D-Glukose, <SEP> D-Fruc- <SEP> D-Glukose, <SEP> D-FrucD-Fructose, <SEP> Lactose, <SEP> tose, <SEP> i-Inosit, <SEP> tose, <SEP> i-Inosit, <SEP> MalMaltose, <SEP> Salicin, <SEP> Maltose <SEP> (SAB)
<SEP> tose <SEP> (SAB <SEP> und <SEP> Dvonch
<tb> i <SEP> -Inosit <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1. <SEP> c.) <SEP>
<tb> nicht <SEP> verwertet <SEP> L-Arabinose, <SEP> D-Sorbit, <SEP> D-Xylose, <SEP> D-Arabi- <SEP> D-Xylose, <SEP> L-Arabinose,
<tb> L-Rhamnose, <SEP> D-Sac-nose, <SEP> L-Rhamnose, <SEP> L-Rhamnose, <SEP> Sacchacharose, <SEP> D-Raffinose, <SEP> D-Saccharose, <SEP> Lac- <SEP> rose, <SEP> Lactose, <SEP> RaffiD-Mannit <SEP> (Xylose, <SEP> tose, <SEP> Raffinose, <SEP> nose, <SEP> D-Sorbit,
<tb> Lactose <SEP> und <SEP> Salicin <SEP> D-Sorbit, <SEP> D-Mannit, <SEP> D-Mannit, <SEP> Salicin
<tb> werden <SEP> langsam <SEP> ver-Salicin
<tb> wertet)
<tb>
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Die Assimilation von Kohlenstoff aus verschiedenen Quellen durch Streptomyces flavopersicus geht aus Tabelle 2 hervor.
Das Vorliegen oder das Fehlen von Sporenbildung, das Aussehen der Rückseite des
Mycels und die Anwesenheit oder das Fehlen von löslichem Pigment in diesem durch die zugesetzten
Kohlenstoffsubstrate variierten Grundmedium sind ebenfalls angegeben. Sporen liegen in überreichem ) Masse in allen Fällen starken Wachstums am 7. oder 14. Tag der Bebrütung vor und ebenso zeitig oder am 21. Tag zeigt sich in den meisten Fällen mässiges Wachstum. Die Farbe des sporenbildenden Mycels stimmt mit der Farbe in den vorher erwähnten Medien überein, d. h. sehr hell-pfirsichfarbig oder hell- gelb-cremegetönt mit rosa. Das Substratmycel (Rückseite) zeigt eine hellere Schattierung von einem
Gelb, dessen Intensität in Abhängigkeit von der Bebrütungszeit von sehr hellgelb (pastellgelb) bis goldgelb variiert. Es wird kein lösliches Pigment erzeugt.
Tabelle 2
Verwertung von Kohlenstoffquellen durch Streptomyces flavopersicus.
EMI4.1
<tb>
<tb>
Quelle <SEP> Verwertung <SEP> Wachstumsgeschwindigkeit
<tb> Pentosen <SEP> Xylose <SEP> + <SEP> langsam
<tb> Arabinose
<tb> Rhamnose <SEP> - <SEP> Hexosen <SEP> Glukose <SEP> + <SEP> tasch
<tb> Galaktose <SEP> + <SEP> mässig
<tb> Mannose <SEP> + <SEP> rasch
<tb> Ketosen <SEP> Fructose <SEP> rasch
<tb> Sorbose
<tb> Disaccharide <SEP> Saccharose
<tb> Lactose <SEP> + <SEP> langsam
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> rasch
<tb> Cellobiose <SEP> + <SEP> mässig
<tb> Trisaccharide <SEP> Raffinose
<tb> Polysaccharide <SEP> lösliche <SEP> Stärke <SEP> + <SEP> rasch <SEP>
<tb> Cellulose
<tb> Glukoside <SEP> Salicin <SEP> + <SEP> langsam <SEP>
<tb> Alkohole <SEP> Glycerin <SEP> + <SEP> rasch
<tb> Mannit
<tb> Dulcit <SEP> + <SEP> mässig
<tb> Inosit <SEP> + <SEP> mässig <SEP>
<tb> Sorbit
<tb> Säuren <SEP> Natriumcitrat <SEP> + <SEP> rasch <SEP>
<tb> Natriumlactat <SEP> + <SEP> langsam <SEP>
<tb> bernsteinsaures <SEP> Na <SEP> + <SEP> mässig
<tb> Natriumacetat <SEP> + <SEP> mässig
<tb> Kalium-Natriumtartrac
<tb> Kontrollversuch <SEP> keine <SEP> Kohlenstoffquelle
<tb>
Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung zur Herstellung des neuen antimikrobiellen Mittels M-141 besteht darin, dass man Streptomyces flavopersicus NRRL Nr. 2820 unter submersen aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlehydratquellen, organischen Stickstoff und anorganische Salze enthält, so lange, vorzugsweise 1 - 5 Tage, bei einer Temperatur zwischen etwa 24 und
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etwa 320C züchtet, bis eine wesentliche antimikrobielle Aktivität im Kulturmedium vorliegt, worauf man das antimikrobielle Mittel M-141 aus dem Kulturmedium gewinnt.
Das Verfahren gemäss dieser Erfindung kann auch mit M-141 erzeugenden Varianten oder Mutanten des Streptomyces flavopersicus ausgeführt werden, wie sie durch Einwirkung eines Modifizierungsmittels, wie Röntgenstrahlen, Ultraviolettlicht, chemische Mittel, wie beispielsweise Stickstofflost, auf Streptomyces flavopersicus NRRL Nr. 2820 erhalten werden. Das antimikrobiell wirksame Mittel M-141 in Form seiner Säureadditionssalze ist durch ein breites, antibakterielles Spektrum gekennzeichnet. Die Aktivität dieses Mittels gegen verschiedene als Beispiele gewählte Organismen ist in der folgenden Tabelle angegeben.
Tabelle 3
Antimikrobielles Spektrum.
EMI5.1
<tb>
<tb>
Organismus <SEP> Minimale <SEP> Hemmkonzen- <SEP>
<tb> tration <SEP> nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> in/ml <SEP>
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> > <SEP> 100
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 6880 <SEP> 25
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> Juhl <SEP> 50
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 25
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalis <SEP> 12,5
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> 50
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> 100
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 75
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 400
<tb> Proteus <SEP> mirabilis <SEP> 100
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> BMH <SEP> Nr. <SEP> 10 <SEP> 25
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> BMH <SEP> Nr. <SEP> 1 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> BMH <SEP> Nr. <SEP> 4 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> BMH <SEP> Nr.
<SEP> 6 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 10145 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 25
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 50
<tb> Clostridium <SEP> sporogenes <SEP> > <SEP> 400
<tb> Corynebacterium <SEP> species <SEP> 50
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 50
<tb> Lactobacillus <SEP> casei <SEP> 25
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 50
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209P <SEP> 100
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> 200
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Treaster <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Wise <SEP> 391 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 100
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 50
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae
<SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Actinomyces <SEP> bovis <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Chaetomium <SEP> globosum <SEP> > <SEP> 100
<tb>
Das antimikrobielle Mittel M-141 in Form seiner Säureadditionssalze hat eine geringe Toxizität und kann oral oder intravenös angewendet werden. Die Toxizität des M-141-Hydrochlorids z. B. wurde bei intravenöser Anwendung mit LDso= etwa 1000 mg/kg bestimmt. Die Toxizität nach oraler Verabreichung
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von M-141-Hydrochlorid ist, als LD50 ausgedrückt, höher als 5000 mg/kg. Das antimikrobielle Mittel
M-141 ist ausserordentlich wertvoll bei der Bekämpfung von Coccidiosis.
Beispielsweise wurde gefunden, dass bei Einverleibung des antimikrobiellen Mittels M-141-Hydrochlorid in Kükenfutter in einer Konzen- tration von 0,9 bis 1, 8 g je 1, 5 kg Futter und Verfütterung dieses Futters an Küken, die stark Cocci- diosis-infiziert waren (welche auf das Protozoon Eimeria tenella zurückzuführen ist), eine ausserordent- lich wirkungsvolle Bekämpfung der Coccidiosis erzielt werden konnte.
Beispiele für assimilierbare Kohlehydratquellen, die in dem beim erfindungsgemässen Verfahren be- nützten Kulturmedium verwendet werden können, sind pflanzliche Öle oder Mischungen von diesen. Als
Quelle für organischen Stickstoff kann im Kulturmedium z. B. Sojamehl vorliegen. Ferner enthält das Kulturmedium zweckmässig Wuchsstoffe und Mineralstoffe, wie "Distillers solubles"., Mineralsalze, wie
Natriumchlorid, ein unlösliches Puffermittel, wie Kalziumkarbonat, zur Verhinderung einer pH-Wert- Änderung, und ein nichttoxisches Antischaummittel, wie umgeesterte pflanzliche Öle oder in Sojaöl ge- löstes Methylpolysiloxan.
Wenn bei der Züchtung des Streptomyces flavopersicus eine genügende Menge antibiotischer Substanz entstanden ist, wie durch einen Versuch nach der Hemmzonenmethode unter Veri wendung von Escherichia coli bestimmt werden kann, wird das antimikrobielle Mittel aus dem Kulturfil- trat gewonnen. Der Hauptteil des aktiven Materials liegt in der flüssigen Phase vor und relativ wenig ist im Mycel des Filterkuchens enthalten. Eine Ausführungsform der Gewinnung des neuen antimikrobiellen
Mittels umfasst die Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, durch welches dem Filtrat die mikrobielle
Aktivität entzogen wird. Die antimikrobielle Substanz kann bequem als kristallines Sulfat oder Hydrochlorid isoliert werden.
Versuche zur Herstellung der freien Base haben bisher zu keinem Erfolg geführt, weil die Base bei den hohen pH-Werten, die zur Abspaltung des Säureesters von der Basenfunktion mit pKcx= 9 erforderlich sind, instabil ist. Es ist jedoch nicht notwendig, die freie Base herzustellen, um sie in das Hydrochlorid oder Sulfat oder in ein beliebiges anderes Salz überzuführen. Zur Gewinnung der antimikrobiellen Sub- stanz aus der Kulturflüssigkeit kann ein Kationenaustauscherharz angewendet werden. Die antimikrobielle
Substanz kann aus dem Harz mit der gewünschten Säure eluiert werden, wobei dann das entsprechende
Salz erhalten wird. Es ist jedoch vorteilhaft, das Salz der antimikrobiellen Base umzukristallisieren, um es von unerwünschten organischen Basen zu befreien.
Hydrochlorid und Sulfat können bequem aus wässe- rigem Aceton oder von deren übersättigten wässerigen Lösungen zur Kristallisation gebracht werden ; es empfiehlt sich daher, das kristalline Hydrochlorid oder Sulfat herzustellen und dann unter Anwendung geeigneter Massnahmen in die andern gewünschten Salze umzuwandeln. Die Verwendung eines Anionen- austauscherharzes, das mit der gewünschten Säure beladen ist, ist eine allgemeine Methode, um die Re- ste einer Säure durch jene einer andern zu ersetzen.
Beispiele von auf diese Weise herstellbaren Salzen sind das Formiat, Carbonat, Oxalat, Salicylat,
Citrat, Benzoat u. dgl.
Ein zur Verwendung im Schüttelkolben geeignetes Impfmaterial kann auf Trypton-Schrägagar ge- züchtet werden. Dieses Medium kann auch verwendet werden, um geeignete Kulturen des Streptomyces flavopersicus, durch Überimpfen von Schrägkultur zu Schrägkultur lebensfähig zu erhalten. Im allgemei- nen hat sich jedoch eine Konservierung von Streptomyces flavopersicus im Boden oder im lyophilisierten
Zustand als zweckmässige Methode erwiesen. Die Züchtung auf Schrägagar wird angewendet, um Schüt- telkolben zu beimpfen, die dann wieder zur Beimpfung von Forschungsfermenternbenütztwerden können.
Bei einer andern Verfahrensweise werden Schüttelkulturen für die Beimpfung von ein entsprechendes
Medium enthaltenden Metallbehälter benützt, deren Inhalt dann zur Animpfung von Fermentern im
Massstab von Pilot-Anlagen oder von Impftanks für grössere Anlagen weiterverwendet wird. Im allgemei- nen wird die Produktion des antimikrobiellen Mittels in Fermentern mit einem Fassungsvermögen von 23 und 2000 1 in 5 Tagen den Maximalwert erreichen. Es wird kein Vorteil erzielt, wenn die Fermentation länger als 5 Tage ausgedehnt wird. Eine für die Verwendung als Impfmaterial geeignete Kultur kann in
24 h erhalten werden. Im Fermenter werden durch Zufuhr steriler Luft über eine Verteilungsvorrichtung im unteren Abschnitt des Fermenters aerobe Bedingungen aufrechterhalten.
Die Menge der in das Kultur- medium eingeführten Luft variiert etwas in Abhängigkeit von Grösse und Form des Fermentationskessels.
Eine Belüftungsgeschwindigkeit von 4/5 Vol.-Teilen Luft pro Vol. -Teil Kultur je min wird im allgemei- nen als zufriedenstellend anzusprechen sein.
Während der Fermentationsperiode empfiehlt es sich, das Kulturmedium kräftig zu rühren. Bei der Gewinnung des Impfmaterials, bei der die Ausbeute an antimikrobieller Substanz nicht von entscheidender Bedeutung ist, wird eine genügende Bewegung für ein zufriedenstellendes Wachstum dadurch erreicht, dass man Luft durch die Flüssigkeit hindurchtreten lässt. Wenn jedoch die Ausbeute an antimikrobieller
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Substanz wichtig ist, soll das Bewegen der Kulturflüssigkeit durch Rührvorrichtungen bewirkt werden. Das
Ausmass der Bewegung hängt von der Grösse der verschiedenen Fermentationskessel ab.
Streptomyces flavopersicus ist geeignet, das gewünschte antimikrobielle Mittel in zufriedenstellen- der Menge in einer Vielzahl von Kulturmedien zu bilden ; dabei ist es nicht notwendig, ein bestimmtes 5 Mass an Belüftung oder mechanischer Bewegung aufrechtzuhalten.
In den folgenden Beispielen wird die Gewinnung, Reinigung und Identifizierung des antimikrobiellen
Mittels M-141 und die Herstellung von Säureadditionssalzen desselben veranschaulicht.
Beispiel l : In einen 500 ml Erlenmeyerkolben werden 150 ml eines Impfmediums gegeben, das die folgenden Bestandteile in den angegebenen Konzentrationen enthält :
EMI7.1
<tb>
<tb> ) <SEP> Glukosemonohydrat <SEP> 15 <SEP> g/1
<tb> feingemahlenes, <SEP> entfettetes <SEP> Sojamehl <SEP> 15 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> Kalziumkarbonat <SEP> 1 <SEP> g/l
<tb>
Kolben samt Inhalt werden durch Autoklavieren während 25 - 30 min bei einer Temperatur von 121 C sterilisiert, Nach dem Abkühlen wird der Kolben mit einem Teil einer Oberflächenkultur eines Trypton- schrägagars beimpft, auf dem Streptomyces flavopersicus wenigstens 6 Tage gezüchtet worden ist.
Der beimpft Kolben wird bei 280C in einer Rundschüttelmaschine geschüttelt, die eine Hubweite von
5, 72 cm (2 1/4 ") aufweist und 48 h mit etwa 230 Umdr/min arbeitet. Eine zweite Passage der Impfkul- tur wird hergestellt, indem die oben genannte Kultur zur Beimpfung weiterer Kolben benützt wird, die, wie oben angegeben, vorbereitet und sterilisiert worden sind. Jeder Kolben wird mit etwa 3 ml der 48 h alten Kultur beimpft. Die Impfkolben werden bebrütet und wie oben 48 h geschüttelt.
In einemFermentationstank mit 23 1 Fassungsvermögen werden 12 l eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung eingebracht :
EMI7.2
<tb>
<tb> Glukosemonohydrat <SEP> 25 <SEP> g/l
<tb> Sojameh. <SEP> l <SEP> 20 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Kalziumkarbonat <SEP> 1 <SEP> g/l
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> Sojaöl <SEP> 5 <SEP> gil <SEP>
<tb> Methylpolysiloxan-Antischaummittel <SEP> l <SEP> g/l <SEP>
<tb>
Fermenter samt Inhalt werden sterilisiert, indem die Anlage 75 min bei 1210C autoklaviert wird.
Nach Abkühlung wird der Fermenter aseptisch mit dem Inhalt der drei oben erwähnten, die zweite Passage der Impfkultur enthaltenden Kolben beimpft. Die Vermehrung der Kultur erfolgt im Fermenter bei 280C während 5 Tagen ; während dieser Zeit wird gerührt und sterile Luft in den unteren Teil des Tanks in einer Menge von etwa 0,8 Vol.-Teilen Luft je Vol.-Teil Kulturflüssigkeit je Minute eingeleitet. Die maximale biologische Aktivität wird nach etwa 5 Tagen erreicht. Die Anwesenheit des antimikrobiellen Mittels im Fermentationsmedium wird wie folgt ermittelt : Eine Papierscheibe von 13 mm Durchmesser wird mit der geklärten Kulturflüssigkeit gesättigt und auf einen mit Escherichia coli beimpften Agarnährboden gebracht. Es entsteht eine Hemmzone von 17 mm.
Unter den gleichen Bedingungen ergibt eine Chloramphenicollösung mit einer Konzentration von 0,08 mg/ml eine Wachstumshemmung von 18 mm.
Beispiel 2: Etwa 7 l der nach Beispiel 1 hergestellten Fermentationsbrühe werden auf einem Saugfilter abfiltriert und ergeben 5, 6 I Filtrat. Das Kulturfiltrat wird über 500 ml eines porösen Ionenaustauscherharzes mit geringem Vernetzungsgrad geleitet, der Carbonsäurereste als aktive Gruppen enthält.
Das Harz ist in einer Glaskolonne mit etwa 3 cm Durchmesser enthalten und wird in der Natriumform verwendet. Nachdem das Kulturfiltrat durch die Kolonne geführt worden ist, wird die Kolonne mit Wasser gewaschen und mit 0, 25n-Salzsäure entwickelt. Die Fraktionen werden aufgefangen und auf antibakterielle Aktivität untersucht. Die aktiven Fraktionen aus der Kolonne werden vereinigt, auf einen PHWert von 4 eingestellt und eingedampft. Der Rückstand wird mit Methanol extrahiert und die Methanollösung mit Schwefelsäure behandelt, um den überwiegenden Teil des Kalziums als Sulfat auszuscheiden, worauf mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von etwa 6 eingestellt und filtriert wird. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 5 ml Wasser aufgelöst und filtriert.
Nach Zugabe von 15 ml Aceton zu der Lösung wird das Hydrochlorid von M-141 in einer Ausbeute von 900 mg zur Kristallisation gebracht.
Das chlorwasserstoffsaure Salz des antimikrobiellen MittelsM -141 kristallisiert aus wässerigen Lösun-
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gen in farblosen, transparenten, langen, schmalen, scharf ausgebildeten Kristallen. In teilweise polarisiertem Licht zeigen die Kristalle zahlreiche Interferenzfarben, hohe Doppelbrechung und scharfe Extinktion parallel zur Längsachse.
In wässeriger Lösung ist das Hydrochlorid rechtsdrehend, [a] = 25. Es liegt keine charakteristische Absorption im Ultraviolettlicht vor. Die Titration einer wässerigen Lösung des Hydrochlorids mit Natron-
EMI8.1
löslich, etwas löslich in Methanol, in andern üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Chloroform und Äther, unlöslich.
Nach Umkristallisation aus Äther zeigt das M-141-Hydrochlorid die folgenden Analysenwerte :
C14H38O12N2Cl2
Berechnet : C = 33, Wo H = 7, 7% N = 5, 6%
Cl = 14,agio 0 = 38, 70/0
Trocknungsverlust = 18, 1%
Gefunden : C = 34,03% H = 7, 46% N = 5,56%
Cl = 14, 19"/0 0 = 38, 83%
Trocknungsverlust = 19, 1%
C-Methyl = 4, 78% 0-Methyl = 0%
Der Trocknungsverlust stimmt sehr gut mit der Anwesenheit von 5 Molekülen Kristallwasser überein, so dass der M-141-Base die Formel C14H26N2O7 zugeschrieben wird.
Zur Herstellung von M-141-Sulfat wird eine Lösung von 100. mg M-141-Hydrochlorid in 2 ml Wasser zu einer Lösung von 62 mg Silbersulfat in 7 ml Wasser gegeben. Das gefällte Silberchlorid wird abfiltriert und die überstehende Flüssigkeit wird auf Chlorion geprüft. Nach Feststellung der Abwesenheit von Chlorionen wird die überstehende Flüssigkeit mit Schwefelwasserstoffgas behandelt, um etwa vorliegendes überschüssiges Silber abzutrennen. Durch die Lösung wird Luft geleitet, bis der Schwefelwasserstoff vollständig ausgetrieben ist. Die Lösung wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 0,8 ml Wasser gelöst. Nach Zugabe von 1 ml Methanol und 2 ml Aceton zur Lösung kristallisiert das M-141-Sulfat in wenigen Minuten. Nach Umkristallisation aus 50% igem wässerigem Methanol beträgt die Ausbeute anM-141-Sulfat 50 mg.
Dieses Produkt zeigt folgende Analysenwerte :
EMI8.2
S = 6,47% O = 46,82% Gefunden : C = 33, 37% H = 6,88% N = 5, 670/0
EMI8.3
Das Sulfat zersetzt sich oberhalb 1900C und kristallisiert in dünnen, flachen, rechtwinkeligen Platten. Im senkrecht polarisierten Licht zeigen die Kristalle starke Doppelbrechung mit einigen Interferenzfarben und scharfe Extinktion parallel zur Längsachse.
Röntgenbeugungsbilder von kristallinem M-141-Sulfat werden auf photographischem Film unter Verwendung von nickelgefilterter CuKα-Strahlung (# = 1, 5418 A) mit einer General Electric-Standard-Pulverkamera mit 7, 16 cm Radius aufgenommen, die eine Bestimmung von d-Abständen bis zu 20 Ä ermöglicht. Die relativen Intensitäten der Beugungslinien wurden geschätzt. Die d-Abstände und Intensitäten sind in der folgenden Tabelle angegeben.
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Tabelle 4 Röntgenbeugungsbild des M-141-Sulfats.
EMI9.1
<tb>
<tb> d-Abstände <SEP> Geschätzte <SEP> d-Abstände <SEP> Geschätzte
<tb> in <SEP> <SEP> relative <SEP> in <SEP> relative
<tb> Intensität <SEP> Intensität
<tb> 14, <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 72 <SEP> 2
<tb> 8, <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 55 <SEP> 2
<tb> 7, <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 2, <SEP> 48 <SEP> 3
<tb> 6, <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 2, <SEP> 42 <SEP> 2
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 35 <SEP> 4
<tb> 5, <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 2, <SEP> 28 <SEP> 2
<tb> 5, <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 2, <SEP> 23 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 9 <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 18 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 4,68 <SEP> 3 <SEP> 2, <SEP> 15 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 41 <SEP> 5 <SEP> 2,11 <SEP> 2
<tb> 4, <SEP> 21 <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 04 <SEP> 3
<tb> 4, <SEP> 02 <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 01 <SEP> 2
<tb> 3, <SEP> 90 <SEP> 4 <SEP> 1,
<SEP> 94 <SEP> 1 <SEP> breit <SEP>
<tb> 3, <SEP> 75 <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 89 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 61 <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 81 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 50 <SEP> 2 <SEP> breit <SEP> 1,78 <SEP> 2
<tb> 3,33 <SEP> 1 <SEP> 1,72 <SEP> 2 <SEP> breit <SEP>
<tb> 3, <SEP> 22 <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 64 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 13 <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 62 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 02 <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 57 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 94 <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 50 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 2,84 <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 42 <SEP> 1 <SEP> breit <SEP>
<tb>
Röntgenbeugungsbilder von kristallinem M-141-hydrochlorid werden in der gleichen Weise, wie vorstehend für das Sulfat beschrieben, erhalten. Die d-Abstände und Intensitäten sind in der folgenden Tabelle angegeben.
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Tabelle 5 Röntgenbeugungsbild des M-141-Hydrochlorids.
EMI10.1
<tb>
<tb> d-Abstände <SEP> Geschätzte <SEP> d-Abstände <SEP> Geschätzte <SEP>
<tb> in <SEP> relative <SEP> in <SEP> Ä <SEP> relative
<tb> Intensität <SEP> Intensität
<tb> 11, <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 2, <SEP> 78 <SEP> 4
<tb> 9, <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 66 <SEP> 4
<tb> 7, <SEP> 9 <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 60 <SEP> 2
<tb> 7, <SEP> 1 <SEP> 6 <SEP> 2, <SEP> 54 <SEP> 2
<tb> 6, <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 2, <SEP> 45 <SEP> 3
<tb> 6, <SEP> 1 <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 36 <SEP> 2
<tb> 5,8 <SEP> 1 <SEP> 2,31 <SEP> 2 <SEP> breit <SEP>
<tb> 5,2 <SEP> 1 <SEP> - <SEP> 2, <SEP> 28 <SEP> 2 <SEP> breit <SEP>
<tb> 4, <SEP> 64 <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 23 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 36 <SEP> 4 <SEP> 2.
<SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> breit <SEP>
<tb> 4, <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 12 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 3,85 <SEP> 6 <SEP> breit <SEP> 2,06 <SEP> 2
<tb> 3, <SEP> 71 <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 99 <SEP> 2
<tb> 3, <SEP> 61 <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 91 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 50 <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 87 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 40 <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 84 <SEP> 2
<tb> 3, <SEP> 30 <SEP> 10 <SEP> 1, <SEP> 77 <SEP> 1 <SEP> breit <SEP>
<tb> 3. <SEP> 16 <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 74. <SEP> 1 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 09 <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 70 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 95 <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 65 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 2, <SEP> 87 <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Bei Aufnahme eines Infrarotspektrums des antimikrobiellen Mittels M-141 als kristallines Hydrochlo-
EMI10.2
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Tabelle 6 Infrarotspektrum.
EMI11.1
<tb>
<tb>
Wellenlänge <SEP> in <SEP> Mikron <SEP> Frequenz <SEP> in <SEP> cm-l <SEP> Intensität
<tb> 2, <SEP> 9-3, <SEP> 4 <SEP> 3400-2940 <SEP> S <SEP> (breit)
<tb> 3, <SEP> 45 <SEP> 2900 <SEP> Nujol
<tb> 5, <SEP> 95 <SEP> - <SEP> 6, <SEP> 15 <SEP> 1680 <SEP> - <SEP> 1625 <SEP> M <SEP> (breit)
<tb> 6,36 <SEP> 1572 <SEP> M
<tb> 6, <SEP> 85 <SEP> 1460 <SEP> Nujol
<tb> 7, <SEP> 27 <SEP> 1376 <SEP> Nujol
<tb> 7,39 <SEP> 1353 <SEP> W
<tb> 7, <SEP> 51 <SEP> 1332 <SEP> W
<tb> 8, <SEP> 49 <SEP> 1177 <SEP> W
<tb> 8, <SEP> 73 <SEP> 1145 <SEP> M
<tb> 8, <SEP> 90 <SEP> 1124 <SEP> W
<tb> 9, <SEP> 01 <SEP> 1110 <SEP> M
<tb> 9, <SEP> 2 <SEP> 1087 <SEP> M
<tb> 9, <SEP> 29 <SEP> 1076 <SEP> M
<tb> 9,54 <SEP> 1048 <SEP> M
<tb> 9, <SEP> 63 <SEP> 1039 <SEP> M
<tb> 9, <SEP> 72 <SEP> 1029 <SEP> M
<tb> 9,97 <SEP> 1003 <SEP> M
<tb> 10, <SEP> 45 <SEP> 957 <SEP> M <SEP>
<tb> 10, <SEP> 62 <SEP> 941 <SEP> W
<tb> 10,
<SEP> 79 <SEP> 927 <SEP> S
<tb> 11,16 <SEP> 896 <SEP> W
<tb> 11,39 <SEP> 878 <SEP> W
<tb> 11,58 <SEP> 864 <SEP> S
<tb> 12, <SEP> 21 <SEP> 819 <SEP> W
<tb> 13,73 <SEP> 728 <SEP> M
<tb> 13,9 <SEP> 719 <SEP> Nujol
<tb>
S = stark ; M = mittel ; W = schwach
Das vollständige Infrarotabsorptionsspektrum des kristallinen Hydrochlorids des antimikrobiellen Mittels M-141 ist in der Zeichnung dargestellt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung des neuen antimikrobiellen Mittels M-141, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces flavopersicus NRRL Nr. 2820 oder dessen Varianten oder Mutanten unter submersen aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlehydratquellen, organischen Stickstoff und anorganische Salze enthält, so lange, vorzugsweise 1-5 Tage, bei einer Temperatur zwischen etwa 24 und etwa 32 C, züchtet, bis eine wesentliche antimikrobielle Aktivität im Kulturmedium vorliegt, worauf man das antimikrobielle Mittel M-141 aus dem Kulturmedium gewinnt.