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Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums Die vorliegende Erfindung
betrifft eine neue und wertvolle antibiotische Substanz, die Viomycin (Warenzeichen)
genannt wird, und Verfahren zu ihrer Herstellung. Insbesondere befaßt sich die Erfindung
mit Verfahren zur Herstellung dieses Stoffes mittels Gärung, zur Gewinnung und Konzentrierung
der Substanz aus den Rohlösungen einschließlich der Gärbrühen, zur Reinigung der
Substanz und zur Herstellung ihrer Salze. Zur Erfindung gehören die Herstellung
des Antibiotikums und seiner Salze sowohl in verdünnten Lösungen, wie z. B. in Foim
von Rohkonzentraten, als auch in reiner, kristalliner Form.
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Das neue Antibiotikum bildet sich bei der gelenkten Kultivierung eines
bisher unbeschriebenen, speziellen Mikroorganismus, der hier Streptomyces puniceus
genannt wird. Dieser Organismus wurde aus einer in der Nähe von Cienfuegos, Kuba,
entnommenen Bodenprobe isoliert. Er wird in Anlehnung an die Bestimmungstafel desWerkesvonB
erg ey »Manual of Deter, minative Bacteriology«, 6. Auflage, S. 929
bis 933 im folgenden beschrieben.
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Die Kulturcharakteristiken dieser Mikroorganismenart werden auf Grund
von Bestimmungen mit der Reinkultur Nr. 1314- 5 unten in Tabellenform wiedergegeben.
(Farbenangaben, die mit R bezeichnet sind, beziehen sich auf dasWerk von Ridgway
2,Color Standards and Nomenclature«).
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Die Angaben beruhen auf der Auswertung von
je
io Röhrchen mit
Ausnahme der Zucker (2 Röhrchen).
| Wachs- Farbe des |
| Nährmedium tums- Luft-Mycels und löslichen Benierkungen |
| grad der Sporen Pigments |
| Glukoseasparagin mäßig Sporenteil variiert zwischen keine Kolonie
erhöht; Rand glatt; Ober- |
| Agar Perlgrau und Blaßweinrot- fläche rauh; Sporenbildung gut; |
| grau bis meistens zum Blaß- Spitzen der Hvphae und Conidio- |
| olivgrau oder »Olive Buff « phores rot oder rosa
- Conidia o,65 |
| (R) Wachsteil Neutralrot bis: x 1,3011, länglich,
in Ketten; drei |
| Corinthpurpur (R) Kolonientypen (von etwa iio Ko- |
| lonien) |
| l# 25 Kolonien vollständig in |
| Sporen, nahezu blaßolivgrau (R) |
| 2. Etwa So Kolonien mit wenig |
| Sporenbildung, weiß bis blaßbraun- |
| graues (R) LLiftmycel, bedeckt mit |
| farblosen Tröpfchen |
| 3. EtWa 5 Kolonien mit wach- |
| siger Oberfläche, kein Luftmycel, |
| aber coreniiaähnliche Strukturen, |
| an deren -Spitze oft mit Sporen ver- |
| schene Hyphae-, alle Kolonien hat- |
| ten vegetatives Mvcel, nahezu co- |
| rinthpurpur (R) |
| Gelatine mäßig Weiß bis »Pale Olive Buft« (R) #i keine starke
Verflüssigung |
| Lackmusmilch gering brauner Ring Dunkel- Keine Hydrolyse oder
Peptoni- |
| braun sierung; p11-Wert wechselte von |
| 6,2 nach 6,3 bis 6,7 |
| Apfelsaures gut bis Weiß auf 4Röhrchen der nor- keine Rückseite
weiß in 6 Röhrchen der |
| Caicium mäßig malen Form des Apfels. Ca, Normal- und i-Form
des apfelsr. |
| »Pale Olive Buff,( (R) auf 2" Ca, gelblich in 4 Röhrchen der
i- |
| Röhrchen der i-Form, auf 4 Forrn |
| anderen Röhrchen der i-Form |
| ist der #'#littelpiinkt der Kolo- |
| nie Blaßmausgrau und ihre |
| Ränder nahe »Pale Chalcedo- |
| ny Yellow« (R) |
| Celltilose Sehr |
| geringes |
| oder kein |
| Wachstum |
| Glukose Agar gut Weiß bis Blaßmausgrau (R) Braun Oberfläche
runzelig zerrissen; Rück- |
| seite braun |
| Kartoffel gut Blaßolivgrau (R) oder mit Dunkel- Kolonien runzelig |
| »Pallid Quaker Drab« (R) braun |
| gefleckt; Wachsstellen -Deep |
| Livis Purple« (R) |
| Stärkeplatten gering Blaßweinrotlila bis Blaß- keine schwach
h\,drolv"iert. Rückseite |
| rauchgrau und Blaßbraungrau neutralrot bis dunkelcorinth- |
| (R) purpur (R) |
| Svnth'etischer mäßig Blaßolivgrau bis Blaßmaus- keine Rückseite
blaßpurpur (R) |
| Agar grau (R) |
| Nähragar mäßig weiß keine Rückseite weiß |
| Emersonsches gut BlaßoliN-grau (R); Wachs- keine Rückseite
nahezu tiefpurpur- |
| Nährmedium stellen nahezu Hellweinrot- weinrot (R) |
| grau (R) |
| Wachs- Farbe des |
| Nährmedium tums- 1 Luft-?vfycels und löslichen Bemerkungen |
| grad der Sporen Pigments |
| d-Xylose mäßig Blaßweinrotgrau (R) keine Rückseite corinthpurpur
(R) |
| i-Arabinose gering Blaßmausgrau (R) keine Rückseite hellzimtgrau
oder |
| weinrotgrau (R) |
| i-Rhamnose gering Weiß keine Rückseite weiß |
| Laevulose mäßig Blaßweinrotgrau (R) keine Rückseite corinthpurpur
(R) |
| Galaktose mäßig Blaßolivgrau (R) keine Rückseite dunkelweinrotpurpur |
| (R) |
| Saccharose gering Weiß keine Rückseite weiß |
| Maltose mäßig Blaßolivgrau (R) keine Rückseite dunkelweinrotpurpur |
| (R) |
| Lactose gering Weiß keine Rückseite weiß |
| Raffinose gering Weiß keine Rückseite weiß |
| Intilin gering Weiß keine Rückseite weiß |
| d-Mannit gut Blaßolivgrau (R) keine Rückseite nahezu dunkelweinrot- |
| pur-pur (R) |
| d-Sorbit gering Weiß keine Rückseite weiß |
| Dulcit gering Weiß keine Rückseite weiß |
| Inosit gering Weiß keine Rückseite weiß |
| Salicin gering Blaßmausgrau (R) keine Rückseite hellzimtgrau
(R) |
| Natriumeitrat gering Blaßmausgrau (R) keine Rückseite sehr
helles Braun |
| Natriumsuccinat gering Blaßmausgrau (R) keine Rückseite weiß |
| Kligler Eisen gut Nährmedium unverändert |
| Tyrosinat-Agar t' ,ering Nahezu -Drab Gray(, (R) keine
Kolonie dünn, wachsig, flach, |
| durchscheinend; Rückseite |
| hellbraun |
| Nitratbrühe mäßig Nitrate sind reduziert |
| Nähragar kein |
| Schüttelröhrchen Wachstum |
| unter der |
| Oberfläche |
| Paraffin kein |
| Wachstum |
Es wird darauf hingewiesen, daß die vorliegende Erfindung sich bezüglich der Herstellung
von Viomycin nicht auf die Verwendung dieses speziellen Organismus oder auf Organismen,
die der obigen Beschreibung voll entsprechen, beschränkt. Die Beschreibung ist nur
zur Erläuterung angeführt. Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung von Varianten
dieses Organismus, die aus ihm mittels mutierend wirkender 'Mittel, wie z. B. Röntgenstrahlen,
Ultraviolettstrahlen, Stickstoff, Senfölen u. dgl., erhalten werden.
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Antibiotika, die durch Organismen der- Gattung Streptomyces der >Actinomyceten
(von denen jetzt einige gut bekannt sind) gebildet werden, werden in zwei Klassen
unterteilt: i. Neutrale Substanzen, die mittels Lösungsmittel aus den Brühen bei
saurem, neutralem und alkalischem PH-Wert extrahiert werden können, und 2. basische
Substanzen, die im allgemeinen mittels organischer Lösungsmittel nicht extrahiert
werden können.
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Chloromycetin und Actinomycin sind typische Vertreter der ersten Gruppe,
während Streptomycin und Streptothricin zur zweiten Gruppe gehören. Nach dieser
Einteilung gehört Viomycin zur zweiten Gruppe. Viomycin besitzt auch die Eigenschaft
dieser Gruppe, daß es durch gewisse saure Farbstoffe, wie z. B. Eriochromviolett,
Pontaminechtorange, Alizarinrot
S,
Synthracenblau, Pontaminstahlblau, Pontamingrün
und ähnliche Farbstoffsulfosäuren, gefällt wird. Charakteristisch
für
diese Gruppe, zu der Viomycin gehört, ist ein breites antibiotisches Spektrum, insbesondere
bei den gramnegativen Bakteri.en. Die folgende Tafel zeigt die Vergleichsspektren
von Streptomycin, Streptothricin, Chloromvcetin, Aureornwin und Viomycin:
| Tafel 1 |
| ,ug je ccm des Antibiotikums, die erforderlich sind,
um das Wachstuin von Mikroorganismen |
| auf Nähragarplatten zu verhindern. |
| Organismu 3- 4. 5. |
| s Aureomycin Chlorornycetin
Streptomycin Streptothricin Vioinvcin |
| S. aureus 0,9 7 4 0 |
| S. albus 0,9 7 6 - |
| Z) 100 |
| B. subtilis 1 3 5 jo ioo |
| B. mycoides o,g 4 7 70 80 |
| Bodenheimer Org. 1 500 1 o00 10 500 |
| S. typhosa 5 4 10 10 100 |
| S. pullorum 2 5 30 5 ioo |
| S. paratyphi A 5 3 20 5 ioo |
| S. paratyphi B 5 5 30 io ioo |
| K. Pneumoniae 7 5 10 5 30 |
| Sh. paradysenteriae 5 1 io - ioo |
| E. coli 5 5 ioo |
| A. aerogenes o,g 2 5 5 30 |
| Ps. aeruginosa 10 20 io 10 3 000 |
| Proteus sp. 50 80 io 8 500 |
| M. Albicans 2000 > 2 000 > 2 000 ioo 3 000 |
| i. Kristallines Hydrochlorid. |
| 2. Kristallin. |
| 3. Streptomycinsulfat (750 Streptomycineinheiten
pro Milligramm) in Milligranim der aktiven Base. |
| 4. Streptothricinsulfat (aus kristallinem Helianthat, 8oo Streptomycineinheiten
pro Milligramm). |
| 5. Rohes, amorphes Viomycinsulfat, das nach Beispiel
3 dieser Beschreibung hergestellt worden war. |
Weitere Unterschiede des Viomycins gegenüber bekannten Antibiotika, die aus den
Streptomyces erhalten werden, ergeben sich durch Vergleich der Wirksamkeit von Präparaten
dieser Antibiotika mit Bakterienr.tämmen, die im Vergleich zu dem ursprünglichen
empfindlichen Stamm gegenüber dem Antibiotikum resistent gemacht worden sind, und
zwar durch reihenweise Übertragung in Brühen, die zunehmend größere Mengen des Antibiotikums
enthalten. Dies wird in der folgenden Tafel erläutert, in der die Dosierung auf
E. Coliverdünnungseinheiten pro Kubikzentimeter bezogen worden ist. Die Wirksamkeit
j edes Antibiotikums wurde zuerst bestimmt durch Ermittlung desjenigen Volumens
einer Nährflüssigkeit (in KubikzentimetermiteinerStandardkulturvonE.-Coli, das mit
i mg des Antibiotikums nach i8stündiger Bebrütung bei
37' wachstumsfrei gehalten
werden konnte. Diese Kubikzentirneterzahl ist der CVE-Wert (Coli-Verdünnungs-Einheit
en) für das betreffende Antibiotikum. Zum Vergleich der Antibiotitika bei gleicher
biologischer Wirksamkeit werden dann einheitliche CVE-Werte von 5o und ioo ccm gewählt
und von jedem Antibiotikum diejenigen '.Mengen
be-
nutzt, die diese Werte
ergeben.
| Tafel 11 |
| Vergleich der Wirkung von verschiedenen Antibiotika gegenüber
Stämmen von A. aerogenes in Nährbrühe. |
| Streptomycin Streptothriein Chloromvcetiii Viomycin |
| Organismus 50 100 50 100 50 100 50 : 100 |
| (CVE/ccm) (CVE/CCM) (CVE Ccm) (CVEI/CCM) |
| A. aerogenes Stamm A |
| A. aerogenes Stamm B - -+ + |
| A. aerogenes Stamm C 4- + |
| A. aerogenes Stamm D + + + + + |
| + Wachstum; - = kein Wachstum |
| A. aerogenes Stamm A ist empfindlich gegenüber
25 CVE/ccm aller obengenannten Antibiotika. |
| A. aerogenes Stamm B ist resistent gegenüber 200
CVE/CCM Chloromycetin. |
| A. aerogenes Stamm C ist resistent gegenüber
4 400 CVE,Iccm Streptomycin und etwa 25 CVE/CCrn Strepto- |
| thricin. |
| A. aerogenes Stamm D ist resistent gegenüber
7 500 CVE/ccm Streptothricin und etwa 200 CVE/Ccm |
| Streptomycin. |
Aus Tafel I I ist ersichtlich, daß Viomycin das Wachstum von A.-aerogenes-Stämmen,
die gegenüber Streptomycin und Chloromycetin resistent gemacht worden sind, nicht
aber von Stämmen, die gegenüber Streptothricin resistent gemacht worden sind, zu
verzögern vermag. Hierdurch unterscheidet sich Viomycin klar von all diesen Antibiotika
mit Ausnahme von Streptothricin.
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Die Unterscheidung von Viomycin gegenüber Streptothricin und Streptomycin
ist möglich durch sein Verhalten auf einem Papierchromatogramm in Wasser, das Mit
20i1, piperidin- und 204 p-toluolsulfosäurehaltigem n-Butanol gesättigt ist, bei
einerBetriebsdauer von 96 Stunden bei 250 C, wobei B subtilis als
Versuchsorganismus verwendet wird., --
Antibiotikum Rf Streptomycin
A ........ 0,38
Streptothricin ......... 0,04 Viomycin .............
o,o6 Viomycin bleibt unverändert, wenn eg 15 Minuten lang in einer Konzentration
von 5oo mg pro Kubikzentimeter in Wasser bei pl,-Werten von 2,o, 6,5:und 9,o gekocht
wird.
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Die Giftigkeit verschiedener Antibiotika einschließlich Viornwin ist
in Tafel III angegeben.
| Tafel III |
| Giftigkeit verschiedener Antibiotika |
| (mg pro 2o g Maus) |
| Antibiotikum Intravenös Subkatam Oral |
| LDO LD50 LDO LD50 LDO LD50 |
| Streptomycinsulfat 2,5 |
| Streptothricinstilfat |
| 4,0 |
| Chloromycetin o,6 |
| Aureomvcinhydrochlorid 1,5 |
| #'iom#?cinstilfat (roh) 6 7 io 35 2oo unbestimmt |
Viomycin kann durch Zücbten von Streptomyces puniceus hergestellt werden, und zwar
vorteilhaft bei 24 bis
30' C unter Rühren und Belüftung innerhalb eines Nährmediums,
das eine Kohlehydratquelle, wie z. B. Zucker, Stärke oder Glycerin, enthält; weiterhin
eine organische Stickstoffquelle, wie z. B. Sojabohnenmehl oder Weizenkleber; eine
Wachstumsstoffquelle, z. B. ein bei der alkoholischen Vergärung von Weizen oder
überwiegend Weizen enthaltenden Körnerfruchtmischungen anfallendes Nebenprodukt,
das nach Abdestillieren des Alkohols aus der Gärflüssigkeit durch deren Eindicken
bis zu Sirupkonsistenz erhalten wird; ferner Kochsalz und Calciumcarbonat als Puffersubstanz.
Nach beendeterri Wachstum wird das Mycel abgetrennt und das Antibiotikum z. B. durch
Zusatz von Farbstoffsulfosäuren, wie z. B. Eriochromviolett, Pontaminechtorange
od. a., aus der Brühe gefällt. Der Farbstoffkuchen wird dann aufgespalten und das
Antibioti-*kum aus dem Filtrat isoliert.
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Impfstoff kann man erhalten, wenn man ein Wachstum aus Schrägnährboden
oder Roux-Flaschen, die mit
S. puniceus geimpft sind, verwendet. Ein Nährmedium,
das sich für dieses Anfangswachstum eignet, besteht aus:
| Dextrose ............................. io
g |
| Fleischextrakt ........................ 4
9 |
| Pepton ... ........................... 4 9 |
| Hefeextrakt .......................... i g |
| Natriumchlorid ....................... 2 , 5g |
| Mit dest. Wasser aufgefüllt zu iooo ccm |
| Nach Einstellung des pl,-Wertes auf 7,o wird |
| hinzugefügt Agar ................... 30 9 |
Dieses Wachstum verwendet man, um entweder geschüttelte Kolben oder andere Behälter
für im Innern des Nährmediums er-folgende Züchfungen (Unterwasserzüchtungstanks)
zu impfen. Man kann auch diese Behälter aus den geschüttelten Kolben impfen. Im
allgemeinen wird das Wachstum in einem geschüttelten Kolben seinen Höchstwert in
4 Tagen erreichen, während Impfstoff in Unterwasserzüchtungstanks -gewöhnlich den
günstigsten Wert in 2 Tagen erreicht.
Aus dem Züchtungstank treibt man die-den
Mikroorganismus enthaltende Brühe unter völlig sterilen Bedingungen in das Gärgefäß,
worin das Züchten zwei weitere Tage lang fortgesetzt wird. Die Gärtanks werden ständig
in der Weise belüftet, daß sterile Luft durch eine Verteilungsvorrichtung im Verhältnis
von
% bis 2 Volumteile freier Luft zu i Volumteil Brühe pro Minute unter
ständigem Rühren der Brühe eingeblasen wird.
' Es ist für dauernde und vollständige
Sterilität zu sorgen. Die Temperatur der Brühe wird im allgemeinen zwischen 24 und
30' C gehalten.
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Viomycin kann aus der Gährflüssigkeit, in der es sich gebildet hat,
nach verschiedenen Verfahren gewonnen werden. Es wurde gefunden, daß das Antibiotikum
aus seinen wäßrigen Lösungen durch Zusatz verschiedener saurerer Farbstoffe gefällt
werden kann. Folgende Farbstoffe erweisen sich z. B. hierbei als wirksam: Erioechtcyagin,
Pontaminechtorange, Alizarinrot S,
Synthracenblau, Pontaminstahlblau, Polargelb,
Methylorange, Pontamingrün, Eriochromviolett. . Von iesen ist der zuletzt
genannte Farbstoff der günstigste. Die gefällten Farbstoffsalze können in ein einfaches
Viomycinsalz dadurch umgewandelt werden, daß man eine Suspension des Farbstoffsalzes
in einem Lösungsmittel, wie z. B. Methanol oder einer Mischung aus .Methanol und
Aceton, mit Triäthylaminsulfat behandelt. Das so gefällte Viomycinsulfat wird abfiltriert
und getrocknet. Man kann auch so verfahren, daß das Sulfat nach dem Abfiltrierewin
Wasser gelöst
und die wäßrige Lösung durch Ausfrieren im Vakuum
getrocknet wird. Es können ' auch andere Aminsulfate oder Aminsalze von Säuren,
die mit Viomycin in Lösungsmitteln unlösliche Salze bilden, verwendet werden. Umgekehrt
kann man auch ein Farbstoffsalz Ales Antibiotikum mit einem anorganischen Salz,
wie z. B. Barium- oder Calciumchlorid, behandeln und dann das gefällte Farbstoffmetallsalz
von der Lösung des löslichen, antibiotischen Salzes abfiltrieren.
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Eine andere allgemeine Methode, um Viornycin aus seinen Gärbrühen
oder ähnlichen wäßrigen Lösungen zu gewinnen, besteht darin, daß man Kationenaustauscher
verwendet, vorzugsweise karboxylierte Harze. Dieses Harz kann ansatzweise oder auch
in Türmen zurVerwendungkommen. NachdemdasAntibiotikum auf einem derartigen Harz
absorbiert worden ist, kann es mit einer verdünnten Säure herausgelöst werden. Aus
der wäßrigen Lösung kann dann das festeViomycyn nach verschiedenen Verfahren gewonnen
werden. Zum Beispiel kann die Lösung nach Einstellung des PH-Wertes auf etwa
6 durch Ausfrieren getrocknet werden, oder die Lösung kann konzentriert und
mit einem Lösungsmittel, wie z. B. Methanol oder ein(r Mischung von Lösu
' ngsmitteln, wie z. B. Methanol und Butanol, behandelt werden, um das Viomvcinsalz
züi fällen. Wird verdünnte Salzsäure zur Auswa'schung de, Kationenaustauschers verwendet,
so kann das salzsaure Salz des Viomycins nach obigem Verfahren -cwonnen werden.
Es kann auch in das Sulfat umgewandelt werden, das aus wäßrigem Methanol, wie z.
B. 2o0/, Wasser enthaltendem Methanol, ausfällt.
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Es lassen sich verschiedene kristalline Salze des Viomycins herstellen,
einschließlich des Reineckats, Pikrats, fl-Naphthalinsulfonats, Sulfats und Hydrochlorids.
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Kristallines Viomycin-Reineckat kann so herIgestellt werden, daß man
das amorphe Viornycinsulfat in Wasser mit Ammoniumreineckat behandelt. Das, kristalline
Pikrat kann in ähnlicher Weise hergestellt werden. Kristallines Viomycin-p-naphthalinsulfat
kann erhalten werden, wenn man eine konzentrierte *wäßrige Lösung des amorphen Sulfats
mit einer konzentrierten, wäßrigen fl-Naphthalinsulfonsäurelösung behandelt. Nach
Einstellung des pi-Wertes auf etwa 6 mittels einer gesättigten Bariumhydroxydlösung
wird die Lösung filtriert, im Vakuum konzentriert und mit Äthanol behandelt. Das
kristalline Salz scheidet sich dann ab.
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Das kristalline Sulfat des Viomv.cins kann auf verschiedene Weise
hergestellt werden. Zum Beispiel wird das amorphe Sulfat (6oou g/mg oder mehr) in
Wasser gelöst und mit Methanol behandelt, bis die Lösung etwa 750/, des Lösungsmittels
enthält. Beim Abkühlen der Lösung und Kratzen der Gefäßwandung scheiden sich Kristalle
ab. Eventuell können auch andere Lösungsmittel, wie z. B. Äthanol, Aceton oder Methylcellosolve
mit Vorteil verwendet werden. Amorphes Viomycinhydrochlorid (etwa 7oo y,/mg) kann
in kristallines Sulfat verwandelt werden, wenn man das amorph e Salz in
50 01 1 ',igern Methanol mit überschüssigern Triäthylaminsulfat und
zusätzlichem Methanol behandelt. Das Salz aus Viomycin und Polargelb kann in Aceton
mit Triäthylaminsulfat behandelt werden, wobei amorphes Viomycinsulfat ausfällt,
welches nach mehrtägigem Stehen kristallin wird.
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Kristallines Viomycinliydrochlorid kann aus amorphem Hydrochlorid,
wie es beispielsweise unter Verwendung von karboxyliertem Harz oder durch Behandlung
des Helianthats mit meihanolhaltiger Salzsäure gewonnen wird, erhalten werden, wenn
man es in einer geringen Nfenge Wasser löst, Methanol hinzufügt und dann die Lösung
kühlt und animpft, Das aus den Gärbrühen erhaltene Viornycin enthält zwei antibiotisch
wirksame Komponenten. Die oben beschriebenen Verfahren zür Herstellung der kiistallinen
Salze eignen sich dazu, ViomN,cin in seine Komponenten zu trennen, und zwar in den
größeren Anteil, der sich als kristallines Salz abscheidet, und den kleineren Anteil,
der in der Mutterlauge zurückbleibt und aus dieser gewonnen werden kann. Die beiden
Komponenten können auch mit Hilfe der Papierchromatographie getrennt weiden, und
zwar unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Piperidin, Butanol und p-toluolstilfonsätire,
wie dies Winsten im journal of the American Chemical Society 70, 1948, S.
3333 beschrieben hat. Bei Anwendung dieses Systems wandert der größere Anteil
auf dem Papier in geringerem #laße als der kleinere Anteil. Unter Verwendung von
Whatman-Filter-II papier Nr- 4 werden 6o bis 70 Stunden Entwicklungszeit
gebraucht, um die Komponenten voneinander zu trennen.
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Viomycin ist eine starke organische Base, die sich aus den Elementen
Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff zusammensetzt. Wie bereits oben
ausgeführt wurde, bildet es Salze mit einer Reihe von organischen und anorganischen
Säuren. Die spezifische optische Drehung einer Probe des krisiallinen Sulfats wurde
bestimmt zu (a)D 25 - - 31"3 (H#O, i O# 0),
Das Ultraviolettabsorptionssl)ektriim
einer Probe des kristallinen Sulfats in Wasser zeigt ein einziges deutliches Maximum.
E bei 267,5 ni, e # 285
Das Infrarotspektrum einer Probe des
kristallinen, in Mineralöl verriebenen Viom.#,cinstilfats zeigt wenige charakteristische,
scharfe Absoiptionsbanden. Drei von diesen festgestellten Banden besitzen die Frequenzen
(in reziproken cm) 324o, 1677 und 1228. Es wurde auch eine sehr breite Bandu mit
(lern Nfaximum bei etwa io8i beobachtet.
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Eine Probe des kristallinen Hvc1roclilorids zeigte den Schmelzpunkt
26,9 bis 2683 C unter Zersetzung. Das kristalline Sulfat besitzt keinen
bestimmten Schmelzpunkt, sondern zersetzt sich allmählich bei erhöhter Temperatur.
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Eine Probe des kristallinen Sulfats, die drei Stunden lang im Vakuum
bei ioo# C getrocknet worden war, zeigte folgende DurchschnittsanalYsenwerte:
36,730 ' ;' 0
Kohlenstoff, 5,8o0" Wasserstoff, 21,420 , Stickstoff,
17,530,/, Sulfationen und l,#"52" , (berechnet aus der Differenz) Sauerstoff.
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Die Salze des mit anni -anischen Säuren,
wie z. B.
Salzsäure und Schwefelsäure, sind leicht löslich in Wasser, aber nur gering löslich
in Lösungsmitteln, wie z. B. Methanol, Aceton und MTethy#cellosolve.
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Viomycin unterscheidet sich von allen bekannten Antibiotika, wie durch
Vergleich der verschiedenen, oben angegebenen physikalischen Eigenschaften ersichtlich
ist.
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Die Wirksamkeit des Viomycins kann turbidimctrisch bestimmt werden,
wobei als Organismus Klebsiella pneumoniae, PCI 602; und als Prüfnährmedium
die Antibiotikumbestimmungsbrühe ' des Baltimore Biological Laboratory verwendet
wird, die nach der Vorschrift für Brühen für turbidimetrische Streptomycinbestimmungen
der -Food and Drug Administration« hergestellt ist. Das Prüfverfahren ist das von
M c M a h o n, j, R., in j. Biol. Chem. Band 153, Seiten 249 bis
258, April 1944, beschriebene Verfahren. Kristallines Viomycinsulfat mit
den oben angegebenen Eigenschaften wird als Standard für den Vergleich von anderen
Viomycinproben und Viomycinlösungen verwendet. Die dem Sulfat zugeteilte Wirksamkeit
beträgt 765 iig pro i!ng (y,2mg). Damit entspricht die freie Viomycinbase
iooo"/mg.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Verfahren, nach
denen Viomycin gebildet, gewonnen, konzentriert, gereinigt und schließlich in die
reine, kristalline Form übergeführt wird. Die kristallinen Salze des Viomycins sind
auf Grund ihrer hohen Reinheit und Wirksamkeit von besonders hohem Wert. Die Beispiele
dienen nur der Erläuterung der Erfindung und. sollen diese in keiner Weise einschränken.
In allen Beispielen wurde ein Stamm. Streptomyces puniceus unter der Bezeichnung
Reinkultur 1314
- 5
verwendet.
| Beispiele |
| i. Bildung und Gewinnung des Viomycins |
| Es wurde ein Nährmedium folgender Zusammen- |
| setzung hergestellt : |
| Sojabohnenmehl .................. iog |
| Dextrose ......................... io g |
| Natriumchlorid ................... 59 |
| Wachstumfördernder Stoff (vgl. oben |
| nach Tafel III) ................. o,5 g |
| Mit Wasser aufgefüllt auf .......... i ooo ccm |
| Nach Einstellung des pli-Wertes mit |
| K 0 H auf 7,0 wurde zugefügt Cal- |
| ciumcarbonat .................. 1 g |
Dieses Nährmedium wurde in 5oo-ccm-Mengen auf 2,8Liter Fernbachkolben verteilt,
die bei 12I'C
30 Minuten lang sterilisiert wurden. Nach dem
Ab-
kühlen
wurde das Nährmedium mit einer Suspension von
S. puniceus geimpft, der aus
Schrägnährböden oder Roux-Impfstoff-Flaschen, wie oben beschrieben, erhalten worden
war. Die Flaschen wurden auf einer Rotationsschüttelmaschine mit etwa
6 cm Versetzung bei 2oo Umdrehungen pro Minute 4 Tage lang bei
27' C geschüttelt. Nach dieser Zeit besaß die Brühe eine Wirksamkeit von
320 CVE pro Kubikzentimeter bei einem pH-Wert von
7,3. Die Mischung
aus Brühe und Mycel wurde mittels Schwefelsäure auf einen pH-Wert
- 2,o eingestellt.
Darauf wurde eine kleine Menge Filterhilfe hinzugegeben und die Mischung filtriert.
Die klare Mischung wurde auf einen pli-Wert von
5,5
eingestellt, worauf Eriochromviolett
im Verhältnis von 2
g pro Liter unter Rühren hinzugefügt wurde. Das Rühren
wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Um die Filtrierung zu ermöglichen,
wurde genügend Filtrierhilfe hinzugegeben, worauf der Kuchen abfiltriert und mit
2o0/
! , des ursprünglichen Wasservolumens gewaschen wurde. Nach dem Trocknen
wurde der Kuchen in
1 '.,'12 des ursprünglichen Volumens 8o0/,igen Methanols
suspendiert und dann unter zweistündigem Rühren bei Raumtemperatur mittels i
g BaC1,
- 2 11,0 auf
je
2
g Eriochromviolett zersetzt.
Nach Filtrierüng wurde das Methanolfiltrat mittels einer geringen Menge Kohle entfärbt
und nochmals filtriert. Zu dem wasserklaren Filtrat wurden 2 Volumteile absoluten
Methanols und pro
g BaC1,
- 2 11,0 weiterhin 2 ccm einer 5o0/jgen
Lösung von Triäthylaminsulfat in Methanol hinzugegeben. Der Niederschlag von Bariumsulfat
und Viamycinsulfat wurde nach Zusatz eines Filterhilfsmittels abfiltriert. Der Kuchen
wurde mit absolutem Methanol gewaschen und dann mit Wasser geschüttelt, um das Viomycinsulfat
in Lösung zu bringen, worauf das Bariumsulfat und das Filtermittel abfiltriert wurden.
Die so erhaltene wasserklare, wäßrige Lösung des Viomycinsulfats wurde getrocknet.
Das daraus erhaltene amorphe, weiße Pulver zeigte eine Wirksamkeit von 40 CVE pro
mg.
| 2. Bildung des Viomycin> |
| Es wurde ein Nährmediurn folgender Zusammen- |
| setzung hergestellt: |
| Weizenkleber ..................... iog |
| Glycerin . ........................ iog |
| Kasein ........................... 59 |
| Rübenmelasge .......... « ......... 2 g |
| Maiseinweichlauge ................. 2 g |
| Wachstumfördernder Stoff (vgl. oben |
| nach Tafel III) ................. 2 g |
| Nach Einstellung des pH-Wertes mit |
| Kalilauge auf 7,o werden zugefügt |
| Calciumcarbonat .............. 59 |
| Mit Leitungswasser aufgefüllt auf i ooo ccm |
| Sojabohnenöl ................ I ccm |
Das Ganze wird 45 Minuten lang bei 121'
C s.terilisiert.
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75 Liter dieses Nährmediums wurden unter Rühren in einem 2oo-Liter-Impftank
Mit 2 Liter Impfstoff geimpft, der, wie oben beschrieben, durch Unterwasserzüchtung
von
S. puniceus und 24stündigem Wachstum bei
27' C bei dauernder Rührung
und Durchblasen steriler Luft durch die Brühe in einem Verhältnis von etwa i,o bis
1,5 Volumteile freier Luft zu i Volumteil Brühe in jeder Minute hergestellt worden
war. Am Ende der 24 Stunden wurde der so hergestellte Impfstoff unter vollkommen
sterilen Bedingungen in 6oo Liter des gleichen Nährmediums in einem iooo Liter-Gärgefäß
eingetragen. Rührung und Belüftung wurden in der gleichen Weise wie, in derh Impftank
durchgeführt. Nach 48 Stunden
bei
270 C zeigte die Brühe
eine definitive Wirksamkeit von ioo CVE pro Kubikzentimeter.
| 3. Bildung und Gewinnung von Viomycin |
| Es wurde ein Nährmedium folgender Zusammen- |
| setzung hergestellt: |
| Weizenkleber ..................... iog |
| Glycerin ......................... 10 g |
| N-Z-Amin B (Kaseinhydrolysat) .... |
| 59 |
| Rübenmelasse .................. '2 g |
| Maiseinweichlauge ................. 2 g |
| Wachstumfördernder Stoff (vgl. oben |
| nach Tafel III) ................. 2 g |
| Mit Leitungswasser aufgefüllt auf .. i ooo ccrn |
| ..Nach Einstellung des pH-Wertes mit |
| KOH auf -7,o wurden zugefügt |
| Calciümcarbonat .............. 59 |
Vier
2,8 Liter Fernbachkolben, von denen jeder i Liter dieses Nährmediums
enthielt, wurden 20 Minuten lang bei 121'
C sterilisiert. Nach dem
Ab-
kühlen wurden sie mit einer Susppnsion von
S. puniceus, der aus
einem Schrägnährhoden erhalten worden war, geimpft und auf einer Rotationsschüttelmaschine
48 Stunden lang bei
28' C geschüttelt. Die aus Brühe und Mvcel bestehende
Mischung wurde zum Impfen eines 2oo-Liter-Gärgefäßes verwendet, das
75 Liter
des obengenannten Nährtnediums enthielt, welches vorher 20 Minuten lang bei 121'
C unter streng aseptischen Bedingungen sterilisiert worden war. Die Rührung
wurde durch eine Propellervorrichtung bewirkt, während dem Gärgefäß durch eine Verteilungsvorrichtung
sterile Luft zugeführt und es dadurch unter positivem Luftdruck gehalten wurde.
Nach 48 Stunden zeigte die Gärflüssigkeit eine Wirksamkeit von ioo CVE pro Kubikzentimeter.
-
Diese 75 Liter Gärflüssigkeit wurden von dem Mycel durch Filtration
getrennt und mit Schwefelsäure auf den pH-Wert 6,5 eingestellt, worauf 240
9
Ammoniumoxalat hinzugefügt wurden, um das Calcium als Oxalat zu fällen,
das dann abfiltriert wurde. Die klare Brühe wurde mit Schwefelsäure auf den PH-Wert
5,5 eingestellt. Darauf wurden i6o g Erioehromviolett hinzugegeben
und die Brühe 1,5 Stunden lang gerührt. Der Farbstoffniederschlag wurde nach
Zusatz von Filterhilfe von der Brühe getrennt. Der Farbstoffkuchen wurde mit
15 Liter Wasser gewaschen und durch Hindurchblasen von Luft durch den Filterkuchen
getrocknet. Der trockene Kuchen wurde in 3 Liter einer Mischung aus 8o0/,
Methanol und 200/, Aceton suspendiert, worauf 250 CCM tiner Lösung von Triäthylaminsulfat
in 5o0/,igem Methanol hinzugegeben wurden und das Ganze noch i St u nden lang gerührt
wurde. Der aus Viomycinsulfat und Filtermittel bestehende Niederschlag wurde abfiltriert
und mit Aceton und dann mit Methanol gewaschen. Der trockene Kuchen wurde dann eine
halbe Stunde lang in 2 Liter destilliertem Wasser verrührt und das Filtermittel
aus der Viomycinsulfatlösung durch Abfiltrieren beseitigt. Die klare, wasserhelle
Viomycinsulfatlösung wurde getrocknet, worauf die so erhaltene amorphe, weiße Substanz
eine Wirksamkeit von 370 CVE pro Milligramm zeigte. 4. Gewinnung des Viomycins
durch Farbstoffsalzfällung 75 Liter Gärbrühe aus dem Wachstum eines Stammes
Streptomyces puniceus mit dem Wirksamkeitswert von etwa 570 7/ccm wurden
filtriert. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 6,5 wurde die Lösting mit 240
g Ammoniumoxalat behandelt und der Calciumoxalatniederschlag abfiltriert.
Die Lösung wurde auf den pil-Wert 5,5 eingestellt und darauf 16o
g Eriochromviolett in sie hineingerührt. Nach einstündigem Rühren wurde ein
Filtrierhilfe züi der iNlischung gegeben und die Fällung abfiliriert, Der Kuchen
wurde mit 15 Liter Wasser gewaschen und dann getrocknet. Der trockene Farbstoffkuchen
wurde in 3 1 einer Mischung aus 8o0/, Aceton und 2o0/', Methanol (Volumenprozent)
suspendiert, worauf eine Lösung von Triäthylaminsulfat in 500,!,igem NIethanol in
geringem Überschuß zugegeben wurde, um eine völlständige Fällung des antibiotischen
Sulfats zu gewährleisten. Die Mischung wurde Stunden lang gerührt und dann filtriert.
Der Filterkuchen wurde mit Aceton und Methanol gewaschen, um (fen Farbstoff zu entfernen,trocken
gesaugt und dann in 2 Liter destillierten Wassers eingetragen. Nachdem das Viornycinsulfat
sich gelöst hatte, wurde die Lösung filtriert und das Filtrat durch Ausfrieren getrocknet.
Es wurden 18 g
Substanz erhalten, die eine Wirkung %-on 620 11) miz
zeigte. ,5. Gewinnung des Viomycins durch Kationenaustauscherharze 2 Liter
einer filtrierten Viomycingärbrühe mit dem Wirksamkeitswert 6oo y/ccm wurden auf
einen pn-Wert von etwa 8 eingestellt und mit ioog Austauscherharz behandelt.
Die Mischung wurde 3 Stunden lang gerührt, worauf das Harz abfiltriert und
mit Wasser gewaschen wurde. Hierbei verblieben in dem Filtrat etwa 340/, der antibiotischen
Wirksamkeit. Das Harz wurde durch zweistündiges Verrühren mit verdünnter Salzsäure
aus ewaschen. Der pH-Wert ,9 lag schließlich bei 2. Die Lösung wurde filtriert und
auf einen PH-Wert von 6,6 eingestellt. Sie erhielt etwa 500/, des
ursprünglich in der Gärflüssigkeit vorhandenen Antibiotikums. Um das feste Viomycinhydrochlorid
zu erhalten, kann diese Lösung durch Ausfrieren getrocknet werden. Es ist jedoch
vorteilhaft, die weitere Reinigung wie im folgenden beschrieben vorzunehmen.
-
Die Harzauswaschungslösung wurde im Vakuum konzentriert, wobei gleichzeitig
ein heißer Methanoldampfstrom eingeleitet wurde, bis der Wassergehalt der Lösung
auf 130/, reduziert war. Nachdem 25 CCM
dieser Lösung mit 25 ccm Methanol
behandelt und der entstandene Niederschlag abfiltriert worden war, konnte Viomycinhyclrochlorid
mit einem Wirksamkeitswert von 325 y.rug durch Zusatz von 50 cem Butanol
gefällt werden. Das Produkt enthielt 21"/, Asche. Wenn diese Substanz in möglichst
wenig. Wasser gelöst und wiederum mitMethanol und Butanol behandelt wurde, so erhielt
man Viomyconhydrochlorid mit einem Wirksamkeitswert von etwa 8oo -plmg, das nur
0,50i, Asche enthielt.
Besser als die Gewinnung des Viomycinhydrochlorids
kann die Gewinnung des Sulfats durchgeführt werden, wie im folgenden beschrieben
wird. Die durch Auswaschen des Kationenaustauscherharzes erhaltene Lösung wurde
neutralisiert und auf etwa 40ooo7ccm konzentriert. Das vorhandene Calcium wurde
mittels einer Lösung von Triäthylaminsulfat in 5o0/,igem Methanol ausgefällt.' Nach
Zusatz eines gleichen Volumteiles Methanol wurde das Calciumsulfat abfiltriert und
das Filtrat mit Methanol behandelt, bis eine Konzentration des Lösungsmittels von
8o0/, erreicht war. Nach evtl. weiterem Zusatz von Triäthylaminsulfat wurde das'
ausgefallene Viomycinsulfat abfiltriert. Das getrocknete Produkt zeigte einen Wirksamkeit-,wert
von etwa 8oo y,.mg und enthielt wenig Asche. 6. Kristallisierung des Viomycinsulfats
Zunächst wurden Kristallkeime von Viomycinsulfat auf folgende Weise hergestellt.
Durch Behandlung einer wäßrigen Lösung von amorphem Viomycinsulfat (Wirksamkeitswert
etwa 700Y/mg) mit einem geringen Überschuß von Ammonium-Reineckat wurde kristallines
Reineckat hergestellt. Dieses sich leicht abscheidende kristalline Reineckat des
Antibiotikums wujde dann in Methanol mit Triäthylaminsulfat behandelt, wodurch kristallines
Viomycinsulfat erhalten wurde.
-
Danach konnte kristallines Viomycinsulfat direkt aus amorphem Material
von genügender Reinheit (etwa 650y,Img) erhalten werden. Das amorphe Material wurde
in einer kleinen Menge Wasser gelöst. Dann wurde Methanot hinzugegeben, bis die
Lösung trübe wurde, Kristallkeime von Viomycinsulfat wurden zugefügt und die Mischung
gerührt. Die ausgeschiedenen Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet. Sie zeigten
einen Wirksamkeitswert von etwa 76o y mg. Es können auch andere Lösungsmittel,
wie z. B. Methylcellosolve, Aceton oder Athanol verwendet werden, jedoch ist Methanol
vorzuziehen.
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Amorphes Viomycinhydrochlorid mit dem Wirksamkeitswert von
720 Y Mg wurde in das kristalline Sulfat wie folgt umgewandelt.
65 g der Substanz wurden in einer Mischung von 500 ccm Wasser und
500 ccm Methanol gelöst. Überschüssiges Triäthylaminsulfat in Form einer
Lösung in 5o0/0igem Methanol (400 ccm) wurde langsam hinzugegeben. Die Mischung
wurde geimpft, gerührt und mit i5o cem Methanol versetzt. Die ausgeschiedenen Kristalle
wurden abfiltriert und nacheinander mit 6o0/,igem Methanol, 8o0,1.igem Methanol
und wasserfreiem Methanol gewaschen. Das Produkt wurde im Vakuum über wasserfreiem
Calciumchlorid getrocknet. Es wurden 56,2 g erhalten, die eine Wirksamkeit
von 750 7/mg zeigten. 7. Kristallierung des Viomycinhydrochlorids
io g amorphes Viomycinhydrochlorid mit dem Wirksamkeitswert 750 y,./mg
wurden in 40 ccm Wasser gelöst und dann 200 CCM Mefhanol hinzugegeben. Die
Lösung wurde er-wärmt, geimpft und gerührt. Während des Abkühlens wurden
500 ccm Methanol allmählich hinzugegeben. Das kristalline Hydrochlorid des
Antibiotikums wurde abfiltriert und getrocknet. Es wurden 3,35 g erhalten,
die eine Wirksamkeit von etwa 8oo y/mg zeigten. Dieses Produkt hatte einen Schmelzpunkt
von 265 bis 268'C. Durch Konzentrierung der Mutterlauge konnte weitere kristalline
Substanz erhalten werden.
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8. Herstellung von kristallinem Viomycin-fl-naphtalinsulfat
io g amorphes Viomycinsulfat mit dem Wirksamkeitswert von etwa
500 y,mg wurden in 40 ccm Wasser gelöst. Zu der Lösung wurden 8,o
g ß-,Naphthalinsulfonsäure in 2o ccm Wasser hinzugegeben. Die Lösung wurde
mittels einer gesättigten Bariumhydroxydlösung auf den pil-Wert 6,o eingestellt,
worauf das ausgefallene Bariumsulfat abfiltriert wurde. Nach Konzentrierung des
Filfrates und Zusatz von Äthanol wurden 1,5 g kristallines fl-Naphthalinsulfonat
erhalten. Es zeigte eine Wirksamkeit von etwa 6oo ylmg.
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Es wird darauf hingewiesen, daß in den vorstehenden Beispielen die
Zusammensetzungen der Kulturnährriiedien weitgehend verändert werden können. Beispielsweise
kann Weizenkleber usw. durch Baumwollsamenmehl oder Sojabohnenmehl ersetzt werden.
Gleichfalls können die Gärbedingungen, wie z. B. Rührung, Belüftung, Temperatur
usw. weitgehend verändert werden. Weiterhin können viele andere, dem Fachmann zur
Verfügung stehende Methoden und Abwandlungen der beschriebenen Verfahren zur Gewinnung,
Konzentrierung und Reinigung des Antibiotikums und seiner Salze verwendet werden.
Zum Beispiel kann man die Gewinnung und Reinigung des Antibiotikums durch Adsorption
an aktivierter Tonerde, Holzkohle od. dgl. und anschließende Auswaschung mit Säuren,
neutralen Lösungsmitteln od. dgl. bewirken.
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Die vorstehenden Angaben zeigen, daß das neue Antibiotikum bei der
Behandlung der verschiedenen menschlichen und tierischen Infektionskrankheiten von
großem Wert ist. Es kann durch parenterale Injektion, oral oder auch örtlich in
den üblichen Dosierungen verabfolgt werden.