DE1215864B

DE1215864B - Verfahren zur Herstellung des neuen tumorhemmenden Antibiotikums Daunomycin sowie seines Aglykons

Info

Publication number: DE1215864B
Application number: DES88232A
Authority: DE
Inventors: Aurelio Di Marco; Graziana Canevazzi; Arpad Grein; Piergiuseppe Orezzi; Marcello Gaetani
Original assignee: Farmaceutici Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1962-11-16
Filing date: 1963-11-11
Publication date: 1966-05-05

Description

Verfahren zur Herstellung des neuen tumorhemmenden Antibiotikums Daunomycin sowie seines Aglykons Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums und seiner Derivate, die in der Therapie besonders als krebshemmende Mittel nützlich sind. Insbesondere ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Herstellung eines neuen Antibiotikums, welches die Eigenschaften eines Indikators besitzt, von der Anmelderin »Daunomycin« benannt und welches im nachstehenden als Antibiotikum »F. I. 1762«bezeichnet wird, sowie seiner Salze und der Produkte seines hydrolytischen Abbaues. Das biosynthetische Verfahren zu seiner Herstellung beruht auf der Anwendung einer neuen Art von Streptomyces, die, vom Erfinder Streptomyces peucetius benannt, im nachstehenden als »Streptomyces F. 1. 1762« oder kurz »Streptomyces 1762« bezeichnet wird. Streptomyces F. 1. 1762 ist bei dem Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew Surrey (England), mit der Indexnummer I. M. 1. 101,335 und bei National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen (England), mit der Indexnummer NCIB 9475 und bei dem Institute of Microbiology of th - e Rutgers University (U. S. A.) mit der Indexnummer IM. 3868 hinterlegt worden. Der erfindungsgemäß neue angewandte Mikroorganismus wurde aus einer in der Nähe von Bari (Italien) entnommenen Bodenprobe isoliert. Er weist die folgenden morphologischen, makroskopischen, mikroskopischen und biochemischen Eigenschaften auf. Mikroskopisches Aussehen Das sich auf gewöhnlichen Kulturböden bildende vegetative Mycel besteht aus dünnen (0,5 bis 0,9 #t Dicke), mehr oder wenig verzweigten Hyphen. Die Verzweigungen tragen dickere Hyphen (1,1 bis 1,6 #t Dicke) die Konidiophora, die oft in Bündelform vereint sind und hakenförmig enden. Die Konidien sind rundlich mit einem Durchmesser zwischen 1,8 und 3,3 #t und sind zuerst in Ketten und dann frei angeordnet.
Unter dem Elektronenmikroskop zeigen sich die Konidien beinahe rundlich mit unregelmäßigen Umrissen und warziger Oberfläche.

Makroskopisches Aussehen In Tabelle I sind die in den daneben angegebenen ZD Kulturböden beobachteten Eigenschaften angeführt, wobei man den Mikroorganismus bei 28'C wachsen ließ und die Beobachtungen am 3., 8., 15., 21. und 30. Tag nach der Beimpfung durchführte.

Biochemische Eigenschaften

Gelatine ............. Langsame und teilweise

Hydrolyse

Nitrate .............. Keine Reduktion zu

Nitriten

Erzeugung von H,S ... Positiv

c

Milch ............... Keine Peptonisierung,

keine G.erinnung

Stärke ............... Sehr laiigsame und

spärliche Hydrolyse

Verwertet ............ Maltose, Xylose, Mannose,

Mannit, Glycerin, Glucose,

Saccharose, Trehalose,

Raffinose, Fruktose

Nicht verwertet ....... Laktose,Adonit,Ramnose,

Sorbit, Arabinose und

Äseulin

Antibiotika .......... Erzeugt in flüssiger

Schüttelkultur antibio-

tische Substanzen.

Tabelle I

Medlum Wachstum Luftmycel Vegetatives Mycel Lösliche Pigmente

Malzagar Kleine, in runze- Sehr spärlich, glatt, Reichlich, gelblich, Intensiv, zuerst

Hefeextrakt -lige, harte, er- blaßrosa, Ab- dann rotgelb gelbrot, dann

(nach - hobene und reich- wesenheit von rotbraun

Hesseltine liche Patina Spiralen und

und Mit- zusammen- Quirlen

arbeiter)* fließende

Kolonien

Bennet- Spärlich, in Form Abwesend Spärlich, zuerst Abwesend

Agar von isolierten weißlich, dann

-gelben kleinen gelblich

Kolonien

Emme on- Mäßig, in Form Abwesend Mäßig, zuerst blaß- Blaßrötlichbraun

Agar von kleinen zu- rosa, dann

sammenfließenden bräunlichrötlich

Kolonien.

Kartoffel- Reichlich, in Reichlich, rosa Reichlich, fleisch- Intensiv, zuerst

Agar (nach gleichmäßig Hyphe, die farbig; glatte, gelbrötlich, dann

Hesseltine glatter Patina hakenförmig und harte Patina leuchtendorange

und Mit- dann knäuelförmig

arbeiter)* endet

Pepton-Agar Reichlich in zu- Abwesend Reichlich, farblos Abwesend

und KNO3 sammenfließenden,

kleinen Kolonien

Czapeck- Reichlich, in zu- Spärlich, weißgrau, Reichlich, blaß- Abwesend

Agar leicht wattige rosa

kleinen Kolonien Hyphe, die haken-

oder knäuel-

förmig endet

Asparagin- Spärlich, in kleinen Spärlich, weißlich- Spärlich, farblos Abwesend

Glucose- isolierten rot, sehr zer-

Agar Kolonien fallenes kurzes

Mycel ohne

Haken am Ende

Glyceringlycin- Reichliche' - glatte, Abwesend Reichlich, von gelb Abwesend

Agar harte Patina bis leicht orange

Stärke-Agar Spärlich, in kleinen Abwesend Spärlich, farblos, Abwesend

isolierten dann gelblichrosa

Kolonien

Gelatine Mäßig, auf der Abwesend Mäßig, von farblos Reichlich, braun

Oberfläche bis gelblich bis tiefschwarz

Milch Spärlich Abwesend Mäßig, ringförmig Spärlich, rosa

auf der Ober-

fläche

EI e s s e 1 t i n e und Mitarbeiter, 1954, Anm. N. Y. Acad. Sci, 60, S. 136 bis 151.

Tabelle II

Vergleich zwischen Streptomyces F. 11762 und Arten, die dem Antibiotikum F. 1. 1762

ähnliche Substanzen erzeugen

Streptomyces

F. 1. 1762 S. purpurascens S. boliliae S. cinereoruber

(S. peucetius)

Sporophora Gerade oder haken- Spiralenförmig Spiralenförmig Gerade oder haken-

förmig förmig

Sporen Beinahe rund, Oval, stachelig, Oval, glatt,

warzig, 0,8 bis 1 p. mal 0,7 bis 1 mal

1,8 bis 3,3 #t 0,4 bis 0,5 #t 0,9 bis 2

Vegetatives Gelbrot Rot Korallenrot Gelbrotbraun

Mycel

Luftmycel Weißrötlich Weißrötlich Weiß Aschgrau

Reduktion +

der Nitrate

Milch (Pep. + +

Gerinnung)

iL-Xylose + + + +

L-Arabinose + + +

L-Ramnose + +

Fruktose + +

Saccharose + + +

Lactose + + +

Raffinose + + +

D-Mannit + +

D-Sorbit

Erzeugte Anti- Daunomycin oder Rodomycin Cynerubin Rodomycin

biotika Antibiotikum

F.I.1762

positive Reaktion; negativeReaktion; Angabenfälen.

S. cinereoruber, var. S. caespitosus S. niveoruber S. galilaeus

fructo-fennen'tans

Sporophora Gerade oder Quirlförmig Spiralenförmig Spiralenförmig

hakenförmig

Sporen Oval, glatt, Oval, glatt, Glatt Glatt

0,7 bis 1 #t mal 0,5 bis 3 #t mal

0,9 bis 2 #t 0,3 bis 0,5 #t

Vegetatives Gelbrotbraun Von cremefarben Karminrot Karminrot

Mycel bis braun,

bis gelbrötlich

Luftmycel Aschgrau Gelblich weißgrau Weißlich Von weiß bis

aschgrau

Reduktion der +

Nitrate

Milch (Pep. + + - +

Gerinning)

L-XyloSe + 17

L-Arabinose +

L-Ramnose +

Fruktose + +

Saccharose + +

Lactose +

Raffinose

D-Mannit +

D-Sorbit +

Erzeugte Anti- Cynerubin Mytomycin Cynerubin Cynerubin

biotika

+ = positive Reaktion; negative Reaktion; Angaben fehlen.

(Fortsetzung Tabelle II)

Streptomyces Streptomyces Streptomyces DOA 1205

S. antibioticus All65 (Ashashov A220 (Asheshov (Brockmann:

let al..- Antib. and et al.: Antib. and Chern. Ber., 92,

Chemoth.,4,S.380,1954) Chemoth.4,S.380,1954) s. 1880, 1959)

Sporophora Gerade Nicht beschrieben Nicht beschrieben Spiralenförmig

Sporen Glatt, rundlich Nicht beschrieben Nicht beschrieben Nicht beschrieben

Vegetatives Cremegelb Nicht beschrieben Nicht beschrieben Ziegelrot weinrot

Mycel

Luftmycel Von weiß bis Nicht beschrieben Nicht beschrieben Rotgrau

mausgrau

Reduktion der

Nitrate

Milch (Pep.

Gerinnung)

L-Xylose

-L-Arabinose

L-Ramnose

Fruktose

Saccharose

Lactose

Raffinose

D-Mannit

D-Sorbit

Erzeugte Anti- Cynerubin Aklavin Rutilantin Pyrromycin

biotika

+ positive Reaktion; negative Reaktion; Angaben fehlen.

Identifizierung des Stammes Die Beschreibung des untersuchten Mikroorganismus führt ihn auf die Gattung Streptomyces Waksman et Henrici (Bergey's Manual of Determinative Baeteriology, 7. Auflage, 1957, S. 744 bis 745) zurück. Die Prüfung der Arten läßt auf folgendes schließen: Im Klassifizierungssystern von P r i d h a m und Mitarbeiter (Appl. Microbiol., 6, S. 52, 1958) gehört der Mikroorganismus in die Abteilung Retinaculum apertum, Serie RED. Im Klassitizierungssystem von B a 1 d a c c i (Giorn. di Microbiol., 6, S. 10, 1958) gehört des Mikroorganismus zu der Seitie Albosporeus; im Waksmanschen System (The Actinornycetes, Vol. 11, 1961, S. 129) gehört der Mikroorganismus der Serie Ruber an.

Ein Vergleich zwischen den Eigenschaften des Mikroorganismus und denen der zu den angegebenen systematischen Gruppen (Taxa) gehörenden Arten hat gezeigte daß keine von ihnen solche Eigenschaften hat, die dg-nen des untersuchten Mikroorganismus entsprechen.
Die Angaben dieses Vergleichs werden in Tabelle II wiedergegeben, soweit sie Arten betreffen, die Substanzen erzeugen, welche denen von der Anmelderin geprüften ähnlich sind. In der Tabelle sind S. cinereoruber, S. einereoruber var. fructo-fermentans, S. eaespitosus und S. antibioticus mit angeführt, obwohl sie nicht zu den oben angegebenen Gruppen gehören.
Hierfolgend werden dagegen die Unterschiede mit den Arten angeführt, die keine Substanzen des untersuchten Types erzeugen. Der vorliegende Mikroorganismus unterscheidet sich von der Art S. Albosporeus (Wa k s m a n, The Aetinomycetes, Vol. II, 1961, S. 171), insofern, als letztere die Nitrate reduziert, keine löslichen Pigmente und keinen Schwefelwasserstoff erzeugt; er unterscheidet sich von der Art S. cinnamomensis (Wa k s m a n, The Actinomycetes, Vol, 11, 1961, S. 195 bis 196) und von S. fradiae (Wa k s m a n, The Actinomycetes, Vol. 11, 1961, S. 211 bis 212) wegen der Farbe des vegetativen Mycels und des Luftmycels; von der Art S. ruber (Wa k sm a n, The Actinomycetes, Vol. 11, 1961, S. 271), weil letztere die Milch zum Gerinnen bringt, keine löslichen Pigmente und -keinen Schwefelwasserstoff erzeugt.
Er unterscheidet sich von S. rubescens (W a k s -m a n, The Actinomycetes, Vol. 11, 1961, S. 271) wegen der Farbe des Luftmycels und weil S. rubescens kein lösliches Pigment und keinen Schwefelwasserstoff erzeugt; er unterscheidet sich von S. oidiosporus (Wa k s m a n, The Actinomycetes, Vol. 11, 1961, S. 251) weil er keine Nitrate reduziert und Milch nicht, peptonisiert. Außerdem bildet S. oidiosporus keine löslichen Pigmente.
Daraus kann geschlossen werden, daß der untersuchte Mikroorganismus von den bisher bekannten Arten verschieden ist, und deshalb wurde er vom Erfinder mit dem Namen Streptomyces peucetius n. sp. bezeichnet.
Der Mikroorganismus Streptomyces 1762 kann durch Gefriertrocknung aufbewahrt werden, wobei Milch oder Milchserum als Aufschlämmungsmittel gebraucht werden. Man kann die Sporen sammeln und sie auf steriler Erde aufbewahren.
Außerdem kann er auch durch wiederholte Züchtung auf einem festen, Glukose oder einen anderen geeigneten Zucker und Stickstoffsubstanzen (Hefeextrakt, Pepton, Kaseinhydrolysat) enthaltenden Nährboden aufbewahrt werden. Zu dem Nährboden können außerdem einige Salze zugesetzt werden, unter denen Magnesiumsulfat und Kaliumphosphat besonders wichtig sind. Die Herstellung des Antibiotikums wird nach den üblichen an sich bekannten Methoden durchgeführt und besteht im wesentlichen darin, daß Streptomyces 1762 in einem flüssigen, vorher sterilisierten Nährboden unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 25 und 37'C (vorzugsweise bei 28'C) über eine Zeitspanne von 3 bis 7 Tagen (vorzugsweise 5 Tagen) bei einem pH, welches anfangs 6,5 bis 7,0 und am Ende der Ferrnentation 7,5 bis 8,0 beträgt, gezüchtet wird. Der Nährboden besteht aus einer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquelle können Stärke, Dextrin, Glukose, Glycerin, Mannit, Maltose, Getreideweiche, lösliche Destillationsrückstände, Sojaöl und Sojamehl verwendet werden. Als Stickstoffquelle kommen außer einigen der obenerwähnten stickstoffhaltigen Substanzen auch Trockenhefe, Fleischpepton und Kasein in Frage.
Gute Ergebnisse kann man auch bei Verwendung der folgenden Ammoniumsalze erzielen: Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Diammoniumphosphat.
Der Zusatz der Mineralsalze, die einen guten Verlauf des Gärungsverfahrens begünstigen kann sich je nach dem verwendeten Nährboden ändern. In einem Nährboden, der komplexe Substanzen wie verschiedene Mehle und Fermentationsrückstände enthält, haben sich Zusätze von Calciumcarbonat, von Natriumphosphat und von Kaliumphosphat als günstig erwiesen. In einem Glukose und Hefe oder Ammoniumsalze enthaltenden Nährboden sind Zusätze von Mineralsalzen, wie Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Zink-, Mangan-, Kupfersalze nötig. Die Fermentation kann in Erlenmeyerkolben oder in Laborfermentern verschiedenen Inhaltes durchgeführt werden.
Der Gehalt an Antibiotikum F. 1. 1762 wird durch spektralphotometrische Ablesung der wäßrig alkoho-Eschen Auszüge derselben bei pH 10 und bei einer Wellenlänge von 540 bis 580 m#t im Vergleich zu einer Eichprobe von F. 1. 1762 mit bekanntem Gehalt festgestellt.
Zur Isolierung des Antibiotikums F. 1. 1762 trennt man das Mycel mit Hilfe eines adsorbierenden kieselgurhaltigen Materials von der Kulturbrühe ab, und man bearbeitet weiter sowohl den Filtrationskuchen als auch die filtrierte Flüssigkeit extra.
Der größte Teil an dem so erzeugten Antibiotikum befindet sich in dem Filtrationskuchen, der aus einem Gemisch von Mycel und adsorbierendem kieselgurhaltigem Material besteht. Der besagte Kuchen wird in einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Butanol und Aceton, Methyläthylketon, Chloroform, Methylchlorid, oder wäßrigen Lösungen organischer oder anorganischer Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure, Schwefelsäure usw., verrieben. Vorteilhaft können Mischungen organischer Lösungsmittel, wie Alkohole und wasserlösliche Ketone, mit wäßrigen Lösungsmitteln anorganischer Säuren verwendet werden. Bei Verwendung von Mischungen organischer Lösungsmittel mit wäßrigen Säuren neutralisiert man die Auszüge und destilliert das organische Lösungsmittel im Vakuum ab, wobei eine wäßrige Suspension erhalten wird. Der während der Konzentration ausgefällte Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird bis zu einem pH-Wert zwischen 8 und 9. alkalisch gemacht und mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Butylalkohol, Amylalkohol,- Chloroform, Methylchlorid; Methylpropylketon, Methylbutylketon; Benzol, Toluol u. dgl. extrahiert. Nach dem Extrahieren mit organischen niedrigsiedenden und mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln werden die Auszüge mit Wasser versetzt und hierauf wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Dann extrahiert man die wäßrige Phase wie oben beschrieben. Aus der organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösung kann die rohe aktive Substanz durch Konzentrieren auf ein kleines Volumen und durch darauffolgendes Ausfällen mit apolaren Lösungsmitteln, wie Äthyläther, Dipropyläther, gesättigtem Kohlenwasserstoff, Hexan, Zyklohexan, Heptan oder Petroläther gewonnen werden. In der so erhaltenen Lösung sind auch andere Farbstoffe erhalten, die man mit wäßrigen anorganischen oder organischen Basen extrahieren kann und die man durch Ansäuern der wäßrigen Lösung in festem Zustand erhält.
Es ist jedoch vorteilhaft, eine erste Reinigung des Antibiotikums auszuführen, wobei man die organische Lösung mit organischen oder anorganischen, verdünnten wäßrigen Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, bei einem pH-Wert zwischen 2 und 5 oder mit Pufferlösungen bei dem gleichen p11-Bereich extrahiert. Zu der Überführung des Antibiotikums in die wäßrige Phase ist es vorteilhaft, der organischen Phase einige Volumteile eines damit mischbaren Lösungsmittels mit niedriger Polarität, wie Äther, Diäthyläther, Düsopropyläther oder Hexan, Zyklohexan, Heptan oder Petroläther, zuzusetzen. In der organischen Phase bleiben verschiedene andere Farbstoffe, deren Natur noch nicht untersucht worden ist.
Das pH der erhaltenen wäßrigen Phase wird auf einen Wert zwischen 8 und 9 eingestellt, und man extrahiert nochmals mit organischen Lösungsmitteln, wie Butylalkohol, Amylalkohol, Chloroform, Methylchlorid, Benzol und Toluol, Phenol und Kresol.
Der erhaltene Extrakt wird dann im Vakuum und auf ein geringes Volumen konzentriert, und durch Zusatz einer organischen oder anorganischen Säure -und eines Lösungsmittels mit niedriger Polarität, wie Äthyläther, Diisopropyläther, Zyklohexan, Hexan, Heptan oder Petroläther, kann man das rohe Antibiotikum als Salz ausfällen.
Eine gute Reinigung des erhaltenen rohen Produktes kann durch Gegenstromverteilung zwischen einer wäßrigen Lösung, wie einer wäßrigen Säure oder einer Pufferlösung, und einem wasserunmischbaren Lösungsmittel durchgeführt werden. Auch die Chromatographie eignet sich als Reinigungsverfahren.
. Das Antibiotikum kann auch durch Behandlung der wäßrigen Lösungen eines seiner rohen Salze mit Pikrinsäure ausgefällt werden. Das Pikrat des Antibiotikums fällt in rotgelben Flocken aus, die gesammelt und getrocknet werden können.' Das Pikrat ist in niederen Alkoholen und halogeniertem Kohlenwasserstoff, wie z. B. Chloroform, und in Ketonen, wie z. B. Aceton und Methyläthylketon, löslich.
Bei Behandlung der organischen Lösungen des Pikrats mit einer anorganische n Säure fällt das Salz des Antibiotikums aus.
Das Antibiotikum F. 1. 1762 kristallisiert als Chlorhydrat in feinen roten Nadeln. Das Chlorhydrat ist in Wasser, Methanol, wäßrigen Alkoholen löslich und in Chloroform, Aceton, Benzol und apolaren Lösungsmitteln unlöslich. In vollkommen trockenem Zustand schmilzt es bei 186 bis 187'C.
Das Chlorhydrat ergibt folgende Elementaranalyse: C = 55>01 0/" H = 6,310/0, N = 2,46 0/0, Cl = 6,20 "/,. Sein Absorptionsspektrum im UV- und im sichtbaren Bereich zeigt Banden bei den folgenden Wellenlängen (s. F i g. 3 und 4 der Zeichnung, ununterbrochene Linie):

In absolutem Methanol

bei 234 m#t EUM = 632

bei 251 m#t E 111 = 454

bei 290 m#t Elm = 149

bei 480 Nipp EU. = 203

bei 495 mp# E IN'. = 208

bei 532 m#t Ell- = 116

In konzentrierter Schwefelsäure bei 257, 303, 545 und 585 m#t Im IR-Spektrum (s. F i g. 1 der Zeichnung) sind Banden bei den folgenden Wellenlängen sichtbar; 2,96, 3,42, 5,82, 6,17, 6,31, 6,51, 6,90, 7,05, 7,23, 7,37, 7,78, 8,11, 8,24, 8,65, 8,96, 9,27, 9,35, 10,10, 10,92, 11,50, 11,85, 12,20, 12,68, 13,12, 13,77-, 14,20, 14,60 #t.
Die wäßrigen Lösungen sind gelbrot und werden im alkalischen Bereich violett. Mit Magnesiumacetat ergeben sie eine karmesinrote Färbung.
Durch Hydrolyse mit verdünnten Mineralsäuren spaltet sich das Antibiotikum F. 1. 1762 in zwei reduzierende Zucker und in ein neutrales Aglykon ab. Das Aglykon bildet glänzend rote Kristalle, die bei 211 bis 213'C schmelzen, und enthält nur Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff. Das Aglykon ergibt folgende Elementaranalyse: C = 61,75 0/(), H = 4,94 0/0, 0 = 33,31 "/0.

Das Spektruin im UV- und im sichtbaren Bereich zeigt Adsorptionsmaxima bei den folgenden Wellenlängen (s. F i g. 3 und 4, gestrichelte Linie):

In absolutem Methanol:

bei 234 m#L E'111 = 782

bei 251 mt Elll = 568

bei 288 m#L EM = 186

bei 480 m#t Efl = 258

bei 496 m#t Ell.1. = 267

bei 532 m#t EII.1 = 149

In konzentrierter Schwefelsäure:

bei 257, 303, 545, 585 mp, (Flexionspunkt bei 390 mp,) In wasserfreiem Piperidin bei 540, 570 und 610 m#L Im IR-Spektrum (s. F i g. 2) bemerkt man Banden bei den folgenden Wellenlängen* 2,90, 3,42, 5,85, 6,18, 6,33, 6,90, 7,03, 7,24, 7,35, 7,75i 8,06, 8,25, 8,94, 9,37, 9,67, 10,10, 10,59, 10,91, 11,68, 11,99, 12,35, 12,63, 13,18, 14,40 #t.

Das Aglykon des Antibiotikums ist in Methanol, Äthanol, Chloroform löslich, in Butanol und Aceton weniger löslich, in Benzol, aliphatischen Estern, Äthyläther kaum löslich und in Wasser und Petroläther unlöslich. Das Aglykon kommt außerdem im rohen Antibiotikum vor. Seine Anwesenheit kann mittels Papierchromatographie (Entwickler: mit wäßrigem Phosphatpuffer bei pH 5,2 gesättigtes n-Butanol) nachgewiesen werden. Das Antibiotikum 1762 zeigt einen Rf-Wert von 0,21, sein Aglykon einen Rf-Wert von 0,85. Das Antibiotikum F. 1. 1762 gehört zu der Gruppe der Antibiotika, wozu auch Rodomycin A, B und y (H. B r o c k in a n n und Mitarbeiter, Chem. Ber., 88, 1955, S. 1762; Naturwissenschaften, 48, 1961, S. 716), Cynerubin (Chein. Ber., 92, 1959, S. 1868), Pyrromycin (Chem. Abstrs., 54, 1960, S. 1470) und Rutilantin (Tetrahedron Letters, 16, 1959, S. 17) gehören. Das Antibiotikum F. 1. 1762 unterscheidet sich von den obengenannten Produkten in seiner chemisch-physikalischen Eigenschaft, besonders in den IR- und UV-Spektren und in seinem chromatographischen Verhalten.
Die Salze des Antibiotikums F. 1. 1762 sind von organischen und anorganischen, nicht toxischen Säu- ren abgeleitet, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure ' Propionsäure, Valeriansäure, Palmitinsäure, Ölsäure, Zitronensäure, Mandelsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure. Die neutralen Salze bilden sich durch Umsetzung der entsprechenden Säuren mit der freien Base, die ihrerseits durch Alkahsieren einer wäßrigen Lösung des Chlorhydrats auf pH 8,6 und durch darauffolgendes Extrahieren mit wasserunmischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Butanol und Chloroform, erhalten wurden. Durch Abdestillieren des organischen Lösungsmittels erhält man das Antibiotikum als freie Base, die bei 208 bis 209'C schmilzt. Die Herstellung der Salze kann auch durch doppelte Umsetzung der Salze ausgeführt werden: z. B. erhält man durch Umsetzen von F. I. 1762-Sulfat mit Calciumpantothenat das Pantothenat von F. 1. 1762. Außer seiner bemerkenswerten bakteriostatischen Wirksamkeit gegen zahlreiche Mikroorganismen, hat sich das Antibiotikum F. 1. 1762 als tumorhernmendes Mittel besonders nützlich erwiesen.
Es zeigt eine bemerkenswert hemmende Wirksamkeit auf das Wachstum der Tumore aseitischer Form, wobei ein unmittelbarer Kontakt zwischen Antibiotikum und den neoplastischen Zellen vorliegt. Gute hemmende Wirksamkeit ist auch bei den soliden Tumoren festgestellt worden, wobei die Wirkung durch den Weg der Verabreichung bedingt ist: Die besten Ergebnisse sind bei intravenöser Verabreichung in Dosen zwischen 2 und 3 mg/kg/Tag erzielt worden.
In der folgenden Tabelle ist die akute Toxizität des Daunomycins als LD., wiedergegeben: Akute Toxizität-LD50 Wert (mg/kg)

Tierart Verabreichungsweg LD.90

(mg/kg)_

Maus intravenös 20

Maus intraperitoneal 5

Ratte intravenös 13 bis 15

.Ratte intraperitoneat 8

Das Antibiotikum F. 1. 1762 und seine Derivate, die Produkte seines hydrolytischen Abbaues und die Mischungen derselben, können als Medikamente verwendet werden. Diese enthalten die spezifischen Verbindungen mit günstigen pharmazeutischen Füllungsmitteln gemischt, die für die orale, parenterale oder lokale- Verabreichung geeignet sind. Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu erläutern, ohne sie hierauf zu beschränken.

Beispiel 1 Zwei 300-mI-Erlenmeyerkolben enthalten je 60m1 des folgenden vegetativen Nährbodens:

Peptone ......................... 0,611/0

Trockenhefe ...................... 0,30/0

Calciumnitrathydrat ............... 030501"

Leitungswasser

Sterilisation: 20 Minuten bei 120'C Nach der Sterilisation liegt der pH-Wert bei 7,2. Jeder Kolben wird mit einem Fünftel einer Suspension in sterilem Wasser des Mycels von Streptomyces 1762 einer 10 Tage alten Kultur beimpft, die im Reagenzglas auf dem folgenden Nährboden gezüchtet wurde:

Saccharose ....................... 20/0

Trockenhefe ...................... 0,10/0

sek. Kaliumphosphat .............. 0,20/,

Natriumnitrat .................... 0,20/0

Magnesiumsulfat .................. 0,20/,

Agar ............................. 20/0

in Leitungswasser

Man bebrütet sie 48 Stunden bei 28'C auf einem Schüttelgerät mit 220 U/min und einer Exzentrizität von 60 mm.

2 ml einer so bebrüteten vegetativen Kultur dienen zur Beimpfung von 300-mI-Erlenmeyerkolben, die je 60 ml des folgenden produktiven Nährbodens enthalten:

Glukose ......................... 40/0

Trockenhefe ..................... 1,501,

Natriumchlorid ................... 0,20/0

sek. Kaliumphosphat .............. 0,10/0

Calciumcarbonat .................. 0,10/0

Magnesiumsulfat .................. 0,011)/o

Eisensulfat ....................... 0,0010/0

Zinksulfat ........................ 0,0010/,

Kupfersulfat ..................... 0,0010[0

in Leitungswasser

pH 7,0

Man sterilisiert 20 Minuten bei 120'C; die Glukose wird separat 20 Minuten bei 110'C sterilisiert. Man bebrütet bei 28'C und bei einer Rührgeschwindigkeit von 220 U/min. Nach 120stündiger Fermentation wird der höchste Gehalt an F. 1. 1762 erreicht (60 #tg/ml) Beispiel 2 Man verfährt wie im Beispiell mit dem Unterschied, daß die zu beimpfende Kultur auf dem folgenden festen Nährboden entwickelt worden ist: 200 g geschälte Kartoffeln werden 20 Minuten in 500 ml Wasser gekocht, man stellt das Volumen des Kartoffelbreies auf seinen ursprünglichen Wert ein -und filtriert ihn durch Gaze. Man fügt 2 0/" Glucose, 0,10/" Hefeextrakt und 2 0/, Agar hinzu und stellt ihn auf 1000 ml Volumen ein. Schließlich sterilisiert man 20 Minuten bei 120'C; der pH-Wert liegt bei 6,8 bis 7. Die höchste Produktion (70 lig/ml) wird nach 140 Stunden erreicht.

Beispiel 3 Man geht wie im Beispiel 2 vor mit dem Unterschied, daß die vegetativen und produktiven Nährböden die folgenden Zusammensetzungen haben:

Ve-etativer Nährboden

C

Dextrin .......................... 30/0

Calciumearbonat .................. 0,41/0

Getreideweiche ................... 0,3l)/,

Ammoniumsulfat ................. 0,10/,

Kasein .......................... 0,50/0

sek. Kaliumphosphat .............. 0,010/0

in Leitungswasser

Nach 20 Minuten Sterilisation bei 120'C liegt der pH-Wert bei 7.

Produktiver Nährboden

Dextrin .......................... 3%

Calciumearbonat .................. 0,6l)/o

Getreideweicheflüssigkeit ........... 0,60/0

Kasein .......................... 0,501,

Ammoniumsulfat .................. 0,10/0

sek. Kaliumphosphat .............. 0,01 1>/,

in Leitungswasser

Nach der Sterilisation liegt das pH bei 7. Die Sterilisation wird in üblicher Weise durchgeführt.

Der höchste Gehalt an F. 1. 1762 wird nach 130 Stunden erreicht (65 pg/ml).
Beispiel 4 Mit einer Kultur von Streptomyces 1762 auf einem festen Nährboden, wie im Beispiel 2 beschrieben, beimpft man 500 ml des im Beispiel 1 beschriebenen vegetativen flüssigen Nährbodens, welcher in einem 2000-ml-Glaskolben enthalten ist.
Man bebrütet ihn 48 Stunden bei 28'C auf einem Schüttelgerät mit 120 U/min und einer Exzentrizität von 70 Tnm; 100 ml der so erhaltenen Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 3000 ml desselben flüssigen Nährbodens, der in einem 5-1-Fermenter aus Neutralglas enthalten ist. Dieser Ferinenter ist mit einem Schraubenrührer, einem Luftverteilungsrohr, das unter dem besagten Rührer endet, einem Wellenbrecher, Beimpfungsröhren, Öffnungen für den Luftauslaß, einer Vorrichtung zur Kontrolle der Temperatur sowie einem Gerät für teilweisen und kontinuierlichen Zusatz unter sterilen Bedingungen versehen. Die Entwicklung vollzieht sich bei 28'C mit einer Luftzufuhr von 3 1 in der Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min.
Nach 24 Stunden verwendet man 300 ml der sich so entwickelten Kulturbrühe zum Beimpfen von 61 des produktiven Nährbodens, dessen Zusammensetzung im -Beispiel 1 beschrieben wurde und die in einem 10-1-Fermenter aus Neutralglas enthalten sind. Während der Fermentation, die bei einer Rührgeschwindigkeit von 350 U/min und mit einer Luftzufuhr von 51 in der Minute ausgeführt wurde, wird die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen silikonenthaltenden Schaumschutzmittels kontrolliert. Die in 150stündiger Fermentation erhaltene Höchstproduktion entsprach einer Konzentration von 60 Vg/ml des F. 1.'1762.
Beispiel 5 Das Verfahren unterscheidet sich von demjenigen des Beispiels4 dadurch, daß der produktive Nährboden anstatt mit 300 ml der vegetativen Kultur mit 600 ml derselben beimpft wird.
Der höchste Gehalt an F. 1. 1762 wird nach 140 Stunden erreicht (70 #tg/ml). Beispiel 6 501 einer Kulturbrühe, die nach dem Beispie14 gewonnen wurde, werden vom Mycel mit Hilfe eines kieselgurenthaltenden adsorbierenden Mittels abfiltriert, wobei ein Filtrationskuchen und ein Filtrat erhalten werden, die man separat extrahiert. Der Filterkuchen wird in Aceton-0,4 n-wäßriger Schwefelsäure aufgeschlämmt und 2 Stunden lang gerührt. Die Aufschlämmung wird filtriert und man wiederholt die Operation mit dem Filterkuchen noch zweimal. Die erhaltenen Extrakte werden neutralisiert und das Aceton wird im Vakuum abgedampft. Die gebildete Suspension wird dann filtriert, und die erhaltene feste Masse wird mehrmals mit angesäuertem Wasser bei einem pH von 3 geschüttelt und wieder filtriert. Das Filtrat wird auf pH 8,6 eingestellt und erschöpfend mit n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolauszüge werden im Vakuum auf ein geringes Volumen konzentriert. Dieser Lösung fügt man 2 Volumteile Äthyläther hinzu, und man extrahiert -sie wieder mit 0,1 n-Salzsäure. Die Operation wird mehrmals durchgeführt, bis sich die saure wäßrige Phase rotgelb verfärbt. Die vereinigten wäßrigen Auszüge werden auf pH 8,6 eingestellt und dreimal mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformauszüge werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, mit einigen Tropfen methanolischem wasserfreiem Chlorwasserstoff bis zur Klarheit der Lösung versetzt und dann auf ein geringes Volumen konzentriert. Während der Konzentrierung fallen rote nadelförraige Kristalle des Produktes aus, die abfiltriert werden. Bei der Analyse erweist sich das so gewonnene Produkt (0,3g) als das Chlorhydrat des Antibiotikums. Nach Konzentrieren der Mutterlauge wird diese mit Äthyläther versetzt, wobei weitere 0,13 g rohes F. 1. 1762 erhalten werden.
Das obengenannte Filtrat wird auf pH 8,6 eingestellt und mit n-Butanol extrahiert. Diese Extraktion wird zweimal durchgeführt. Die vereinten, auf ein geringes Volumen konzentrierten und mit 2 Volumteilen Äthyläther versetzten organischen Auszüge werden nochmals mit 0,1 n-Salzsäure extrahiert. Die wäßrigen vereinten Auszüge werden auf pH 8,6 eingestellt und mit Chloroform dreimal extrahiert. Die chloroformische Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und mit einigen Tropfen methanolischem wasserfreiem Chlorwasserstoff versetzt und auf ein geringes Volumen konzentriert. Von der konzentrierten Lösung werden durch Zusatz von Äthyläther 0,35 g F. 1. 1762 als rohes Chlorhydrat ausgefällt, das gleichzeitig das Aglykon enthält. Bei Verwendung von Schwefelsäure in Methanol anstatt Chlorwasserstoff erhält man das Antibiotikum F. i. 1762 als Sulfat.
Beispiel 7 451 einer Kulturbrühe, die nach dem Beispie14 gewonnen wurde, werden vom Mycel mit Hilfe von üblichen adsorbierenden kieselgurenthaltenden Materialien abflltriert. Der Filterkuchen wird in n-Butanol aufgeschlämmt, dreimal mit diesem Lösungsmittel extrahiert und dann verworfen.'Die Auszüge werden im Vakuum auf ein geringes Volumen konzentriert, worauf man 3 Volumina Äther zusetzt und mehrmals mit 50/0iger wäßriger Essigsäure extrahiert. Die wäßrigen Auszüge werden auf pH 8,6 eingestellt und mit Chloroform nochmals extrahiert. Der chloroformische Auszug wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein geringes Volumen konzentriert, worauf einige Tropfen wasserfreier methanohscher Salzsäure zugesetzt werden und mit Äther gefällt wird. Die erhaltene feste Masse besteht aus rohem Chlorhydrat des Antibiotikums F.I. 1762. Bei Verwendung von Schwefelsäure anstatt Salzsäure erhält man das entsprechende Sulfat.
Die Chloroform-Äther-Lösungen enthalten 'noch manche Farbstoffe, die man mit 1 n-Natronlauge extrahieren kann, deren Natur jedoch bisher noch nicht untersucht worden ist. Beispiel 8 Zu 121 einer Kulturbrühe, die nach dem Beispiel 4 gewonnen wurden, werden die üblichen adsorbierenden kieselgurhaltigen Materialien zugesetzt, und das Ganze wird filtriert. Der Filterkuchen wird dreimal mit je 3 1 einer Lösung Aceton-0,5 n-Salzsäure (Verhältnis. 3 Teile Aceton und 2 Teile Säure) verrührt. Dann wird neutralisiert und das Aceton im Vakuum abdestilliert. Die resultierende wäßrige Lösung wird filtriert, auf pH 8,6 eingestellt und so lange erschöpfend mit Butanol extrahiert, bis sich der Butanolauszug rot färbt. Man konzentriert ihn im Vakuum auf ein geringes Volumen, fügt 1 Volumen Petroläther hinzu und extrahiert mit 0,1 n-Salzsäure.
Die vereinigten wäßrigen Auszüge werden auf pH 8,6 eingestellt und mit Chloroform wieder extrahiert, bis sich dieses rot färbt. Die vereinten Chloroformauszüge werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf ein geringes Volumen konzentriert. Man setzt einige Tropfen methanohsche wasserfreie Salzsäure zu und fällt das rohe Produkt mit Äthyläther aus. Man erhält 1,2 g rohes Chlorhydrat F.l. 1762. Bei Verwendung von Schwefelsäure an Stelle von Salzsäure erhält man das entsprechende Sulfat. Beispiel 9 1 g rohes F.l. 1762 wird der Gegenstroinverteilung in einem Craigschen Apparat mit 40 Röhren ausgesetzt, wobei man das Lösungsmittelsystem n-Butanol-Phosphatpuffer bei pH 5,2 anwendet.
Man füllt jede Röhre mit 25 ml pro Phase. Nach der nötigen Übertragungsanzahl stellt man bei spektrophotometrischer Prüfung des Inhalts der verschiedenen Röhren bei 500 m#t zwei Gruppen fest, die einen hohen Gehalt an Substanz enthalten: Die eine entspricht den Röhren 7 bis 21, die andere den Röhren 32 bis 39. Die Zwischenröhren zeigen ebenfalls die Anwesenheit von Farbstoffen und werden abseits aufbewahrt. Der Gehalt der Röhren 7 bis 21 wird vereint, die organische Phase abgetrennt und die wäßrige Phase auf pH 8,5 mit 1 n-Natronlauge eingestellt. Die wäßrige Phase wird dann zweimal mit ii-Butanol extrahiert, die organischen Auszüge werden vereint und unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen konzentriert, worauf 3 Volumina Äther hinzugefügt werden und die Lösung mit verdünnter Salzsäure in kleinen Mengen extrahiert wird, bis sich die Phase färbt. Die wäßrige Phase wird dann auf pH 8,6 eingestellt und mit Chloroform extrahiert. Der chloroforrnische Auszug wird getrocknet und mit wenigen Tropfen wasserfreier, methanolischer Salzsäure bis zur Klärung der Lösung versetzt und bei niedriger Temperatur «35'C) im Vakuum konzentriert. Beim Konzentrieren fällt das Produkt F.l. 1762 als Chlorhydrat in kristalliner Form aus. Ausbeute = 0,125 g. Bei Verwendung von Schwefelsäure an Stelle von Salzsäure erhält man das entsprechende Sulfat. Der Farbstoff in den Röhren 32 bis 39 erweist sich bei Papierchromatographie als das Aglykon des F.l. 1762. Bei Vereinigung der höheren Phasen, Zusatz desselben Volumens an Äther und Extrahieren mit 1 n-Natronlauge beobachtet man einen Farbumschlag von Rot nach Blauviolett und erzielt gleichzeitig den Übergang der Farbstoffe in die wäßrige Lösung. Die Extrahierung mit Natronlauge wird zweimal durchgeführt. Die alkalischen Auszüge werden mit Salzsäure sauer gemacht, wobei ein rotes Produkt ausfällt, welches sich nach Umkristallisieren aus n-Butanol bei der chromatographischen Analyse, nach den spektro-photometrischen Analysen im UV, im sichtbaren Bereich und im IR und nach dem Schmelzpunkt als das Aglykon des Antibiotikums F.I. 1762 erweist. Beispiel 10 2g des rohen Produktes, welches 10"/, des Antibiotikums F.I.1762 und seines Aglykons (bestimmt auf Grund der Intensität der Adsorptionsmaxima im sichtbaren Bereich) enthält, werden in 150 ml Wasser gelöst und auf ein neutrales pH eingestellt. Man filtriert das Unlösliche ab und extrahiert die wäßrige Lösung mehrnals mit Äther. Nach mehrmaligem Extrahieren vereinigt man die Ätherauszüge und konzentriert sie im Vakuum auf ein geringes Volumen. Man erhält 20 mg einer festen roten Masse, die sich papierchromatographisch als das Aglykon des Antibiotikums F.I. 1762 erweist. Der wäßrigen Phase setzt man 40 ml einer wäßrigen, gesättigten Pikrinsäurelösung zu. Es fällt ein rotgelblicher Niederschlag aus, der abzentrifugiert wird. Die feste Masse wird über wasserfreiem Kalziumchlorid getrocknet und in Aceton wieder gelöst, worauf man einige Tropfen wasserfreie Salzsäure in Aceton zusetzt, wobei ein Niederschlag eines rotorangen Produktes sofort ausfällt. Die feste Masse (120 mg) wird gesammelt und getrocknet. Durch Umkristallisieren aus n-Propanol erhält man 30 mg eines kristallinen nadelförmigen Produktes, welches sich als das Chlorhydrat des Antibiotikums F.I. 1762 erweist. Beispiel 11 Setzt man das Sulfat des Antibiotikums F.l. 1762 mit einer Lösung von Calciumpantothenat um, erhält man durch doppelte Umsetzung das Pantothenat des Antibiotikums F. 1. 1762. Beispiel 12 50Omg des F.1.-Chlorhydrats werden in 10m1 1 n-Schwefelsäure gelöst und 20 Minuten auf 100'C gehalten. Es scheiden sich rote Flocken aus. Nach Ab- kühlen extrahiert man mit n-Butanol, wobei der Farbstoff in die organische Phase übergeht. Die wäßrige Phase wird mit Bariumhydroxyd neutralisiert, filtriert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand enthält mindestens zwei reduzierende Zucker, die bei Papierchromatographie mit dem Lösungsmittel n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4: 1: 5) (höhere Phase) die folgenden Rf-Werte zeigen: 0,245 und 0,30. Die rotgefärbten Butanolauszüge werden mit Wasser gewaschen und auf ein geringes Volumen im Vakuum eingedampft. Nach Abkühlen und Stehenlassen fallen glänzendrote, nadelförmige Kristalle des Antibiotikumaglykons aus. Schmelzpunkt 211 bis 213' C.
Bei Papierchromatographie mit einem Lösungsmittel, das aus mit Methanol gesättigtem Petroläther besteht, zeigt das Aglykon des F.I. 1762 einen Rf-Wert von 0,41.
Pharmakologie Untersuchung der tumorhernmenden Wirkung des Antibiotikums F.I. 1762 Die Untersuchung der tumorhemmenden Wirkung des Antibiotikums F.i. 1762 wurde mitte Is eines Tumor-»Spektrums« an Soliden- und Ascites-Formen der Maus und der Ratte durchgeführt. 1. Ascites-Tumore Die Wirkung wurde an mit Ehrlichschem Ascites-Careinom beimpften Mäusen und mit Hepatom A H 130 und Oberling-Guerin-GuTrin Myelom beimpften Ratten untersucht. a) Ehrlichsches Aseites-Carcinom Mäuse wurden i.p. mit einer Tumorzellensuspension beimpft. Gleichzeitig wurde mit der Verabfolgung von verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums täglich während 5 Tagen begonnen.

Tabelle III gibt die Ergebnisse wieder. Es ist ersichtlich, daß das untersuchte Antibiotikum im Dosisbereich von 1,25 bis 1,75 mg/kg/Tag eine bemerkenswerte hemmende Eigenschaft auf das Wachstum der Aseites-Tumore ausübt und außerdem die Überlebensdauer der behandelten Tiere verlängert.

Tabelle 111

Ehrlichsches Ascites-Carcinom

Substanz Dosis Gewichtszunahme am Durchschnittliche

Überlebensdauer

mg/kg/Tag 7. Tag 14. Tag 21. Tag

Kontrollen ...................... - +9,6 +21,4 - 16,4

F.l. 1762 ......... . ............. 1,75 +1,3 + 2,4 +4,7 36,4

F.I. 1762 ....................... 1,25 +1,5 + 3,1 +4,4 32,0

F.l. 1762 ....................... 0,75 +2,9 + 5,3 - 18,8

In einer zweiten Untersuchungsreihe wurden die Ergebnisse mit 1,75 mg/kg/Tag während 4 Tagen bestätigt-(Tabelle IV).

Tabelle IV

Ehrlichsches Aseites-Carcinom

Substanz Dosis Gewichtszunahme am Durchschnittliche Überlebensdauer

mg/kg/Tag 7. Tag 12. Tag

Kontrollen ...................... +6,3 +l4,2 12,4

RL 1762 ....................... 1,75 +0,1 +2,2

35,1

# b) Hepatom A H 130 Mit Ascites-Hepatom A H 130 angeimpfte Wistar-Ratten wurden täglich während fünf aufeinanderfolgenden Tagen mit dem Antibiotikum in Dosen von 2 und 1 mg/kg/Tag behandelt.

Die durchschnittliche Überlebensdauer unbehandelter Kontrolltiere betrug 11,8 Tage, die behandelten Tiere hingegen lebten noch alle am 50. Tag des Versuchs. Keines dieser Tiere wies Anzeichen eines Tumors auf.
9) Ascites-Myelom Zum Versuch wurden Wistar-Ratten mit einer Tumorzellensuspension i.p. infiziert und nach folgendem Schema behandelt: Die erste Gruppe erhielt dreimal in 2tägigem Abstand jeweils 2 mg/kg/Tag.

Die zweite Gruppe wurde täglich während fünf aufeinanderfolgenden Tagen mit 1 mg/kg/Tag behandelt. Als Ergebnis wurden eine Verzögerung des Tumorwachstums und eine Verlängerung der durchschnittlichen Überlebensdauer im Vergleich zu den Kontrollen (Tabelle V) festgestellt.

Tabelle V

Ascites-Myelom

osis

Substanz Anzahl der Durchschnittliche

mg/kg/Tag Behandlungen Überlebensdauer

Kontrollen ......... - 10,7

F.l. 1762 ........... 2 3 17,7

F.I. 1762 ............................ ........... 1 5 16,7

2. Solide Tumore Die Wirkung auf das, Verhalten solider Tumore wurde an der mit Ehrlichschem Adenocarcinom und mit dem Sarkom 180 angeimpften Maus und an der mit Walkerschem und mit Oberling-Gu6rin-Gu6rinschem, Myelom angeimpftenRatte untersucht.

a) Ehrlichsches Adenocarcinom Mäuse, die einen transplantierten Tumor trugen, wurden, einen Tag nach der Transplantation beginnend,' täglich 6 Tage -hindurch mit einer Lösung des Antibiotikums behandelt. Am 8. Versuchstag wurden die Tiere getötet, die Tumore herauspräpariert, getrocknet und danach gewogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt.

Tabelle VI

Ehrlichsches Adenocarcinom

Dosis Veränderung Durchschnitts- 01, J-1,mmu, -

Substanz ing/kg/Tag des Körpergewichts Sterbhehkeit gewicht des Tumo 9

brutto netto rs

Kontrollen ................... - +4,85 +2,27 0/10 2,583 -

F.I. 1762 .................. 6 +2,59 +1,07 0/10 1,522 41 > 1

F.I. 1762 .................. 3 +3,84 +1,59 0/10 2,253 1230

Es wurde festgestellt, daß das Antibiotikum bei einer Dosis von 6 mg/kg/Tag eine Hemmung des Tumorwachstums von 41,10/, aufweist.

b) Sarkom 180 Einige mit einem Stück des neoplastischen Gewebes beimpfte Mäuse wurden während sieben aufeinanderfolgenden Tagen, einen Tag nach der Beiinpfung beginnend, intraperitoneal behandelt, Das Antibiotikum wurde mit einer Dosis von 2 mg/kg/Tag verabreicht. Am 10. Versuchstag wurden die Mäuse getötet und der Tumor und die Milz entnomm .

Die in TabelleVII wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß auch in dieser Versuchsanordnung die Behandlung mit dem Antibiotikum eine bemerkenswerte Hemmung des Tumorwachstums und eine beachtliche Reduzierung des Milzvolumens bewirkt hat.

Tabelle VII

Sarkom 180

Dosis Körpergewichts- Durchschnitts- Hemmung, %

Substanz mg/kg/Tag veränderung Sterblichkeit gewicht

brutto netto Tumor, g Milz, mg Tumor Milz

Kontrollen ................ +5,05 +2,83 0/10 2,225 251, -

F. 1. 1762 ................. 2 -1,72 -3,01 0/10 1,289 93 5

42,1 62,7

c) Walkersches Careinosarkom Die mit diesem Tumor beimpften Ratten wurden achtmal während 10 Tagen intravenös behandelt; am 11. Versuchstag wurden die überlebenden Tiere getötet und die Tumore entnommen. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse zusammengefaßt.

Tabelle VIII

Walkersches Carcinosarkom

Substanz Dosis Gewichtsveränderung Sterblichkeit Durchschnitts- 90 Hemmung

mg/kg/Tag brutto netto

gewicht des Tumors

Kontrollen ................ - +229 + 6,96 1/10 15,940 -

F. 1. 1762 ................. 1 +l0,2 + 0,76 1/10 9,443 42,1

F. 1. 1762 ................. 2 +27,9 +22,25 1/10 5,404 66,1

Auch auf diese Tumorart hat das Antibiotikum eine bemerkenswerte hemmende Wirkung ausgeübt, besonders in der Dosis von 2 mg/kg/Tag, welche intravenös verabfolgt, gut vertragen wurde. Eine zweite Untersuchung wurde an mit demselben Tumor infizierten Ratten zur Feststellung der Wirkung des Antibiotikums auf das Überleben der Tiere durchgeführt. Bei dieser Versuchsreihe wurden die Ratten achtmal während 12 Tagen mit 3 mg/kg/Tag intravenös behandelt.

Die in der folgenden Tabelle wiedergegebenen Ergebnisse bestätigen die hemmende Wirkung des Antibiotikums auf das Wachstum des Tumors und zeigen, daß die durchschnittliche Überlebensdauer der Ratten durch diese Behandlung um 50,8 0/, angestiegen ist

Tabelle IX

Walkersches Carcinosarkom

Herabsetzung des

Substanz Dosis Tumorwachstums Durchschnittliche Überlebensdauer

mg/kg/Tag 0/() der Kontrolle

9. Tag 29. Tag

Kontrollen ..................... 16,9

F. 1. 1762 ...................... 3 71,0 31,6 25,5

Die Herabsetzung des Tumorwachstums ist während der Behandlung beachtlich und hält auch bis zum 20. Tag nach dem Einstellen der Behandlung an.

d) Oberling-Gu6rin-Gu6rinsches Myelom Long Evans Ratten, die mit einem Stück des Tumorgewebes angeimpft sind, wurden täglich während 10 Tagen, einen Tag nach der Animpfung beginnend, intravenös behandelt. Am 13. Versuchstag wurden die überlebenden Tiere getötet, die entsprechenden Tumore entnommen und gewogen.

Tabelle X

0.G.G.sches Myelom

Dosis Gewichtsveränderung Sterblichke

Substanz it

Durchschnitts- rs Hemmung

mg/kg/Tag brutto netto

gewicht des Tumo

Kontrollen ................ - +452 +280 3/12 17,23

F. 1. 1762 ................. 2 +33:3 +20,'0 0/12 11,30 34,5

F. 1. 1762 ................. 4 + 3,8 + 0,8 4/12 2,98 82,8

Diese Ergebnisse sind in einem zweiten Versuch bestätigt worden, wobei die Tiere siebenmal während 14 Tagen mit einer Lösung des Antibiotikums (2,5mg/kg/Tag) intravenös behandelt wurden.

Tabelle XI

0.G.G.sches Myelom

Substanz Dosis Gewichtsveränderung Durchschnitts- 1/o Hemmung

Ing/kgiTag Sterblichkeit gewicht

brutto netto Tumor 1 Milz Tumor Milz

Kontrollen .......... +53,7 +40,22 5115 13,486 1,303

F. 1. 1762 ............ 2,5 +20,9 +l6,79 5115 4,114

0,598 69,5 54,1

Aus den TabellenX und XI geht hervor, daß das #untersuchte, Antibiotikum auch gegen diesen Tumortyp wirksam ist; die Dosen von 2 mg und 2,5 mg/kg/ Tag, intravenös verabfolgt, haben die besten Ergebnisse in Bezug sowohl auf die antitumorale Wirkung als auch auf die Verträglichkeit des Antibiotikums gezeigt.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung des neuen tumorhemmenden Antibiotikums Daunomycin sowie seines Aglykons, dadurch gekennz e i c h n e t, daß, Streptomyces peucetius 1.M.I. 101335 unter üblichen Bedingungen gezüchtet wird, das gebildete Antibiotikum aus dem Gärmedium bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 9 mittels eines üblichen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels extrahiert wird, worauf gegebenenfalls das gereinigte Antibiotikum durch Säurehydrolyse in sein Aglykon umgewandelt wird.